Dankon pro via vizito al Nature.com. Vi uzas retumilan version kun limigita CSS-subteno. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Montras karuselon de tri lumbildoj samtempe. Uzu la butonojn Antaŭa kaj Sekva por moviĝi tra tri lumbildoj samtempe, aŭ uzu la butonojn de la ŝovilo ĉe la fino por moviĝi tra tri lumbildoj samtempe.
Mem-kunmetantaj neŭraj organetoj reprezentas promesplenan in vitro platformon por modelado de homa disvolviĝo kaj malsanoj. Tamen, organoidoj mankas la konekteblecon, kiu ekzistas in vivo, kio limigas maturiĝon kaj malhelpas integriĝon kun aliaj cirkvitoj, kiuj regas konduton. Ĉi tie ni montras, ke homaj stamĉeloj derivitaj kortikaj organoidoj transplantitaj en la somatosensoran kortekson de novnaskitaj nudaj ratoj evoluigas maturajn ĉeltipojn, kiuj integriĝas en sensajn kaj motivig-rilatajn cirkvitojn. MR rivelis post-transplantadan organoidan kreskon en pluraj stamĉelaj linioj kaj bestoj, dum unu-kerna analizo rivelis progreson de kortikogenezo kaj la aperon de agad-dependa transskriba programo. Efektive, transplantitaj kortikaj neŭronoj montras pli kompleksajn morfologiajn, sinaptajn kaj internajn membranproprecojn ol iliaj in vitro ekvivalentoj, permesante la detekton de neŭronaj difektoj en pacientoj kun Timoteo-sindromo. Anatomia kaj funkcia spurado montris, ke transplantitaj organetoj ricevas talamokortikajn kaj kortikokortikajn enigojn, kaj in vivo registradoj de neŭra agado sugestas, ke ĉi tiuj enigoj povas generi sensajn respondojn en homaj ĉeloj. Fine, kortikaj organoidoj etendas aksonojn tra la rata cerbo, kaj ilia optogenetika aktivigo kondukas al rekompenc-serĉa konduto. Tiel, transplantitaj homaj korteksaj neŭronoj maturiĝas kaj partoprenas en la gastigaj cirkvitoj, kiuj regas konduton. Ni atendas, ke ĉi tiu aliro faciligos la detekton de fenotipoj je fadennivelo en paciento-derivitaj ĉeloj, kiujn oni ne povas detekti per aliaj rimedoj.
La evoluanta homa cerbo estas rimarkinda mem-organiza procezo, en kiu ĉeloj multiĝas, diferenciĝas, migras kaj konektiĝas por formi funkciajn neŭronajn cirkvitojn, kiuj estas plue rafinataj per sensa sperto. Ŝlosila problemo en komprenado de la homa cerba evoluo, precipe en la kunteksto de malsanoj, estas la manko de aliro al cerba histo. Mem-organizaj organetoj, inkluzive de homaj korteksaj organoidoj (hCO; ankaŭ konataj kiel la homa korteksa sfero), povas generi 2,3,4,5,6. Tamen, pluraj limigoj limigas ilian pli vastan aplikon al komprenado de la evoluo kaj funkciado de neŭraj cirkvitoj. Aparte, ne estas klare, ĉu la maturiĝo de hCO estas limigita de la foresto de certaj mikromediaj kaj sensaj enigoj ĉeestantaj en vivo. Krome, ĉar hCO-oj ne estas integritaj en cirkvitojn, kiuj povas generi kondutajn rezultojn, ilia utileco en modelado de genetike kompleksaj kaj kondutaj neŭropsikiatriaj malsanoj estas nuntempe limigita.
La transplantado de hCO en sendifektan vivantan cerbon povas superi ĉi tiujn limigojn. Antaŭaj studoj montris, ke homaj neŭronoj transplantitaj en la ronĝulan kortekson kapablas pluvivi, projekcii kaj komuniki kun ronĝulaj ĉeloj7,8,9,10,11,12. Tamen, ĉi tiuj eksperimentoj kutime estas faritaj sur plenkreskaj bestoj, kio povas limigi sinaptan kaj aksonan integriĝon. Ĉi tie, ni priskribas transplantan paradigmon, en kiu ni transplantis 3D hCO derivitan de hiPS-ĉeloj en la primaran somatosensoran kortekson (S1) de imunodeficientaj ratoj en frua stadio de plasta disvolviĝo. Transplantitaj hCO (t-hCO) neŭronoj spertas grandan maturiĝon, ricevas talamokortikajn kaj kortik-kortikajn enigojn, kiuj elvokas sensajn respondojn, kaj etendas aksonajn projekciojn en la ratan cerbon por instigi rekompenc-serĉan konduton. Plilongigita maturiĝo de t-hCO rivelis neŭronajn difektojn en pacientoj kun Timoteo-sindromo (TS), severa genetika malsano kaŭzita de mutacioj en la tensi-sentema L-tipa CaV1.2 kalcia kanalo (kodita de CACNA1C).
Por studi homajn kortikajn neŭronojn en cirkvitoj in vivo, ni stereotakse transplantis sendifektan 3D hCO en S1 de fruaj postnaskaj atimiaj ratoj (tagoj 3-7 postnaske) (Fig. 1a kaj plilongigitaj datumoj de Fig. 1a-c). Ĉe tiu punkto, la talamokortikaj kaj kortikokortikaj aksonaj projekcioj ankoraŭ ne kompletigis sian S1-nervizadon (ref. 13). Tial, ĉi tiu aliro estas desegnita por maksimumigi la integriĝon de t-hCO, minimumigante la efikon sur endogenaj cirkvitoj. Por bildigi la lokon de t-hCO en vivaj bestoj, ni faris T2-pezitajn MRI-cerbajn rekonstruojn de ratoj 2-3 monatojn post transplantado (Fig. 1b kaj plilongigitaj datumoj, Fig. 1d). t-hCO₃ estis facile observitaj kaj volumenaj mezuradoj de t-hCO₃ estis similaj al tiuj kalkulitaj el fiksitaj tranĉaĵoj (Etenditaj Datumoj Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO₃ estis facile observitaj kaj volumenaj mezuradoj de t-hCO₃ estis similaj al tiuj kalkulitaj el fiksitaj tranĉaĵoj (Etenditaj Datumoj Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксины фикси (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO₃ estis facile observitaj, kaj volumetraj t-hCO₃ mezuradoj estis similaj al tiuj kalkulitaj por fiksitaj sekcioj (vastigitaj datumoj, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксернызово (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO₃ estis facile observebla, kaj volumetraj t-hCO₃ mezuroj estis similaj al tiuj kalkulitaj por fiksitaj sekcioj (vastigitaj datumoj, Fig. 1d, e; P > 0,05).Ni determinis t-hCO₃ en 81% de transplantitaj bestoj proksimume 2 monatojn post transplantado (n = 72 bestoj; hCO₃ el 10 hiPS-ĉellinioj; hiPS-ĉellinioj en Aldona Tabelo 1). El ĉi tiuj, 87% troviĝis en la kortekso (Fig. 1c). Per seriaj MRI-skanadoj je pluraj tempopunktoj en la sama transplantita rato, ni trovis naŭ-oblan pliiĝon en la volumeno de t-hCO₃ ene de 3 monatoj (Fig. 1d kaj plivastigitaj datumoj, Fig. 1f). Transplantitaj bestoj havis altan supervivoprocenton (74%) 12 monatojn post-transplantado (plivastigitaj datumoj, Fig. 1g kaj Aldona Tabelo 2), kaj neniuj evidentaj motoraj aŭ memordifektoj, gliozo, aŭ elektroencefalogramo (EEG) estis trovitaj. Datumoj Fig. 1g kaj aldona tabelo 2). 1h–m kaj 3e).
a, Skemo de eksperimenta dezajno. hCO derivita de hiPS-ĉeloj estis transplantita en S1 de novnaskitaj nudaj ratoj je tagoj 30-60 de diferenciĝo. b, T2-pezbalancitaj koronaj kaj horizontalaj MR-bildoj montrantaj t-hCO en S1 2 monatojn post transplantado. Skalbreto, 2 mm. c, Kvantigo de sukcesprocentoj de enplantiĝo montritaj por ĉiu hiPS-ĉellinio (n = 108, nombroj ene de stangoj indikas kvanton de t-hCO por hIPS-ĉellinio) kaj korteksa aŭ subkorteksa loko (n = 88). d, MR-bildo de koronaria arterio (maldekstre; skalbreto, 3 mm) kaj koresponda 3D volumetra rekonstruo (skalbreto, 3 mm) montranta pliiĝon de t-hCO dum 3 monatoj. e, Revizio de t-hCO-padronoj en rata cerba kortekso. Skalbreto, 1 mm. f, Reprezentaj imunocitokemiaj bildoj de t-hCO montritaj de supre maldekstre dekstren (dum diferenciĝo): PPP1R17 (4 monatojn aĝa), NeuN (8 monatojn aĝa), SOX9 kaj GFAP (8 monatojn aĝaj), PDGFRα; (8 monatoj), MAP2 (8 monatoj) kaj IBA1 (8 monatoj). Skalbreto, 20 µm. Kunesprimo de HNA indikas ĉelojn de homa origino. g, snRNA-sekvenco: Unuigita multnombra kaj projekcia (UMAP) dimensieca redukta bildigo de ĉiuj altkvalitaj t-hCO-nukleoj post Seurat-integriĝo (n=3 t-hCO-specimenoj, n=2 hiPS-ĉellinioj). Astrocitoj, ĉeloj de la astrocita linio; cyc prog, cirkulantaj prapatroj; GluN DL, profundaj glutamatergaj neŭronoj; GluN DL/SP, profundaj kaj sublamelaj glutamatergaj neŭronoj; GluN UL, supratavolaj glutamatergaj neŭronoj; oligodendrocitoj, oligodendrocitoj; OPC, oligodendrocitaj praĉeloj; RELN, rilinaj neŭronoj. h, Gene Ontology (GO) termino-riĉiganalizo de genoj signife suprenreguligitaj (adaptita P < 0.05, faldoŝanĝo > 2, esprimitaj en almenaŭ 10% de nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj. h, Gene Ontology (GO) termino-riĉiganalizo de genoj signife suprenreguligitaj (adaptita P < 0.05, faldoŝanĝo > 2, esprimitaj en almenaŭ 10% de nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по снира глутаматергическими нейронами hCO. h, analizo de riĉigo per Gena Ontologio (GO) por genoj kun signifa aktivigo (adaptita P<0.05, ŝanĝo de faldo >2, esprimo en almenaŭ 10% da nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 后 ， ， ， p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсрусспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергимичергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергимичергических нейронах Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, genoj estis signife suprenreguligitaj (adaptita P < 0.05, faldoŝanĝo > 2, esprimitaj en almenaŭ 10% de nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj. Ontologia (GO) analizo de la riĉigtermino.La punktita linio indikas akv-valoron de 0,05. i, UMAP-bildigo de GluN-ĉeltipoj en t-hCO uzante etikedtransigon de referenca 22 snRNA-sekvencaj plenkreska motorkorteksa datumbazo. CT — kortikotalamaj ĉeloj, ET — ekstercerbaj ĉeloj, IT — internaj telencefalaj ĉeloj, NP — proksima projekcio.
Ni poste taksis la citoarkitekturon kaj ĝeneralan ĉelan konsiston de t-hCO. Antikorpa kolorigo de rataj endotelaj ĉeloj rivelis vaskulariĝon kun t-hCO, dum IBA1-kolorigo rivelis la ĉeeston de rata mikroglio tra la tuta transplantaĵo (Fig. 1f kaj pligrandigitaj datumoj, Fig. 3c,d). Imunokolorigo rivelis homajn nukleajn antigenajn (HNA) pozitivajn ĉelojn kunesprimantajn PPP1R17 (kortikaj praĉeloj), NeuN (neŭronoj), SOX9 kaj GFAP (glio-derivitaj ĉeloj) aŭ PDGFRα (oligodendrocitaj praĉeloj) (Figuro 1f). Por studi la ĉelan konsiston de t-hCO ĉe unuopa ĉela rezolucio, ni efektivigis unu-kernan RNA-sekvencadon (snRNA-sekvencado) post ĉirkaŭ 8 monatoj da diferenciĝo. Amasfiltrado kaj forigo de rataj nukleoj rezultigis 21 500 altkvalitajn homajn mononukleajn mapojn (Fig. 1g kaj pligrandigitaj datumoj, Fig. 4a,b). Esprimpadronoj de tipaj ĉeltipaj indikiloj identigis aretojn de gravaj kortikaj ĉelklasoj, inkluzive de profundaj kaj supraĵaj glutamatergaj neŭronoj, cirkulantaj praĉeloj, oligodendrocitoj kaj astrocita stirpo (Fig. 1g, plilongigitaj datumoj, Fig. 4c kaj Aldona Tabelo 3). Imunokolorigo por SATB2 kaj CTIP2 montris, ke malgraŭ la ĉeesto de kortikaj subtipoj, t-hCO ne montris klaran anatomian tavoliĝon (plilongigitaj datumoj, Fig. 3a). Stadi-kongrua snRNA-sekvencado hCO produktis larĝe similajn ĉelklasojn, kun kelkaj esceptoj, inkluzive de la foresto de oligodendrocitoj kaj la ĉeesto de GABAergaj neŭronoj, kiuj povas reflekti la antaŭe raportitajn favorajn in vitro kondiĉojn por lateralaj praĉeloj15 (plilongigitaj datumoj, Fig. 4f-i kaj Aldona Tabelo 4). Analizo de diferenciga genekspresio rivelis signifajn diferencojn en glutamatergaj neŭronoj inter t-hCO kaj hCO (Aldona Tabelo 5), inkluzive de aktivigo de aroj de genoj asociitaj kun neŭrona maturiĝo kiel sinapta signalado, dendrita lokalizo kaj tensi-dependa kanala aktiveco (Figuro 1h kaj Aldona Tabelo 5). tabelo 6). Sekve, kortikaj glutamatergaj t-hCO-neŭronoj montris akcelitan transkripcian maturiĝon.
Por klarigi ĉu ĉi tiuj transkripciaj ŝanĝoj en t-hCO rilatas al morfologiaj diferencoj inter hCO in vitro kaj t-hCO in vivo, ni rekonstruis stadio-kongruajn biocitino-plenajn hCO kaj hCO en akutaj sekcioj post 7-8 monatoj da diferenciĝo. hCO-neŭronoj (Fig. 2a). t-hCO-neŭronoj estis signife pli grandaj, havis 1.5-oblan soman diametron, duoble pli da dendritoj, kaj entute sesoblan pliiĝon en totala dendrita longo kompare kun in vitro hCO (Fig. 2b). Krome, ni observis signife pli altan densecon de dendritaj spinoj en t-hCO-neŭronoj ol en hCO-neŭronoj (Fig. 2c). Ĉi tio sugestas, ke t-hCO-neŭronoj spertas ampleksan dendritan plilongigon kaj branĉiĝon, kiu, kombine kun daŭra ĉelmultobliĝo, povas kontribui al la intensa kresko de t-hCO post transplantado (Fig. 1d kaj Etenditaj Datumoj Fig. 1f). Ĉi tio instigis nin esplori la elektrofiziologiajn ecojn. La membrana kapacitanco estis ok fojojn pli alta (vastigitaj datumoj, Fig. 8d), la ripozstata membrana potencialo estis pli hiperpolarigita (ĉirkaŭ 20 mV), kaj kurenta injekto induktis pli altan maksimuman ekscitoftecon en t-hCO-neŭronoj ol en hCO-neŭronoj in vitro (Fig. 2d), e), kio kongruas kun la pli grandaj kaj pli kompleksaj morfologiaj trajtoj de t-hCO. Krome, la ofteco de spontaneaj ekscitaj postsinapsaj kurentaj eventoj (EPSC) estis signife pli alta en t-hCO-neŭronoj (Fig. 2f), sugestante, ke la pliigita denseco de dendritaj spinoj observita en t-hCO-neŭronoj estis asociita kun funkcia ekscitebleco en seksa sinapso. Ni konfirmis la nematuran karakteron de hCO-neŭronoj in vitro per registrado de etikeditaj glutamatergaj neŭronoj (vastigitaj datumoj, Fig. 6a-c).
a, 3D rekonstruo de biocitino-plenaj hCO3 kaj t-hCO3 neŭronoj post 8 monatoj da diferenciĝo. b, Kvantigo de morfologiaj trajtoj (n = 8 hCO-neŭronoj, n = 6 t-hCO-neŭronoj; **P = 0,0084, *P = 0,0179 kaj ***P < 0,0001). b, Kvantigo de morfologiaj trajtoj (n = 8 hCO-neŭronoj, n = 6 t-hCO-neŭronoj; **P = 0,0084, *P = 0,0179 kaj ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; = ** 080, 080, 000 нейронов t-hCO); *** P <0,0001). b, kvantigo de morfologiaj trajtoj (n=8 hCO-neŭronoj, n=6 t-hCO-neŭronoj; **P=0,0084, *P=0,0179, kaj ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.01*** 元，*P = <90 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.01*** 元，*P = <90 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; = ** 080, 080, 000 нейронов t-hCO); *** P <0,0001). b, kvantigo de morfologiaj trajtoj (n=8 hCO-neŭronoj, n=6 t-hCO-neŭronoj; **P=0,0084, *P=0,0179, kaj ***P<0,0001).c, 3D rekonstruo de hCO₃ kaj t-hCO₃ dendritaj branĉoj post 8 monatoj da diferenciĝo. Ruĝaj asteriskoj indikas supozeblajn dendritajn spinojn. Kvantigo de la denseco de la dendrita spino (n = 8 hCO₃ neŭronoj, n = 6 t-hCO₃ neŭronoj; **P = 0,0092). d, Kvantigo de la ripozmembrana potencialo (n = 25 hCO₃-neŭronoj, n = 16 t-hCO₃-neŭronoj; ***P < 0,0001). d, Kvantigo de la ripozmembrana potencialo (n = 25 hCO₃-neŭronoj, n = 16 t-hCO₃-neŭronoj; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO,00*** P). d, kvantigo de ripozmembrana potencialo (n = 25 hCO₃-neŭronoj, n = 16 t-hCO₃-neŭronoj; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO,00*** P). d, kvantigo de ripozmembrana potencialo (n = 25 hCO₃-neŭronoj, n = 16 t-hCO₃-neŭronoj; ***P < 0,0001). e, Ripetema agpotenciala ekbruligo en hCO₃ kaj t-hCO₃ induktita per kreskantaj kurentaj injektoj, kaj kvantigo de la maksimuma ekbruliga ofteco (n = 25 hCO₃ neŭronoj, n = 16 t-hCO₃ neŭronoj; ***P < 0,0001). e, Ripetema agpotenciala ekbruligo en hCO₃ kaj t-hCO₃ induktita per kreskantaj kurentaj injektoj, kaj kvantigo de la maksimuma ekbruliga ofteco (n = 25 hCO₃ neŭronoj, n = 16 t-hCO₃ neŭronoj; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количением тока, и кнествия в hCO и t-hCO максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reekfunkciigo de agpotencialo en hCO₃ kaj t-hCO₃ induktita per pliiĝo de kurento kaj kvantigo de maksimuma pafrapideco (n = 25 hCO₃ neŭronoj, n = 16 t-hCO₃ neŭronoj; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电大放电率率率动作电位放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 最 大 大 缈 （  （ 重复个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-10,000в *** P-10,000в ***). e, ripetema pafado de hCO₃ kaj t-hCO₃ agopotencialoj induktitaj de pliigita kurentoprovizo kaj kvantigo de maksimuma pafrapideco (n = 25 hCO₃ neŭronoj, n = 16 t-hCO₃ neŭronoj; *** P < 0,0001). f, Spontaneaj EPSC-oj (sEPSC-oj) en hCO- kaj t-hCO-neŭronoj je 8 monatoj da diferenciĝo, kaj kvantigo de la ofteco de sinaptaj eventoj (n = 25 hCO-neŭronoj, n = 17 t-hCO-neŭronoj; ***P < 0,0001). f, Spontaneaj EPSC-oj (sEPSC-oj) en hCO- kaj t-hCO-neŭronoj je 8 monatoj da diferenciĝo, kaj kvantigo de la ofteco de sinaptaj eventoj (n = 25 hCO-neŭronoj, n = 17 t-hCO-neŭronoj; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествечная количественая количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontaneaj EPSC-oj (sEPSC-oj) en hCO- kaj t-hCO-neŭronoj je 8 monatoj da diferenciĝo kaj kvantigo de sinaptaj okazaĵaj oftecoj (n = 25 hCO-neŭronoj, n = 17 t-hCO-neŭronoj; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCoj (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCoj神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCoj (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCoj神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествечная количественая количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontaneaj EPSC-oj (sEPSC-oj) en hCO- kaj t-hCO-neŭronoj je 8 monatoj da diferenciĝo kaj kvantigo de sinaptaj okazaĵfrekvencoj (n = 25 hCO-neŭronoj, n = 17 t-hCO-neŭronoj; *** P<0,0001).Por bf, hCO3 kaj t-hCO3 en linio 1208-2 estis prenitaj el la sama diferenciga aro konservita paralele. g, Analizo de gena aro-riĉigo (unuflanka preciza testo de Fisher) de genoj signife suprenreguligitaj (adaptita P < 0.05, faldoŝanĝo > 2, esprimitaj en almenaŭ 10% de nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj kun genaroj de kaj fru-respondaj (ERG) kaj malfru-respondaj (LRG) agad-dependaj genoj identigitaj de en viva musstudo16 kaj hom-specifaj LRG-oj de en vitraj neŭronoj17. g, Analizo de gena aro-riĉigo (unuflanka preciza testo de Fisher) de genoj signife suprenreguligitaj (adaptita P < 0.05, faldoŝanĝo > 2, esprimitaj en almenaŭ 10% de nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj kun genaroj de kaj fru-respondaj (ERG) kaj malfru-respondaj (LRG) agad-dependaj genoj identigitaj de en viva musstudo16 kaj hom-specifaj LRG-oj de en vitraj neŭronoj17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со знатьчитей (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядетерь в гадетерь) нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированнысфицированнысах вованнысни в мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analizo de genara riĉigo (unuvosta preciza testo de Fisher) de genoj kun signifa aktivigo (adaptita P<0.05, faldoŝanĝo >2, esprimo en almenaŭ 10% de nukleoj) en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronaj aroj de kaj fruaj (ERG) kaj malfruaj (LRG) agad-dependaj genoj identigitaj en en vivaj musoj16 kaj hom-specifaj LRG-oj de neŭronoj en vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异悀性LRGむ g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 神经 元 渴 元 比<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （分析 （分析 （分析 （单侾（单） 核中 表达）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 基因组 16 和 神 神 17中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутамч глутамч нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обоногащ гниогаще (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO-glutamatergaj neŭronoj estis signife suprenreguligitaj kompare kun hCO-glutamatergaj neŭronoj (adaptita P<0.05, faldoŝanĝo >2, almenaŭ 10%. Analizo de frua respondo (ERG) kaj malfrua respondo-gena riĉigo (unuvosta preciza testo de Fisher) per respondaktiveco-dependaj genoj (LRG-oj) identigitaj en en vivaj musoj16 kaj en vitraj neŭronoj.17 Homaj specifaj LRG-oj.La punktita linio indikas Bonferroni-korektitan P-valoron de 0.05. h, GluN-genekspresio (pseŭdo-pakaĵo kaj skalado de ĉiu geno) estis signife suprenreguligita en snRNA-sekvencaj kopioj de LRG-genoj en t-hCO-glutamatergaj neŭronoj. i, imunokolorigo montranta SCG2-esprimon en t-hCO (supra) kaj hCO (malsupra) neŭronoj. Blankaj sagoj montras al SCG2+ ĉeloj. Skalbreto, 25 µm. Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± norma devio.
Surbaze de la pliigita aktiveco de t-hCO observita en eks-vivaj tranĉaĵoj, snRNA-sekvencado rivelis aktivec-dependan suprenreguligon de genaj transskribaĵoj en t-hCO kompare kun hCO in vitro. Glutamatergaj t-hCO-neŭronoj esprimis pli altajn nivelojn de genoj reguligantaj malfruan respondaktivecon (Fig. 2g,h), kiuj estis trovitaj en antaŭaj studoj en musaj kaj homaj neŭronoj16,17. Ekzemple, BDNF18, SCG2, kaj OSTN, primat-specifa aktivec-reguliganta geno, montris pliigitan esprimon en t-hCO-neŭronoj kompare kun hCO-neŭronoj (Fig. 2g-i). Tiel, t-hCO-neŭronoj montris plibonigitajn maturiĝajn karakterizaĵojn kompare kun hCO-neŭronoj per transskribaj, morfologiaj kaj funkciaj analizoj.
Por plue taksi la asocion de t-hCO-maturiĝo kun homa cerba disvolviĝo, ni faris transkriptoman komparojn de fetaj kaj plenkreskaj kortikaj ĉeltipoj19,20 kaj plenkreskaj21,22, same kiel ampleksajn datumojn pri kortikala gena esprimo23 dum disvolviĝo (vastigitaj datumoj, Fig. 5). ). kun antaŭa laboro24, la tutmonda hCO kaj t-hCO-transkriptoma maturiĝa stato je 7-8 monatoj da diferenciĝo estas larĝe kongrua kun la disvolviĝa tempo en vivo kaj estas plej ekvivalenta al malfrua feta vivo (Vastigitaj Datumoj Fig. 5a). Rimarkinde, ni observis pliigitan transkriptoman maturecon en t-hCO kompare kun aĝ-kongrua hCO, same kiel transkriptoman aktivigon asociitan kun sinaptogenezo, astrogenezo kaj mieliniĝo (vastigitaj datumoj, Fig. 5b-d). Je la ĉela nivelo, ni trovis signojn de pli maldika korteksa subtipo en t-hCO, kun aretoj de glutamatergaj neŭronoj interkovrantaj kun plenkreskaj L2/3, L5 kaj L6 neŭronaj subtipoj (Figuro 1i). Kontraste, la interkovro de aretoj inter glutamatergaj t-hCO-neŭronoj kaj fetalaj kortikaj neŭronoj estis pli limigita meze de gravedeco (vastigitaj datumoj, Figuro 5e-j). Por determini ĉu t-hCO-neŭronoj estas funkcie similaj al homaj postnaskaj neokortikaj neŭronoj, ni faris elektrofiziologiajn registradojn kaj anatomiajn rekonstruojn de homaj L2/3 piramidaj neŭronoj en akraj sekcioj de la homa postnaska kortekso (vastigitaj datumoj, Fig. 7a). La elektrofiziologiaj ecoj de L2/3 piramidaj neŭronoj estis similaj al tiuj de t-hCO-piramidaj neŭronoj (vastigitaj datumoj, Fig. 7e). Morfologie, L2/3-neŭronoj el postnaskaj homaj specimenoj estis pli similaj al t-hCO ol al hCO, kvankam L2/3-ĉeloj estis pli longaj, enhavis pli da branĉoj entute, kaj havis pli altan spinan densecon (Fig. 3g kaj vastigitaj datumoj, Fig. 7b-). G).
a, transplantado de hCO produktita de kontrolaj kaj TS hiPS ĉellinioj en novnaskitajn ratojn. b, 3D rekonstruo de biocitino-plenaj t-hCO neŭronoj post 8 monatoj da diferenciĝo. c, kvantigo de meza dendrita longo (n = 19 kontrolaj neŭronoj, n = 21 TS-neŭronoj; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruitaj dendritaj branĉoj el kontrolo kaj TS t-hCO3 je 8 monatoj da diferenciĝo, kaj kvantigo de dendrita spindenseco (n = 16 kontrolneŭronoj, n = 21 TS-neŭronoj, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruitaj dendritaj branĉoj el kontrolo kaj TS t-hCO3 je 8 monatoj da diferenciĝo, kaj kvantigo de dendrita spindenseco (n = 16 kontrolneŭronoj, n = 21 TS-neŭronoj, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцев дифференциро вскоинца оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D rekonstruo de dendritaj branĉoj el kontrolo kaj t-hCO3 TS je 8 monatoj da diferenciĝo kaj kvantigo de dendrita spina denseco (n = 16 kontrolneŭronoj, n = 21 TS-neŭronoj, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = 16（n个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 密度 量度 匸  分支 分支神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцирововей контроля и и стровения оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D rekonstruo de kontrolaj dendritaj branĉoj kaj TS t-hCO3 je 8 monatoj da diferenciĝo kaj kvantigo de dendrita spinodenseco (n = 16 kontrolaj neŭronoj, n = 21 TS-neŭronoj, ***P < 0,0001).Ruĝaj asteriskoj indikas supozeblajn dendritajn spinojn. e, spontaneaj EPSC-oj en kontrolaj kaj TS t-hCO-neŭronoj post 8 monatoj da diferenciĝo. f, akumula frekvenca grafikaĵo kaj kvantigo de frekvenco kaj amplitudo de sinaptaj eventoj (n = 32 kontrolaj neŭronoj, n = 26 TS-neŭronoj; **P = 0,0076 kaj P = 0,8102). g, Scholl-analizo de TS kaj kontrolaj neŭronoj en hCO kaj t-hCO. Punktetitaj linioj montras homajn L2/3 postnaskajn piramidajn neŭronojn por komparo (n = 24 kontrolaj t-hCO-neŭronoj, n = 21 TS t-hCO-neŭronoj, n = 8 kontrolaj hCO-neŭronoj, kaj n = 7 TS hCO-neŭronoj). Datumoj estas esprimitaj kiel la meznombro ± norma devio.
La kapablo de t-hCO reprodukti la morfologiajn kaj funkciajn trajtojn de homaj korteksaj neŭronoj je alta nivelo instigis nin esplori ĉu t-hCO povus esti uzata por detekti malsanfenotipojn. Ni fokusiĝis al TS, severa neŭrodisvolviĝa malsano kaŭzita de gajno-de-funkciaj mutacioj en la geno kiu kodas CaV1.2, kiu iniciatas agad-dependan genan transskribon en neŭronoj. Ni akiris hCO de tri TS-pacientoj portantaj la plej oftan anstataŭigon (p.G406R) kaj tri kontroloj (Fig. 3a). Post transplantado, ni trovis, ke dendrita morfologio estis ŝanĝita en TS-neŭronoj kompare kun kontroloj (Fig. 3b kaj plivastigitaj datumoj, Fig. 8a,b), kun duobla pliiĝo en la nombro de primaraj dendritoj kaj ĝenerala pliiĝo en meza kaj ĝenerala malpliiĝo en dendrita longo (Fig. 3c kaj plivastigitaj datumoj, Fig. 8c). Ĉi tio estis asociita kun pliigita denseco de spinoj kaj pliigita ofteco de spontaneaj EPSC-oj en TS kompare kun kontrolneŭronoj (Fig. 3d-f kaj plivastigitaj datumoj, Fig. 8g). Plia analizo rivelis ŝablonojn de nenormala dendrita branĉiĝo en t-hCO TS kompare kun kontroloj, sed ne en in vitro TS hCO en simila stadio de diferenciĝo (Fig. 3g). Ĉi tio kongruas kun niaj antaŭaj raportoj pri aktivec-dependa dendrita ŝrumpiĝo en TS kaj elstarigas la kapablon de ĉi tiu transplanta platformo detekti malsanfenotipojn in vivo.
Ni poste demandis, kiomgrade t-hCO-ĉeloj estas funkcie integritaj en ratan S1. S1 en ronĝuloj ricevas fortajn sinaptajn enigojn de la ipsilateraj ventraj bazaj kaj malantaŭaj talamaj nukleoj, same kiel de la ipsilateraj motoraj kaj sekundaraj somatosensoraj korteksoj, kaj kontraŭlatera S1 (Fig. 4a). Por restarigi la nervizado-padronon, ni infektis hCO per rabia viruso-dG-GFP/AAV-G kaj transplantis hCO en S1-raton 3 tagojn poste. Ni observis densan GFP-esprimon en neŭronoj de la ipsilateraj S1 kaj ventraj bazaj ganglioj 7-14 tagojn post transplantado (Fig. 4b, c). Krome, antikorpa kolorigo de la talama markilo netrin G1 rivelis la ĉeeston de talamaj finaĵoj en t-hCO (Fig. 4d, e). Por taksi ĉu ĉi tiuj aferentaj projekcioj povus elvoki sinaptajn respondojn en t-hCO-ĉeloj, ni faris tutajn ĉelregistradojn de homaj ĉeloj en akraj sekcioj de la talamokortika tavolo. Elektra stimulo de rata S1, interna kapsulo, blanka substanco, fibroj proksime de t-hCO aŭ optogenetika aktivigo de opsino-esprimantaj talamaj finaĵoj en t-hCO induktis mallong-latencajn EPSC-ojn en t-hCO-neŭronoj eksponitaj al la AMPA-receptora antagonisto NBQX. (Fig. 4f, g kaj etenditaj datumoj, Fig. 9a-g). Ĉi tiuj datumoj montras, ke t-hCO estas anatomie integrita en la ratan cerbon kaj povas esti aktivigita per la gastiga histo de la rata.
a, Skemata diagramo de eksperimento pri rabiospurado. b, GFP kaj hom-specifa STEM121-esprimo inter t-hCO kaj rata cerba kortekso (supra panelo). Ankaŭ montrita estas GFP-esprimo en la ipsilatera ventra baza nukleo (VB) (malsupra maldekstre) kaj ipsilatera S1 (malsupra dekstre) de la rato. Skalbreto, 50 µm. La ruĝaj kvadratoj reprezentas la areojn de la cerbo, kie la bildoj estis prenitaj. c, kvantigo de ĉeloj esprimantaj GFP (n = 4 ratoj). d, e — Netrin G1+ talamaj terminaloj en t-hCO. d montras koronan sekcon enhavantan t-hCO kaj VB-nukleojn. Skalbreto, 2 mm. e montras Netrin G1 kaj STEM121-esprimon en t-hCO (maldekstre) kaj VB (dekstre) neŭronoj. Skalbreto, 50 µm. La oranĝkolora punktita linio indikas la t-hCO-limon. f, g, Aktualaj spuroj de t-hCO-neŭronoj post elektra stimulo en S1-rato (f) aŭ interna kapsulo (g), kun (viola) aŭ sen (nigra) NBQX (maldekstre). EPSC-amplitudoj kun kaj sen NBQX (n = 6 S1-neŭronoj, *P = 0,0119; kaj n = 6 internaj kapsulaj neŭronoj, **P = 0,0022) (centre). Procento de t-hCO-neŭronoj montrantaj EPSC en respondo al elektra stimulo de rata S1 (f) aŭ interna kapsulo (g) (dekstre). aCSF, artefarita cerbo-spina likvaĵo. h, skema diagramo de la 2P-bildiga eksperimento (maldekstre). Esprimo de GCaMP6-oj en t-hCO (meze). Skalbreto, 100 µm. Fluoreska tempointervalo de GCaMP6-oj (dekstre). i, Z-poentaro de spontanea aktiveca fluoresko. j, skema ilustraĵo de liphara stimulo. k, z-poentitaj 2P fluoreskaj trajektorioj en unu provo, akordigitaj kun la devio de la lipharoj je tempo nulo (strekita linio) en ekzemplaj ĉeloj. l, populaci-averaĝitaj z-poentaj respondoj de ĉiuj ĉeloj akordigitaj kun la devio de la lipharoj je tempo nulo (strekita linio) (ruĝa) aŭ hazarde generitaj tempstampoj (griza). m. Skema diagramo de la eksperimento pri optika markado. n, Krudaj tensiaj kurboj de ekzempla t-hCO3-ĉelo dum blua lasera stimulo aŭ dekliniĝo de la lipharoj. Ruĝaj sagoj indikas la unuajn pikilojn kaŭzitajn de lumo (supre) aŭ kaŭzitajn de dekliniĝo de la lipharoj (malsupre). Griza haĉado indikas periodojn de dekliniĝo de la lipharoj. o, Pintaj lumondformoj kaj respondoj al dekliniĝo de la lipharoj. p, pikiloj de ununura provo, akordigitaj kun la devio de la lipharoj en la ĉeloj de la ekzemplo. 0 indikas deviiĝon de la lipharoj (strekita linio). q, populaci-averaĝita z-poentara pafofteco por ĉiuj fotosentemaj ĉeloj, akordigita kun la devio de la lipharoj je tempo nulo (strekita linio) (ruĝa) aŭ hazarde generitaj tempstampoj (griza). r, Proporcio de fotosentemaj unuoj signife modulitaj per liphara devio (n = 3 ratoj) (maldekstre). Pinta z-poentara latenteco (n = 3 ratoj; n = 5 (helverda), n = 4 (malhelverda), kaj n = 4 (ciankolora) lipharaj deviomodulaj unuoj por rato) (dekstre). Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± norma devio
Ni poste demandis ĉu t-hCO povus esti aktivigita per sensaj stimuloj in vivo. Ni transplantis hCO esprimantan la genetike ĉifritajn kalciajn indikilojn GCaMP6 en S1-ratojn. Post 150 tagoj, ni faris fibrofotometrion aŭ du-fotonan kalcian bildigon (Fig. 4h kaj plivastigitaj datumoj, Fig. 10a). Ni trovis, ke t-hCO-ĉeloj montris sinkronigitan ritman agadon (Figuro 4i, Plivastigitaj datumoj, Figuro 10b kaj Aldona Vidbendo 1). Por karakterizi pintan t-hCO-agadon, ni faris eksterĉelajn elektrofiziologiajn registradojn en narkotitaj transplantitaj ratoj (plivastigitaj datumoj, Fig. 10c-f). Ni generis stereotaksiajn koordinatojn el MRI-bildoj; tiel, ĉi tiuj registritaj unuoj reprezentas supozeblajn homajn neŭronojn, kvankam elektrofiziologio sole ne permesas determini specion de origino. Ni observis sinkronigitajn ekbrilojn de agado (plivastigitaj datumoj, Fig. 10d). La eksplodoj daŭris ĉirkaŭ 460 ms kaj estis apartigitaj per silentoperiodoj de ĉirkaŭ 2 sekundoj (vastigitaj datumoj, Fig. 10d, e). Individuaj unuoj pafis averaĝe ĉirkaŭ tri kuglojn po eksplodo, kio estas proksimume 73% de registritaj unuoj po eksplodo. La aktivecoj de individuaj unuoj estis tre korelaciitaj, kaj ĉi tiuj korelacioj estis pli altaj ol tiuj de unuoj identigitaj en nevakcinitaj bestoj registritaj sub la samaj kondiĉoj (vastigitaj datumoj, Fig. 10f). Por plue karakterizi la pikilajn respondojn de identigitaj hom-derivitaj neŭronoj, ni faris lum-etikedajn eksperimentojn sur narkotitaj ratoj transplantitaj per hCO3 esprimanta la lumsenteman katjonan kanalon rodopsino 2 (hChR2), tra kiu t-hCO3-neŭronoj havas mallong-latentan rekonon (malpli ol 10 ms) en respondo al bluaj lumstimuloj (Fig. 4m-o). t-hCO-neŭronoj montris eksplodojn de spontanea aktiveco je frekvencoj similaj al tiuj observitaj en kalcia bildigo, same kiel elektrofiziologiaj registradoj faritaj en t-hCO sen lummarkado (vastigitaj datumoj, Fig. 10c-g). Neniu spontanea aktiveco estis observita en la respondaj stadioj de hCO registrita in vitro. Por taksi ĉu t-hCO povus esti aktivigita per sensaj stimuloj, ni nelonge deviigis la ratajn lipharojn for de t-hCO (Fig. 4j,m kaj vastigitaj datumoj, Fig. 10h,k). Laŭ antaŭaj studoj8,10, subaro de t-hCO-ĉeloj montris pliigitan aktivecon en respondo al liphara dekliniĝo, kio ne estis observita kiam la datumoj estis komparitaj kun hazardaj temposignoj (Fig. 4k-q kaj vastigitaj datumoj, Fig. 10h-q). Efektive, ĉirkaŭ 54% de la opto-markitaj unuopaj unuoj montris signife pliigitan vekiĝoftecon post liphara stimulo, pintante je ĉirkaŭ 650 ms (Fig. 4r). Kune, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke t-hCO ricevas taŭgajn funkciajn enigaĵojn kaj povas esti aktivigita per mediaj stimuloj.
Ni poste esploris ĉu t-hCO povus aktivigi cirkvitojn en ratoj por kontroli konduton. Ni unue esploris ĉu la aksonoj de t-hCO-neŭronoj projekcias en la ĉirkaŭajn histojn de la rato. Ni infektis hCO per lentiviruso kodanta hChR2 kunfanditan al EYFP (hChR2-EYFP). Post 110 tagoj, ni observis EYFP-esprimon en ipsilateraj kortikaj regionoj, inkluzive de la aŭdaj, motoraj kaj somatosensaj korteksoj, same kiel en subkortikaj regionoj, inkluzive de la striato, hipokampo kaj talamo (Fig. 5a). Por taksi ĉu ĉi tiuj eferentaj projekcioj povus elvoki sinaptajn respondojn en rataj ĉeloj, ni optike aktivigis t-hCO-ĉelojn esprimantajn hChR2-EYFP per registrado de rataj cerbokorteksaj ĉeloj en akraj cerbaj sekcioj. Aktivigo de t-hCO-aksonoj per blua lumo induktis mallong-latencajn EPSC-ojn en piramidaj korteksaj neŭronoj de ratoj, kiuj estis blokitaj de NBQX (Fig. 5b-g). Krome, ĉi tiuj respondoj povus esti blokitaj per tetrodotoksino (TTX) kaj restarigitaj per 4-aminopiridino (4-AP), sugestante ke ili estis kaŭzitaj de monosinaptaj konektoj (Fig. 5e).
a, Skemo de aksona spurado (maldekstre). t-hCO EYFP-esprimo (dekstre). Skalbreto, 100 µm. A1, aŭda kortekso, ACC, antaŭa cingulkortekso, d. striato, dorsa striato, HPC, hipokampo; Diafragmo, laterala septo, mPFC, mediala prealfronta kortekso, piri-muskolo, piriforma kortekso, v. striato, ventra striato, VPM, ventropostomediala nukleo de la talamo, VTA, ventra tegmentala regiono. La ruĝaj kvadratoj reprezentas la areojn de la cerbo, kie la bildoj estis prenitaj. b, Skemo de la stimula eksperimento. c, d, Ekzemploj de la respondo de blua lumo-induktita fotofluo (supre) kaj tensio (malsupre) en homaj (c) EYFP+ t-hCO aŭ rataj (d) EYFP-ĉeloj. e, f, Aktualaj spuroj de rataj neŭronoj post blua lumstimulo de t-hCO-aksonoj kun TTX kaj 4-AR (verda), TTX (griza) aŭ aCSF (nigra) (e), kun (viola) aŭ sen (nigra)) ) NBQX (e). g, latenteco de respondoj induktitaj de blua lumo en rataj ĉeloj (n = 16 ĉeloj); horizontalaj stangoj indikas mezan latentecon (7,13 ms) (maldekstre). Amplitudo de lum-elvokitaj EPSC-oj registritaj kun aŭ sen NBQX (n = 7 ĉeloj; ***P < 0,0001) (meze). Amplitudo de lum-elvokitaj EPSC-oj registritaj kun aŭ sen NBQX (n = 7 ĉeloj; ***P < 0,0001) (meze). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Amplitudo de lum-induktitaj EPSC-oj registritaj kun aŭ sen NBQX (n = 7 ĉeloj; ***P < 0,0001) (centre).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Amplitudo de lum-induktitaj EPSC-oj registritaj kun aŭ sen NBQX (n = 7 ĉeloj; ***P < 0,0001) (centre).Procento de rataj ĉeloj montrantaj EPSC-ojn, kiuj respondas al blua lumo (dekstre). h, Skemo de kondutisma tasko. d0, tago 0. i. Elfaro de ekzemplaj bestoj en tago 1 (maldekstre) aŭ tago 15 (dekstre) de trejnado. La averaĝa nombro da lekado-manieroj faritaj en la unua tago (maldekstre) aŭ la 15-a tago (dekstre centre) (n = 150 provoj per blua lumo, n = 150 provoj per ruĝa lumo; ***P < 0,0001). La averaĝa nombro da lekado-manieroj faritaj en la unua tago (maldekstre) aŭ la 15-a tago (dekstre centre) (n = 150 provoj per blua lumo, n = 150 provoj per ruĝa lumo; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре спра 150 (в центре справа150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Meza nombro da lekadoj faritaj en tago 1 (maldekstre) aŭ tago 15 (centre dekstre) (n = 150 blulumaj provoj, n = 150 ruĝalumaj provoj; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре спра 150 (в центре справа150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Meza nombro da lekadoj faritaj en tago 1 (maldekstre) aŭ tago 15 (centre dekstre) (n = 150 blulumaj provoj, n = 150 ruĝalumaj provoj; ***P < 0,0001).Akumulaj lekadoj por ruĝaj kaj bluaj lumprovoj en tago 1 (meze maldekstre) aŭ tago 15 (dekstre). NS, ne signifa. j,k, Kondutaj karakterizaĵoj de ĉiuj bestoj transplantitaj kun t-hCO esprimanta hChR2-EYFP (j) aŭ kontrola fluoroforo (k) en tago 1 aŭ 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ratoj, ** P = 0,0049; kontrolo: n = 9, P = 0,1497). l, Evoluo de preferpoentaro (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolo; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evoluo de preferpoentaro (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolo; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluo de preferpoentaro (n = 9 hChR2, n = 9 kontroloj; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluo de preferpoentaroj (n = 9 hChR2, n = 9 kontroloj; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-esprimo en respondo al optogenetika aktivigo de t-hCO en S1. Bildoj de FOS-esprimo (maldekstre), kaj kvantigo (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 kaj ***P < 0,001) (dekstre) estas montritaj. Bildoj de FOS-esprimo (maldekstre), kaj kvantigo (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 kaj ***P < 0,001) (dekstre) estas montritaj. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, * P<0,0 5, ** P<0,0 5, ** P<0,0 ; <0,001) (справа). Bildoj de FOS-esprimo (maldekstre) kaj kvantigo (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01, kaj ***P<0,001) estas montritaj (dekstre).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, * P<0,0 5, ** P<0,0 5, ** P<0,0 ; <0,001) (справа). Bildoj de FOS-esprimo (maldekstre) kaj kvantigo (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01, kaj ***P<0,001) estas montritaj (dekstre).Skalbreto, 100 µm. Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± norma eraro de BLA, bazolaterala tonsilo, MDT, dorsomediala talama nukleo, PAG, periakvedukta grizo.
Fine, ni demandis ĉu t-hCO povus moduli ratan konduton. Por testi tion, ni transplantis hChR2-EYFP-esprimantan hCO en S1, kaj 90 tagojn poste, ni implantis optikajn fibrojn en t-hCO por lumliverado. Ni tiam trejnis la ratojn per modifita operanta kondiĉiga paradigmo (Fig. 5h). Ni metis la bestojn en kondutan testĉambron kaj hazarde aplikis 5-sekundajn bluajn (473 nm) kaj ruĝajn (635 nm) laserajn stimulojn. Bestoj ricevis akvan rekompencon se ili lekis dum blua lumstimulo sed ne lekis dum ruĝlumstimulo. En la unua tago de trejnado, la bestoj montris neniun diferencon en lekado kiam stimulitaj per blua aŭ ruĝa lumo. Tamen, en la 15-a tago, bestoj transplantitaj kun hCO esprimanta hChR2-EYFP montris pli aktivan lekadon kiam stimulitaj per blua lumo kompare kun ruĝlumstimulo. Ĉi tiuj ŝanĝoj en lekada konduto ne estis observitaj en kontrolbestoj transplantitaj kun hCO esprimanta la kontrolfluoroforon (lernada sukcesprocento: hChR2 89%, EYFP 0%, Figuro 5i-1 kaj Aldona Vidbendo 2). Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke t-hCO-ĉeloj povas aktivigi ratajn neŭronojn por stimuli rekompenc-serĉan konduton. Por ekscii, kiuj rataj t-hCO-neŭralaj cirkvitoj eble estas implikitaj en ĉi tiuj kondutaj ŝanĝoj, ni optogenetike aktivigis t-hCO en trejnitaj bestoj kaj rikoltis histojn 90 minutojn poste. Imunohistokemio rivelis esprimon de la agad-dependa FOS-proteino en pluraj cerbaj regionoj implikitaj en motivita konduto, inkluzive de la mediala prealfronta kortekso, mediala talamo kaj periakvedukta griza substanco, kiu estis esprimita aŭ en nestimulitaj kontrolbestoj aŭ en bestoj. rizo. 5m). Kune, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke t-hCO povas moduli ratan neŭronan agadon por stiri konduton.
Neŭralaj organoidoj reprezentas promesplenan sistemon por studi homan disvolviĝon kaj malsanojn in vitro, sed ili estas limigitaj pro la manko de konektoj inter cirkvitoj, kiuj ekzistas in vivo. Ni evoluigis novan platformon, en kiu ni transplantis hCO en S1 de imunokompromititaj fruaj postnaskaj ratoj por studi homajn ĉeldisvolviĝon kaj funkcion in vivo. Ni montris, ke t-hCO evoluigas maturajn ĉeltipojn ne observitajn in vitro28 kaj ke t-hCO estas anatomie kaj funkcie integrita en la cerbon de ronĝuloj. La integrado de t-hCO en neŭralajn cirkvitojn de ronĝuloj permesis al ni establi ligon inter homa ĉela aktiveco kaj studita besta konduto, montrante, ke t-hCO-neŭronoj povas moduli ratan neŭronan aktivecon por stimuli kondutajn respondojn.
La platformo, kiun ni priskribas, havas plurajn avantaĝojn super antaŭaj esploroj pri transplantado de homaj ĉeloj en ronĝulajn cerbojn. Unue, ni transplantis hCO3 en la evoluantan kortekson de fruaj postnaskaj ratoj, kio povus faciligi anatomian kaj funkcian integriĝon. Due, t-hCO3 MRI-monitorado permesis al ni studi la pozicion kaj kreskon de greftaĵoj en vivaj bestoj, permesante al ni fari longdaŭrajn plurbestajn studojn kaj establi la fidindecon de pluraj hiPS-ĉellinioj. Fine, ni transplantis sendifektajn organoidojn, anstataŭ izolitajn unuopajn ĉelsuspendojn, kiuj estas malpli detruaj al homaj ĉeloj kaj povas antaŭenigi la integriĝon kaj generadon de homaj korteksaj neŭronoj en ratcerboj.
Ni agnoskas, ke malgraŭ progresoj en ĉi tiu platformo, tempaj, spacaj kaj interspeciaj limigoj malhelpas la formadon de homaj neŭraj cirkvitoj kun alta fideleco, eĉ post transplantado en frua stadio de disvolviĝo. Ekzemple, ne estas klare ĉu la spontanea aktiveco observita en t-hCO reprezentas disvolviĝan fenotipon similan al la ritma aktiveco observita dum kortika disvolviĝo, aŭ ĉu ĝi ŝuldiĝas al la foresto de subpremaj ĉeltipoj ĉeestantaj en t-hCO. Simile, ne estas klare kiomgrade la foresto de lameniĝo en t-hCO influas ĉenkonektecon30. Estonta laboro temigos pri integrado de aliaj ĉeltipoj kiel homa mikroglio, homaj endotelaj ĉeloj, kaj ŝanĝiĝantaj proporcioj de GABAergaj interneŭronoj kiel montrite uzante asembleon 6 in vitro, same kiel komprenon pri kiel neŭra integriĝo kaj prilaborado povas okazi en ŝanĝitaj t-hCO-niveloj, transskribaj, sinaptaj kaj kondutaj niveloj en ĉeloj akiritaj de pacientoj.
Ĝenerale, ĉi tiu *in vivo* platformo reprezentas potencan rimedon, kiu povas kompletigi *in vitro* homa cerbo-disvolviĝon kaj malsanesploradon. Ni antaŭvidas, ke ĉi tiu platformo permesos al ni malkovri novajn faden-nivelajn fenotipojn en alie pasemaj pacient-derivitaj ĉeloj kaj testi novajn terapiajn strategiojn.
Ni generis hCO2.5 el HiPS-ĉeloj kiel antaŭe priskribite. Por komenci hCO2-produktadon el hiPS-ĉeloj kultivitaj sur nutraj tavoloj, sendifektaj kolonioj de hiPS-ĉeloj estis forigitaj el kulturpladoj uzante dispazon (0.35 mg/mL) kaj translokigitaj al ultra-malalligaj plastaj kulturoj enhavantaj pladojn kun hiPS-ĉelkulturmedio (Corning) suplementita per du SMAD-inhibiciiloj dorsomorfino (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) kaj SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) kaj ROCK-inhibiciilo Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Dum la unuaj 5 tagoj, la hiPS-ĉelkulturmedio estis ŝanĝita ĉiutage kaj dorsomorfino kaj SB-431542 estis aldonitaj. En la sesa tago en suspendo, neŭraj sferoidoj estis translokigitaj al neŭrala medio enhavanta neŭrobazalon-A (10888, Life Technologies), B-27-suplementon sen vitamino A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilinon kaj streptomicinon (1:100, Life Technologies) kaj suplementita per la epiderma kreskofaktoro (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) kaj fibroblasta kreskofaktoro 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ĝis la 24-a tago. De la 25-a ĝis la 42-a tago, la medio estis suplementita per cerbo-derivita neŭrotrofa faktoro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) kaj neŭrotrofino 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) kun mediaj ŝanĝoj ĉiun duan tagon. En la sesa tago en suspendo, neŭraj sferoidoj estis translokigitaj al neŭrala medio enhavanta neŭrobazalon-A (10888, Life Technologies), B-27-suplementon sen vitamino A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilinon kaj streptomicinon (1:100, Life Technologies) kaj suplementita per la epiderma kreskofaktoro (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) kaj fibroblasta kreskofaktoro 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ĝis la 24-a tago. De la 25-a ĝis la 42-a tago, la medio estis suplementita per cerbo-derivita neŭrotrofa faktoro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) kaj neŭrotrofino 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) kun mediaj ŝanĝoj ĉiun duan tagon.En la sesa tago en suspendo, la neŭraj sferoidoj estis translokigitaj al neŭrala medio enhavanta Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-aldonaĵon sen vitamino A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilinon.kaj стрептомицин (1:100, Life Technologies) kaj дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) kaj фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. kaj streptomicino (1:100, Life Technologies) kaj kompletigita per epiderma kreskofaktoro (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) kaj fibroblasta kreskofaktoro 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) ĝis la 24-a tago.De la 25a ĝis la 42a tagoj, cerbo-derivita neŭrotrofa faktoro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) kaj neŭrotrofino 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) estis aldonitaj al la kultivmedio, ŝanĝante la medion ĉiun duan tagon.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉1素的神经培养基中和链霉（1000（Life:1000 Teknologioj）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 的 皴 的 皴 a b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链 ， 100 （ Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链 ，10 Teknologioj） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； R&D Sistemoj） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Sistemoj）直至穬㬀24凤 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы (Vivo Technologies), На 6-й день В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, (1:1000, Life Technologies) добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) kaj фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Je la 6-a tago, la suspendoj de neŭrosferoj estis ŝanĝitaj al suplemento enhavanta neŭrobazalon-A (10888, Life Technologies), B-27 suplementon sen vitamino A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin-neŭtraligitan streptomicinon (1:100, Life Technologies) suplementitan per epiderma kreskofaktoro (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) kaj fibroblasta kreskofaktoro 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) до 24-го дня. R&D Systems) ĝis la 24-a tago.De la 25a ĝis la 42a tagoj, cerbo-derivita neŭrotrofa faktoro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) kaj neŭrotrofa faktoro 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) estis aldonitaj al la kulturmedio ĉiun duan tagon. La medio ŝanĝiĝu unufoje.Ekde la 43-a tago, hCO₃ estis konservita en nesuplementita neŭrobazala-A medio (NM; 1088022, Thermo Fisher) kun ŝanĝo de medio ĉiujn 4-6 tagojn. Por akiri hCO₃ el hiPS-ĉeloj kultivitaj sub sennutrilaj kondiĉoj, hiPS-ĉeloj estis inkubaciitaj kun Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) je 37°C dum 7 minutoj, disigitaj en unuopajn ĉelojn, kaj plantitaj sur AggreWell 800-platoj (34815, STEMCELL Technologies) je denseco de 3 × 10⁶ unuopaj ĉeloj po puto en Essential 8 medio suplementita per la ROCK-inhibitoro Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Post 24 horoj, la medioj en la putoj estis pipetataj supren kaj malsupren en mediojn enhavantajn Essential 6 medion (A1516401, Life Technologies) kompletigitan per dorsomorfino (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) kaj SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). De la 2a ĝis la 6a tago, Essential 6 medio estis anstataŭigita ĉiutage per dorsomorfino kaj suplemento SB-431542. Ekde la sesa tago, la neŭrosferaj suspendoj estis translokigitaj al la neŭrobaza medio kaj konservitaj kiel priskribite supre.
Ĉiuj bestaj proceduroj estis plenumitaj laŭ la gvidlinioj pri bestoprizorgo aprobitaj de la Administra Komitato pri Laboratoria Bestoprizorgo (APLAC) de Universitato Stanford. Gravedaj eutimaj RNU (rnu/+) ratoj estis aĉetitaj (Charles River Laboratories) aŭ loĝigitaj. La bestoj estis tenataj laŭ 12-hora lum-malluma ciklo kun manĝaĵo kaj akvo laŭvole. Nudaj (FOXN1–/–) ratidoj en aĝo de tri ĝis sep tagoj estis identigitaj per la kresko de nematuraj lipharoj antaŭ buĉado. Hundidoj (masklaj kaj inaj) estis narkotitaj per 2-3% izoflurano kaj metitaj sur stereotaksian kadron. Trepanado de la kranio kun diametro de proksimume 2-3 mm super S1 estis plenumita, konservante la integrecon de la duramatro. Poste uzu 30-G-pinglon (proksimume 0.3 mm) tuj ekster la kraniotomio por trapiki la duramatron. Poste apliku HCO3 al maldika 3×3 cm parafilmo kaj forigu troan medion. Uzante Hamilton-injektilon alkroĉitan al 23 G, 45°-pinglo, milde tiru hCO3 en la plej distalan finon de la pinglo. Poste instalu la injektilon sur la injektilpumpilon konektitan al la stereotaksa aparato. Poste metu la pinton de la pinglo super antaŭe faritan 0,3 mm larĝan piktruon en la duramatro (z = 0 mm) kaj mallarĝigu la injektilon je 1-2 mm (z = proksimume –1,5 mm) ĝis la pinglo estas inter la duramatro A. Densa sigelo formiĝas. Poste levu la injektilon al la centro de la kortikala surfaco je z = -0,5 mm kaj injektu hCO3 je rapideco de 1-2 µl minute. Post kompletigo de la hCO3-injekto, la pinglo estas retirita je rapideco de 0,2-0,5 mm minute, la haŭto estas suturita, kaj la hundido estas tuj metita sur varman varmigkusenon ĝis kompleta resaniĝo. Kelkaj bestoj estis transplantitaj duflanke.
Ĉiuj bestaj proceduroj estis faritaj laŭ la gvidlinioj pri besta prizorgo aprobitaj de Universitato Stanford, APLAC. Ratoj (pli ol 60 tagojn post transplantado) estis induktitaj per 5% izoflurana anestezo kaj narkotitaj per 1-3% izoflurana dum bildigo. Por bildigo, oni uzis 7-Teslan aktive ŝirmitan horizontalan bortruoskanilon Bruker (Bruker Corp.) kun gradienta transmisio de International Electric Company (IECO), ŝirmitan gradientan enigaĵon kun interna diametro de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) uzante AVANCE.III, ok-kanalan mult-bobenan RF kaj mult-kernajn kapablojn, kaj la akompanan platformon Paravision 6.0.1. Registrado estis farita uzante aktive malkuplitan volumetran RF-bobenon kun interna diametro de 86 mm kaj kvar-kanalan krio-malvarmigitan RF-bobenon nur por ricevo. Aksa 2D Turbo-RARE (ripettempo = 2500 ms, eĥotempo = 33 ms, 2 averaĝoj) kun 16 tranĉaĵkaptoj, tranĉaĵdikeco 0,6–0,8 mm, enhavanta 256 × 256 specimenojn. La signaloj estis ricevitaj uzante kvadraturan sendilon-ricevilon volumetran RF-bobenon kun interna diametro de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Fine, uzu la enkonstruitajn Imaris (BitPlane) surfacajn ŝatatajn funkciojn por 3D-bildigo kaj volumenanalizo. Sukcesa transplantaĵo estis difinita kiel tiu, en kiu areoj de kontinua T2-pezbalancita MR-signalo formiĝis en la transplantita hemisfero. Greftmalakcepto estis difinita kiel transplantaĵo, kiu ne produktis areojn de kontinua T2-pezbalancita MR-signalo en la transplantita hemisfero. Subkortikala t-hCO estis ekskludita de posta analizo.
Por stabile esprimi GCaMP6s en hCO3 por du-fotona kalcia bildigo, hiPS-ĉeloj estis infektitaj per pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro sekvata de elekto de antibiotikoj. Mallonge, la ĉeloj estis disigitaj per EDTA kaj suspenditaj en 1 ml da Essential 8-medio je denseco de proksimume 300 000 ĉeloj en la ĉeesto de polibreno (5 μg/ml) kaj 15 μl da viruso. La ĉeloj estis poste kovitaj en suspendo dum 60 minutoj kaj semitaj je denseco de 50 000 ĉeloj po puto. Post konfluenco, la ĉeloj estis traktitaj per 5-10 μg ml-1 puromicino dum 5-10 tagoj aŭ ĝis stabilaj kolonioj aperis. Akuta hCO3-infekto estis plenumita kiel antaŭe priskribite5 kun kelkaj modifoj. Mallonge, translokigu la tagon 30-45 de hCO3 en 1,5 ml Eppendorf-mikrocentrifugilajn tubojn enhavantajn 100 µl da nerva medio. Poste, proksimume 90 µl da la medio estas forigitaj, 3-6 µl da alt-titra lentiviruso (de 0,5 x 108 ĝis 1,2 x 109) estas aldonita al la tubo, kaj la hCO3 estas translokigita al la inkubatoro dum 30 minutoj. Poste aldonu 90-100 µl da medio al ĉiu tubo kaj revenu la tubojn al la inkubatoro dum la nokto. La sekvan tagon, translokigu hCO3 al freŝa nerva medio en malalt-alligaj platoj. Post 7 tagoj, hCO3 estis translokigita al 24-putaj vitrofundaj platoj por bildigo kaj taksado de la infektokvalito. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE kaj pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE estis generitaj per VectorBuilder. Lentiviruso estas uzata en la plej multaj eksperimentoj ĉar ĝi estas integrita en la gastigan genaron, permesante esprimon de raportista geno en infektitaj ĉellinioj. Por sekvado de rabio, tagoj 30-45 hCO estis kuninfektita per rabio-ΔG-eGFP kaj AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmido #67528, Addgene), lavita plene dum 3 tagoj, kaj transplantita en ratojn en S1 kaj konservita en vivo dum 7-14 tagoj.
Por imunocitokemio, bestoj estis narkotitaj kaj transkardie perfuzitaj per PBS sekvata de 4% paraformaldehido (PFA en PBS; Electron Microscopy Sciences). Cerboj estis fiksitaj en 4% PFA dum 2 horoj aŭ dumnokte je 4°C, kriokonservitaj en 30% sakarozo en PBS dum 48-72 horoj, kaj enigitaj en 1:1, 30% sakarozo: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) kaj koronaj sekcoj estis faritaj je 30 µm uzante kriostaton (Leica). Por imunohistokemio de dikaj sekcoj, bestoj estis perfuzitaj per PBS, kaj la cerbo estis dissekcita kaj korone sekcita je 300-400 µm uzante vibratomon (Leica) kaj la sekcioj estis fiksitaj per 4% PFA dum 30 minutoj. Poste kriosekcioj aŭ dikaj sekcioj estis lavitaj per PBS, blokitaj dum 1 horo je ĉambra temperaturo (10% normala azena serumo (NDS) kaj 0.3% Triton X-100 diluita en PBS) kaj blokitaj per blokanta solvaĵo je 4 °C. – Inkubacio Kriosekcioj estis inkubaciitaj dumnokte kaj dikaj sekcioj estis inkubaciitaj dum 5 tagoj. Primaraj uzitaj antikorpoj estis: kontraŭ-NeuN (muso, 1:500; ab104224, abcam) kontraŭ-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), kontraŭ-GFAP (kuniklo, 1:1,000; Z0334, Dako), kontraŭ-GFP (kokido, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), kontraŭ-HNA (muso, 1:200; ab191181, abcam), kontraŭ-NeuN (kuniklo, 1:500; ABN78, Millipore), kontraŭ-PDGFRA (kuniklo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), kontraŭ-PPP1R17 (kuniklo, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), kontraŭ-RECA-1 (muso, 1:50; ab9774, abcam), kontraŭ-SCG2 (kuniklo, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), kontraŭ-SOX9 (kapro, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kapro, 1:100; AF1166, R&D Systems), kontraŭ-STEM121 (muso, 1:200; Y40410, Takara Bio), kontraŭ-SATB2 (muso, 1:50; ab51502, abcam), kontraŭ-GAD65/67 (kuniklo, 1:400; ABN904, Millipore) kaj kontraŭ-IBA1 (kapro, 1:100; ab5076, abcam). Primaraj uzitaj antikorpoj estis: kontraŭ-NeuN (muso, 1:500; ab104224, abcam) kontraŭ-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), kontraŭ-GFAP (kuniklo, 1:1,000; Z0334, Dako), kontraŭ-GFP (kokido, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), kontraŭ-HNA (muso, 1:200; ab191181, abcam), kontraŭ-NeuN (kuniklo, 1:500; ABN78, Millipore), kontraŭ-PDGFRA (kuniklo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), kontraŭ-PPP1R17 (kuniklo, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), kontraŭ-RECA-1 (muso, 1:50; ab9774, abcam), kontraŭ-SCG2 (kuniklo, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), kontraŭ-SOX9 (kapro, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kapro, 1:100; AF1166, R&D Systems), kontraŭ-STEM121 (muso, 1:200; Y40410, Takara Bio), kontraŭ-SATB2 (muso, 1:50; ab51502, abcam), kontraŭ-GAD65/67 (kuniklo, 1:400; ABN904, Millipore) kaj kontraŭ-IBA1 (kapro, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:с130 (мышиные, 1:500); ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (, м,11шь0 (,181шь, 1:1000); abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab9775ь, ab97:5ь, ab97:5ь; анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз1060, козий, 6, 1160), 1:1160 анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1 :100; абббака, абб5076, ). La primaraj uzitaj antikorpoj estis: kontraŭ-NeuN (muso, 1:500; ab104224, abcam), kontraŭ-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), kontraŭ-GFAP (kuniklo, 1:1000; Z0334, Dako), kontraŭ-GFP (kokido, 1:1000; GTX13970, GeneTex), kontraŭ-HNA (muso, 1:200; ab191181, abcam), kontraŭ-NeuN (kuniklo, 1:500; ABN78, Millipore), kontraŭ-PDGFRA (kuniklo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), kontraŭ-PPP1R17 (kuniklo, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), kontraŭ-RECA-1 (muso, 1:50;). ab9774, abcam), kontraŭ-SCG2 (kuniklo, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), kontraŭ-SOX9 (kapro, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kapro, 1:100; AF1166, R&D Systems), kontraŭ-STEM121 (muso, 1:200; Y40410, Takara Bio), kontraŭ-SATB2 (muso, 1:50; ab51502, abcam), kontraŭ-GAD65/67 (kuniklo, 1:400; ABN904, Millipore) kaj kontraŭ-IBA1 (kapro, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlaso抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:10106；AF3075，R&D Systems） Sistemoj），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）（抗HNA（小鼠（1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlaso抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Protetech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:106；AF306；R&D Systems） Sistemoj）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), kontraŭ-SATB2 (muso, 1:50; ab51502, abcam), kontraŭ-GAD65/67 (kuniklo, 1:400; ABN904, Millipore) kaj kontraŭ-IBA1 (kapro, 1:100; ab5076, abcam).La primaraj uzitaj antikorpoj estis: kontraŭ-NeuN (muso, 1:500; ab104224, abcam), kontraŭ-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), kontraŭ-GFAP (kuniklo, 1:1000; Z0334, Dako). , kontraŭ-GFP (kokido, 1:1000; GTX13970, GeneTex), kontraŭ-HNA (muso, 1:200; ab191181, abcam), kontraŭ-NeuN (kuniklo, 1:500; ABN78, Millipore), kontraŭ-PDGFRA (kuniklo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), kontraŭ-PPP1R17 (kuniklo, 1:200; HPA047819, Atlas-antikorpo), kontraŭ-RECA-1 (muso, 1:50; ab9774, abcam), kontraŭ-SCG2 (kuniklo), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти (мы12ь, мы12ь -STEM,; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1, к1700, кролик, 1:400; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), kontraŭ-SOX9 (kapro, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kapro, 1:100; AF1166, R&D Systems), kontraŭ-STEM121 (muso, 1:200; Y40410, Takara Bio), kontraŭ-SATB2 (muso, 1:50; ab51502, abcam), kontraŭ-GAD65/67 (kuniklo, 1:400; ABN904, Millipore), kaj kontraŭ-IBA1 (kapro, 1:100; ab5076, abkam).La sekcioj estis poste lavitaj per PBS kaj inkubaciitaj kun sekundara antikorpo dum 1 horo je ĉambra temperaturo (frostaj sekcioj) aŭ dumnokte je 4°C (dikaj sekcioj). Sekundara antikorpo Alexa Fluor (Life Technologies) diluita 1:1000 en blokanta solvaĵo estis uzata. Post lavado per PBS, la nukleoj estis bildigitaj per Hoechst 33258 (Life Technologies). Fine, la vitraĵoj estis metitaj sur mikroskopon kun kovrovitroj (Fisher Scientific) uzante Aquamount (Polysciences) kaj analizitaj per Keyence fluoreska mikroskopo (BZ-X analizilo) aŭ Leica TCS SP8 konfokusa mikroskopo (Las-X) sur la bildo. La bildoj estis prilaboritaj per la programo ImageJ (Fiji). Por kvantigi la proporcion de homaj neŭronoj en t-hCO3 kaj la rata kortekso, 387.5 μm larĝaj rektangulaj bildoj estis prenitaj en la centro de la t-hCO3, ĉe aŭ proksime al la rando de la rata kortekso. La marĝenoj de la transplantaĵo estis determinitaj per taksado de ŝanĝoj en la travidebleco de histo, HNA+-nukleoj, kaj/aŭ la ĉeesto de aŭtofluoreskeco de histo. En ĉiu bildo, la tuta nombro de NeuN+ kaj HNA+-ĉeloj estis dividita per la tuta nombro de NeuN+-ĉeloj en la sama areo. Por certigi, ke nur ĉeloj kun nukleoj en la bildebeno estas kalkulitaj, nur ĉeloj, kiuj ankaŭ estas Hoechst+, estas inkluditaj en la kalkulo. Du bildoj apartigitaj je almenaŭ 1 mm estis averaĝitaj por redukti la statistikan eraron.
Unu semajnon antaŭ la specimenkolektado, metu hCO₃-transplantitajn bestojn (ĉirkaŭ 8 monatojn post diferenciĝo) en malhelan ĉambron kun lipharoj tonditaj por minimumigi sensan stimulon. Izolado de nukleoj estis farita kiel antaŭe priskribite, kun kelkaj modifoj. Mallonge, t-hCO₃ kaj hCO₃ estis detruitaj uzante lesiv-mekanikan ĉellizon kaj 2 ml vitran histomuelilon (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). La krudaj nukleoj estis poste filtritaj uzante 40 µm filtrilon kaj centrifugitaj je 320 g dum 10 minutoj je 4 °C antaŭ ol efektivigi sakarozan densecgradienton. Post la centrifuga paŝo (320 g dum 20 minutoj je 4 °C), la specimenoj estis resuspenditaj en 0.04% BSA/PBS kun aldono de 0.2 unuoj de µl-1 RNase-inhibiciilo (40 u µl-1, AM2682, Ambion) kaj pasigitaj tra 40 µm fluofiltrilo. La disigitaj nukleoj estis poste resuspenditaj en PBS enhavanta 0.02% BSA kaj ŝarĝitaj sur Chromium Single Cell 3′-blaton (laŭtaksa reakiro de 8,000 ĉeloj po leno). snRNA-sekvencaj bibliotekoj estis preparitaj per la Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-sekvencaj bibliotekoj estis preparitaj per la Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single-ĉelo 3′ GEM, Biblioteko & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). La snRNA-sekvencaj bibliotekoj estis preparitaj uzante Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Kromo Ununura ĉelo 3′ GEM、Biblioteko & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Kromo Ununura ĉelo 3′ GEM、Biblioteko & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). La biblioteko de snRNA-sekvencado estis preparita uzante Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bibliotekoj el malsamaj specimenoj estis kunigitaj kaj sekvencitaj de Admera Health sur NovaSeq S4 (Illumina).
Genekspresio-niveloj por ĉiu supozebla nuklea strekkodo estis kvantigitaj uzante la analizan programarpakaĵon 10x Genomics CellRanger (versio 6.1.2). Specife, la legaĵoj estis komparitaj kun kombinaĵo de homaj (GRCh38, Ensemble, versio 98) kaj rataj (Rnor_6.0, Ensemble, versio 100) referencaj genaroj kreitaj per la komando mkref kaj uzante count kun la komando –include-introns=TRUE por kvantigi inkluzivi legaĵoj mapitaj al intronaj regionoj. Por t-hCO-specimenoj, homaj nukleoj estis identigitaj surbaze de la konservativa postulo, ke almenaŭ 95% de ĉiuj mapitaj legaĵoj kongruu kun la homa genaro. Ĉiuj postaj analizoj estis faritaj sur filtrita strekkoda aro eligita de CellRanger uzante la R-pakaĵon (versio 4.1.2) Seurat (versio 4.1.1)32.
Por certigi, ke nur altkvalitaj nukleoj estas inkluzivitaj en la posta analizo, iteracia filtrado estis efektivigita por ĉiu specimeno. Unue, malaltkvalitaj nukleoj kun malpli ol 1000 unikaj genoj trovitaj kaj pli ol 20% de la totalaj mitokondrioj estas identigitaj kaj forigitaj. Poste, la kruda matrico de genoj estis normaligita per regularigita negativa binoma regreso uzante la funkcion sctransform(vst.flavor="v2", kiu ankaŭ identigis la 3000 plej variajn genojn uzante defaŭltajn parametrojn. Dimensioredukto estis farita sur la supraj variaj genoj uzante Analizon de Ĉefaj Komponantoj (PCA) kun defaŭltaj parametroj uzante datumaran dimension de 30 (dims = 30 estis elektita surbaze de vida inspektado de genuolokoj kaj uzita por ĉiuj specimenoj kaj ensemblaj analizoj). Ni tiam plenumis plurajn rondojn de iteracia agregaciado (rezolucio = 1) por klasifiki genojn surbaze de nenormale malalta gennombro (mediano sub la 10a percentilo), nenormale alta mitokondria gennombro (mediano super la 95a percentilo) por identigi kaj forigi supozeblajn ĉelojn de malalta kvalito. Aretoj kaj/aŭ alta proporcio de suspektataj ĝemeloj identigitaj uzante la pakaĵon DoubletFinder33 (meza DoubletFinder-poentaro super la 95a percentilo). t-hCO-specimenoj (n=3) kaj hCO-specimenoj (n=3) estis integritaj aparte uzante la funkcion IntegrateData kun la supraj parametroj. Poste... plia rondo de kvalita filtrado de la integrita datumbazo estis efektivigita kiel priskribite supre.
Post forigo de la malaltkvalitaj kernoj, la integrita datumbazo estis grupigita (rezolucio = 0.5) kaj enigita por UMAP34-bildigaj celoj. Markilaj genoj por ĉiu areto estis determinitaj uzante la funkcion FindMarkers kun defaŭltaj parametroj kalkulitaj el normaligitaj genekspresio-datumoj. Ni identigas kaj klasifikas ĉefajn ĉelklasojn kombinante fetajn kaj plenkreskajn kortikajn referencajn datumbazojn kun markila genesprimo 19,20,21,35 kaj prinotado. Aparte, cirkulantaj antaŭuloj estis identigitaj per la esprimo de MKI67 kaj TOP2A. Praaretoj estis difinitaj per la foresto de mitozaj transskribaĵoj, alta interkovro kun multipotencaj gliaj praaretoj priskribitaj en malfrua metafaza feta kortekso, kaj EGFR kaj OLIG1-esprimo. Ni uzas la terminon astrocito por ampleksi plurajn statojn de astrocita diferenciĝo, de malfrua radiala glio ĝis maturiĝo de astrocitoj. Astrocitaj aretoj esprimas altajn nivelojn de SLC1A3 kaj AQP4 kaj montriĝis mapi kun subtipoj de feta radiala glio kaj/aŭ plenkreskaj astrocitoj. OPC-oj esprimas PDGFRA kaj SOX10, dum oligodendrocitoj esprimas mielinigajn markilojn (MOG kaj MYRF). Glutamatergaj neŭronoj estis identigitaj per la ĉeesto de neŭronaj transskribaĵoj (SYT1 kaj SNAP25), la foresto de GABAergaj markiloj (GAD2), kaj la esprimo de NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, aŭ SATB2. GluN-neŭronoj estis plue dividitaj en suprajn (SATB2-esprimo kaj perdo de BCL11B) kaj profundajn (BCL11B-esprimo) subklasojn. Supozitaj subplato-neŭronoj (SP) esprimas konatajn SP18-markilojn kiel ST18 kaj SORCS1, aldone al profundaj GluN-markiloj. Koroido-plekso-similaj ĉeloj estis identigitaj per TTR-esprimo, kaj meningeo-similaj ĉeloj esprimis fibroblast-asociitajn genojn kaj mapitajn pial/vaskulajn ĉelojn de la referenca datumbazo.
Diferenciala analizo de gena esprimo inter t-hCO kaj hCO-subklasoj estis farita uzante nove evoluigitan pseŭdo-aran metodon reproduktitan en specimenoj efektivigitaj uzante la pakaĵon Libra R (versio 1.0.0). Specife, edgeR log-verŝajnecaj testoj (versio 3.36.0, pakaĵo R) estis faritaj por grupoj sumigante la nombron de genoj en ĉeloj por difinita ĉelklaso por ĉiu specimena replikado. Por varmomapa bildigo, normaligitaj po miliono (CPM) valoroj estas kalkulitaj uzante edgeR (funkcio cpm()) kaj skalitaj (por atingi meznombron = 0, norma devio = 1). Gene Ontology (GO) riĉiga analizo de signife suprenreguligitaj t-hCO GluN-genoj estis farita (Benjamini-Hochberg korektita P-valoro malpli ol 0.05 esprimita en almenaŭ 10% de t-hCO GluN-ĉeloj kaj faldpliiĝo en ŝanĝo de almenaŭ 2-obla). farita uzante ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ni uzas la aplikaĵon ToppFun kun defaŭltaj parametroj kaj raportas Benjamini-Hochberg-korektitajn P-valorojn kalkulitajn el GO-prinotitaj hipergeometriaj testoj.
Por kongruigi niajn snRNA-sekvencajn aretojn kun prinotitaj ĉelaretoj el referencaj studoj de primara unuĉela RNA-sekvenco aŭ plenkreska snRNA-sekvenco19,20,21,22, ni aplikis aliron por integri parigitajn datumbazojn. Ni uzis la normaligan laborfluon SCTransform (v2) en Seurat por integri kaj kompari aretajn interkovrojn inter datumbazoj (uzante la samajn parametrojn kiel supre). Individuaj datumbazoj estis hazarde subarangigitaj ĝis 500 ĉeloj aŭ kernoj por originala areto por komputila efikeco. Uzante similan aliron kiel priskribite antaŭe, areta interkovro estis difinita kiel la proporcio de ĉeloj aŭ nukleoj en ĉiu kunigita areto, kiuj interkovris kun la etikedo de la referenca areto. Por plue klasifiki GluN-ojn, ni uzis la laborfluon TransferData de Seurat por GluN-subaraj datumoj por asigni referencdatumajn etikedojn al niaj GluN-ĉeloj.
Por taksi la maturiĝan staton de la tutmonda transkriptomo de t-hCO kaj hCO-specimenoj, ni komparis niajn pseŭdo-amasajn specimenojn kun BrainSpan/psychENCODE23, kiu konsistas el granda RNA-sekvenco ampleksanta la homan cerban disvolviĝon. Ni plenumis PCA-on sur kombinita padron-normaligita gena esprima matrico el kortikaj specimenoj 10 semajnojn post koncepto kaj poste, en 5567 genoj (kune kun niaj datumoj) kiuj antaŭe estis identigitaj kiel aktivaj en BrainSpan-kortikaj specimenoj (difinitaj kiel pli ol 50% en disvolviĝa varianco klarigita per aĝo uzante kuban modelon)38. Krome, ni derivis genojn asociitajn kun gravaj transkriptomaj signaturoj de neŭrodisvolviĝo uzante nenegativan matrican faktorigon kiel antaŭe priskribite. La specimenaj pezoj kalkulitaj uzante la nenegativan matrican faktorigan proceduron estas grafike prezentitaj en Figuroj 5b kun vastigitaj datumoj por ĉiu el la kvin signaturoj priskribitaj de Zhu et al.38. Denove, aktivec-dependaj transkripciaj markiloj estis derivitaj de antaŭe publikigitaj studoj. Aparte, ERG kaj LRG estis signife suprenreguligitaj en glutamatergaj neŭronoj identigitaj per la musa vidkorteksa snRNA-sekvenca kolekto post vida stimulo el Aldona Tabelo 3 Hrvatin et al.16. Hom-riĉigitaj LRG-oj estis akiritaj el KCl-aktivigitaj homaj fetaj cerbkulturoj kaj rikoltitaj 6 horojn post stimulo, kaj la filtritaj genoj estis signife suprenreguligitaj en homoj sed ne en ronĝuloj (Aldona Tabelo 4). Analizo de genara riĉigo uzante ĉi tiujn genarojn estis farita uzante unudirektan precizan teston de Fisher.
Anestezigu ratojn per izoflurano, forigu la cerbojn kaj metu ilin en malvarman (ĉirkaŭ 4°C) oksigenitan (95% O2 kaj 5% CO2) sakarozan solvaĵon por sekcioj enhavantaj: 234 mM sakarozon, 11 mM glukozon, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 kaj 0.5 mM CaCl2 (ĉirkaŭ 310 mOsm). Koronaj sekcioj de rataj cerboj (300–400 µm) enhavantaj t-hCO estis faritaj uzante Leica VT1200 vibratomon kiel antaŭe priskribite39. Sekcioj estis poste translokigitaj al sekciga ĉambro kun kontinua oksigenado je ĉambra temperaturo enhavanta aCSF preparitan el: 10 mM glukozo, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 kaj 126 mM NaCl (298 mOsm) almenaŭ 45 minutojn antaŭ registrado. Sekcioj estis registritaj en mergita ĉambro, kie ili estis kontinue perfuzitaj per aCSF (95% O2 kaj 5% CO2 fiolo). Ĉiuj datumoj estis registritaj je ĉambra temperaturo. t-hCO-neŭronoj estis finitaj per borosilikata vitra pipeto plenigita per solvaĵo enhavanta 127 mM kalian glukonaton, 8 mM NaCl, 4 mM magnezian ATP, 0.3 mM natrian GTP, 10 mM HEPES, kaj 0.6 mM EGTA, pH 7.2, interna solvaĵo alĝustigita per KOH (290 mOsm). Por resaniĝi, biocitino (0.2%) estis aldonita al la registra solvaĵo.
Datumoj estis akiritaj per amplifilo MultiClamp 700B (Molecular Devices) kaj ciferecigilo Digidata 1550B (Molecular Devices), malalt-pase filtritaj je 2 kHz, ciferecigitaj je 20 kHz, kaj analizitaj per Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). kaj kutimaj MATLAB-funkcioj (Mathworks). La krucvoja potencialo estis kalkulita per JPCalc kaj la enigoj estis adaptitaj al la kalkulita valoro de -14 mV. Operacio IV konsistas el serio de nunaj paŝoj en paŝoj de 10-25 pA, de -250 ĝis 750 pA.
La talamo, blanka substanco, kaj S1-aferentoj estis elektre stimulitaj en talamokortikaj tranĉaĵoj dum peceto-fiksa registrado de hCO-neŭronoj, kiel priskribite antaŭe. Mallonge, la cerbo estis metita sur 3D-presilan tablon klinitan je 10° angulo, kaj la fronto de la cerbo estis tranĉita je 35° angulo. La cerbo tiam estis gluita al la tranĉita surfaco kaj sekcita, konservante la talamokortikajn elstarantajn aksonojn. Dupolusaj volframaj elektrodoj (0.5 MΩ) estis muntitaj sur dua mikromanipulilo kaj strategie poziciigitaj por stimuli kvar regionojn po ĉelo (interna kapsulo, blanka substanco, S1 kaj hCO). Registru sinaptajn respondojn post 300 µA faza stimulo je 0.03–0.1 Hz.
hChR2-esprimantaj hCO-neŭronoj estis aktivigitaj je 480 nm kaj lumpulsoj generitaj de LED (Prizmatix) estis aplikitaj tra ×40-objektivo (0.9 NA; Olympus) por registri hChR2-esprimon proksime al la ĉeloj. La diametro de la lumigita kampo estas proksimume 0.5 mm kaj la tuta potenco estas 10-20 mW. La pulslarĝo estis agordita al 10 ms, kio korespondas al la pulso donita dum la kondutisma lernada eksperimento. Diversaj stimulaj frekvencoj estis uzitaj, de 1 ĝis 20 Hz, sed nur la unua pulso de la serio estis uzita por kvantigo. La intervaloj inter trajnoj estas kutime pli longaj ol 30 s por minimumigi la efikon sur sinaptaj inhibiciaj aŭ faciligaj vojoj. Por testi ĉu la hChR2-respondo estis monosinapsa, ni aplikis TTX (1 μM) al la bano ĝis la EPSC-reakcio malaperis, kaj poste aplikis 4-aminopiridinon (4-AP; 100 μM). Tipe, respondo estas redonata ene de kelkaj minutoj, kun iomete pli longa prokrasto inter LED-ekbruligo kaj EPSC-generado. NBQX (10 μM) estis uzata por testi ĉu la respondo estas pelita de AMPA-receptoroj.
Akraj hCO-sekcioj estis kreitaj kiel antaŭe priskribite. Mallonge, hCO-sekcioj estis enmetitaj en 4%-agarozon kaj transdonitaj al ĉeloj enhavantaj 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 kaj 10 mM d-(+)-glukozon. Sekcioj estis tranĉitaj je 200–300 µm je ĉambra temperaturo uzante Leica VT1200-vibrilon kaj konservitaj en ASF je ĉambra temperaturo. Poste, peceto-kampa registrado de tutaj ĉeloj estis farita sur hCO-sekcioj sub rekta SliceScope-mikroskopo (Scientifica). Sekcioj estis perfuzitaj per aCSF (95% O2 kaj 5% CO2) kaj ĉelaj signaloj estis registritaj je ĉambra temperaturo. hCO3-neŭronoj estis aplikitaj uzante borosilikatan vitran pipeton plenigitan per solvaĵo enhavanta 127 mM kalian glukonaton, 8 mM NaCl, 4 mM magnezian ATP, 0.3 mM natrian GTP, 10 mM HEPES, kaj 0.6 mM EGTA, interna pH 7, 2, alĝustigita per KOH (osmolareco 290). Por reakiraj celoj, aldonu 0.2% Biocitinon al la interna solvaĵo.
Datumoj estis akiritaj per Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) uzante MultiClamp 700B-amplifilon (Molecular Devices) kaj Digidata 1550B-ciferecigilon (Molecular Devices), malalt-pase filtritaj je 2 kHz, ciferecigitaj je 20 kHz, kaj analizitaj per Clampfit (versio 10.6) por analizo, molekulaj aparatoj) kaj kutimaj MATLAB-funkcioj (MATLAB 2019b, Mathworks). La krucvoja potencialo estis kalkulita per JPCalc kaj la enigoj estis adaptitaj al la kalkulita krucvoja potencialo de -14 mV. Operacio IV konsistas el serio de kurentaj paŝoj en 5-10 pA-paŝoj de -50 ĝis 250 pA.
Por morfologia rekonstruo de pinĉitaj neŭronoj, 0.2% da biocitino (Sigma-Aldrich) estis aldonita al la interna solvaĵo. La ĉeloj estas preparitaj dum almenaŭ 15 minutoj post pinĉado. La pipeto estas poste malrapide enprenita dum 1-2 minutoj ĝis la registrita membrano estas tute sigelita. Sekvante la sekcian fiziologian proceduron, la sekcioj estis fiksitaj dumnokte je 4°C en 4% PFA, lavitaj per PBS X3, kaj diluitaj 1:1000 per streptavidin-konjugita DyLight 549 aŭ DyLight 405 (Vector Labs). Ĉeloj plenigitaj per biocitino (2%; Sigma-Aldrich) estis etikeditaj dum registrado per peceta krampo je ĉambra temperaturo dum 2 horoj. La sekcioj estis poste muntitaj sur mikroskopajn lamelojn uzante Aquamount (Thermo Scientific) kaj bildigitaj la sekvan tagon per Leica TCS SP8 konfokusa mikroskopo uzante olean mergan celon kun numera aperturo ×40 1.3, pligrandigo ×0.9–1.0, xy. La specimeniga ofteco estas proksimume 7 rastrumeroj por mikrometro. Z-stakoj je intervaloj de 1 µm estis akiritaj serie, kaj z-stakaj mozaikoj kaj Leica-bazita aŭtomata kudrado estis faritaj por kovri la tutan dendritan arbon de ĉiu neŭrono. Neŭronoj estis poste spuritaj duonmane uzante la neuTube 40 interfacon kaj SWC-dosieroj estis generitaj. La dosieroj estis poste alŝutitaj al la SimpleNeuriteTracer41 Fiji kromprogramo (ImageJ, versio 2.1.0; NIH).
Homa korteksa histo estis akirita kun informita konsento laŭ protokolo aprobita de la Institucia Revizia Komitato de Universitato Stanford. Du specimenoj de homa postnaska histo (3- kaj 18-jaraĝaj) estis akiritaj per resekco de la fronta kortekso (meza fronta giro) kiel parto de kirurgio por rezistema epilepsio. Post resekco, rikoltu histon en glacimalvarma NMDG-aCSF enhavanta: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukozo, 2 mM tioureo, 5 mM natria askorbato, 3 mM natria piruvato, 0.5 mM CaCl2·4H2O kaj 10 mM MgSO4·7H2O. Titru ĝis pH 7.3-7.4 per koncentrita klorida acido. La histoj estis liveritaj al la laboratorio ene de 30 minutoj kaj koronaj sekcoj estis prenitaj laŭ la proceduro priskribita supre.
Ĉiuj bestaj proceduroj estis faritaj laŭ la gvidlinioj pri besta prizorgo aprobitaj de Universitato Stanford, APLAC. Ratoj (pli ol 140 tagojn post la transplantado) estis induktitaj per 5%-izoflurana anestezo kaj narkotitaj per 1-3%-izoflurana intraoperacie. Bestoj estis metitaj en stereotaksian kadron (Kopf) kaj daŭre liberiga buprenorfino (SR) estis injektita subhaŭte. La kranio estas eksponita, purigita kaj 3-5 ostoŝraŭboj estas enigitaj. Por celi t-hCO3, ni generis stereotaksiajn koordinatojn el MRI-bildoj. Truo estis borita ĉe la interesa loko kaj fibroj (400 µm en diametro, NA 0.48, Doric) estis malaltigitaj 100 µm sub la hCO3-surfaco kaj fiksitaj al la kranio per UV-resanigebla denta cemento (Relyx).
Fibro-fotometriaj registradoj estis faritaj kiel antaŭe priskribite42. Por registri spontanean agadon, ratoj estis metitaj en puran kaĝon kaj 400 µm diametra fibro-optika konektilo-kablo (Doric) konektita al fibro-optika fotometria daten-akira sistemo estis konektita al la enplantita fibro-optika kablo. Dum la 10-minuta registrado de motora agado, la bestoj povis libere esplori la kaĝon. Por registri la elvokitan agadon, ratoj (pli ol 140 tagojn post transplantado) estis narkotitaj per 5% izoflurano por indukto kaj 1-3% izoflurano por bontenado. Metu la beston en stereotaksan kadron (Kopf) kaj la lipharoj sur la kontraŭa flanko de la t-hCO3 estas tonditaj ĝis ĉirkaŭ 2 cm kaj pasigitaj tra reto konektita al piezoelektra aktuatoro (PI). 400 µm fibro-optika konektilo-kablo (Doric) estis konektita al la enplantita fibro kaj konektita al la daten-akira sistemo. La lipharoj sur la kontraŭa flanko de t-hCO3 estis poste deviigitaj 50 fojojn (2 mm je 20 Hz, 2 s por prezento) je hazardaj tempoj per piezoelektra motoro dum 20-minuta registra periodo. Uzu la Arduino MATLAB Support Package por kontroli la deviotempon per kutima MATLAB-kodo. Eventoj estas sinkronigitaj kun la datenakira programaro uzante transistor-transistorajn logikajn (TTL) pulsojn.
Ratoj (pli ol 140 tagojn post la transplantado) estis induktitaj per 5%-izoflurana anestezo kaj narkotitaj per 1-3%-izoflurano intraoperacie. Bestoj estis metitaj en stereotaksian kadron (Kopf) kaj buprenorfino SR kaj deksametazono estis injektitaj subhaŭte. La kranio estas eksponita, purigita kaj 3-5 ostoŝraŭboj estas enigitaj. Por celi t-hCO, ni generis stereotaksiajn koordinatojn el MRI-bildoj. Cirkla kraniotomio (ĉirkaŭ 1 cm en diametro) estis farita per alt-rapida borilo rekte super la transplantita hCO. Post kiam la osto estas kiel eble plej maldika, sed antaŭ ol bori tra la tuta osto, uzu forcepson por forigi la restantan sendifektan pelvan diskon por riveli subestan t-hCO. La kraniotomio estis plenigita per sterila salakvo, kaj kovrovitro kaj speciala kappinglo estis fiksitaj al la kranio per UV-hardita denta cemento (Relyx).
Du-fotona bildigo estis farita per Bruker-multifotona mikroskopo kun Nikon LWD (×16, 0.8 NA) objektivo. GCaMP6-bildigo estis farita je 920 nm kun 1.4x ununura z-ebena pligrandigo kaj 8x averaĝo de 7.5 fps. Ratoj estis induktitaj per 5% izoflurana anestezo kaj konservitaj per 1-3% izoflurana. La ratoj estis metitaj en speciale faritan kapfiksilon kaj poziciigitaj sub la lenso. 3-minuta fona registrado de motora agado estis akirita. Dum 20 minutoj da registrado, 50 blovetoj (ĉiu prezento 100 ms longa) estis hazarde liveritaj al la liphara kuseneto kontraŭ t-hCO3 uzante pikosprezigilon. Uzu la Arduino MATLAB Support Package por kontroli eksplodtempon per speciala MATLAB-kodo. Sinkronigu eventojn kun datenakira programaro (PrairieView 5.5) uzante TTL-pulsojn. Por analizo, la bildoj estis korektitaj por xy-moviĝo uzante afinan korekton en la MoCo-programo lanĉita en Fiĝioj. Ekstraktado de fluoreskaj spuroj el individuaj ĉeloj uzante CNMF-E43. Fluoresko estis ekstraktita por ĉiu regiono de intereso, konvertita al dF/F-kurboj, kaj poste konvertita al z-poentaroj.
Ratoj (pli ol 140 tagojn post-transplantado) estis induktitaj per 5%-izoflurana anestezo kaj narkotitaj per 1-3%-izoflurano intraoperacie. Bestoj estis metitaj en stereotaksian kadron (Kopf) kaj buprenorfino SR kaj deksametazono estis injektitaj subhaŭte. La lipharoj sur la kontraŭa flanko de la t-hCO estis tranĉitaj ĝis ĉirkaŭ 2 cm kaj surfadenigitaj tra reto konektita al piezoelektra aktuatoro. La kranio estas eksponita kaj purigita. Grundŝraŭbo el rustorezista ŝtalo estas fiksita al la kranio. Por celi t-hCO, ni generis stereotaksiajn koordinatojn el MRI-bildoj. Faru cirklan kraniotomion (ĉirkaŭ 1 cm en diametro) per alt-rapida borilo ĝuste super la t-hCO. Post kiam la osto estas kiel eble plej maldika, sed antaŭ ol bori tra la tuta osto, uzu forcepson por forigi la restantan sendifektan pelvan diskon por riveli subestan t-hCO. Individuaj ĉeloj estis registritaj uzante 32-kanalajn aŭ 64-kanalajn alt-densecajn siliciajn sondilojn (Cambridge Neurotech) terkonektitajn al terŝraŭboj kaj antaŭ-ampligitajn per RHD-amplifiloj (Intan). Uzu la manipulilon por mallevi la elektrodojn al la cela loko tra la kraniotomio, kiu estas plenigita per sterila salakvo. Datenkolektado estis farita je frekvenco de 30 kHz uzante la daten-akiran sistemon Open Ephys. La registrado daŭris nur kiam ni detektis tre korelaciitan ritman spontanean agadon en pli ol 10 kanaloj, sugestante, ke la elektrodoj troviĝis en la transplantaĵo (bazite sur du-fotonaj kalciaj bildigaj datumoj). 10-minuta fona registrado de motora agado estis akirita. La lipharoj sur la kontraŭa flanko de t-hCO3 estis poste deviigitaj 50 fojojn (2 mm je 20 Hz, 2 s por prezento) hazarde per piezoelektra motoro dum 20-minuta registra periodo. Uzante la MATLAB Support Package por Arduino (MATLAB 2019b), kontrolu la deviotempon per kutima MATLAB-kodo. Uzu TTL-pulsojn por sinkronigi eventojn kun daten-akira programaro.
Por eksperimentoj pri optika markado, 200 µm optika konektilo (Doric) konektita al 473 nm lasero (Omicron) estis konektita al 200 µm optika fibro metita super la kraniotomio. Tuj antaŭ tio, ĝustigu la potencon de la konektilo al 20 mW. Uzu la manipulilon por mallevi la elektrodojn al la cela loko tra la kraniotomio, kiu estas plenigita per sterila salakvo. Komence de la registrado, dek pulsoj de lumo 473 nm (frekvenco 2 Hz, pulsdaŭro 10 ms) estis elsenditaj. Fotosentemaj ĉeloj estis difinitaj kiel ĉeloj, kiuj montris pikilan respondon ene de 10 ms da lumo en 70% aŭ pli da la provoj.