Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu la Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni prezentos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Likva biopsio (LB) estas koncepto, kiu rapide gajnas popularecon en la biomedicina kampo. La koncepto baziĝas ĉefe sur la detekto de fragmentoj de cirkulanta eksterĉela DNA (ccfDNA), kiuj estas ĉefe liberigitaj kiel malgrandaj fragmentoj post ĉelmorto en diversaj histoj. Malgranda proporcio de ĉi tiuj fragmentoj originas de fremdaj (fremdaj) histoj aŭ organismoj. En nuna laboro, ni aplikis ĉi tiun koncepton al musloj, gardostaranta specio konata pro sia alta marakva filtra kapacito. Ni uzas la kapablon de musloj agi kiel naturaj filtriloj por kapti mediajn DNA-fragmentojn el diversaj fontoj por provizi informojn pri la biodiverseco de marbordaj ekosistemoj. Niaj rezultoj montras, ke musla hemolimfo enhavas DNA-fragmentojn, kiuj varias multe laŭ grandeco, de 1 ĝis 5 kb. Sekvencado per ĉaspafilo montris, ke granda nombro da DNA-fragmentoj estas de fremda mikroba origino. Inter ili, ni trovis DNA-fragmentojn de bakterioj, arkeoj kaj virusoj, inkluzive de virusoj konataj infekti diversajn gastigantojn ofte troveblajn en marbordaj maraj ekosistemoj. Konklude, nia studo montras, ke la koncepto de LB aplikita al musloj reprezentas riĉan sed ankoraŭ neesploritan fonton de scio pri mikroba diverseco en maraj marbordaj ekosistemoj.
La efiko de klimata ŝanĝo (KŜ) sur la biodiversecon de maraj ekosistemoj estas rapide kreskanta esplora areo. Tutmonda varmiĝo ne nur kaŭzas gravajn fiziologiajn stresojn, sed ankaŭ puŝas la evoluajn limojn de la termika stabileco de maraj organismoj, influante la vivejon de kelkaj specioj, instigante ilin serĉi pli favorajn kondiĉojn [1, 2]. Aldone al influado de la biodiverseco de metazooj, KŜ interrompas la delikatan ekvilibron de gastiganto-mikrobaj interagoj. Ĉi tiu mikroba disbakteriozo prezentas gravan minacon al maraj ekosistemoj, ĉar ĝi igas marajn organismojn pli sentemaj al infektaj patogenoj [3, 4]. Oni kredas, ke SS ludas gravan rolon en amasaj mortoj, kio estas grava problemo por la administrado de tutmondaj maraj ekosistemoj [5, 6]. Ĉi tio estas grava afero konsiderante la ekonomiajn, ekologiajn kaj nutrajn efikojn de multaj maraj specioj. Ĉi tio estas aparte vera por konkoj vivantaj en la polusaj regionoj, kie la efikoj de KŜ estas pli tujaj kaj severaj [6, 7]. Fakte, konkoj kiel Mytilus spp. estas vaste uzataj por monitori la efikojn de KŜ sur maraj ekosistemoj. Ne surprize, relative granda nombro da biosignoj estis evoluigitaj por monitori ilian sanon, ofte uzante du-nivelan aliron implikantan funkciajn biosignojn bazitajn sur enzima agado aŭ ĉelaj funkcioj kiel ĉela vivebleco kaj fagocita agado [8]. Ĉi tiuj metodoj ankaŭ inkluzivas la mezuradon de la koncentriĝo de specifaj premindikiloj, kiuj akumuliĝas en molaĵoj post la sorbado de grandaj kvantoj da marakvo. Tamen, la alta filtra kapacito kaj duonmalferma kardiovaskula sistemo de konkoj provizas ŝancon evoluigi novajn hemolimfajn biosignojn uzante la koncepton de likva biopsio (LB), simpla kaj minimume invasiva aliro al pacientadministrado. sangospecimenoj [9, 10]. Kvankam pluraj specoj de cirkulantaj molekuloj troveblas en homa LB, ĉi tiu koncepto ĉefe baziĝas sur DNA-sekvenca analizo de cirkulantaj eksterĉelaj DNA-fragmentoj (ccfDNA) en plasmo. Fakte, la ĉeesto de cirkulanta DNA en homa plasmo estas konata ekde la mezo de la 20-a jarcento [11], sed nur en la lastaj jaroj la apero de alt-trairaj sekvencaj metodoj kondukis al klinika diagnozo bazita sur ccfDNA. La ĉeesto de ĉi tiuj cirkulantaj DNA-fragmentoj ŝuldiĝas parte al la pasiva liberigo de genoma DNA (nuklea kaj mitokondria) post ĉelmorto. Ĉe sanaj individuoj, la koncentriĝo de ccfDNA estas normale malalta (<10 ng/mL) sed povas esti pliigita 5-10-oble ĉe pacientoj suferantaj de diversaj patologioj aŭ submetitaj al streso, rezultante en histodamaĝo. Ĉe sanaj individuoj, la koncentriĝo de ccfDNA estas normale malalta (<10 ng/mL) sed povas esti pliigita 5-10-oble ĉe pacientoj suferantaj de diversaj patologioj aŭ submetitaj al streso, rezultante en histodamaĝo. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться вккДНК в норме низкая больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. Ĉe sanaj homoj, la koncentriĝo de cccDNA estas normale malalta (<10 ng/mL), sed ĝi povas pliiĝi 5-10 fojojn ĉe pacientoj kun diversaj patologioj aŭ sub streso, kiu kondukas al histodamaĝo.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致滍炟患者中可增加5-10在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 扅理 或 扅理 或 手中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе-ны 10 увеличены ны пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-koncentriĝoj estas kutime malaltaj (<10 ng/ml) ĉe sanaj individuoj, sed povas esti pliigitaj 5-10-oble ĉe pacientoj kun diversaj patologioj aŭ streso, rezultante en histodamaĝo.La grandeco de ccfDNA-fragmentoj varias multe, sed kutime varias de 150 ĝis 200 bazpunktoj. [12]. Analizo de mem-derivita ccfDNA, t.e., ccfDNA el normalaj aŭ transformitaj gastigaj ĉeloj, povas esti uzata por detekti genetikajn kaj epigenetikajn ŝanĝojn ĉeestantajn en la nuklea kaj/aŭ mitokondria genaro, tiel helpante klinikistojn elekti specifajn molekul-celitajn terapiojn [13]. Tamen, ccfDNA povas esti akirita el fremdaj fontoj kiel ekzemple ccfDNA el fetaj ĉeloj dum gravedeco aŭ el transplantitaj organoj [14,15,16,17]. ccfDNA ankaŭ estas grava fonto de informoj por detekti la ĉeeston de nukleaj acidoj de infekta agento (fremda), kiu permesas ne-invazian detekton de ĝeneraligitaj infektoj ne identigitaj per sangokulturoj, evitante invazian biopsion de infektita histo [18]. Lastatempaj studoj efektive montris, ke homa sango enhavas riĉan fonton de informoj, kiu povas esti uzata por identigi virusajn kaj bakteriajn patogenojn, kaj ke ĉirkaŭ 1% de la ccfDNA trovita en homa plasmo estas de fremda origino [19]. Ĉi tiuj studoj montras, ke la biodiverseco de la cirkulanta mikrobiomo de organismo povas esti taksita per ccfDNA-analizo. Tamen, ĝis antaŭ nelonge, ĉi tiu koncepto estis uzata ekskluzive ĉe homoj kaj, malpligrade, ĉe aliaj vertebruloj [20, 21].
En la nuna artikolo, ni uzas la LB-potencialon por analizi la ccfDNA-on de Aulacomya atra, suda specio ofte trovebla en la subantarktaj Kerguelen-Insuloj, grupo de insuloj sur granda altebenaĵo, kiu formiĝis antaŭ 35 milionoj da jaroj. Uzante in vitro-eksperimentan sistemon, ni trovis, ke DNA-fragmentoj en marakvo estas rapide sorbitaj de musloj kaj eniras la hemolimfan kupeon. Sekvencado per ĉaspafilpafilo montris, ke la ccfDNA-o de la musla hemolimfo enhavas DNA-fragmentojn de sia propra kaj ne-membra origino, inkluzive de simbiozaj bakterioj kaj DNA-fragmentoj el biomoj tipaj por malvarmaj vulkanaj marbordaj ekosistemoj. La ccfDNA-o de la hemolimfo ankaŭ enhavas virussekvencojn derivitajn de virusoj kun malsamaj gastigantaj gamoj. Ni ankaŭ trovis DNA-fragmentojn el multĉelaj bestoj kiel ostaj fiŝoj, maraj anemonoj, algoj kaj insektoj. Konklude, nia studo montras, ke la LB-koncepto povas esti sukcese aplikita al maraj senvertebruloj por generi riĉan genoman repertuaron en maraj ekosistemoj.
Plenkreskuloj (55-70 mm longaj) *Mytilus platensis* (*M. platensis*) kaj *Aulacomya atra* (*A. atra*) estis kolektitaj de la intertajdaj rokaj marbordoj de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E*). Kerguelen-Insuloj en decembro 2018. Aliaj plenkreskaj bluaj mituloj (*Mytilus spp.*) estis akiritaj de komerca provizanto (PEI Mussel King Inc., Insulo de Princo Eduardo, Kanado) kaj metitaj en temperatur-kontrolitan (4°C) aerumitan tankon enhavantan 10–20 litrojn da 32‰ artefarita sala akvo (artefarita mara salo Reef Crystal, Instant Ocean, Virginio, Usono). Por ĉiu eksperimento, la longo kaj pezo de individuaj konkoj estis mezuritaj.
Senpaga protokolo kun malferma aliro por ĉi tiu programo estas havebla interrete (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Mallonge, LB-hemolimfo estis kolektita el abduktoraj muskoloj kiel priskribite [22]. La hemolimfo estis klarigita per centrifugado je 1200×g dum 3 minutoj, la supernatanto estis frostigita (-20°C) ĝis uzo. Por izolado kaj purigo de cfDNA, specimenoj (1,5-2,0 ml) estis degelitaj kaj prilaboritaj uzante la NucleoSnap cfDNA-ilaron (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. ccfDNA estis konservita je -80°C ĝis plia analizo. En kelkaj eksperimentoj, ccfDNA estis izolita kaj purigita uzante la QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanado). Purigita DNA estis kvantigita uzante norman PicoGreen-analizon. La fragmenta distribuo de la izolita ccfDNA estis analizita per kapilara elektroforezo uzante Agilent 2100 bioanalizilon (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kalifornio) kaj alt-senteman DNA-ilaron. La analizo estis farita uzante 1 µl de la ccfDNA-specimeno laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
Por sekvencado de hemolimfaj ccfDNA-fragmentoj, Génome Québec (Montrealo, Kebekio, Kanado) preparis ĉaspafilajn bibliotekojn uzante la Illumina DNA Mix-ilaron de la Illumina MiSeq PE75-ilaro. Norma adaptilo (BioO) estis uzita. Krudaj datendosieroj estas haveblaj de la NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 kaj SRR8924809). Baza legadkvalito estis taksita uzante FastQC [23]. Trimmomatic [24] estis uzita por tondi adaptilojn kaj malbonkvalitajn legadojn. Ĉaspafilaj legadoj kun parigitaj finoj estis FLASH-kunfanditaj en pli longajn unuopajn legadojn kun minimuma interkovro de 20 bp por eviti miskongruojn [25]. Kunigitaj legaĵoj estis prinotitaj per BLASTN uzante duvalvan NCBI-taksonomian datumbazon (e-valoro < 1e−3 kaj 90% homologio), kaj maskado de malalt-kompleksaj sekvencoj estis farita uzante DUST [26]. Kunigitaj legaĵoj estis prinotitaj per BLASTN uzante duvalvan NCBI-taksonomian datumbazon (e-valoro < 1e−3 kaj 90% homologio), kaj maskado de malalt-kompleksaj sekvencoj estis farita uzante DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных танных таки двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй нователь сложности было выполнено с использованием POLVO [26]. Kunigitaj legaĵoj estis prinotitaj per BLASTN uzante la NCBI-datumbazon pri taksonomio de konkoj (e-valoro < 1e-3 kaj 90% homologio), kaj malalt-kompleksa sekvencmaskado estis farita uzante DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数诌数，， 同源性）用BLASTN进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 Ｈ 读数 Ｈ 并 读数 Ｈ 同源）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой Ѕнотированы двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй ностворчатых моллюсков NCBI сложности было выполнено с использованием POLVO [26]. Kunigitaj legaĵoj estis prinotitaj per BLASTN uzante la taksonomian datumbazon de konkoj de NCBI (e-valoro <1e-3 kaj 90% homologio), kaj maskado de malalta komplekseco estis farita uzante DUST [26].La legaĵoj estis dividitaj en du grupojn: rilataj al konkaj sekvencoj (ĉi tie nomataj memlegaĵoj) kaj senrilataj (ne-memlegaĵoj). Du grupoj estis aparte kunmetitaj uzante MEGAHIT por generi kontiguojn [27]. Dume, la taksonomia distribuo de fremdaj mikrobiomaj legaĵoj estis klasifikita uzante Kraken2 [28] kaj grafike reprezentita per Krona cirklodiagramo sur Galaxy [29, 30]. La optimumaj kmeroj estis determinitaj kiel kmeroj-59 el niaj preparaj eksperimentoj. Memkontiguoj estis poste identigitaj per akordigo kun BLASTN (konka NCBI-datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio) por fina prinotado. Memkontiguoj estis poste identigitaj per akordigo kun BLASTN (konka NCBI-datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio) por fina prinotado. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база даннытх двхуство моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Mem-kontiguoj estis identigitaj per kongruo kontraŭ BLASTN (NCBI-konkuba datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio) por fina prinotado.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сол BLAS данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Mem-kontiguoj estis poste identigitaj por fina prinotado per kongruo kontraŭ BLASTN (NCBI-konkdatumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio). Paralele, ne-memgrupaj kontiguoj estis prinotitaj per BLASTN (nt NCBI datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). Paralele, ne-memgrupaj kontiguoj estis prinotitaj per BLASTN (nt NCBI datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данннач, e база данннач, e <1e-10 kaj гомология 60%). Paralele, fremdgrupaj kontiguoj estis prinotitaj per BLASTN (NT NCBI datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд на BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Paralele, ne-memgrupaj kontiguoj estis prinotitaj per BLASTN (nt NCBI datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio). BLASTX ankaŭ estis farita sur ne-memaj kontiguoj uzante la nr kaj RefSeq proteinajn NCBI datumbazojn (e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). BLASTX ankaŭ estis farita sur ne-memaj kontiguoj uzante la nr kaj RefSeq proteinajn NCBI datumbazojn (e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeq nr белигах e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX ankaŭ estis farita sur ne-memaj kontiguoj uzante la proteinajn datumbazojn nr kaj RefSeq NCBI (e-valoro < 1e-10 kaj 60% homologio).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性）还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性） BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безнка NC e BI (Ref. <1e-10 kaj гомология 60%). BLASTX ankaŭ estis farita sur ne-memaj kontiguoj uzante la proteinajn datumbazojn nr kaj RefSeq NCBI (e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio).La BLASTN kaj BLASTX grupoj de ne-mem-kontiguoj reprezentas la finajn kontiguojn (vidu suplementan dosieron).
La komenciloj uzitaj por PCR estas listigitaj en Tabelo S1. Taq DNA-polimerazo (Bio Basic Canada, Markham, ON) estis uzita por amplifiki la ccfDNA-celajn genojn. La jenaj reakciaj kondiĉoj estis uzitaj: denaturigo je 95°C dum 3 minutoj, 95°C dum 1 minuto, fiksita kalcina temperaturo dum 1 minuto, plilongigo je 72°C dum 1 minuto, 35 cikloj, kaj fine 72°C ene de 10 minutoj. PCR-produktoj estis apartigitaj per elektroforezo en agarozaj ĝeloj (1.5%) enhavantaj SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanado) je 95 V.
Mituloj (Mytilus spp.) estis alklimatigitaj en 500 ml da oksigenita marakvo (32 PSU) dum 24 horoj je 4°C. Plasmida DNA enhavanta enigaĵon kodantan la homan galektino-7 cDNA-sekvencon (NCBI-surskriba numero L07769) estis aldonita al la fiolo je fina koncentriĝo de 190 μg/μl. Mituloj inkubaciitaj sub la samaj kondiĉoj sen DNA-aldono estis la kontrolo. La tria kontroltanko enhavis DNA-on sen mituloj. Por monitori la kvaliton de DNA en marakvo, marakvaj specimenoj (20 μl; tri ripetoj) estis prenitaj el ĉiu tanko je la indikita tempo. Por plasmida DNA-spurebleco, LB-mituloj estis rikoltitaj je la indikitaj tempoj kaj analizitaj per qPCR kaj ddPCR. Pro la alta salenhavo de marakvo, alikvotoj estis diluitaj en PCR-kvalita akvo (1:10) antaŭ ĉiuj PCR-analizoj.
Cifereca guteta PCR (ddPCR) estis efektivigita uzante la protokolon BioRad QX200 (Misisogo, Ontario, Kanado). Uzu la temperaturprofilon por determini la optimuman temperaturon (Tabelo S1). Gutoj estis generitaj uzante gutgeneratoron QX200 (BioRad). ddPCR estis efektivigita jene: 95°C dum 5 minutoj, 50 cikloj de 95°C dum 30 sekundoj kaj difinita kalcina temperaturo dum 1 minuto kaj 72°C dum 30 sekundoj, 4°C dum 5 minutoj kaj 90°C ene de 5 minutoj. La nombro da gutoj kaj pozitivaj reagoj (nombro da kopioj/µl) estis mezurita uzante gutlegilon QX200 (BioRad). Specimenoj kun malpli ol 10 000 gutetoj estis malakceptitaj. Padronkontrolo ne estis efektivigita ĉiufoje kiam ddPCR estis efektivigita.
qPCR estis plenumita uzante Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidnejo, Aŭstralio) kaj LGALS7-specifajn prajmerojn. Ĉiuj kvantaj PCR-oj estis plenumitaj en 20 µl uzante la QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR estis komencita per 15-minuta inkubacio je 95°C sekvata de 40 cikloj je 95°C dum 10 sekundoj kaj je 60°C dum 60 sekundoj kun unu datenkolekto. Fandokurboj estis generitaj uzante sinsekvajn mezuradojn je 95°C dum 5 sekundoj, 65°C dum 60 sekundoj, kaj 97°C ĉe la fino de la qPCR. Ĉiu qPCR estis plenumita trioble, krom kontrolprovaĵoj.
Ĉar musloj estas konataj pro sia alta filtra rapideco, ni unue esploris ĉu ili povus filtri kaj reteni DNA-fragmentojn ĉeestantajn en marakvo. Ni ankaŭ interesiĝis pri ĉu ĉi tiuj fragmentoj akumuliĝas en ilia duonmalferma limfa sistemo. Ni solvis ĉi tiun problemon eksperimente spurante la sorton de solveblaj DNA-fragmentoj aldonitaj al bluaj mitulaj tankoj. Por faciligi spuradon de DNA-fragmentoj, ni uzis fremdan (ne propran) plasmidan DNA-on enhavantan la homan galektino-7-genon. ddPCR spuras plasmidajn DNA-fragmentojn en marakvo kaj musloj. Niaj rezultoj montras, ke se la kvanto de DNA-fragmentoj en marakvo restis relative konstanta laŭlonge de la tempo (ĝis 7 tagoj) en la foresto de musloj, tiam en la ĉeesto de musloj ĉi tiu nivelo preskaŭ tute malaperis ene de 8 horoj (Fig. 1a,b). Fragmentoj de eksogena DNA estis facile detektitaj ene de 15 minutoj en intravalva fluido kaj hemolimfo (Fig. 1c). Ĉi tiuj fragmentoj ankoraŭ povus esti detektitaj ĝis 4 horojn post eksponiĝo. Ĉi tiu filtra agado rilate al DNA-fragmentoj estas komparebla al la filtra agado de bakterioj kaj algoj [31]. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke musloj povas filtri kaj akumuli fremdan DNA-on en siaj fluidaj kupeoj.
Relativaj koncentriĝoj de plasmida DNA en marakvo ĉeestante (A) aŭ forestante (B) musloj, mezuritaj per ddPCR. En A, la rezultoj estas esprimitaj kiel procentoj, kun la randoj de la skatoloj reprezentantaj la 75-an kaj 25-an percentilojn. La alĝustigita logaritma kurbo estas montrita ruĝe, kaj la areo ombrita grize reprezentas la 95%-konfidencintervalon. En B, la ruĝa linio reprezentas la meznombron kaj la blua linio reprezentas la 95%-konfidencintervalon por la koncentriĝo. C Amasiĝo de plasmida DNA en la hemolimfo kaj valva fluido de musloj je malsamaj tempoj post la aldono de plasmida DNA. Rezultoj estas prezentitaj kiel absolutaj detektitaj kopioj/mL (±SE).
Poste, ni esploris la originon de ccfDNA en musloj kolektitaj de muslitoj sur la Kerguelen-Insuloj, malproksima grupo de insuloj kun limigita antropogena influo. Por ĉi tiu celo, cccDNA el muslaj hemolimfoj estis izolita kaj purigita per metodoj ofte uzataj por purigi homan cccDNA [32, 33]. Ni trovis, ke averaĝaj hemolimfaj ccfDNA-koncentriĝoj en musloj estas en la malalta gamo de mikrogramoj por ml da hemolimfo (vidu Tabelon S2, Suplementaj Informoj). Ĉi tiu gamo de koncentriĝoj estas multe pli granda ol ĉe sanaj homoj (malaltaj nanogramoj por mililitro), sed en maloftaj kazoj, ĉe kanceruloj, la nivelo de ccfDNA povas atingi plurajn mikrogramojn por mililitro [34, 35]. Analizo de la grandecdistribuo de hemolimfa ccfDNA montris, ke ĉi tiuj fragmentoj multe varias laŭ grandeco, intervalante de 1000 bp ĝis 1000 bp ĝis 5000 bp (Fig. 2). Similaj rezultoj estis akiritaj uzante la silik-bazitan QIAamp Investigator Kit, metodo ofte uzata en krimmedicina scienco por rapide izoli kaj purigi genoman DNA-on el malalt-koncentriĝaj DNA-specimenoj, inkluzive de ccfDNA [36].
Reprezenta ccfDNA-elektroforegramo de musla hemolimfo. Eltirita per NucleoSnap Plasma Kit (supre) kaj QIAamp DNA Investigator Kit. B Violona grafikaĵo montranta la distribuon de hemolimfaj ccfDNA-koncentriĝoj (±SE) en musloj. La nigraj kaj ruĝaj linioj reprezentas la medianon kaj la unuan kaj trian kvartilojn, respektive.
Proksimume 1% de ccfDNA en homoj kaj primatoj havas fremdan fonton [21, 37]. Konsiderante la duonmalferman kardiovaskulan sistemon de konkoj, mikrob-riĉan marakvon, kaj la grandecdistribuon de musla ccfDNA, ni hipotezis, ke musla hemolimfa ccfDNA povus enhavi riĉan kaj diversan provizon de mikroba DNA. Por testi ĉi tiun hipotezon, ni sekvencis hemolimfan ccfDNA el specimenoj de Aulacomya atra kolektitaj de la Kerguelen-Insuloj, rezultante pli ol 10 milionojn da legaĵoj, el kiuj 97.6% pasis kvalitkontrolon. La legaĵoj estis poste klasifikitaj laŭ propraj kaj ne-propraj fontoj uzante la konkajn datumbazojn BLASTN kaj NCBI (Fig. S1, Suplementaj Informoj).
Ĉe homoj, kaj nuklea kaj mitokondria DNA povas esti liberigitaj en la sangocirkuladon [38]. Tamen, en la nuna studo, ne eblis detale priskribi la nuklean genoman DNA-on de musloj, ĉar la genaro de A. atra ne estis sekvencita aŭ priskribita. Tamen, ni povis identigi kelkajn ccfDNA-fragmentojn de nia propra origino uzante la konkan bibliotekon (Fig. S2, Suplementaj Informoj). Ni ankaŭ konfirmis la ĉeeston de DNA-fragmentoj de nia propra origino per direktita PCR-amplifikado de tiuj A. atra-genoj, kiuj estis sekvencitaj (Fig. 3). Simile, ĉar la mitokondria genaro de A. atra estas havebla en publikaj datumbazoj, oni povas trovi pruvojn por la ĉeesto de mitokondriaj ccfDNA-fragmentoj en la hemolimfo de A. atra. La ĉeesto de mitokondriaj DNA-fragmentoj estis konfirmita per PCR-amplifikado (Fig. 3).
Diversaj mitokondriaj genoj ĉeestis en la hemolimfo de A. atra (ruĝaj punktoj - stoknumero: SRX5705969) kaj M. platensis (bluaj punktoj - stoknumero: SRX5705968) amplifikitaj per PCR. Figuro adaptita de Breton et al., 2011 B Amplifikado de hemolimfa supernatanto de A. atra Konservita sur FTA-papero. Uzu 3 mm stampilon por aldoni rekte al la PCR-tubo enhavanta la PCR-miksaĵon.
Konsiderante la abundan mikroban enhavon en marakvo, ni komence fokusiĝis al la karakterizado de mikrobaj DNA-sekvencoj en hemolimfo. Por fari tion, ni uzas du malsamajn strategiojn. La unua strategio uzis Kraken2, algoritm-bazitan sekvencan klasifikprogramon, kiu povas identigi mikrobajn sekvencojn kun precizeco komparebla al BLAST kaj aliaj iloj [28]. Pli ol 6719 legaĵoj estis determinitaj kiel bakteriaj, dum 124 kaj 64 estis de arkeoj kaj virusoj, respektive (Fig. 4). La plej abundaj bakteriaj DNA-fragmentoj estis Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), kaj Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Ĉi tiu distribuo kongruas kun antaŭaj studoj pri la mikrobiomo de mara blua mitulo [39, 40]. Gammaproteobacteria estis la ĉefa klaso de Proteobacteria (44%), inkluzive de multaj Vibrionaloj (Fig. 4b). La ddPCR-metodo konfirmis la ĉeeston de Vibrio DNA-fragmentoj en la ccfDNA de A. atra hemolimfo (Fig. 4c) [41]. Por akiri pliajn informojn pri la bakteria origino de ccfDNA, oni uzis plian metodon (Fig. S2, Suplementaj Informoj). En ĉi tiu kazo, legaĵoj kiuj interkovriĝis estis kunmetitaj kiel parafinaj legaĵoj kaj estis klasifikitaj kiel de propra (konkoj) aŭ ne-propra origino uzante BLASTN kaj e-valoron de 1e−3 kaj fortranĉon kun >90% homologio. En ĉi tiu kazo, legaĵoj kiuj interkovriĝis estis kunmetitaj kiel parafinaj legaĵoj kaj estis klasifikitaj kiel de propra (konkoj) aŭ ne-propra origino uzante BLASTN kaj e-valoron de 1e−3 kaj fortranĉon kun >90% homologio. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны с парными концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использование моллюски или чужие по происхождению с использование м 1 BLAS-3 отсечения с гомологией> 90%. En ĉi tiu kazo, interkovrantaj legaĵoj estis kolektitaj kiel par-finaj legaĵoj kaj estis klasifikitaj kiel denaskaj (konkaj) aŭ ne-originalaj uzante BLASTN kaj e-valoron de 1e-3 kaj fortranĉon kun >90% homologio.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值值值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 的 3值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классикфи класынико собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использований e BLAS 1e-3 kaj порога гомологии> 90%. En ĉi tiu kazo, interkovrantaj legaĵoj estis kolektitaj kiel paraj legaĵoj kaj klasifikitaj kiel propraj (konkoj) aŭ ne-originalaj uzante e BLASTN kaj 1e-3 valorojn kaj homologian sojlon >90%.Ĉar la genaro de *A. atra* ankoraŭ ne estas sekvencita, ni uzis la strategion de *de novo* kunmetado de la asemblero MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Entute 147 188 kontiguoj estis identigitaj kiel dependaj (konkoj) de origino. Ĉi tiuj kontiguoj estis poste eksplodigitaj kun e-valoroj de 1e-10 uzante BLASTN kaj BLASTX. Ĉi tiu strategio permesis al ni identigi 482 ne-konkajn fragmentojn ĉeestantajn en la ccfDNA de *A. atra*. Pli ol duono (57%) de ĉi tiuj DNA-fragmentoj estis akiritaj de bakterioj, ĉefe de brankaj simbiontoj, inkluzive de sulfotrofaj simbiontoj, kaj de brankaj simbiontoj Solemya velum (Fig. 5).
Relativa abundeco je la tipnivelo. B Mikroba diverseco de du ĉefaj filumoj (Firmicutes kaj Proteobacteria). Reprezenta amplifikado de ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmentoj de la 16S rRNA geno (blua) en tri atra hemolimfoj.
Entute 482 kolektitaj kontigoj estis analizitaj. Ĝenerala profilo de la taksonomia distribuo de metagenomaj kontigaj prinotadoj (prokariotoj kaj eŭkariotoj). B Detala distribuo de bakteriaj DNA-fragmentoj identigitaj per BLASTN kaj BLASTX.
Analizo per Kraken2 ankaŭ montris, ke la ccfDNA de musloj enhavis arkeajn DNA-fragmentojn, inkluzive de DNA-fragmentoj de Eŭriarkeotoj (65%), Krenarkeotoj (24%), kaj Taurmarkeotoj (11%) (Fig. 6a). La ĉeesto de DNA-fragmentoj derivitaj de Eŭriarkeotoj kaj Krenarkeotoj, antaŭe trovitaj en la mikroba komunumo de kaliforniaj musloj, ne devus esti surprizo [42]. Kvankam Eŭriarkeotoj ofte asociiĝas kun ekstremaj kondiĉoj, nun oni agnoskas, ke kaj Eŭriarkeotoj kaj Krenarkeotoj estas inter la plej oftaj prokariotoj en la mara kriogena medio [43, 44]. La ĉeesto de metanogenaj mikroorganismoj en musloj ne estas surpriza, konsiderante lastatempajn raportojn pri ampleksaj metan-elfluoj de fundaj elfluoj sur la Kerguelen-Altebenaĵo [45] kaj eblan mikroban metan-produktadon observitan apud la marbordo de la Kerguelen-Insuloj [46].
Nia atento tiam ŝoviĝis al legaĵoj de DNA-virusoj. Laŭ nia scio, ĉi tiu estas la unua ekstercela studo pri la virusenhavo de musloj. Kiel atendite, ni trovis DNA-fragmentojn de bakteriofagoj (Caudovirales) (Fig. 6b). Tamen, la plej ofta virusa DNA venas de filumo de nukleocitovirusoj, ankaŭ konata kiel la nuklea citoplasma granda DNA-viruso (NCLDV), kiu havas la plej grandan genaron el ĉiuj virusoj. Ene de ĉi tiu filumo, la plej multaj DNA-sekvencoj apartenas al la familioj Mimimidoviridae (58%) kaj Poxviridae (21%), kies naturaj gastigantoj inkluzivas vertebrulojn kaj artikulojn, dum malgranda proporcio de ĉi tiuj DNA-sekvencoj apartenas al konataj virusologiaj algoj. Infektas marajn eŭkariotajn algojn. La sekvencoj ankaŭ estis akiritaj de la Pandora viruso, la giganta viruso kun la plej granda genara grandeco el ĉiuj konataj virusgenroj. Interese, la gamo de gastigantoj konataj esti infektitaj per la viruso, kiel determinite per hemolimfa ccfDNA-sekvencado, estis relative granda (Figuro S3, Suplementaj Informoj). Ĝi inkluzivas virusojn, kiuj infektas insektojn kiel Baculoviridae kaj Iridoviridae, same kiel virusojn, kiuj infektas amebojn, algojn kaj vertebrulojn. Ni ankaŭ trovis sekvencojn kongruantajn kun la genaro de Pithovirus sibericum. Pitovirusoj (ankaŭ konataj kiel "zombiaj virusoj") unue estis izolitaj el 30.000-jaraĝa permafrosto en Siberio [47]. Tiel, niaj rezultoj kongruas kun antaŭaj raportoj, kiuj montras, ke ne ĉiuj modernaj specioj de ĉi tiuj virusoj estas formortintaj [48] kaj ke ĉi tiuj virusoj eble ĉeestas en malproksimaj subarktaj maraj ekosistemoj.
Fine, ni testis ĉu ni povus trovi DNA-fragmentojn de aliaj multĉelaj bestoj. Entute 482 fremdaj kontiguoj estis identigitaj per BLASTN kaj BLASTX kun nt, nr kaj RefSeq bibliotekoj (genomaj kaj proteinaj). Niaj rezultoj montras, ke inter la fremdaj fragmentoj de ccfDNA de multĉelaj bestoj superregas DNA de ostaj ostoj (Fig. 5). DNA-fragmentoj de insektoj kaj aliaj specioj ankaŭ estis trovitaj. Relative granda parto de la DNA-fragmentoj ne estis identigita, eble pro la subreprezentado de granda nombro da maraj specioj en genomaj datumbazoj kompare kun surteraj specioj [49].
En la nuna artikolo, ni aplikas la koncepton de LB al musloj, argumentante, ke sekvencado de hemolimfo per ccfDNA povas provizi komprenon pri la konsisto de marbordaj ekosistemoj. Aparte, ni trovis, ke 1) la hemolimfo de musloj enhavas relative altajn koncentriĝojn (mikrogramaj niveloj) de relative grandaj (~1-5 kb) cirkulantaj DNA-fragmentoj; 2) ĉi tiuj DNA-fragmentoj estas kaj sendependaj kaj ne-sendependaj; 3) Inter la fremdaj fontoj de ĉi tiuj DNA-fragmentoj, ni trovis bakterian, arkean kaj virusan DNA-on, same kiel DNA-on de aliaj multĉelaj bestoj; 4) La amasiĝo de ĉi tiuj fremdaj ccfDNA-fragmentoj en la hemolimfo okazas rapide kaj kontribuas al la interna filtra agado de musloj. Konklude, nia studo montras, ke la koncepto de LB, kiu ĝis nun estis aplikita ĉefe en la kampo de biomedicino, ĉifras riĉan sed neesploritan fonton de scio, kiu povas esti uzata por pli bone kompreni la interagadon inter sentinelaj specioj kaj ilia medio.
Aldone al primatoj, ccfDNA-izolado estis raportita en mamuloj, inkluzive de musoj, hundoj, katoj kaj ĉevaloj [50, 51, 52]. Tamen, laŭ nia scio, nia studo estas la unua, kiu raportas la detekton kaj sekvencadon de ccfDNA en maraj specioj kun malferma cirkulada sistemo. Ĉi tiu anatomia trajto kaj filtra kapablo de musloj povas, almenaŭ parte, klarigi la malsamajn grandeckarakterizaĵojn de cirkulantaj DNA-fragmentoj kompare kun aliaj specioj. Ĉe homoj, la plej multaj DNA-fragmentoj cirkulantaj en la sango estas malgrandaj fragmentoj, kiuj varias en grandeco de 150 ĝis 200 bp. kun maksimuma pinto de 167 bp. [34, 53]. Malgranda sed signifa parto de DNA-fragmentoj estas inter 300 kaj 500 bp., kaj ĉirkaŭ 5% estas pli longaj ol 900 bp. [54]. La kialo de ĉi tiu grandecdistribuo estas, ke la ĉefa fonto de ccfDNA en plasmo okazas kiel rezulto de ĉelmorto, ĉu pro ĉelmorto aŭ pro nekrozo de cirkulantaj hematopoezaj ĉeloj en sanaj individuoj aŭ pro apoptozo de tumorĉeloj en kanceruloj (konata kiel cirkulanta tumora DNA, ctDNA). La grandecdistribuo de hemolimfa ccfDNA, kiun ni trovis en musloj, variis de 1000 ĝis 5000 bp, sugestante, ke musla ccfDNA havas malsaman originon. Ĉi tio estas logika hipotezo, ĉar musloj havas duonmalferman angian sistemon kaj vivas en maraj akvaj medioj enhavantaj altajn koncentriĝojn de mikroba genomika DNA. Fakte, niaj laboratoriaj eksperimentoj uzantaj eksogenan DNA montris, ke musloj akumulas DNA-fragmentojn en marakvo, almenaŭ post kelkaj horoj ili estas degraditaj post ĉela sorbado kaj/aŭ liberigitaj kaj/aŭ stokitaj en diversaj organizoj. Konsiderante la maloftaĵon de ĉeloj (kaj prokariotaj kaj eŭkariotaj), la uzo de intravalvaj kupeoj reduktos la kvanton de ccfDNA el memfontoj same kiel el fremdaj fontoj. Konsiderante la gravecon de denaska imuneco ĉe konkoj kaj la grandan nombron da cirkulantaj fagocitoj, ni plue hipotezis, ke eĉ fremda ccfDNA estas riĉigita je cirkulantaj fagocitoj, kiuj akumulas fremdan DNA-on post konsumado de mikroorganismoj kaj/aŭ ĉelaj derompaĵoj. Sume, niaj rezultoj montras, ke la ccfDNA de konka hemolimfo estas unika deponejo de molekulaj informoj kaj plifortigas ilian statuson kiel gardostaranta specio.
Niaj datumoj indikas, ke sekvencado kaj analizo de bakteri-derivitaj hemolimfaj ccfDNA-fragmentoj povas provizi ŝlosilajn informojn pri la gastiganta bakteria flaŭro kaj la bakterioj ĉeestantaj en la ĉirkaŭa mara ekosistemo. Teknikoj de pafsekvencado rivelis sekvencojn de la komensal-bakterio A. atra gill, kiuj estus preteratentitaj se konvenciaj 16S rRNA-identigmetodoj estus uzitaj, parte pro referencbiblioteka biaso. Fakte, nia uzo de LB-datumoj kolektitaj de M. platensis en la sama musla tavolo ĉe Kerguelen montris, ke la konsisto de brank-asociitaj bakteriaj simbiontoj estis la sama por ambaŭ muslaj specioj (Fig. S4, Suplementaj Informoj). Ĉi tiu simileco de du genetike malsamaj musloj povas reflekti la konsiston de bakteriaj komunumoj en la malvarmaj, sulfuraj kaj vulkanaj deponaĵoj de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Pli altaj niveloj de sulfur-reduktantaj mikroorganismoj estis bone priskribitaj dum rikoltado de musloj el bioturbitaj marbordaj areoj [59], kiel ekzemple la marbordo de Port-au-France. Alia ebleco estas, ke la komensala musla flaŭro povus esti trafita de horizontala dissendo [60, 61]. Pli da esplorado estas necesa por determini la korelacion inter la mara medio, la marfunda surfaco kaj la konsisto de simbiozaj bakterioj en musloj. Ĉi tiuj studoj nuntempe daŭras.
La longo kaj koncentriĝo de hemolimfa ccfDNA, ĝia facileco de purigo, kaj alta kvalito por ebligi rapidan sekvencadon per ĉaspafilo estas kelkaj el la multaj avantaĝoj de uzado de musla ccfDNA por taksi biodiversecon en maraj marbordaj ekosistemoj. Ĉi tiu aliro estas aparte efika por karakterizi virusajn komunumojn (viromojn) en difinita ekosistemo [62, 63]. Male al bakterioj, arkeoj, kaj eŭkariotoj, virusaj genaroj ne enhavas filogenetike konservitajn genojn kiel 16S-sekvencoj. Niaj rezultoj indikas, ke likvaj biopsioj de indikilaj specioj kiel musloj povas esti uzataj por identigi relative grandajn nombrojn da ccfDNA-virusfragmentoj konataj infekti gastigantojn, kiuj tipe loĝas en marbordaj maraj ekosistemoj. Ĉi tio inkluzivas virusojn konatajn infekti protozoojn, artikulojn, insektojn, plantojn, kaj bakteriajn virusojn (ekz., bakteriofagojn). Simila distribuo estis trovita kiam ni ekzamenis la hemolimfan ccfDNA-viromon de bluaj mituloj (M. platensis) kolektitaj en la sama mitultavolo ĉe Kerguelen (Tabelo S2, Suplementaj Informoj). Pafilsekvencado de ccfDNA estas efektive nova aliro, kiu akiras impeton en la studo de la viromo de homoj aŭ aliaj specioj [21, 37, 64]. Ĉi tiu aliro estas precipe utila por studi duoble-fadenajn DNA-virusojn, ĉar neniu unuopa geno estas konservita inter ĉiuj duoble-fadenaj DNA-virusoj, reprezentante la plej diversan kaj larĝan klason de virusoj en Baltimoro [65]. Kvankam la plej multaj el ĉi tiuj virusoj restas neklasifikitaj kaj povas inkluzivi virusojn el tute nekonata parto de la virusa mondo [66], ni trovis, ke la viromoj kaj gastigantaj gamoj de la musloj A. atra kaj M. platensis falas inter la du specioj simile (vidu figuron S3, pliaj informoj). Ĉi tiu simileco ne estas surpriza, ĉar ĝi povas reflekti mankon de selektiveco en la sorbado de DNA ĉeestanta en la medio. Estontaj studoj uzantaj purigitan RNA estas nuntempe necesaj por karakterizi la RNA-viromon.
En nia studo, ni uzis tre rigoran procezon adaptitan de la laboro de Kowarski kaj kolegoj [37], kiuj uzis du-ŝtupan forigon de kunigitaj legaĵoj kaj kontiguoj antaŭ kaj post kunmetado de indiĝena ccfDNA, rezultante en alta proporcio de nemapitaj legaĵoj. Tial, ni ne povas ekskludi, ke iuj el ĉi tiuj nemapitaj legaĵoj eble ankoraŭ havas sian propran originon, ĉefe ĉar ni ne havas referencan genaron por ĉi tiu muslospecio. Ni ankaŭ uzis ĉi tiun procezon ĉar ni zorgis pri la ĥimeroj inter mem- kaj ne-mem-legaĵoj kaj la legaĵlongoj generitaj de la Illumina MiSeq PE75. Alia kialo por la plimulto de nemapitaj legaĵoj estas, ke multaj el la maraj mikroboj, precipe en malproksimaj areoj kiel Kerguelen, ne estis prinotitaj. Ni uzis Illumina MiSeq PE75, supozante longojn de ccfDNA-fragmentoj similajn al homa ccfDNA. Por estontaj studoj, konsiderante niajn rezultojn montrantajn, ke hemolimfa ccfDNA havas pli longajn legaĵojn ol homoj kaj/aŭ mamuloj, ni rekomendas uzi sekvencan platformon pli taŭgan por pli longaj ccfDNA-fragmentoj. Ĉi tiu praktiko multe faciligos identigi pli da indikoj por pli profunda analizo. Akiri la nuntempe nehaveblan kompletan nuklean genoman sekvencon de A. atra ankaŭ multe faciligus la distingon de ccfDNA de propraj kaj ne-propraj fontoj. Ĉar nia esplorado fokusiĝis al la ebleco apliki la koncepton de likva biopsio al musloj, ni esperas, ke dum ĉi tiu koncepto estos uzata en estonta esplorado, novaj iloj kaj procezoj estos evoluigitaj por pliigi la potencialon de ĉi tiu metodo por studi la mikroban diversecon de musloj en mara ekosistemo.
Kiel neinvazia klinika biosigno, levitaj homaj plasmoniveloj de ccfDNA estas asociitaj kun diversaj malsanoj, hista damaĝo kaj streskondiĉoj [67,68,69]. Ĉi tiu pliiĝo estas asociita kun la liberigo de DNA-fragmentoj de sia propra origino post hista damaĝo. Ni traktis ĉi tiun problemon uzante akutan varmostreson, en kiu musloj estis nelonge eksponitaj al temperaturo de 30 °C. Ni faris ĉi tiun analizon sur tri malsamaj specoj de musloj en tri sendependaj eksperimentoj. Tamen, ni ne trovis ian ŝanĝon en ccfDNA-niveloj post akuta varmostreso (vidu Figuron S5, pliaj informoj). Ĉi tiu malkovro povas klarigi, almenaŭ parte, la fakton, ke musloj havas duonmalferman kardiovaskulan sistemon kaj akumulas grandajn kvantojn da fremda DNA pro sia alta filtra aktiveco. Aliflanke, musloj, kiel multaj senvertebruloj, povas esti pli rezistemaj al stres-induktita hista damaĝo, tiel limigante la liberigon de ccfDNA en sia hemolimfo [70, 71].
Ĝis nun, DNA-analizo de biodiverseco en akvaj ekosistemoj ĉefe fokusiĝis al media DNA-metastrekkodado (eDNA). Tamen, ĉi tiu metodo kutime estas limigita en biodiverseca analizo kiam oni uzas komencilojn. La uzo de ĉaspafila sekvencado evitas la limigojn de PCR kaj la misgvidan selektadon de komencilaj aroj. Tiel, iasence, nia metodo estas pli proksima al la ĵus uzata alt-traira eDNA-ĉaspafila sekvencada metodo, kiu kapablas rekte sekvenci fragmentitan DNA-on kaj analizi preskaŭ ĉiujn organismojn [72, 73]. Tamen, ekzistas kelkaj fundamentaj aferoj, kiuj distingas LB de normaj eDNA-metodoj. Kompreneble, la ĉefa diferenco inter eDNA kaj LB estas la uzo de naturaj filtrilaj gastigantoj. La uzo de maraj specioj kiel spongoj kaj konkoj (Dresseina spp.) kiel natura filtrilo por studi eDNA estis raportita [74, 75]. Tamen, la studo de Dreissena uzis histajn biopsiojn, el kiuj DNA estis ekstraktita. Analizo de ccfDNA el LB ne postulas histan biopsion, specialigitan kaj foje multekostan ekipaĵon kaj loĝistikon asociitan kun eDNA aŭ hista biopsio. Fakte, ni ĵus raportis, ke ccfDNA el LB povas esti stokita kaj analizita kun FTA-subteno sen konservi malvarman ĉenon, kio estas grava defio por esplorado en malproksimaj regionoj [76]. La ekstraktado de ccfDNA el likvaj biopsioj ankaŭ estas simpla kaj provizas altkvalitan DNA por ĉaspafila sekvencado kaj PCR-analizo. Ĉi tio estas granda avantaĝo konsiderante kelkajn el la teknikaj limigoj asociitaj kun eDNA-analizo [77]. La simpleco kaj malalta kosto de la specimenmetodo ankaŭ estas aparte taŭgaj por longdaŭraj monitoradprogramoj. Aldone al ilia alta filtra kapablo, alia konata trajto de konkoj estas la kemia mukopolisakarida konsisto de ilia muko, kiu antaŭenigas la sorbadon de virusoj [78, 79]. Ĉi tio faras konkojn ideala natura filtrilo por karakterizi biodiversecon kaj la efikon de klimata ŝanĝo en difinita akva ekosistemo. Kvankam la ĉeesto de gastiganto-derivitaj DNA-fragmentoj povas esti vidata kiel limigo de la metodo kompare kun eDNA, la kosto asociita kun tia denaska ccfDNA kompare kun eDNA estas samtempe komprenebla pro la vasta kvanto da informoj haveblaj por sanstudoj pri la kompensita gastiganto. Tio inkluzivas la ĉeeston de virussekvencoj integritaj en la genaron de la gastiganta gastiganto. Tio estas aparte grava por musloj, konsiderante la ĉeeston de horizontale transdonitaj leŭkemiaj retrovirusoj en konkoj [80, 81]. Alia avantaĝo de LB super eDNA estas, ke ĝi ekspluatas la fagocitan agadon de cirkulantaj sangaj ĉeloj en la hemolimfo, kiu englutas mikroorganismojn (kaj iliajn genarojn). Fagocitozo estas la ĉefa funkcio de sangaj ĉeloj en konkoj [82]. Fine, la metodo utiligas la altan filtran kapaciton de musloj (averaĝe 1.5 l/h da marakvo) kaj dutaga cirkulado, kiuj pliigas la miksadon de malsamaj tavoloj de marakvo, permesante la kapton de heterologa eDNA. [83, 84]. Tiel, analizo de musla ccfDNA estas interesa vojo konsiderante la nutrajn, ekonomiajn kaj mediajn efikojn de musloj. Simile al la analizo de LB kolektita de homoj, ĉi tiu metodo ankaŭ malfermas la eblecon mezuri genetikajn kaj epigenetikajn ŝanĝojn en gastiga DNA en respondo al eksogenaj substancoj. Ekzemple, triageneraciaj sekvencaj teknologioj povas esti antaŭviditaj por plenumi tutgenoman metilanalizon en indiĝena ccfDNA uzante nanopora sekvencado. Ĉi tiun procezon faciligus la fakto, ke la longo de la muslaj ccfDNA-fragmentoj estas ideale kongrua kun longlegaj sekvencaj platformoj, kiuj permesas tutgenoman DNA-metilanalizon el ununura sekvenca kuro sen la bezono de kemiaj transformoj.85,86] Ĉi tio estas interesa ebleco, ĉar estis montrite, ke DNA-metiligaj padronoj reflektas respondon al media streso kaj daŭras tra multaj generacioj. Tial, ĝi povas provizi valorajn komprenojn pri la subestaj mekanismoj regantaj respondon post eksponiĝo al klimata ŝanĝo aŭ poluaĵoj [87]. Tamen, la uzo de LB ne estas sen limigoj. Evidente, ĉi tio postulas la ĉeeston de indikilaj specioj en la ekosistemo. Kiel menciite supre, uzi LB por taksi la biodiversecon de difinita ekosistemo ankaŭ postulas rigoran bioinformadikan dukton, kiu konsideras la ĉeeston de DNA-fragmentoj de la fonto. Alia grava problemo estas la havebleco de referencaj genaroj por maraj specioj. Oni esperas, ke iniciatoj kiel la Projekto pri Maraj Mamuloj-Genaroj kaj la ĵus establita projekto Fish10k [88] faciligos tian analizon estonte. La apliko de la LB-koncepto al maraj filtril-manĝantaj organismoj ankaŭ kongruas kun la plej novaj progresoj en sekvenca teknologio, kio igas ĝin bone taŭga por la disvolviĝo de mult-omaj biosignoj por provizi gravajn informojn pri la sano de maraj vivejoj rilate al media streso.
Datumoj pri genara sekvencado estas deponitaj en la NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sub Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Efiko de klimata ŝanĝo sur mara vivo kaj ekosistemoj. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Konsideru la kombinitajn efikojn de klimata ŝanĝo kaj aliaj lokaj stresfaktoroj sur la maran medion. ĝenerala scienca medio. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Scienco de la unua de marto. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduktita varmotoleremo sub ripetaj varmostresaj kondiĉoj klarigas la altan someran mortecon de bluaj mituloj. Scienca raporto 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Lastatempaj ŝanĝoj en la ofteco, kaŭzoj kaj amplekso de bestaj mortoj. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Multoblaj ne-speciaj specifaj patogenoj eble kaŭzis amasmortecon de Pinna nobilis. Vivo. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Ebla efiko de klimata ŝanĝo sur arktaj zoonozaj malsanoj. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Bluaj mituloj (Mytilus edulis spp.) kiel signalaj organismoj en monitorado de marborda poluado: recenzo. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integriĝo de likva biopsio en kancertraktado. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maturiĝo per likva biopsio: Permesas al tumora DNA cirkuli. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleaj acidoj en homa plasmo. Kunvenprotokoloj de filioj de Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova rolo por senĉela DNA kiel molekula markilo por kancertraktado. Kvantigo de biomolara analizo. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Likva biopsio eniras la klinikon - efektivigaj problemoj kaj estontaj defioj. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW kaj aliaj. Feta DNA ĉeestas en patrina plasmo kaj serumo. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studo pri la daŭro de gravedeco kaj ĝiaj komplikaĵoj uzante cirkulantan eksterĉelan RNA-on en la sango de virinoj dum gravedeco. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Likva biopsio: donacĉela sen-DNA estas uzata por detekti alogenajn lezojn en rena transplantaĵo. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Novigoj en antaŭnaska diagnozo: patrina plasmogenoma sekvencado. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Rapida detekto de patogenoj per venontgeneracia metagenomika sekvencado de infektitaj korpaj fluidoj. Nat Medicine. 2021;27:115-24.