Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Likva biopsio (LB) estas koncepto kiu rapide akiras popularecon en la biomedicina kampo.La koncepto estas plejparte bazita sur la detekto de fragmentoj de cirkulanta eksterĉela DNA (ccfDNA), kiuj estas plejparte liberigitaj kiel malgrandaj fragmentoj post ĉelmorto en diversaj histoj.Malgranda proporcio de tiuj fragmentoj originas de fremdaj (fremdaj) histoj aŭ organismoj.En nuna laboro, ni aplikis ĉi tiun koncepton al mituloj, gardostaranta specio konata pro sia alta marakva filtra kapablo.Ni uzas la kapablon de mituloj funkcii kiel naturaj filtriloj por kapti mediajn DNA-fragmentojn de diversaj fontoj por provizi informojn pri la biodiverseco de maraj marbordaj ekosistemoj.Niaj rezultoj montras, ke musla hemolimfo enhavas DNA-fragmentojn kiuj multe varias en grandeco, de 1 ĝis 5 kb.Ĉaspafilo-sekvencado montris ke granda nombro da DNA-fragmentoj estas de fremda mikroba origino.Inter ili, ni trovis DNA-fragmentojn de bakterioj, arkeoj kaj virusoj, inkluzive de virusoj konataj infekti diversajn gastigantojn ofte trovitajn en marbordaj maraj ekosistemoj.Konklude, nia studo pruvas, ke la koncepto de LB aplikita al mituloj reprezentas riĉan sed ankoraŭ neesplorita fonton de scio pri mikroba diverseco en maraj marbordaj ekosistemoj.
La efiko de klimata ŝanĝo (CC) sur la biodiverseco de maraj ekosistemoj estas rapide kreskanta areo de esplorado.Mondvarmiĝo ne nur kaŭzas gravajn fiziologiajn stresojn, sed ankaŭ puŝas la evoluajn limojn de la termika stabileco de maraj organismoj, influante la vivejon de kelkaj specioj, instigante ilin serĉi pli favorajn kondiĉojn [1, 2].Krom influado de la biodiverseco de metazooj, CC interrompas la delikatan ekvilibron de gastiganto-mikrobaj interagoj.Ĉi tiu mikroba disbakteriozo prezentas gravan minacon al maraj ekosistemoj ĉar ĝi igas marajn organismojn pli sentemaj al infektaj patogenoj [3, 4].Oni kredas, ke SS ludas gravan rolon en amasaj mortoj, kio estas grava problemo por la administrado de tutmondaj maraj ekosistemoj [5, 6].Ĉi tio estas grava afero pro la ekonomiaj, ekologiaj kaj nutraj efikoj de multaj maraj specioj.Ĉi tio validas precipe por bivalvoj vivantaj en la polusaj regionoj, kie la efikoj de CK estas pli tujaj kaj severaj [6, 7].Fakte, bivalvoj kiel Mytilus spp.estas vaste uzataj por monitori la efikojn de CC sur maraj ekosistemoj.Ne surprize, relative granda nombro da biomarkoj estis evoluigita por monitori sian sanon, ofte uzante dunivelan aliron implikantan funkciajn biomarkojn bazitajn sur enzima agado aŭ ĉelaj funkcioj kiel ĉela daŭrigebleco kaj fagocita aktiveco [8].Ĉi tiuj metodoj ankaŭ inkluzivas la mezuradon de la koncentriĝo de specifaj premaj indikiloj, kiuj amasiĝas en molaj histoj post la sorbado de grandaj kvantoj de mara akvo.Tamen, la alta filtra kapacito kaj duonmalferma cirkulada sistemo de bivalvoj donas ŝancon evoluigi novajn hemolimfajn biosignojn uzante la koncepton de likva biopsio (LB), simpla kaj minimume enpenetra aliro al pacienca administrado.sangospecimenoj [9, 10].Kvankam pluraj specoj de cirkulantaj molekuloj povas esti trovitaj en homa LB, tiu koncepto estas ĉefe bazita sur DNA-sekvencanalizo de cirkulantaj eksterĉelaj DNA (ccfDNA) fragmentoj en plasmo.Fakte, la ĉeesto de cirkulanta DNA en homa plasmo estas konata ekde la mezo de la 20-a jarcento [11], sed estas nur en la lastaj jaroj ke la apero de alt-rendimentaj sekvencaj metodoj kondukis al klinika diagnozo bazita sur ccfDNA.La ĉeesto de tiuj cirkulantaj DNA-fragmentoj ŝuldiĝas delvis al la pasiva liberigo de genoma DNA (nuklea kaj mitokondria) post ĉelmorto. En sanaj individuoj, la koncentriĝo de ccfDNA estas normale malalta (<10 ng/mL) sed povas esti pliigita je 5-10 fojojn en pacientoj suferantaj de diversaj patologioj aŭ submetitaj al streso, rezultigante histan damaĝon. En sanaj individuoj, la koncentriĝo de ccfDNA estas normale malalta (<10 ng/mL) sed povas esti pliigita je 5-10 fojojn en pacientoj suferantaj de diversaj patologioj aŭ submetitaj al streso, rezultigante histan damaĝon. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатрация вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. En sanaj homoj, la koncentriĝo de cccDNA estas normale malalta (<10 ng/mL), sed ĝi povas pliiĝi je 5-10 fojojn en pacientoj kun diversaj patologioj aŭ sub streso kiu kondukas al histodamaĝo.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或承常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承常较低加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 病理 或 扅理 或 扅 理 或 扏增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелича ны 10 нг/мл) с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-koncentriĝoj estas kutime malaltaj (<10 ng/ml) en sanaj individuoj, sed povas esti pliigitaj 5-10-oble en pacientoj kun diversaj patologioj aŭ streso, rezultigante histan damaĝon.La grandeco de ccfDNA fragmentoj varias vaste, sed kutime varias de 150 ĝis 200 bp.[12].Analizo de mem-derivita ccfDNA, te, ccfDNA de normalaj aŭ transformitaj gastigaj ĉeloj, povas esti uzata por detekti genetikajn kaj epigenetikajn ŝanĝojn ĉeestantajn en la nuklea kaj/aŭ mitokondria genaro, tiel helpante al klinikistoj elekti specifajn molekulajn celitajn terapiojn [13] .Tamen, ccfDNA povas esti akirita de fremdaj fontoj kiel ekzemple ccfDNA de fetaj ĉeloj dum gravedeco aŭ de transplantitaj organoj [14,15,16,17].ccfDNA ankaŭ estas grava fonto de informoj por detekti la ĉeeston de nukleaj acidoj de infekta agento (fremda), kiu permesas ne-invasivan detekton de ĝeneraligitaj infektoj ne identigitaj de sangokulturoj, evitante invadan biopsion de infektita histo [18].Lastatempaj studoj ja montris, ke homa sango enhavas riĉan fonton de informoj, kiu povas esti uzata por identigi virusajn kaj bakteriajn patogenojn, kaj ke ĉirkaŭ 1% de la ccfDNA trovita en homa plasmo estas de fremda origino [19].Tiuj studoj pruvas ke la biodiverseco de la cirkulanta mikrobiomo de organismo povas esti taksita uzante ccfDNA-analizon.Tamen, ĝis antaŭ nelonge, ĉi tiu koncepto estis uzata ekskluzive en homoj kaj, en pli malgranda mezuro, en aliaj vertebruloj [20, 21].
En la nuna artikolo, ni uzas la LB-potencialon por analizi la ccfDNA de Aulacomya atra, suda specio ofte trovita en la subantarktaj Kerguelen-insuloj, grupo de insuloj sur granda altebenaĵo kiu formiĝis antaŭ 35 milionoj da jaroj.vulkana erupcio.Uzante en-vitran eksperimentan sistemon, ni trovis, ke DNA-fragmentoj en marakvo estas rapide prenitaj de mituloj kaj eniras la hemolimfan kupeon.Ĉaspafilo-sekvencado montris ke muslohemolimfo ccfDNA enhavas DNA-fragmentojn de sia propra kaj ne-memdeveno, inkluzive de simbiozaj bakterioj kaj DNA-fragmentoj de biomoj karakterizaj por malvarmaj vulkanaj marbordaj ekosistemoj.Hemolymph ccfDNA ankaŭ enhavas virussekvencojn derivitajn de virusoj kun malsamaj gastigaj intervaloj.Ni ankaŭ trovis DNA-fragmentojn de multĉelaj bestoj kiel ostaj fiŝoj, maranemonoj, algoj kaj insektoj.Konklude, nia studo pruvas, ke la LB-koncepto povas esti sukcese aplikita al maraj senvertebruloj por generi riĉan genoman repertuaron en maraj ekosistemoj.
Plenkreskuloj (55-70 mm longaj) Mytilus platensis (M. platensis) kaj Aulacomya atra (A. atra) estis kolektitaj de la intertajdaj rokaj bordoj de Porto-Francio (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kerguelen-insuloj en decembro 2018. Aliaj plenkreskaj bluaj mituloj (Mytilus spp.) estis akiritaj de komerca provizanto (PEI Mussel King Inc., Insulo de Princo Eduardo, Kanado) kaj metitaj en temperaturkontrolitan (4°C) aerumitan tankon enhavanta 10–20 L da artefarita sala akvo 32‰.(artefarita mara salo Reef Crystal, Instant Ocean, Virginio, Usono).Por ĉiu eksperimento, la longo kaj pezo de individuaj konkoj estis mezuritaj.
Senpaga libera alira protokolo por ĉi tiu programo estas disponebla interrete (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Mallonge, LB-hemolimfo estis kolektita de abductoraj muskoloj kiel priskribite [22].La hemolimfo estis klarigita per centrifugado je 1200×g dum 3 minutoj, la supernatante estis frostigita (-20 °C) ĝis uzo.Por izolado kaj purigo de cfDNA, specimenoj (1.5-2.0 ml) estis degelitaj kaj prilaboritaj uzante la NucleoSnap cfDNA-ilaron (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.ccfDNA estis stokita je -80 °C ĝis plia analizo.En kelkaj eksperimentoj, ccfDNA estis izolita kaj purigita uzante la QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanado).Purigita DNA estis kvantigita uzante norman PicoGreen-analizon.La fragmentdistribuo de la izolita ccfDNA estis analizita per kapilara elektroforezo uzante bioanalizilon Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) uzante High Sensitivity DNA Kit.La analizo estis farita uzante 1 µl de la specimeno de ccfDNA laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
Por sekvencado de hemolimfccfDNA fragmentoj, Génome Québec (Montrealo, Kebekio, Kanado) preparis ĉaspafilbibliotekojn uzante la Illumina DNA Mix-ilaron de la Illumina MiSeq PE75-ilaro.Norma adaptilo (BioO) estis uzita.Krudaj datendosieroj estas haveblaj de la NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 kaj SRR8924809).Baza legado-kvalito estis taksita per FastQC [23].Trimmomatic [24] estis uzita por tondado de adaptiloj kaj malbonkvalitaj legas.Ĉaspafilo-legadoj kun parigitaj finoj estis FLASH kunfanditaj en pli longajn unuopajn legadojn kun minimuma interkovro de 20 bp por eviti miskongruojn [25]. Kunfanditaj legoj estis komentitaj kun BLASTN uzante bivalvan NCBI-Taksonomian datumbazon (e valoro < 1e−3 kaj 90% homologio), kaj maskado de malalt-kompleksaj sekvencoj estis farita per DUST [26]. Kunfanditaj legoj estis komentitaj kun BLASTN uzante bivalvan NCBI-Taksonomian datumbazon (e valoro < 1e−3 kaj 90% homologio), kaj maskado de malalt-kompleksaj sekvencoj estis farita per DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой низкой сло сложной слологии пользованием POLVO [26]. Kunigitaj legoj estis komentitaj kun BLASTN uzante la NCBI-bivalva taksonomia datumbazo (e valoro < 1e-3 kaj 90% homologio), kaj malalta komplekseca sekvenco-maskado estis farita per DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数并的诌数诌数＿，数低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 （ 并 读数 Ａ ， 读数 ） ） 用 用复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесанкой сономичесонкой сованием тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низологи ностей низологии с использованием POLVO [26]. Kunigitaj legoj estis komentitaj kun BLASTN uzante la NCBI-bivalva taksonomia datumbazo (e valoro <1e-3 kaj 90% homologio), kaj malalta kompleksecsekvenca maskado estis farita per DUST [26].Legaĵoj estis dividitaj en du grupojn: rilataj al bivalvaj sekvencoj (ĉi tie nomitaj memlegaj) kaj senrilataj (ne-memlegaj).Du grupoj estis aparte kunvenitaj uzante MEGAHIT por generi kontigs [27].Dume, la taksonomia distribuo de eksterteraj mikrobiomaj legadoj estis klasifikita uzante Kraken2 [28] kaj grafike reprezentita per Krona kuktabulo sur Galaxy [29, 30].La optimumaj kmers estis kialigitaj esti kmers-59 de niaj preparaj eksperimentoj. Memkontigs tiam estis identigitaj per paraleligo kun BLASTN (bivalva NCBI-datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio) por fina komentario. Memkontigs tiam estis identigitaj per paraleligo kun BLASTN (bivalva NCBI-datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio) por fina komentario. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN BI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Mem-kontigs tiam estis identigitaj per kongruo kontraŭ BLASTN (NCBI-bivalva datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio) por fina komentario.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识对齐来识堫翇臍西褓最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сона Bпос х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Mem-kontigs tiam estis identigitaj por fina komentario per kongruo kontraŭ BLASTN (NCBI-bivalva datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio). Paralele, nememaj grupaj kontigs estis komentitaj kun BLASTN (nt NCBI-datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). Paralele, nememaj grupaj kontigs estis komentitaj kun BLASTN (nt NCBI-datumbazo, e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данннач, 10-10 гомология 60%). Paralele, eksterlandaj grupaj kontigs estis komentitaj kun BLASTN (NT NCBI-datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд на BLASBI ачение e <1e-10 и гомология 60%). Paralele, ne-memaj grupaj kontigs estis komentitaj kun BLASTN (nt NCBI-datumbazo, e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio). BLASTX ankaŭ estis farita sur nememaj kontigs uzante la nr- kaj RefSeq-proteinajn NCBI-datumbazon (e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). BLASTX ankaŭ estis farita sur nememaj kontigs uzante la nr- kaj RefSeq-proteinajn NCBI-datumbazon (e-valoro < 1e−10 kaj 60% homologio). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка на бель на 10 kaj гомология 60%). BLASTX ankaŭ estis farita sur ne-memaj kontigs uzante la nr- kaj RefSeq NCBI-proteinajn datumbazojn (e-valoro < 1e-10 kaj 60% homologio).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性）还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性） BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безни NC белка бель 1 белка NC бель 1 гомология 60%). BLASTX ankaŭ estis farita sur ne-memaj kontigs uzante la nr- kaj RefSeq NCBI-proteinajn datumbazojn (e-valoro <1e-10 kaj 60% homologio).La BLASTN kaj BLASTX naĝejoj de ne-mem-kontigs reprezentas la finajn kontigs (vidu Suplementan dosieron).
La enkondukoj uzitaj por PCR estas listigitaj en Tabelo S1.Taq DNA-polimerazo (Bio Basic Canada, Markham, ON) kutimis plifortigi la ccfDNA-celgenojn.La jenaj reakcikondiĉoj estis uzataj: denaturado je 95 °C dum 3 minutoj, 95 °C dum 1 minuto, fiksita kalcia temperaturo dum 1 minuto, plilongigo je 72 °C dum 1 minuto, 35 cikloj, kaj finfine 72 °C ene de 10 minutoj..PCR-produktoj estis apartigitaj per elektroforezo en agarozaj ĝeloj (1.5%) enhavantaj SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanado) ĉe 95 V.
Mituloj (Mytilus spp.) estis alklimatigitaj en 500 ml oksigenita marakvo (32 PSU) dum 24 horoj je 4 °C.Plasmida DNA enhavanta enigaĵon kodantan la homan galectin-7 cDNA-sekvencon (NCBI-surtroniĝnumero L07769) estis aldonita al la fiolo ĉe fina koncentriĝo de 190 μg/μl.Musloj kovataj sub la samaj kondiĉoj sen DNA-aldono estis la kontrolo.La tria kontroltanko enhavis DNA sen mituloj.Por kontroli la kvaliton de DNA en marakvo, marakvoprovaĵoj (20 μl; tri ripetoj) estis prenitaj de ĉiu tanko en la indikita tempo.Por plasmida DNA-spurebleco, LB-musloj estis rikoltitaj en la indikitaj tempoj kaj analizitaj per qPCR kaj ddPCR.Pro la alta salenhavo de marakvo, alikvotoj estis diluitaj en PCR-kvalita akvo (1:10) antaŭ ĉiuj PCR-analizoj.
Cifereca guto PCR (ddPCR) estis farita per la BioRad QX200-protokolo (Misissauga, Ontario, Kanado).Uzu la temperaturprofilon por determini la optimuman temperaturon (Tabelo S1).Gutoj estis generitaj per QX200-gutgeneratoro (BioRad).ddPCR estis efektivigita jene: 95 °C dum 5 minutoj, 50 cikloj de 95 °C dum 30 s kaj donita kalcia temperaturo dum 1 minuto kaj 72 °C dum 30 s, 4 °C dum 5 minutoj kaj 90 °C ene de 5 minutoj.La nombro da gutoj kaj pozitivaj reagoj (nombro da kopioj/µl) estis mezuritaj per QX200-gutlegilo (BioRad).Provaĵoj kun malpli ol 10,000 gutetoj estis malaprobitaj.Padronkontrolo ne estis farita ĉiufoje kiam ddPCR estis rulita.
qPCR estis farita per Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidnejo, Aŭstralio) kaj LGALS7-specifaj enkondukoj.Ĉiuj kvantaj PCR estis faritaj en 20 µl uzante la QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR estis komencita per 15-minuta kovado je 95 °C sekvita de 40 cikloj je 95 °C dum 10 sekundoj kaj je 60 °C dum 60 sekundoj kun unu datumkolekto.Fandaj kurboj estis generitaj per sinsekvaj mezuradoj je 95 °C dum 5 s, 65 °C dum 60 s, kaj 97 °C ĉe la fino de la qPCR.Ĉiu qPCR estis farita triope, krom kontrolprovaĵoj.
Ĉar mituloj estas konataj pro sia alta filtra indico, ni unue esploris ĉu ili povus filtri kaj reteni DNA-fragmentojn ĉeestantajn en marakvo.Ni ankaŭ interesiĝis pri tio, ĉu tiuj fragmentoj akumuliĝas en sia duonmalferma limfa sistemo.Ni solvis ĉi tiun problemon eksperimente spurante la sorton de solveblaj DNA-fragmentoj aldonitaj al bluaj mituloj-tankoj.Por faciligi spuradon de DNA-fragmentoj, ni uzis fremdan (ne mem) plasmidan DNA enhavantan la homan galektin-7-genon.ddPCR spuras plasmidajn DNA-fragmentojn en marakvo kaj mituloj.Niaj rezultoj montras, ke se la kvanto de DNA-fragmentoj en marakvo restis relative konstanta dum tempo (ĝis 7 tagoj) en foresto de mituloj, tiam en ĉeesto de mituloj ĉi tiu nivelo preskaŭ tute malaperis ene de 8 horoj (Fig. 1a,b).Fragmentoj de eksogena DNA estis facile detektitaj ene de 15 min en intravalvula fluido kaj hemolimfo (Fig. 1c).Ĉi tiuj fragmentoj ankoraŭ povus esti detektitaj ĝis 4 horojn post eksponiĝo.Ĉi tiu filtra agado rilate al DNA-fragmentoj estas komparebla al la filtra agado de bakterioj kaj algoj [31].Tiuj rezultoj indikas ke mituloj povas filtri kaj akumuli fremdan DNA en siaj fluidaj sekcioj.
Relativaj koncentriĝoj de plasmida DNA en marakvo en la ĉeesto (A) aŭ foresto (B) de mituloj, mezuritaj per ddPCR.En A, la rezultoj estas esprimitaj kiel procentoj, kun la randoj de la kestoj reprezentantaj la 75-a kaj 25-a procentoj.La konvenita logaritma kurbo estas montrita en ruĝa, kaj la areo ombrita en griza reprezentas la 95%-konfidan intervalon.En B, la ruĝa linio reprezentas la meznombre kaj la blua linio reprezentas la 95%-konfidan intervalon por la koncentriĝo.C Amasiĝo de plasmida DNA en la hemolimfo kaj valvula likvaĵo de mituloj en malsamaj tempoj post aldono de plasmida DNA.Rezultoj estas prezentitaj kiel absolutaj kopioj detektitaj/mL (± SE).
Poste, ni esploris la originon de ccfDNA en mituloj kolektitaj de mituloj sur la Kerguelen-insuloj, malproksima grupo de insuloj kun limigita antropogena influo.Por ĉi tiu celo, cccDNA de muslaj hemolimfoj estis izolita kaj purigita per metodoj kutime uzataj por purigi homan cccDNA [32, 33].Ni trovis, ke mezaj hemolimfccfDNA-koncentriĝoj en mituloj estas en la malaltaj mikrogramoj per ml de hemolimfa gamo (vidu Tabelon S2, Suplementaj Informoj).Ĉi tiu gamo de koncentriĝoj estas multe pli granda ol ĉe sanaj homoj (malaltaj nanogramoj por mililitro), sed en maloftaj kazoj, ĉe kanceruloj, la nivelo de ccfDNA povas atingi plurajn mikrogramojn por mililitro [34, 35].Analizo de la grandecdistribuo de hemolimfa ccfDNA montris ke tiuj fragmentoj varias multe en grandeco, intervalante de 1000 bp ĝis 1000 bp.ĝis 5000 bp (Fig. 2).Similaj rezultoj estis akiritaj per la silic-bazita QIAamp Investigator Kit, metodo ofte uzata en krimmedicina scienco por rapide izoli kaj purigi genoman DNA de malaltaj koncentriĝaj DNA-provaĵoj, inkluzive de ccfDNA [36].
Reprezenta ccfDNA elektroforegramo de musla hemolimfo.Ekstraktita per NucleoSnap Plasma Kit (supro) kaj QIAamp DNA Investigator Kit.B Violinintrigo montrante la distribuadon de hemolimfccfDNA-koncentriĝoj (±SE) en mituloj.La nigraj kaj ruĝaj linioj reprezentas la medianon kaj la unuan kaj trian kvartilojn, respektive.
Proksimume 1% de ccfDNA en homoj kaj primatoj havas fremdan fonton [21, 37].Konsiderante la duonmalferman cirkulan sistemon de bivalvoj, mikrob-riĉa marakvo, kaj la granddistribuo de muslo ccfDNA, ni hipotezis ke muslohemolimfa ccfDNA povas enhavi riĉan kaj diversan naĝejon de mikroba DNA.Por testi ĉi tiun hipotezon, ni sekvencis hemolimfccfDNA de Aulacomya atra specimenoj kolektitaj de la Kerguelen-insuloj, donante pli ol 10 milionojn da legaĵoj, 97.6% de kiuj trapasis kvalitkontrolon.La legaĵoj tiam estis klasifikitaj laŭ memaj kaj ne-memaj fontoj uzante la BLASTN kaj NCBI-bivalvaj datumbazoj (Fig. S1, Suplementaj Informoj).
En homoj, kaj nuklea kaj mitokondria DNA povas esti liberigita en la sangocirkuladon [38].Tamen, en la nuna studo, ne eblis detale priskribi la nuklean genoman DNA de mituloj, ĉar la A. atra genaro ne estis sekvencita aŭ priskribita.Tamen, ni povis identigi kelkajn ccfDNA fragmentojn de nia propra origino uzante la bivalva biblioteko (Fig. S2, Suplementa Informo).Ni ankaŭ konfirmis la ĉeeston de DNA-fragmentoj de nia propra origino per direktita PCR plifortigo de tiuj A. atra genoj kiuj estis sekvencitaj (Fig. 3).Simile, donita ke la mitokondria genaro de A. atra estas havebla en publikaj datumbazoj, oni povas trovi indicon por la ĉeesto de mitokondriaj ccfDNA fragmentoj en la hemolimfo de A. atra.La ĉeesto de mitokondriaj DNA-fragmentoj estis konfirmita per PCR-amplificado (Fig. 3).
Diversaj mitokondriaj genoj ĉeestis en la hemolimfo de A. atra (ruĝaj punktoj - akcia numero: SRX5705969) kaj M. platensis (bluaj punktoj - akcia nombro: SRX5705968) plifortigita per PCR.Figuro adaptita de Breton et al., 2011 B Plifortigo de hemolimfa supernatant de A. atra Stokita sur FTA-papero.Uzu 3 mm stampilon por aldoni rekte al la PCR-tubo enhavanta la PCR-miksaĵon.
Konsiderante la abundan mikroban enhavon en marakvo, ni komence koncentriĝis pri la karakterizado de mikrobaj DNA-sekvencoj en hemolimfo.Por fari tion, ni uzas du malsamajn strategiojn.La unua strategio uzis Kraken2, algoritm-bazitan sekvencon klasifikan programon kiu povas identigi mikrobajn sekvencojn kun precizeco komparebla al BLAST kaj aliaj iloj [28].Pli ol 6719 legaĵoj estis determinitaj esti de bakteria origino, dum 124 kaj 64 estis de arkeoj kaj virusoj, respektive (Fig. 4).La plej abundaj bakteriaj DNA-fragmentoj estis Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) kaj Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Ĉi tiu distribuo kongruas kun antaŭaj studoj pri la mara blua muslo-mikrobiomo [39, 40].Gammaproteobacteria estis la ĉefa klaso de Proteobacteria (44%), inkluzive de multaj Vibronales (Fig. 4b).La ddPCR-metodo konfirmis la ĉeeston de Vibrio DNA-fragmentoj en la ccfDNA de A. atra hemolimfo (Fig. 4c) [41].Por akiri pli da informoj pri la bakteria origino de ccfDNA, aldona aliro estis prenita (Fig. S2, Suplementa Informo). En ĉi tiu kazo, legaĵoj kiuj interkovris estis kunvenitaj kiel par-finitaj legas kaj estis klasifikitaj kiel de memo (bivalvoj) aŭ nememdeveno uzante BLASTN kaj e-valoron de 1e−3 kaj detranĉo kun >90% homologio. En ĉi tiu kazo, legaĵoj kiuj interkovris estis kunvenitaj kiel par-finitaj legas kaj estis klasifikitaj kiel de memo (bivalvoj) aŭ nememdeveno uzante BLASTN kaj e-valoron de 1e−3 kaj detranĉo kun >90% homologio. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и 1-3син и 1 ждению с гомологией> 90%. En ĉi tiu kazo, imbrikitaj legaĵoj estis kolektitaj kiel par-finitaj legadoj kaj estis klasifikitaj kiel indiĝenaj (bivalvaj) aŭ ne-originalaj uzante BLASTN kaj e-valoron de 1e-3 kaj tranĉo kun >90% homologio.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倢值倢倭值怢末端读数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 的 用 用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и концами и концами и класссоквасны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием зованием несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зованием зованием зна гори знач происхождению мологии> 90%. En ĉi tiu kazo, imbrikitaj legaĵoj estis kolektitaj kiel par-finitaj legaĵoj kaj klasifikitaj kiel propraj (bivalvoj) aŭ ne-originalaj uzante e BLASTN kaj 1e-3-valorojn kaj homologian sojlon > 90%.Ĉar la A. atra genaro ankoraŭ ne estis sekvencita, ni uzis la de novo kunigstrategio de la MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) asemblero.Totalo de 147,188 kontig'oj estis identigita kiel dependaj (bivalvoj) de origino.Ĉi tiuj kontigs tiam estis eksploditaj kun e-valoroj de 1e-10 uzante BLASTN kaj BLASTX.Ĉi tiu strategio permesis al ni identigi 482 ne-bivalvaj fragmentoj ĉeestantaj en A. atra ccfDNA.Pli ol duono (57%) de ĉi tiuj DNA-fragmentoj estis akiritaj de bakterioj, ĉefe de brankaj simbiontoj, inkluzive de sulfotrofaj simbiontoj, kaj de brankiaj simbiontoj Solemya velum (Fig. 5).
Relativa abundo ĉe la tipnivelo.B Mikroba diverseco de du ĉefaj filumoj (Firmicutes kaj Proteobacteria).Reprezenta plifortigo de ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmentoj de la 16S rRNA-geno (blua) en tri atra hemolimfoj.
Entute 482 kolektitaj kontigs estis analizitaj.Ĝenerala profilo de la taksonomia distribuado de metagenomaj kontigkotadoj (prokariotoj kaj eŭkariotoj).B Detala distribuo de bakteriaj DNA-fragmentoj identigitaj fare de BLASTN kaj BLASTX.
Kraken2-analizo ankaŭ montris, ke muslo ccfDNA enhavis arkeajn DNA-fragmentojn, inkluzive de DNA-fragmentoj de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) kaj Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).La ĉeesto de DNA-fragmentoj derivitaj de Euryarchaeota kaj Crenarchaeota, antaŭe trovitaj en la mikroba komunumo de Kaliforniaj mituloj, ne devus surprizi [42].Kvankam Euryarchaeota ofte estas asociita kun ekstremaj kondiĉoj, nun estas rekonite ke kaj Euryarchaeota kaj Crenarcheota estas inter la plej oftaj prokariotoj en la mara kriogena medio [43, 44].La ĉeesto de metanogenaj mikroorganismoj en mituloj ne estas surpriza, donitaj lastatempaj raportoj pri ampleksaj metanlikoj de malsupraj likoj sur la Kerguelen Altebenaĵo [45] kaj ebla mikroba metanproduktado observita ĉe la marbordo de la Kergueleninsuloj [46].
Nia atento tiam ŝanĝiĝis al legaĵoj de DNA-virusoj.Laŭ nia scio, ĉi tiu estas la unua ekstercela studo pri la virusenhavo de mituloj.Kiel atendite, ni trovis DNA-fragmentojn de bakteriofagoj (Caudovirales) (Fig. 6b).Tamen, la plej ofta virusa DNA venas de filumo de nukleocitovirusoj, ankaŭ konata kiel la nuklea citoplasma granda DNA-viruso (NCLDV), kiu havas la plej grandan genaron de iu viruso.Ene de tiu filumo, la plej multaj DNA-sekvencoj apartenas al la familioj Mimimidoviridae (58%) kaj Poxviridae (21%), kies naturaj gastigantoj inkludas vertebrulojn kaj artropodojn, dum malgranda proporcio de tiuj DNA-sekvencoj apartenas al konataj virologiaj algoj.Infektas marajn eŭkariotajn algojn.La sekvencoj ankaŭ estis akiritaj de la Pandora viruso, la giganta viruso kun la plej granda genargrandeco de iuj konataj virusgenroj.Kurioze, la gamo da gastigantoj konataj esti infektitaj kun la viruso, kiel determinite per hemolimfa ccfDNA-sekvencado, estis relative granda (Figuro S3, Suplementaj Informoj).Ĝi inkludas virusojn kiuj infektas insektojn kiel ekzemple Baculoviridae kaj Iridoviridae, same kiel virusojn kiuj infektas amebon, algojn kaj vertebrulojn.Ni ankaŭ trovis sekvencojn kongruantajn kun la genaro de Pithovirus sibericum.Pitovirusoj (ankaŭ konataj kiel "zombiaj virusoj") unue estis izolitaj de 30,000-jara permafrosto en Siberio [47].Tiel, niaj rezultoj estas kongruaj kun antaŭaj raportoj montrantaj ke ne ĉiuj modernaj specioj de tiuj virusoj estas formortintaj [48] kaj ke tiuj virusoj povas ĉeesti en malproksimaj subarktaj maraj ekosistemoj.
Fine, ni provis vidi ĉu ni povus trovi DNA-fragmentojn de aliaj multĉelaj bestoj.Totalo de 482 eksterlandaj kontigs estis identigita fare de BLASTN kaj BLASTX kun nt, nr kaj RefSeq-bibliotekoj (genomic kaj proteino).Niaj rezultoj montras, ke inter la fremdaj fragmentoj de ccfDNA de multĉelaj bestoj regas DNA de ostaj ostoj (Fig. 5).DNA-fragmentoj de insektoj kaj aliaj specioj ankaŭ estis trovitaj.Relative granda parto de la DNA-fragmentoj ne estis identigita, eble pro la subreprezento de granda nombro da maraj specioj en genomaj datumbazoj kompare kun surteraj specioj [49].
En la nuna artikolo, ni aplikas la LB-koncepton al mituloj, argumentante, ke hemolimfa ccfDNA-pafo-sekvencado povas doni sciojn pri la konsisto de maraj marbordaj ekosistemoj.Aparte, ni trovis ke 1) musla hemolimfo enhavas relative altajn koncentriĝojn (mikrogramaj niveloj) de relative grandaj (~1-5 kb) cirkulantaj DNA-fragmentoj;2) ĉi tiuj DNA-fragmentoj estas kaj sendependaj kaj nesendependaj 3) Inter la fremdaj fontoj de tiuj DNA-fragmentoj, ni trovis bakterian, arkean kaj virusan DNA, same kiel DNA de aliaj multĉelaj bestoj;4) La amasiĝo de ĉi tiuj fremdaj ccfDNA fragmentoj en la hemolimfo okazas rapide kaj kontribuas al la interna filtra agado de mituloj.Konklude, nia studo pruvas, ke la koncepto de LB, kiu ĝis nun estis aplikata ĉefe en la kampo de biomedicino, ĉifras riĉan sed neesploritan fonton de scio, kiu povas esti uzata por pli bone kompreni la interagadon inter gardostaraj specioj kaj ilia medio.
Krom primatoj, ccfDNA-izolado estis raportita en mamuloj, inkluzive de musoj, hundoj, katoj kaj ĉevaloj [50, 51, 52].Tamen, laŭ nia scio, nia studo estas la unua se temas pri raporti la detekton kaj sekvencon de ccfDNA en maraj specioj kun malferma cirkuladsistemo.Ĉi tiu anatomia trajto kaj filtra kapablo de mituloj povas, almenaŭ delvis, klarigi la malsamajn grandecokarakterizaĵojn de cirkulantaj DNA-fragmentoj kompare kun aliaj specioj.En homoj, la plej multaj DNA-fragmentoj cirkulantaj en la sango estas malgrandaj fragmentoj intervalantaj en grandeco de 150 ĝis 200 bp.kun maksimuma pinto de 167 bp [34, 53].Malgranda sed signifa parto de DNA-fragmentoj estas inter 300 kaj 500 bp en grandeco, kaj proksimume 5% estas pli longaj ol 900 bp.[54].La kialo de tiu grandecdistribuo estas ke la ĉeffonto de ccfDNA en plasmo okazas kiel rezulto de ĉelmorto, aŭ pro ĉelmorto aŭ pro nekrozo de cirkulantaj hematopoezaj ĉeloj en sanaj individuoj aŭ pro apoptozo de tumorĉeloj en kanceruloj (konata kiel cirkulanta tumora DNA)., ctDNA).La grandecdistribuo de hemolimfa ccfDNA kiun ni trovis en mituloj intervalis de 1000 ĝis 5000 bp, sugestante ke mitulo ccfDNA havas malsaman originon.Tio estas logika hipotezo, ĉar mituloj havas duonmalferman angian sistemon kaj vivas en maraj akvaj medioj enhavantaj altajn koncentriĝojn de mikroba genoma DNA.Fakte, niaj laboratoriaj eksperimentoj uzantaj eksogenan DNA montris, ke mituloj amasigas DNA-fragmentojn en marakvo, almenaŭ post kelkaj horoj ili estas degradataj post ĉela preno kaj/aŭ liberigitaj kaj/aŭ stokitaj en diversaj organizaĵoj.Surbaze de la maloftaĵo de ĉeloj (kaj prokariotaj kaj eŭkariotaj), la uzo de intravalvulaj sekcioj reduktos la kvanton de ccfDNA de memfontoj same kiel de eksterlandaj fontoj.Konsiderante la gravecon de bivalva denaska imuneco kaj la granda nombro da cirkulantaj fagocitoj, ni plue hipotezis, ke eĉ fremda ccfDNA estas riĉigita en cirkulantaj fagocitoj, kiuj amasigas fremdan DNA sur konsumado de mikroorganismoj kaj/aŭ ĉelaj derompaĵoj.Kune, niaj rezultoj montras, ke bivalva hemolimfa ccfDNA estas unika deponejo de molekulaj informoj kaj plifortigas ilian statuson kiel gardostaranto.
Niaj datumoj indikas, ke sekvencado kaj analizo de bakteri-derivitaj hemolimfaj ccfDNA fragmentoj povas provizi ŝlosilajn informojn pri la gastiga bakteria flaŭro kaj la bakterioj ĉeestantaj en la ĉirkaŭa mara ekosistemo.Pafsekvencaj teknikoj rivelis sekvencojn de la komensaj bakterioj A. atra branko kiu estintus sopirita se konvenciaj 16S rRNA-identigmetodoj estus uzitaj, pro parte al referencbiblioteka biaso.Fakte, nia uzo de LB-datumoj kolektitaj de M. platensis en la sama musla tavolo ĉe Kerguelen montris, ke la konsisto de bakteriaj simbiontoj asociitaj kun brankoj estis la sama por ambaŭ mitulospecioj (Fig. S4, Suplementaj Informoj).Ĉi tiu simileco de du genetike malsamaj mituloj povas reflekti la konsiston de bakteriaj komunumoj en la malvarmaj, sulfuraj kaj vulkanaj kuŝejoj de Kerguelen [55, 56, 57, 58].Pli altaj niveloj de sulfur-reduktantaj mikroorganismoj estis bone priskribitaj dum rikoltado de mituloj de bioturbitaj marbordaj regionoj [59], kiel ekzemple la marbordo de Porto-Francio.Alia ebleco estas, ke la komensa musloflaŭro povas esti tuŝita de horizontala dissendo [60, 61].Pli da esplorado estas necesa por determini la korelacion inter la mara medio, marfundsurfaco, kaj la kunmetaĵo de simbiozaj bakterioj en mituloj.Ĉi tiuj studoj estas nuntempe daŭrantaj.
La longo kaj koncentriĝo de hemolifccfDNA, ĝia facileco de purigo, kaj alta kvalito por permesi rapidan ĉaspafilsekvencadon estas kelkaj el la multaj avantaĝoj de uzado de mitulo ccfDNA por taksi biodiversecon en maraj marbordaj ekosistemoj.Ĉi tiu aliro estas speciale efika por karakterizi virusajn komunumojn (viromes) en donita ekosistemo [62, 63].Male al bakterioj, arkeoj, kaj eŭkariotoj, virusgenaroj ne enhavas filogenetike konservitajn genojn kiel ekzemple 16S-sekvencoj.Niaj rezultoj indikas ke likvaj biopsioj de indikilspecioj kiel ekzemple mituloj povas esti uzitaj por identigi relative grandajn nombrojn da ccfDNA virusfragmentoj konataj infekti gastigantojn kiuj tipe enloĝas marbordajn marajn ekosistemojn.Ĉi tio inkluzivas virusojn konatajn infekti protozoojn, artropodojn, insektojn, plantojn kaj bakteriajn virusojn (ekz., bakteriofagoj).Simila distribuo estis trovita kiam ni ekzamenis la hemolymph ccfDNA viromon de bluaj mituloj (M. platensis) kolektitaj en la sama musla tavolo ĉe Kerguelen (Tablo S2, Suplementa Informo).Sekvencado de ĉaspafilo de ccfDNA estas ja nova aliro akiranta impeton en la studo de la viromo de homoj aŭ aliaj specioj [21, 37, 64].Ĉi tiu aliro estas precipe utila por studado de duoble-fadenaj DNA-virusoj, ĉar neniu ununura geno estas konservita inter ĉiuj duoble-fadenaj DNA-virusoj, reprezentante la plej diversan kaj larĝan klason de virusoj en Baltimoro [65].Kvankam la plej multaj el tiuj virusoj restas neklasigitaj kaj povas inkluzivi virusojn de tute nekonata parto de la virusmondo [66], ni trovis ke la viromoj kaj gastigaj teritorioj de la mituloj A. atra kaj M. platensis falas inter la du specioj.simile (vidu figuron S3, pliajn informojn).Tiu simileco ne estas surpriza, ĉar ĝi povas reflekti mankon de selektiveco en asimilado de DNA ĉeestanta en la medio.Estontaj studoj uzantaj purigitan RNA estas nuntempe necesaj por karakterizi la RNA-viromon.
En nia studo, ni uzis tre rigoran dukton adaptitan de la laboro de Kowarski kaj kolegoj [37], kiuj uzis du-paŝan forigon de kunigitaj legoj kaj kontigs antaŭ kaj post kunigo de indiĝena ccfDNA, rezultigante altan proporcion de nemapitaj legadoj.Tial ni ne povas ekskludi, ke kelkaj el ĉi tiuj nemapitaj legaĵoj ankoraŭ povas havi sian propran originon, ĉefe ĉar ni ne havas referencan genaron por ĉi tiu mitulospecio.Ni ankaŭ uzis ĉi tiun dukton ĉar ni zorgis pri la ĥimeroj inter memaj kaj ne-memaj legadoj kaj la legaj longoj generitaj de la Illumina MiSeq PE75.Alia kialo de la plimulto de neesploritaj legaĵoj estas ke multaj el la maraj mikroboj, precipe en malproksimaj lokoj kiel Kerguelen, ne estis komentitaj.Ni uzis Illumina MiSeq PE75, supozante fragmentojn de ccfDNA similaj al homa ccfDNA.Por estontaj studoj, pro niaj rezultoj montrante, ke hemolimfa ccfDNA havas pli longajn legadojn ol homoj kaj/aŭ mamuloj, ni rekomendas uzi sinsekvan platformon pli taŭga por pli longaj ccfDNA fragmentoj.Ĉi tiu praktiko multe pli facilas identigi pli da indikoj por pli profunda analizo.Akiro de la nuntempe neatingebla kompleta A. atra nuklea genarsekvenco ankaŭ multe faciligus la diskriminacion de ccfDNA de mem- kaj ne-memfontoj.Konsiderante ke nia esplorado koncentriĝis pri la ebleco apliki la koncepton de likva biopsio al mituloj, ni esperas, ke ĉar ĉi tiu koncepto estas uzata en estonta esplorado, novaj iloj kaj duktoj estos evoluigitaj por pliigi la potencialon de ĉi tiu metodo por studi la mikroban diversecon de mituloj.mara ekosistemo.
Kiel ne-invasiva klinika biomarkilo, altigitaj homaj plasmaj niveloj de ccfDNA estas asociitaj kun diversaj malsanoj, histodamaĝo kaj streskondiĉoj [67,68,69].Tiu pliiĝo estas rilata al la liberigo de DNA-fragmentoj de sia propra origino post histodamaĝo.Ni traktis ĉi tiun aferon uzante akran varmegan streson, en kiu mituloj estis mallonge elmontritaj al temperaturo de 30 °C.Ni faris ĉi tiun analizon sur tri malsamaj specoj de mituloj en tri sendependaj eksperimentoj.Tamen, ni ne trovis ajnan ŝanĝon en ccfDNA-niveloj post akra varmostreso (vidu Figuro S5, pliaj informoj).Ĉi tiu malkovro povas klarigi, almenaŭ parte, la fakton, ke mituloj havas duonmalferman cirkulan sistemon kaj amasigas grandajn kvantojn de fremda DNA pro sia alta filtra agado.Aliflanke, mituloj, kiel multaj senvertebruloj, povas esti pli rezistemaj al stres-induktita histo-damaĝo, tiel limigante la liberigon de ccfDNA en sia hemolimfo [70, 71].
Ĝis nun, DNA-analizo de biodiverseco en akvaj ekosistemoj plejparte temigis median DNA (eDNA) metastrekkodigon.Tamen, tiu metodo estas kutime limigita en biodiversecanalizo kiam enkondukoj estas uzitaj.La uzo de ĉaspafilsekvencado evitas la limigojn de PCR kaj la partian selektadon de enkondukaroj.Tiel, iusence, nia metodo estas pli proksima al la lastatempe uzata altprodukta eDNA Shotgun-sekvenca metodo, kiu kapablas rekte sekvencon fragmentan DNA kaj analizi preskaŭ ĉiujn organismojn [72, 73].Tamen, ekzistas kelkaj fundamentaj temoj kiuj distingas LB de normaj eDNA-metodoj.Kompreneble, la ĉefa diferenco inter eDNA kaj LB estas la uzo de naturaj filtrilaj gastigantoj.La uzo de maraj specioj kiel ekzemple spongoj kaj bivalvoj (Dresseina spp.) kiel natura filtrilo por studi eDNA estis raportita [74, 75].Tamen, la studo de Dreissena uzis histobiopsiojn de kiuj DNA estis eltirita.Analizo de ccfDNA de LB ne postulas histobiopsion, specialecan kaj foje multekostan ekipaĵon kaj loĝistikon asociitan kun eDNA aŭ histobiopsio.Fakte, ni ĵus raportis, ke ccfDNA de LB povas esti stokita kaj analizita kun FTA-subteno sen konservi malvarman ĉenon, kio estas grava defio por esplorado en foraj areoj [76].La eltiro de ccfDNA de likvaj biopsioj ankaŭ estas simpla kaj disponigas altkvalitan DNA por ĉaspafilo-sekvencado kaj PCR-analizo.Ĉi tio estas granda avantaĝo donita iuj el la teknikaj limigoj asociitaj kun eDNA-analizo [77].La simpleco kaj malalta kosto de la prova metodo ankaŭ estas precipe taŭgaj por longperspektivaj monitoradprogramoj.Krom ilia alta filtra kapablo, alia konata trajto de bivalvoj estas la kemia mukopolisakarida konsisto de ilia muko, kiu antaŭenigas la sorbadon de virusoj [78, 79].Tio igas bivalvojn ideala natura filtrilo por karakterizado de biodiverseco kaj la efiko de klimata ŝanĝo en antaŭfiksita akva ekosistemo.Kvankam la ĉeesto de mastro-derivitaj DNA-fragmentoj povas esti vidita kiel limigo de la metodo komparite kun eDNA, la kosto asociita kun havado de tia indiĝena ccfDNA komparite kun eDNA estas samtempe komprenebla por la vasta kvanto de informoj haveblaj por sanstudoj.ofseto gastiganto.Tio inkludas la ĉeeston de virussekvencoj integritaj en la genaron de la gastiga gastiganto.Ĉi tio estas precipe grava por mituloj, pro la ĉeesto de horizontale transdonitaj leŭkemaj retrovirusoj en bivalvoj [80, 81].Alia avantaĝo de LB super eDNA estas ke ĝi ekspluatas la fagocitan agadon de cirkulado de sangoĉeloj en la hemolimfo, kiu englutas mikroorganismojn (kaj iliajn genarojn).Fagocitozo estas la ĉefa funkcio de sangaj ĉeloj en bivalvoj [82].Fine, la metodo utiligas la altan filtran kapablon de mituloj (averaĝe 1,5 l/h da marakvo) kaj dutagan cirkuladon, kiuj pliigas la miksadon de malsamaj tavoloj de marakvo, permesante la kapton de heterologa eDNA.[83, 84].Tiel, mitulo ccfDNA-analizo estas interesa vojo donita la nutrajn, ekonomiajn, kaj mediajn efikojn de mituloj.Simila al la analizo de LB kolektita de homoj, tiu metodo ankaŭ malfermas la eblecon de mezurado de genetikaj kaj epigenezaj ŝanĝoj en gastiga DNA en respondo al eksogenaj substancoj.Ekzemple, triageneraciaj sekvencaj teknologioj povas esti antaŭviditaj por elfari genar-kovrantan metiliganalizon en indiĝena ccfDNA uzante nanoporsekvencadon.Ĉi tiu procezo devus esti faciligita per la fakto ke la longo de la mitulo ccfDNA-fragmentoj estas ideale kongrua kun longlegeblaj sekvencaj platformoj kiuj permesas genar-kovrantan DNA-metiligan analizon de ununura sekvenca kuro sen la bezono de kemiaj transformoj.85,86] Ĉi tio estas interesa ebleco, ĉar estis montrite ke DNA-metiligpadronoj daŭras super respondo al mediaj generaciaj streso kaj daŭras super respondo al mediaj generacioj streso.Tial ĝi povas doni valorajn sciojn pri la subestaj mekanismoj regantaj respondon post eksponiĝo al klimata ŝanĝo aŭ malpurigaĵoj [87].Tamen, la uzo de LB ne estas sen limigoj.Ne necesas diri, ke ĉi tio postulas la ĉeeston de indikilaj specioj en la ekosistemo.Kiel menciite supre, uzi LB por taksi la biodiversecon de antaŭfiksita ekosistemo ankaŭ postulas rigoran bioinformadikan dukton kiu enkalkulas la ĉeeston de DNA-fragmentoj de la fonto.Alia grava problemo estas la havebleco de referencaj genaroj por maraj specioj.Estas esperite ke iniciatoj kiel ekzemple la Marine Mammal Genomes Project kaj la ĵus establita Fish10k-projekto [88] faciligos tian analizon en la estonteco.La apliko de la LB-koncepto al maraj filtril-manĝigaj organismoj ankaŭ estas kongrua kun la plej novaj progresoj en sekvenca teknologio, igante ĝin bone konvena por la evoluo de multi-ohmaj biosignoj por disponigi gravajn informojn pri la sano de maraj vivejoj en respondo al media streso.
Genaro-sekvencaj datumoj estis deponitaj en la NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sub Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Efiko de klimata ŝanĝo sur mara vivo kaj ekosistemoj.Cole Biologio.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Konsideru la kombinitajn efikojn de klimata ŝanĝo kaj aliaj lokaj streĉintoj sur la mara medio.ĝenerala scienca medio.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Scienco de la unua de marto.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduktita varmotoleremo sub ripetemaj varmostreskondiĉoj klarigas la altan someran mortecon de bluaj mituloj.Scienca raporto 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Lastatempaj ŝanĝoj en la ofteco, kaŭzoj kaj amplekso de bestaj mortoj.Proc Natl Acad Sci Usono.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Multoblaj ne-speciaj specifaj patogenoj eble kaŭzis amasmortecon de Pinna nobilis.Vivo.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Ebla efiko de klimata ŝanĝo sur arktaj zoonotaj malsanoj.Int J Ĉirkaŭpolusa sano.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Bluaj mituloj (Mytilus edulis spp.) kiel signalaj organismoj en marborda poluomonitorado: revizio.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integriĝo de likva biopsio en kancero-traktado.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Likva biopsia maturiĝo: Permesas al tumora DNA cirkuli.Nat Rev Kancero.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleaj acidoj en homa plasmo.Kunvenprotokolo de filioj de Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova rolo por senĉela DNA kiel molekula signo por kancero-traktado.Kvantigo de biomolara analizo.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Likva biopsio eniras la klinikon - efektivigproblemoj kaj estontaj defioj.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW kaj aliaj.Feta DNA ĉeestas en patrina plasmo kaj serumo.Lanceto.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studo de la kurso de gravedeco kaj ĝiaj komplikaĵoj uzante cirkulantan eksterĉelan RNA en la sango de virinoj dum gravedeco.Dopediatrio.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Likva biopsio: donanta senĉela DNA estas uzata por detekti alogenajn lezojn en rengreftaĵo.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Novaĵoj en antaŭnaska diagnozo: patrina plasmogenarsekvencado.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Rapida patogendetekto kun venontgeneracia metagenomia sekvencado de infektitaj korpaj fluidoj.Nat Medicino.2021;27:115-24.