Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Angustifolius lupino (NLL, Lupinus angustifolius L.) estas leguminoza planto uzata por nutraĵproduktado kaj grunda plibonigo.La tutmonda vastiĝo de NLL kiel kultivaĵo altiris multajn patogenajn fungojn, inkluzive de lupinantraknozo, kiu kaŭzas la gigantan antraknozmalsanon.Du aleloj, Lanr1 kaj AnMan, kiuj donas pliigitan reziston, estis uzitaj en NLL-reproduktado, sed la subestaj molekulaj mekanismoj restas nekonataj.En tiu studo, la Lanr1 kaj AnMan-signoj estis uzitaj por ekzameni eŭropajn NLL-provaĵojn.Testado de la vakcino en kontrolita medio konfirmis la efikecon de ambaŭ rezistemaj organdonacantoj.Diferenca genesprimprofilado estis farita sur reprezentaj rezistemaj kaj akceptemaj linioj.Antraknozorezisto estis asociita kun troesprimo de la genaj ontologioperiodoj "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", kaj "GO:0015979 Photosynthesis".Krome, la linio Lanr1 (83A:476) montris signifan reprogramadon de transcriptome rapide post inokulado, dum la aliaj linioj montris prokraston en ĉi tiu respondo je proksimume 42 horoj.Defendorespondoj estas rilataj al la TIR-NBS, CC-NBS-LRR kaj NBS-LRR genoj, 10 proteinoj implikitaj en patogenezo, lipidaj transiga proteinoj, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glicin-riĉaj ĉelmuroproteinoj, kaj genoj de reaktiva vojo de oksigeno.Fruaj respondoj al 83A:476, inkluzive de zorgema subpremado de genoj asociitaj kun fotosintezo, koincidis kun sukcesa protekto dum la vegetativa kreskofazo de funga biologio, sugestante ke efektoro ekigas imunecon.La Mandeloop-reago estas bremsita, same kiel la totala horizontala tiriĝo.
La mallarĝfolia lupino (NLL, Lupinus angustifolius L.) estas altproteina cerealo originanta en la okcidenta mediteranea regiono1,2.Ĝi estas nuntempe kultivita kiel manĝkultivaĵo por bestoj kaj homoj.Ĝi ankaŭ estas konsiderita verda sterko en kultiv-rotadsistemoj pro nitrogenfiksado de simbiozaj nitrogenfiksantaj bakterioj kaj totala plibonigo de grundostrukturo.NLL spertis rapidan procezon de malsovaĝigo en la lasta jarcento kaj daŭre estas sub alta reprodukta premo3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Kun la ĝeneraligita kultivado de NLL, la sinsekvo de patogenaj fungoj evoluigis novajn agrikulturajn niĉojn kaj kaŭzis novajn kultivaĵ-detruajn malsanojn. La plej rimarkinda por lupinfarmistoj kaj bredistoj estis la apero de antraknozo, kaŭzita de la patogena fungo, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. La plej rimarkinda por lupinfarmistoj kaj bredistoj estis la apero de antraknozo, kaŭzita de la patogena fungo, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав, паиболее примечательным антракнозав, паиболее ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Plej rimarkinda al lupinfarmistoj kaj bredistoj estis la apero de antraknozo kaŭzita de la patogena fungo Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由真眅腏目的是炭目的是炭疽病的出现，它是现它是由眗埏它是由真 hum) iler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现说它是玟眵Hum)引人注目的是炭疽病的出现，它是玟眵Hum) d。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антратракнозогозонеров грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Plej okulfrapa al lupinfarmistoj kaj bredistoj estas la apero de antraknozo kaŭzita de la patogena fungo Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.La plej fruaj raportoj pri la malsano venis de Brazilo kaj Usono, kun tipaj simptomoj aperantaj en 1912 kaj 1929 respektive.Tamen, post proksimume 30 jaroj, la patogeno estis nomumita kiel Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld en Celita Morfologio. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.kaj H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。kaj H. Schlenk,.Antaŭmalsana fenotipado farita en la mezo de la 20-a jarcento montris iom da rezisto en NLL kaj flava lupino (L. luteus L.) surtroniĝoj, sed ĉiuj blanka lupino (L. albus L.) surtroniĝoj testitaj estis tre susceptibles15,16.Studoj montris, ke la disvolviĝo de antraknozo rilatas al pliigita precipitaĵo (aera humideco) kaj temperaturo (en la intervalo de 12-28 °C), kondukante al malobservo de rezisto ĉe pli altaj temperaturoj17, 18. Fakte, la tempo bezonata por ke konidioj ĝermu kaj la malsano komenciĝu, estis kvaroble pli mallonga je 24 °C (12 horoj) 12 °C en alta humido (17, 12 horoj) ol je 12 °C (12 horoj) alta humido.Tiel, la daŭranta mondvarmiĝo kaŭzis la disvastiĝon de antraknozo.Tamen, la malsano estis observita en Francio (1982) kaj Ukrainio (1983) kiel antaŭsigno de baldaŭa minaco, sed ŝajne estis ignorita de la lupina industrio tiutempe20,21.Kelkajn jarojn poste, tiu ruiniga malsano disvastiĝis tra la mondo kaj ankaŭ influis ĉefajn lupinajn landojn kiel Aŭstralio, Pollando kaj Germanio22,23,24.Sekvante antraknozekaperon en la mez-1990-aj jaroj, ampleksa rastrumo rezultigis la identigon de pluraj rezistemaj organdonacantoj NLL19-provaĵoj.NLL-rezisto al antraknozo estas kontrolita per du apartaj dominaj aleloj trovitaj en malsamaj ĝermoplasmofontoj: Lanr1 en kulturvario Tanjil kaj Wonga kaj AnMan en kulturvario.Mandalay 25, 26. Ĉi tiuj aleloj kompletigas la molekulajn markilojn, kiuj subtenas la elekton de rezistema ĝermoplasmo en reproduktaj programoj25,26,27,28,29,30.La rezistema reproduktlinio 83A:476 portanta la Lanr1-alelon estis krucita kun la akceptema sovaĝa linio P27255 por akiri RIL-populacion apartigantan por antraknozorezisto, kio ebligis asigni la Lanr1-lokson al kromosomo NLL-1131, 32, 33. Paraleligo de ligaj kadraj NLL-rezistaj markoj de ligaj kadraj NLL-rezisto malkaŝis genoreziston al kromosomo NLL-1131, 32, 33. la loko de ĉiuj tri aleloj sur la sama kromosomo (NLL-11), sed en malsamaj pozicioj29,34,35.Tamen, pro la malmulto de RILoj kaj la granda genetika distanco inter signoj kaj ekvivalentaj aleloj, neniuj fidindaj konkludoj povas esti desegnitaj pri iliaj subestaj genoj.Aliflanke, la uzo de inversa genetiko en lupenoj estas malfacila pro ilia tre malalta regenera potencialo, kio igas genetikan manipuladon maloportuna37.
La evoluo de malsovaĝigita ĝermoplasmo portanta la deziratan alelon en la homozigoza stato, kiel ekzemple 83A:476 (Lanr1) kaj Mandelup (AnMan), malfermis la pordon al studado de antraknozorezisto spite al la ĉeesto de kontraŭstaraj kombinaĵoj de aleloj en sovaĝaj populacioj.Ebloj de molekulaj mekanismoj.Komparu defendajn respondojn generitajn de specifaj gentipoj.Ĉi tiu studo taksis la fruan transcriptomrespondon de NLL al C. lupini-vakcinado.Unue, eŭropa NLL-germoplasma panelo enhavanta 215 liniojn estis ekzamenita uzante molekulaj signoj kiuj markas la Lanr1 kaj AnMan alelojn.Antraknozo-fenotipado tiam estis farita sur 50 NLL-linioj, antaŭe selektitaj por molekulaj signoj, sub kontrolitaj kondiĉoj.Surbaze de tiuj eksperimentoj, kvar linioj diferencantaj en antraknozorezisto kaj Lanr1/AnMan alela kunmetaĵo estis elektitaj por diferenciga defenda genesprimprofilado uzante du komplementajn alirojn: alt-trafia RNA-sekvencado kaj realtempa PCR-kvantigado.
Ekzamenado de aro de NLL-ĝermoplasmo (N = 215) kun markiloj Lanr1 (Anseq3 kaj Anseq4) kaj AnMan (Anseq4) kaj AnMan (AnManM1) montris, ke nur unu linio (95726, proksime de Salamanca-b) plifortigas la "rezistan" alelon por ĉiuj signoj, dum "ĉeesto de 173" markoj troviĝis en la proporcio de ĉiuj aleloj 17'3" .5%) linioj.Dek tri linioj produktis du "rezistemajn" alelojn de la Lanr1-signo, kaj 8 linioj produktis "rezistajn" alelojn de Lanr1.markilo.La "rezista" alelo de la markilo AnMan (Aldona Tabelo S1).Du linioj estis heterozigotaj por la signo Anseq3 kaj unu heterozigoza por la signo AnManM1.42 linioj (19.5%) portis kontraŭajn fazojn de la Anseq3 kaj Anseq4 aleloj, indikante altfrekvencon de rekombinigo inter tiuj du lokusoj.Antraknozo-fenotipoj sub kontrolitaj kondiĉoj (Suplementa Tabelo S2) malkaŝis ŝanĝeblecon en la rezisto de la testitaj gentipoj, kiu estis reflektita en la severeco de antraknozo.Diferencoj en averaĝaj poentoj variis de 1.8 (modere rezistema) ĝis 6.9 (susceptible) kaj plantopezdiferencoj variis de 0.62 (susceptible) ĝis 4.45 g (imuna). Estis signifa korelacio inter valoroj observitaj en du reproduktaĵoj de la eksperimento (0.51 por malsangravecpoentoj, P = 0.00017 kaj 0.61 por plantopezo, P <0.0001) same kiel inter ĉi tiuj du parametroj (−0.59 kaj -0.77, P <0.0001). Estis grava korelacio inter valoroj observitaj en du kopioj de la eksperimento (0.51 por malsano-graveco-poentaro, P = 0.00017 kaj 0.61 por plantopezo, P <0.0001) kaj ankaŭ inter ĉi tiuj du parametroj (−0.59 kaj -0.77, P <0.0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями в тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двару, 7ми пару,-7ми Р < 0,0001) 0,0001). Signifa korelacio estis trovita inter la valoroj observitaj en du ripetoj de la eksperimento (0.51 por malsano-graveco-poentaro, P = 0.00017 kaj 0.61 por plantopezo, P < 0.0001), same kiel inter ĉi tiuj du parametroj (- 0.59 kaj -0.77, P < 0.00001) ).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分 度评分1︺00.00.50，00.物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 为度 诸0. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（（（，，90.（及 两 个 参数 之间 （（（（（（，，90.-5.和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потцонка значениями аболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), kaj между этими двумя парамететрами 0,61, P <0,0001), kaj между этими двумя парамететрами (-1,00,509 и) . Estis grava korelacio inter la valoroj observitaj duplikate (malsana severeco-poentaro 0,51, P = 0,00017 kaj plantopezo 0,61, P <0,0001) kaj inter ĉi tiuj du parametroj (-0,59 kaj -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Tipaj simptomoj viditaj en akceptemaj plantoj inkluzivas fleksadon kaj tordiĝadon de la tigo simila al strukturo de "paŝtisto-arko", sekvataj de ovalaj lezoj kun oranĝaj/rozkoloraj sporozoitoj (Suplementa Fig. 1).Aŭstraliaj surtroniĝoj portantaj la Lanr1 (83A:476 kaj Tanjil) kaj AnMan (Mandelup) genoj estas modere rezistemaj, 0.0331 kaj 0.0036).Iuj linioj, kiuj ankaŭ portas "rezistemajn" Lanr1 kaj/aŭ AnMan-alelojn, montras simptomojn de la malsano.
Kurioze, kelkaj NLL-linioj malhavantaj ajnan "rezistan" markilon rivelis altan nivelon de antraknozorezisto (komparebla aŭ pli alta ol por Lanr1 aŭ AnMan genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro < 0.0001 por ambaŭ parametroj), Bojar (P-valoro < 0.0001 por poentaro kaj 0.0001 por planto-valoro) kaj <P. 001 por poentaro kaj ne-signifa por pezo). Kurioze, kelkaj NLL-linioj malhavantaj ajnan "rezistan" markilon rivelis altan nivelon de antraknozorezisto (komparebla aŭ pli alta ol por Lanr1 aŭ AnMan genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro < 0.0001 por ambaŭ parametroj), Bojar (P-valoro < 0.0001 por poentaro kaj 0.0001 por planto-valoro) kaj <P. 001 por poentaro kaj ne-signifa por pezo). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокави золокави, солого-либо ь устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), так0, более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), так0 1 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) kaj по 54ние P-549ние (P-549ние) ,0001 для оценки и незначимо для массы). Interese, pluraj NLL-linioj malhavantaj ajnan "rezistan" markilon-alelon montris altan nivelon de rezisto al antraknozo (komparebla al aŭ pli alta ol por Lanr1 aŭ AnMan genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro < 0.0001 por ambaŭ parametroj), Bojar (P-valoro < 0.0001 por taksado kaj B - 0.0001 por populacio-valoro kaj B - 0.0001 por plantvaloro (0.0001 por taksado) kaj B-0. 0001 por taksado kaj ne signifa por pezo).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭水平的炭疽AnLan 有趣的是基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分万0.龗分万0.数的P 值< 0,0001） 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Estas interese, ke iuj NLL-sistemoj, kiuj ne havas iujn ajn "antigenajn" markilojn, montras altan horizontalan reziston (ekvivalenta al Lanr1 aŭ AnMan-genoj aŭ pli alte), kiel ekzemple Boregine (ambaŭ parametroj P < 0,0001), Bojar (P-valoro < 0,0001, plantopezo 0,001) kaj trostreĉiĝo B-549/0, ne signifa pezo (p-549/1, 790b). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентнорые линии NLL", слистентноста в спокура стойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (знирач доли пера 0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) kaj популяция B-549/79b (оценка P-значенка P-значение 0,00001, масса 0,0001) a). Kurioze, kelkaj NLL-linioj malhavantaj iujn ajn "rezistajn" markilo-alelojn montris altajn nivelojn de antraknozorezisto (komparebla aŭ pli alta ol Lanr1 aŭ AnMan genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro por ambaŭ parametroj <0.0001), Bojar (P-valoro <0.0001, plantopezo 0.70-541) kaj populacio <0.70-541-valoro (B-valoro 0.70-54) 01, pezo ne signifa).Ĉi tiu fenomeno sugestas la eblecon de nova genetika fonto de rezisto, klarigante la observitan mankon de korelacio inter signoj-genotipoj kaj malsanfenotipoj (P-valoroj de ~0.42 ĝis ~0.98).Tiel, la Kolmogorov-Smirnov-testo montris, ke la datumoj pri antraknozo-rezisto estis proksimume normale distribuitaj por interpunkcioj (P-valoroj 0,25 kaj 0,11) kaj planta maso (P-valoroj 0,47 kaj 0,55), sugestante, ke mi hipotezas, ke pli da aleloj ol Lanr1 kaj AnMan estas implikitaj.
Surbaze de la rezultoj de antraknozorezista rastrumo, 4 linioj estis elektitaj por transkriptomanalizo: 83A:476, Boregine, Mandelup, kaj Population 22660. Tiuj linioj estis retestitaj por antraksorezisto en inokulaj eksperimentoj per RNA-sekvencado, kondiĉe ke ili estis la sama kiel en la antaŭa testo.La poentaj valoroj estis kiel sekvas: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) kaj loĝantaro 22660 (6,11 ± 1,29).
La protokolo Illumina NovaSeq 6000 atingis mezumon de 40.5 Mread-paroj per specimeno (29.7 ĝis 54.4 Mreads) (Suplementa Tabelo S3).Paraleliĝpoentaroj en la referenca sekvenco variis de 75.5% ĝis 88.6%.La averaĝa korelacio de legokalkulaj datumoj inter eksperimentaj variantoj inter biologiaj kopioj variis de 0.812 ĝis 0.997 (meznombro 0.959). El la 35,170 genoj analizitaj, 2917 rivelis neniun esprimon, kaj la aliaj 4785 genoj estis esprimitaj je nekonsiderinda nivelo (baza meznombro < 5). El la 35,170 genoj analizitaj, 2917 rivelis neniun esprimon, kaj la aliaj 4785 genoj estis esprimitaj je nekonsiderinda nivelo (baza meznombro < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов проявляли экспрессии начительном уровне (базовое среднее <5). El la 35,170 genoj analizitaj, 2917 montris neniun esprimon, kaj la ceteraj 4785 genoj estis esprimitaj je nekonsiderinda nivelo (baza meznombro <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忨达可以応表达，其他4785值< 5）.35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелсунч имелсунь имелись прессию (базовое среднее значение <5). El la 35,170 genoj analizitaj, 2917 ne estis esprimitaj kaj la ceteraj 4785 genoj havis nekonsiderindan esprimon (baza meznombro <5).Tiel, la nombro da genoj konsiderataj esprimitaj (baza meznombro ≥ 5) dum la eksperimento estis 27,468 (78,1%) (Suplementa Tabelo S4).
De la unua tempopunkto, ĉiuj NLL-linioj respondis al la inokulado de C. lupini (trostreĉiĝo Col-08) per reprogramado de la transcriptome (Tablo 1), tamen, signifaj diferencoj estis observitaj inter la linioj.Tiel, la rezistlinio 83A:476 (portanta la Lanr1-genon) montris signifan transcriptome reprogramadon ĉe la unua tempopunkto (6 hpi) kun 31-69-obla pliiĝo en la nombro da izolitaj supren- kaj malsupren-genoj komparite kun aliaj tempopunktoj ĉe tiu tempopunkto.Krome, ĉi tiu pinto estis mallongdaŭra, ĉar la esprimo de nur kelkaj genoj restis signife ŝanĝita ĉe la dua tempopunkto (12 hpi).Interese, Boregine, kiu ankaŭ montris altnivelan de rezisto en la grefttesto, ne spertis tian masivan transskriban reprogramadon dum la eksperimento.Tamen, la nombro da diferencige esprimitaj genoj (DEG) estis la sama por Boregine kaj 83A:476 ĉe 12 HPI.Kaj Mandelup kaj populacio 22660 montris DEG-pintojn ĉe la lasta tempopunkto (48 l/s), indikante relativan prokraston en defendaj respondoj.
Ĉar 83A:476 spertis masivan transcriptome-reprogramadon en respondo al C. lupini ĉe 6 HPI kompare kun ĉiuj aliaj linioj, ~91% de la DEG-oj observitaj ĉe ĉi tiu tempo estis genliniospecifa (Fig. 1).Tamen, estis iu interkovro en fruaj respondoj inter studlinioj, ĉar 68.5%, 50.9%, kaj 52.6% DEG en Boregine, Mandelup, kaj populacio 22660, respektive, interkovris kun tiuj trovitaj en 83A:476 en certaj punktoj en tempo.Tamen, tiuj DEGoj respondecis pri nur malgranda frakcio (0.97-1.70%) de ĉiuj DEGoj nuntempe detektitaj uzante 83A:476.Krome, 11 DEG-oj de ĉiuj linioj estis koheraj ĉi-momente (Aldonaj Tabloj S4-S6), inkluzive de komunaj komponentoj de plantdefendaj respondoj: lipida transiga proteino (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glukozida enzimo (TanjilG_23384), du stres-indukteblaj proteinoj (TanjilG_23384), du stres-indukteblaj proteinoj (TanjilG_323131). 531), baza lateksoproteino (TanjilG_32352), kaj du glicin-riĉaj strukturaj ĉelaj murproteinoj (TanjilG_19701 kaj TanjilG_19702).Estis ankaŭ relative alta interkovro en transcriptomaj respondoj inter 83A:476 kaj Boregine ĉe 24 HPI (totalo 16-38% DEG) kaj inter Mandelup kaj Loĝantaro 22660 ĉe 48 HPI (totalo 14-20% DEG).
Venn-diagramo montranta la nombron da diferencige esprimitaj genoj (DEG) en mallarĝfoliaj lupinaj (NLL) linioj inokulitaj kun Colletotrichum lupini (trostreĉiĝo Col-08 akirita de lupinkampoj en Wierzhenice, Pollando, 1999).La NLL-linioj analizitaj estis: 83A:476 (rezista, portanta la Lanr1-alelon), Boregine (imuna, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la AnMan-alelon) kaj populacio 22660 (tre sentema).La mallongigo hpi staras horojn post vakcinado.Nulaj valoroj estis forigitaj por simpligi la grafeon.
La aro de troesprimitaj genoj je 6 hpi estis analizita por la ĉeesto de kanonikaj R-genaj domajnoj (Suplementa Tabelo S7).Ĉi tiu studo rivelis transcriptoman indukton de klasikaj malsanrezistaj genoj kun NBS-LRR-domajnoj nur ĉe 83A:476.Tiu aro konsistis el unu TIR-NBS-LRR-geno (tanjilg_05042), kvin CC-NBS-LRR-genoj (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, kaj tanjilg_16162), kaj Kvar NBS-LR616162), kaj Kvar NBS-LR6162_RE, Kvar jilg_16162) same kiel Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) kaj Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Ĉiuj tiuj genoj havas kanonajn domajnojn aranĝitajn en konservitaj sekvencoj.Aldone al la NBS-LRR-domajngenoj, pluraj RLL-kinazoj estis aktivigitaj je 6 hpi, nome unu en Boregine (TanjilG_19877), du en Mandelup (TanjilG_07141 kaj TanjilG_19877) kaj en populacio 22660 (TanjilG_03411 kaj TanjilG_09877) 476.
Genoj kun signife ŝanĝita esprimo en respondo al inokulado kun C. lupini (trostreĉiĝo Col-08) estis submetitaj al Gene Ontology (GO) riĉiga analizo (Suplementa Tabelo S8). La plej ofte superreprezentita biologia proceza termino estis "GO:0006952-defenda respondo", kiu aperis en 6 el 16 (tempo × linio) kombinaĵoj kun alta signifo (P-valoro < 0.001) (Fig. 2). La plej ofte superreprezentita biologia proceza termino estis "GO:0006952-defenda respondo", kiu aperis en 6 el 16 (tempo × linio) kombinaĵoj kun alta signifo (P-valoro < 0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рисокой значимостью). La plej ofte superreprezentita biologia proceza termino estis "GO:0006952-defenda respondo", kiu aperis en 6 el 16 (tempo × genlinio) kombinaĵoj kun alta signifo (P-valoro < 0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（绶魗（旿魗（旺魴绶反应”个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 La plej reprezenta biologia proceztermino estas "GO:0006952 defenda respondo", kiu aperas en 6 el la 16 (时间×线) kombinaĵoj, kun alta signifo (P-valoro < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Respondo Defense» в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). La plej ofte superreprezentita biologia proceza termino estis 'GO:0006952 Defendo-Respondo', kiu aperis en 6 el 16 kombinaĵoj (tempo × linio) kun alta signifo (P-valoro < 0.001) (Fig. 2).Tiu esprimo estis troreprezentita ĉe du tempopunktoj en 83A: 476 kaj Boregine (6 kaj 24 hpi) kaj foje en Mandelup kaj Populacio 22660 (12 kaj 6 hpi, respektive).Ĉi tio estas atendata rezulto, elstarigante la kontraŭfungan respondon de la rezistemaj linioj.Krome, 83A:476 respondis al C. lupini rapide induktante genojn ligitajn al la oksidativa eksplodo reprezentita per la esprimo "GO:0055114 redox-procezo", indikante specifan defendan respondon, dum Boregine rivelis specifajn defendajn respondojn, rilatajn al la esprimo "GO".:0006950 Stresa respondo”.Loĝantaro 22660 aktivigis la horizontalan rezistan respondon engaĝante malĉefajn metabolitojn, elstarigante la troan nombron da terminoj "GO:0016104 Process of triterpene biosintezo" kaj "GO:0006722 Process of triterpene metabolo" (ambaŭ terminoj apartenas al la sama aro de genoj), konsiderante la rezultojn de GO: 0016104 Procezo de biosintezo de triterpenoj" (Ambaŭ terminoj apartenas al la sama aro de genoj), konsiderante la rezultojn de la termino-riĉiĝo de la analizo de la terma reakcio kaj la analizo de la reakcia stabileco. 22660. Krome, frua reago 83A:476 (6 hpi) kaj malfrua reago Mandelup kaj Population 22660 inkluzivas la esprimon GO:0015979 "fotosintezo" kaj aliajn rilatajn biologiajn procezojn.
La bioprocezaj genaj ontologio-terminoj elektitaj en la komentario de diferencige esprimitaj genoj dum transcriptomrespondoj de mallarĝfolia lupino (NLL) inokulita kun antraksoolupino (Col-08-trostreĉiĝo akirita de lupinkampoj en Wierzhenice, Pollando, en 1999) estas tre troigitaj.La NLL-linioj analizitaj estis: 83A:476 (rezista, portanta la homozigotan Lanr1-alelon), Boregine (imuna, nekonata genetika fono), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozigotan AnMan-alelon) kaj populacio 22660 (susceptebla).
Ĉar ĉi tiu studo celis identigi genojn, kiuj kontribuas al antraknozo-rezisto, la genoj asignitaj al la terminoj GO "GO: 0006952 Defensive responses" kaj "GO: 0055114 Redox-procezoj" estis analizitaj kun tranĉoj ĉar bazlinio signifas ≥ 30 kun almenaŭ unu linio.× punkto en tempo kombinante statistike signifajn valorojn de log2 (falda ŝanĝo).La nombro da genoj renkontantaj ĉi tiujn kriteriojn estis 65 por GO:0006952 kaj 524 por GO:0055114.
83A:476 rivelis du DEG-pintojn komentitajn kun la esprimo GO:0006952, la unua je 6 genoj je colo (64 genoj, supren kaj malsupren reguligo) kaj la dua je 24 genoj je colo (15 genoj, supren reguligo nur).Boregine ankaŭ montris, ke GO:0006952 pintis en la sama tempopunkto, sed kun malpli DEG (11 kaj 8) kaj prefera aktivigo.Mandeloop montris du pintojn de GO:0006952 ĉe 12 kaj 48 HPI, ambaŭ portante 12 genojn (la unua kun aktivigaj genoj, kaj la dua kun nur subpremaj genoj), dum la 22660 populacio ĉe 6 HPI (13 genoj) havis pli grandan superregadon de la pliiĝopinto.reguligo.Oni devas rimarki, ke 96.4% de GO:0006952 DEG en ĉi tiuj pintoj havis la saman specon de respondo (supren aŭ malsupren), indikante signifan interkovron en defendaj respondoj malgraŭ diferencoj en la nombro da genoj implikitaj.La plej granda grupo de sekvencoj ligitaj al la esprimo GO:0006952 ĉifras la Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-simila), kiu apartenas al la klaso 10 patogenez-rilata proteino (PR-10) proteinklado kaj la kernproteina latekso.simila (MLP-simila) proteino) proteino (Fig. 3).La du grupoj malsamis en la naturo de esprimo kaj la direkto de la respondo.La genoj kodantaj SAM22-similajn proteinojn montris konsekvencan kaj signifan indukton ĉe fruaj tempopunktoj (6 aŭ 12 hpi) kaj estis ĝenerale nerespondemaj ĉe la fino de la eksperimento (48 hpi), dum MLP-similaj proteinoj montris kunordigon ĉe 6 hpi.hpi.83A:476 kaj Mandelup je 48 ĉp/in, preskaŭ ĉiuj aliaj datenpunktoj estis nerespondemaj.Krome, diferencoj en esprimprofiloj de SAM22-similaj proteingenoj sekvis observitan ŝanĝeblecon en antraknozorezisto, ĉar pli rezistemaj linioj havis pli da tempopunktoj signife induktante tiujn genojn ol pli akceptemaj genoj.Alia LlR18A/B-simila PR-10 geno montris tre similan esprimpadronon al la SAM22-simila proteingeno.
La ĉefaj komponentoj de la biologia proceztermino "GO:0006952 Defense Response" kaj la esprimpadronoj de kandidataj genoj de la Lanr1 kaj AnMan aleloj estis identigitaj.La Log2-skalo reprezentas log2-valorojn (falda ŝanĝo) inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita de lupinaj kampoj, Wizhenica, Pollando, 1999) kaj kontrolaj (sam-inokulataj) plantoj samtempe.La sekvaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezista, portanta la homozigotan Lanr1-alelon), Boregine (imuna, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozigotan AnMan-alelon), kaj Populacio 22660 (susceptebla).
Krome, la esprimprofiloj de RNA-seq-kandidatgenoj Lanr1 (TanjilG_05042) kaj AnMan (TanjilG_12861) estis taksitaj (Fig. 3).La TanjilG_05042 geno montris signifan respondon (aktivigo) ĉe 83A:476 nur ĉe la unua tempopunkto (6 hpi), dum TanjilG_12861 estis signifa en Mandeloop nur ĉe du tempopunktoj: 6 hpi (malsupren reguligo) kaj 24 hpi (6 hpi).Kun.).alĝustigebla) ).
La plej superesprimitaj genoj en la termino GO:0055114 "redox-procezo" estis genoj kodantaj citokromo P450-proteinojn kaj peroksidazon (Fig. 4).Por specimenoj izolitaj de 83A:476 ĉe 6 HPI, maksimumaj aŭ minimumaj log2 (obla ŝanĝo) valoroj (por 86.6% de genoj) estis ĝenerale observitaj inter inokulitaj kaj kontrolaj plantoj, elstarigante la altan respondon de ĉi tiu genotipo al inokulado de sekso.83A:476 montris la plej signifan GO: 0055114 DEG ĉe 6 hpi (503 genoj), dum la resto de la linioj ĉe 48 hpi (Boregine, 31 genoj; Mandelup, 85 genoj; kaj Loĝantaro 22660, 78 genoj)).En la plej multaj genoj de la familio GO:0055114, du specoj de respondoj al vakcinado (aktivigo kaj inhibicio) estis observitaj.Kurioze, ĝis 97.6% de la DEG identigitaj por la termino GO: 0055114 en Mandelupe je 48 hp. Ĉi tiuj observoj sugestas, ke malgraŭ la signife pli malgranda skalo (t.e., la nombro da mutaciitaj redox-genoj, 85 kontraŭ 503), la ŝablono de malfruaj transkriptomaj respondoj similas al la frua respondo de 64:64 al la respondo de rdox-malfruaj.En Boregine kaj Loĝantaro 22660, ĉi tiu konverĝo estas pli malalta ĉe 51.6% kaj 75.6%, respektive.
La ŝablonoj de esprimo de la ĉefaj komponantoj de la termino de la biologia procezo "GO:0055114 Redox-procezo" estis malkaŝitaj.La Log2-skalo reprezentas log2-valorojn (falda ŝanĝo) inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita de lupinaj kampoj, Wizhenica, Pollando, 1999) kaj kontrolaj (sam-inokulataj) plantoj samtempe.La sekvaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezista, portanta la homozigotan Lanr1-alelon), Boregine (imuna, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozigotan AnMan-alelon), kaj Populacio 22660 (susceptebla).
83A:476 Transcriptomic-respondoj al inokulado kun C. lupini (trostreĉiĝo Col-08) ankaŭ inkludis kunordigitan silentigon de genoj atribuitaj al la esprimo GO:0015979 "fotosintezo" kaj aliaj rilataj biologiaj procezoj (FIG. 5).Ĉi tiu GO:0015979 DEG-aro enhavis 105 genojn kiuj estis signife subpremitaj ĉe 6 hpi ĉe 83A:476.En tiu subaro, 37 genoj ankaŭ estis subreguligitaj en Mandelup ĉe 48 HPI kaj 35 en la sama tempopunkto en la 22660 populacio, inkluzive de 19 DEGoj komunaj al ambaŭ gentipoj.Neniuj DEG rilate al termino GO: 0015979 estis signife aktivigitaj en iu ajn kombinaĵo (linio x tempo).
La ŝablonoj de esprimo de la ĉefaj komponantoj de la termino de la biologia procezo "GO:0015979 Fotosintezo" estis malkaŝitaj.La Log2-skalo reprezentas log2-valorojn (falda ŝanĝo) inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita de lupinaj kampoj, Wizhenica, Pollando, 1999) kaj kontrolaj (sam-inokulataj) plantoj samtempe.La sekvaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezista, portanta la homozigotan Lanr1-alelon), Boregine (imuna, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozigotan AnMan-alelon), kaj Populacio 22660 (susceptebla).
Surbaze de la rezultoj de diferenciga esprima analizo kaj supozeble implikita en defendaj respondoj kontraŭ patogenaj fungoj, ĉi tiu aro de sep genoj estis elektita por kvantigado de esprimaj profiloj per realtempa PCR (Suplementa Tabelo S9).
La supozata proteina geno TanjilG_10657 estis signife induktita en ĉiuj studitaj linioj kaj tempopunktoj kompare kun kontrolaj (imitantaj) plantoj (Suplementaj Tabeloj S10, S11).Krome, la esprima profilo de TanjilG_10657 montris kreskantan tendencon dum la eksperimento por ĉiuj linioj.Loĝantaro 22660 montris la plej altan sentivecon de TanjilG_10657 al inokulado kun 114-obla aktivigo kaj la plej alta relativa esprimnivelo (4.4 ± 0.4) ĉe 24 HPI (Fig. 6a).La PR10 LlR18A proteina geno TanjilG_27015 ankaŭ montris aktivigon tra ĉiuj linioj kaj tempopunktoj, kun statistika signifo maksimume datumpunktoj (Fig. 6b).Simile al TanjilG_10657, la plej alta relativa esprimnivelo de TanjilG_27015 estis observita en la 22660 inokulita populacio ĉe 24 HPI (19.5 ± 2.4).La acida endokitinaza geno TanjilG_04706 estis signife suprenreguligita en ĉiuj linioj kaj en ĉiuj tempopunktoj krom Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Ĝi estis forte induktita ĉe la unua tempopunkto (6 HPI) ĉe 83A:476 (je 10.5 fojojn) kaj modere pliiĝis en aliaj linioj (per 6.6-7.5 fojojn).Dum la eksperimento, la esprimo de TanjilG_04706 restis sur similaj niveloj en 83A:476 kaj Boregine, dum en Mandelup kaj Loĝantaro 22660 ĝi signife pliiĝis, atingante relative altajn valorojn (5.9 ± 1.5 kaj 6.2 ± 1.5, respektive).La endoglucan-1,3-β-glucosidase-simila geno TanjilG_23384 montris altan aktivigon ĉe la unuaj du tempopunktoj (6 kaj 12 hpi) en ĉiuj linioj krom populacio 22660 (Fig. 6d).La plej altaj relativaj esprimniveloj de TanjilG_23384 estis observitaj ĉe la dua tempopunkto (12 hpi) en Mandelup (2.7 ± 0.3) kaj 83A:476 (1.5 ± 0.1).Je 24 HPI, TanjilG_23384-esprimo estis relative malalta en ĉiuj studitaj linioj (de 0.04 ± 0.009 ĝis 0.44 ± 0.12).
Esprimprofiloj de elektitaj genoj (ag) rivelitaj per kvanta PCR.La numeroj 6, 12 kaj 24 reprezentas horojn post vakcinado.La LanDExH7 kaj LanTUB6-genoj estis uzitaj por normaligo kaj LanTUB6 estis uzita por inter-seria alĝustigo.Erarstangoj reprezentas la norman devion bazitan sur tri biologiaj kopioj, ĉiu el kiuj estas la mezumo de tri teknikaj kopioj. La statistika signifo de diferencoj en la esprimniveloj inter la inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita en 1999 el la lupina kampo en Wierzenica, Pollando) kaj kontrolo (mok-inokulataj) plantoj estas markitaj super datenpunktoj (*P-valoro < 0.05, **P-valoro ≤ 0.0.0. ≤ 0.0.). La statistika signifo de diferencoj en la esprimniveloj inter la inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita en 1999 el la lupina kampo en Wierzenica, Pollando) kaj kontrolo (mok-inokulataj) plantoj estas markitaj super datenpunktoj (*P-valoro < 0.05, **P-valoro ≤ 0.0.0. ≤ 0.0.). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, мунш прессии между инокулированными) 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) расчд мными расто и данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistike signifaj diferencoj en esprimniveloj inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita en 1999 de lupinkampo en Wierzhenice, Pollando) kaj kontrolaj (sham-inokulataj) plantoj estas notitaj super la datenpunktoj (*P-valoro < 0.05, **P-valoro ≤ 0.01, ≤ 0.0.0.接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟照（模拟（模拟掉模拟掉波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值.≤ 值.001)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照水波兰 ）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Koletotrichum lupini олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными расдимы нымтет олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) ми данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistike signifaj diferencoj en esprimniveloj inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita de lupinkampoj en Verzhenice, Pollando, en 1999) kaj kontrolaj (sham-inokulataj) plantoj estas notitaj super la datumaj punktoj (*P-valoro < 0.05 , **P-valoro ≤ 0.01, ≤ 0-0.La NLL-linioj analizitaj estis: 83A:476 (rezista, portanta la homozigozan Lanr1-alelon), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozigozan AnMan-alelon), Boregine (imuna, nekonata genetika fono) kaj populacio 22660 (susceptebla).
La kandidato geno TanjilG_05042 ĉe la Lanr1-lokuso montris rimarkinde malsaman espriman ŝablonon de la profiloj akiritaj de RNA-seq-studoj (Fig. 6e).Signifa aktivigo de ĉi tiu geno estis observita en Mandelup kaj la 22660 populacio (ĝis 39.7 kaj 11.7 fojojn, respektive), rezultigante relative altajn esprimnivelojn (ĝis 1.4 ± 0.14 kaj 7.2 ± 1.3, respektive).83A:476 ankaŭ rivelis iun plialtigon de la TanjilG_05042 geno (ĝis 3.8-obla), tamen, la relativaj esprimniveloj atingitaj (0.044 ± 0.002) estis pli ol 30-oble pli malaltaj ol tiuj observitaj en Mandelup kaj la 22660 populacio.analizita de qPCR montris signifajn diferencojn en esprimniveloj inter gentipoj en mok-vakcinitaj (kontrolo) variaĵoj, atingante 58-oblan diferencon inter populacioj 22660 kaj 83A:476, same kiel inter populacioj 22660 kaj 22660. Duobla diferenco estis atingita inter Boregine kaj Mandalup.
La kandidato geno ĉe la AnMan-lokuso, TanjilG_12861, estis aktivigita en respondo al vakcinado en 83A:476 kaj Mandelup, estis neŭtrala en la 22660-populacio, kaj estis subreguligita en Boregine (Fig. 6f).La relativa esprimo de la TanjilG_12861 geno estis la plej alta en inokulita 83A: 476 (0.14±0.01).La 17.4 kDa klaso I varmoŝoka proteina geno TanjilG_05080 HSP17.4 montris pli malaltajn relativajn esprimnivelojn en ĉiuj studitaj streĉoj kaj tempopunktoj (Fig. 6g).La plej alta valoro estis observita ĉe 24 HPI en la 22660 populacio (0.14 ± 0.02, ok-obla pliiĝo en respondo al vakcinado).
Komparo de gen-esprimprofiloj (Fig. 7) rivelis altan korelacion inter TanjilG_10657 kaj kvar aliaj genoj: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80.), kaj = 470.6G, (r = 0.89).Tiaj rezultoj povas indiki kunreguligon de tiuj genoj dum defendaj respondoj.La genoj TanjilG_12861 kaj TanjilG_23384 montris malsamajn esprimprofilojn kun pli malaltaj Pearson-korelaciaj koeficientaj valoroj (de 0,08 ĝis 0,43 kaj -0,19 ĝis 0,28, respektive) kompare kun aliaj genoj.
Korelacioj inter genekspresioprofiloj estis detektitaj uzante kvantan PCR.La sekvaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezista, portanta la homozigotan Lanr1-alelon), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozigotan AnMan-alelon), Boregine (imuna, genetika fono nekonata), kaj Loĝantaro 22660 (susceptebla).Tri tempopunktoj estis kalkulitaj (6, 12 kaj 24 horojn post inokulado), inkluzive de inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita de lupinkampoj en Wierzhenice, Pollando, en 1999) kaj kontrolaj (sham-inokulataj) plantoj.La skalo montras la valoron de la Pearson-korelacia koeficiento.
Surbaze de datumoj akiritaj je 6 ĉevalfortoj per colo, WGCNA estis farita sur 9981 DEG identigitaj komparante inokulitajn kaj kontrolajn plantojn por temigi fruajn defendajn respondojn (Suplementa Tabelo S12).Dudek du genmoduloj (aretoj) estis trovitaj kun korelaciitaj (pozitivaj aŭ negativaj) esprimoprofiloj inter gentipoj kaj eksperimentaj variaĵoj. Averaĝe, gen-esprimniveloj estis malkreskantaj en ordo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 (en ambaŭ variantoj, tamen, tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj). Averaĝe, gen-esprimniveloj estis malkreskantaj en ordo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 (en ambaŭ variantoj, tamen, tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 (в оботих датах вато нденция была сильнее у контрольных растений). Averaĝe, gen-esprimniveloj malpliiĝis en la ordo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 (en ambaŭ variantoj, tamen, tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 的顺序下降（然而，在两缌䜨两缌在势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populacio 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 筌 在 筌 ， 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 ция была сильнее у контрольных растений). Averaĝe, gen-esprimniveloj malpliiĝis en la serio 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 (tamen, en ambaŭ variantoj, ĉi tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj).Vakcinado rezultigis suprenreguligo de genesprimo, precipe en moduloj 18, 19, 14, 6 kaj 1 (en malkreskanta sinsekvo de efiko), negativa reguligo (ekz. moduloj 9 kaj 20) aŭ kun neŭtralaj efikoj (ekz. moduloj 11, 22, 8 kaj 13).GO-terminriĉiga analizo (Suplementa Tabelo S13) rivelis "GO: 0006952 Protektaj respondoj" por la inokulita modulo (18) kun maksimuma aktivigo, inkluzive de genoj analizitaj per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657), same kiel la plej multaj subpremitaj fotoj, kaj la plej multaj subpremitaj fotoj. s moduloj (9).Modulo 18-koncentrilo (Fig. 8) estis identigita kiel la TanjilG_26536-geno kodanta la PR-10-similan LlR18B-proteinon, kaj modulo 9-koncentrilo estis identigita kiel la TanjilG_28955-geno kodanta la fotosistemo II PsbQ-proteinon.Kandidata antraknozorezista geno Lanr1, TanjilG_05042, estis trovita en modulo 22 (Fig. 9) kaj estas rilata al la esprimoj "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" kaj "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" portanta la TanjilG_0121-nabon.la geno ĉifras varmstresan transkripcifaktoron A-4a (HSFA4a).
Pezita reta analizo de gena kunesprimo de moduloj kun troreprezentitaj biologiaj procezperiodoj "GO: 0006952 Defendo-respondoj".Ligado estis simpligita por reliefigi la kvar genojn analizitajn per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 kaj TanjilG_27015).
Pezita reta analizo de gena kunesprimo de modulo kun superreprezentita biologia proceztermino "GO: 0006355: Transskriba reguligo, DNA-ŝablono" kaj portanta kandidaton kontraŭ antraknozorezista geno Lanr1 TanjilG_05042.Ligado estis simpligita por izoli la TanjilG_05042 genon kaj la centran TanjilG_01212 genon.
Antraknozorezista ekzamenado kolektita en Aŭstralio montris ke la plej multaj el la frue liberigitaj kulturvarioj estis sentemaj;Kalya, Coromup kaj Mandelup estis priskribitaj kiel modere rezistemaj, dum Wonga, Tanjil kaj 83A:476 estis priskribitaj kiel tre rezistemaj26,27,31.havis la saman rezistalelon, nomitan Lanr1, kaj Coromup kaj Mandelup havis malsaman alelon, nomitan AnMan10, 26, 39, dum Kalya transdonis malsaman alelon., Lanr2.Rastrumo por antraknozorezisto en Germanio rezultigis la identigon de rezistema linio Bo7212 kun kandidatalelo krom Lanr1, nomumita LanrBo36.
Nia studo rivelis tre malaltan frekvencon (ĉirkaŭ 6%) de la alelo Lanr1 en la testita ĝermoplasmo.Ĉi tiu observado kongruas kun la rezultoj de ekzamenado de orienteŭropa ĝermoplasmo uzante la markilojn Anseq3 kaj Anseq4, kiuj montris, ke la alelo Lanr1 ĉeestas en nur du belorusaj linioj.Tio indikas ke la Lanr1-alelo ankoraŭ ne estas vaste uzita per lokaj reproduktaj programoj, male al en Aŭstralio, kie ĝi estas unu el la ŝlosilaj alelo por markilo-helpita reproduktado.Ĉi tio povas ŝuldiĝi al la pli malalta nivelo de rezisto provizita de la alelo Lanr1 en eŭropaj kampokondiĉoj kompare kun la aŭstralia raporto.Krome, studoj de antraknozo en altaj pluvokvantaj lokoj en Aŭstralio montris ke rezistaj respondoj mediaciitaj per la Lanr1-alelo eble ne estas efikaj en vetercirkonstancoj kiuj favoras kreskon kaj rapidan evoluon de la patogeno19,42.Fakte, en la nuna studo, kelkaj simptomoj de antraknozo ankaŭ estis observitaj en gentipoj portantaj la Lanr1-alelon, sugestante ke rezisto povas malaperi sub optimumaj kondiĉoj por la evoluo de C. lupini.Krome, falsaj pozitivaj interpretoj de la ĉeesto de Anseq3 kaj Anseq4-markoj, kiuj estas proksimume 1 cm de la Lanr1-lokuso, estas eblaj 28,30,43.
Nia studo montris ke 83A:476, portanta la Lanr1-alelon, respondis al C. lupini-inokulado per grandskala transcriptome-reprogramado ĉe la unua analizita tempopunkto (6 hpi), dum en Mandelup, portanta la AnMan-alelon, transcriptomic-respondoj estis observitaj multe pli poste.(de 24 ĝis 48 ĉp.).Tiuj tempaj varioj en defendaj respondoj estas rilataj al diferencoj en malsansimptomoj, elstarigante la gravecon de frua patogenrekono por sukcesa respondo al rezisto.Por infekti planthiston, antraksoosporoj devas trairi plurajn evoluajn stadiojn sur la mastro-surfaco, inkluzive de ĝermado, ĉeldividiĝo, kaj formado de apresorio.Alpendaĵo estas infekta strukturo kiu aliĝas al la surfaco de la gastiganto kaj faciligas penetron en la gastigajn histojn.Tiel, sporoj de C. gloeosporioides en piza ekstrakto montris la unuan dividon de la nukleo post 75-90 minutoj da kovado, la formadon de ĝermtubo post 90-120 minutoj, kaj subpremadon post 4 horoj 45 .Mango C. gloeosporioides montris pli ol 40% konidian ĝermadon post 3 horoj da kovado kaj proksimume 20% formadon de apresoroj post 4 horoj.La virulec-rilata CAP20 geno de C. gloeosporioides montris transskriban agadon en epifit-formaj konidioj post 3.5 h kovado en avokada surfacvakso kun altaj koncentriĝoj de CAP20-proteino post 4 h 46 min.Simile, la agado de melanina biosintezo genoj en C. trifolii estis induktita dum 2-hora kovado sekvita per la formado de apresorio post 1 horo.Studoj de foliaj histoj montris, ke fragoj inokulitaj kun C. acutatum havas unuan subpremadon je 8 hpi, dum tomatoj inokulitaj kun C. coccodes havas unuan subpremadon je 4 hpi48,49.plejparte kongrua kun la temposkalo de Colletotrichum spp.infekta procezo.Rapidaj defendaj respondoj al 83A:476 sugestas implikiĝon de plantrezisto kaj efektor-ekigita imuneco (ETI) genoj en tiu linio, dum la malfruaj respondoj de Mandelup apogas la mikro-asociitan molekulan padron-ekigitan imunecon (MTI) hipotezon 50. Fruaj respondoj al 83A: 476 kaj Mandelup.La parta interkovro inter supren- aŭ malsupren-reguligitaj genoj en malfrua respondo ankaŭ subtenas ĉi tiun koncepton, ĉar ETI ofte estas konsiderata kiel akcelita kaj plifortigita MTI-respondo, kiu kulminas per programita ĉelmorto ĉe la loko de infekto, konata kiel anafilaksa ŝoko 51,52.
La plej multaj el la genoj atribuitaj al la troreprezentita esprimo Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" estas la 11 homologoj de la stres-induktita fasta mesaĝo 22 proteino (simila al SAM22) kaj la sep ĉefaj lateksoprotein-similaj (MLPoj).-similaj proteinoj 31, 34, 43 kaj 423 montris sekvencsimilecon.SAM22-similaj genoj montris signifan aktivigon kiu daŭris pli longe, montrante pliigitajn nivelojn de antraknozorezisto (83A:476 kaj Boregine).Tamen, MLP-similaj genoj estis subreguligitaj nur en linioj portantaj la kandidatrezistan alelon (83A:476/Lanr1 je 6 hpi kaj Mandelup/AnMan je 24 hpi).Devus notiĝi ke ĉiuj identigitaj SAM22-similaj homologoj originas de genareto enhavanta ĉirkaŭ 105 kb, dum MLP-similaj genoj originas de apartaj regionoj de la genaro.Kunordigita aktivigo de tiaj SAM22-similaj genoj ankaŭ estis trovita en nia antaŭa studo de NLL-rezisto al Diaporthetoxica inokulado, sugestante ke ili estas implikitaj en la horizontalaj komponentoj de la defenda respondo.Ĉi tiu konkludo ankaŭ estas subtenata de raportoj pri pozitiva respondo de SAM22-similaj genoj al vundo aŭ traktado kun salicila acido, fungaj induktiloj aŭ hidrogena peroksido.
MLP-similaj genoj pruviĝis respondi al diversaj abiotaj kaj biotaj stresoj, inkluzive de bakteriaj, virusaj kaj patogenaj fungaj infektoj en multaj plantospecioj55.La direktoj de respondo al certaj interagoj inter plantoj kaj patogenoj intervalis de forte kreskanta (t.e., dum infestiĝo de kotono kun Verticillium dahliae) ĝis signife malpliiĝanta (t.e., post infekto de pomarbo kun Alternaria spp.)56,57.Signifa subreguligo de la MLP-simila 423 geno estis observita dum avokaddefendoj al F. niger-infekto kaj dum infekto de la pomarbo Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola kaj Alternaria alternata estas pompatotipoj58,59.Krome, pomaj kaloj troesprimanta la MLP-similan 423 genon havis pli malaltan esprimon de rezist-rilataj genoj kaj estis pli sentemaj al funga infekto59.Sekvante Fusarium oxysporum f, la MLP-simila 423 geno ankaŭ estis subpremita en rezistema ordinara fabĝermoplasmo.cn.Infekto de faboj 60.
Aliaj membroj de la PR-10-familio identigitaj en nia RNA-seq-studo estis la LlR18A kaj LlR18B-genoj en respondo al suprenreguligo, same kiel la suprenreguligita (1 geno) aŭ subreguligita (3 genoj) geno por la lipida transiga proteino DIR1..Krome, WGCNA elstarigas la LlR18B-genon kiel nabon en ĉi tiu modulo, kiu estas tre sentema al vakcinado kaj portas plurajn protektajn respondgenojn.La LlR18A kaj LlR18B-genoj estis induktitaj en flavaj lupinfolioj en respondo al patogenaj bakterioj, same kiel en NLL-tigoj post D. toxica inokulado, dum la rizhomologo de tiuj genoj, RSOsPR10, estis rapide induktita per funga infekto supozeble implikita en la jasmona acida signala proteino nespecifa transportpado DIR1623. s kiuj estas postulataj por la komenco de sistema akirita rezisto (SAR).Kun la evoluo de protektaj reagoj, la DIR1-proteino estas transportita de la fokuso de infekto tra la floemo por indukti SAR en malproksimaj organoj.Kurioze, la geno TanjilG_02313 DIR1 estis signife induktita ĉe la unua tempopunkto en linioj 84A:476 kaj Loĝantaro 22660, sed antraknozorezisto evoluis sukcese nur en linio 84A:476.Tio povas indiki iun subfunkciigon de la DIR1-geno en NLL, ĉar la ceteraj tri homologoj respondis al inokulado nur en la 83A:476 linio ĉe 6 hpi, kaj tiu respondo estis direktita malsupren.
En nia studo, la plej oftaj komponantoj respondaj al la biologia procezo nomita "GO:0055114 Redox-procezo" estis citokromo P450-proteino, peroksidazo, linoleika acido 9S-/13S-lipoxygenase kaj 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.Krome, nia WGCNA difinas la HSFA4a homologon kiel nabon portanta modulojn kiel ekzemple la Lanr1-rezistgena kandidato TanjilG_05042.HSFA4a estas komponento de la Redoks-dependa reguligo de atomtransskribo en plantoj.
Citokromo P450-proteinoj estas oksidoreductazoj, kiuj katalizas NADPH kaj/aŭ O2-dependajn hidroksilation reagojn en primara kaj sekundara metabolo, inkluzive de la metabolo de ksenobiotikoj, same kiel hormonoj, grasacidoj, steroloj, ĉelaj murkomponentoj, biopolimeroj, kaj la biosintezo de protektaj funkcioj. d de -10.6 log2 (falda ŝanĝo) al 5.7 pro granda nombro da ŝanĝitaj homologoj (37) kaj diferencoj en respondpadronoj inter specifaj genoj, reflektante suprenan revizion..Uzi nur RNA-seq-datenojn por pliklarigi la supozan biologian funkcion de la NLL-genoj en tia granda proteinsuperfamilio estus tre konjekta.Tamen, indas noti, ke iuj genoj de citokromo P450 estas asociitaj kun pliigita rezisto al patogenaj fungoj aŭ bakterioj, inkluzive de kontribuo al alergiaj reagoj69,70,71.
Klaso III-peroksidazoj estas multfunkciaj plantenzimoj implikitaj en larĝa gamo de metabolaj procezoj dum plantkresko kaj evoluo, same kiel en respondo al mediaj stresoj kiel ekzemple saleco, sekeco, alta lumintenseco, kaj patogenatako72.Peroksidazoj estas implikitaj en la interagado de pluraj plantospecioj kun Anthracis, inkluzive de Stylosanthes humilis kaj C. gloeosporioides, Lens culinaris kaj C. truncatum, Phaseolus vulgaris kaj C. lindemuthianum, Cucumis sativus kaj C. lagenarium73,74,75,76.La respondo estas tre rapida, foje eĉ je 4 HPI, antaŭ ol la fungo penetras la planthiston73.La peroksidazgeno ankaŭ reagis al D. toxica NLL-inokulado.Aldone al iliaj tipaj funkcioj por reguligi oksidativan eksplodon aŭ forigi oksidativan streson, peroksidazoj povas malhelpi patogenan kreskon kreante fizikajn barojn bazitajn sur ĉela muro plifortikigo dum ligniĝo, subunuo aŭ krucligo de specifaj kunmetaĵoj.Ĉi tiu funkcio povas esti atribuita en silico al la TanjilG_03329 geno kodanta supozatan lignin-forman anjonperoksidazon kiu estis signife suprenreguligita en nia studo en la 83A:476 imuna linio ĉe 6 HPI, sed ne en aliaj trostreĉoj kaj tempopunktoj kiuj ne respondis.
9S-/13S-lipoksigenazo de linoleika acido estas la unua paŝo en la oksidativa vojo de lipida biosintezo78.La produktoj de ĉi tiu vojo havas multoblajn funkciojn en plantdefendo, inkluzive de ĉela muro plifortigo per la formado de kalozaj kaj pektinaj kuŝejoj, kaj reguligo de oksidativa streso per la produktado de reaktivaj oksigenaj specioj79,80,81,82,83.En la nuna studo, la esprimo de linoleika acido 9S-/13S-lipoksigenazo estis ŝanĝita en ĉiuj trostreĉoj, sed en la akceptema populacio 22660, suprenreguligo regis en malsamaj tempopunktoj, dum en trostreĉoj portantaj rezisteman Lanr1 kaj la AnMan-alelon, ĝi emfazas la diversigon de la oksilipina tavolo en protektaj reakcioj inter tiuj oxylipin-tavolaj reakcioj.
La 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) homologo estis signife suprenreguligita (9 genoj) aŭ subreguligita (2 genoj) kiam inokulite kun lupino.Kun du esceptoj, ĉiuj ĉi tiuj respondoj okazis ĉe 6 ĉp.ĉe 83A:476.La enzimata reago mediaciita de ACO-proteinoj estas la rapid-limiga paŝo en etilena produktado kaj estas tial tre reguligita84.Etileno estas planta hormono, kiu ludas diversajn rolojn en reguligado de planto-disvolviĝo kaj respondo al abiotaj kaj biotaj streskondiĉoj.La indukto de ACO-transskribo kaj aktivigo de la etilena signalpado estas implikitaj en pliigado de la rezisto de rizo al la hemibiotrofa fungo oryzae oryzae reguligante la produktadon de reaktivaj oksigenspecioj kaj fitoaleksinoj.Tre simila folia infektoprocezo trovita inter M. oryzae kaj C. lupini88,89, kontraŭ la fono de signifa suprenreguligo de ACO-homologoj en la 83A:476-linio raportita en ĉi tiu studo, ŝanĝas la eblecon atribui reziston al NLL-antraknozo Etileno signala centra paŝo en molekulaj vojoj.
En la nuna studo, grandskala subpremado de multaj genoj asociitaj kun fotosintezo estis observita je 6 hpi en 83A:476 kaj je 48 hpi en Mandeloop kaj la 22660 populacio.La amplekso kaj progresado de ĉi tiuj ŝanĝoj estas proporciaj al la nivelo.Antraknozorezisto estis observita en tiu eksperimento.Lastatempe, forta kaj frua subpremo de fotosintez-rilataj transskribaĵoj estis raportita en pluraj modeloj de plant-patogenaj interagoj, inkluzive de patogenaj bakterioj kaj fungoj.Hasto (de 2 HPI en kelkaj interagoj) kaj tutmonda subpremado de genoj asociitaj kun fotosintezo en respondo al infekto povas ekigi plantimunecon bazitan sur la deplojo de reaktivaj oksigenspecioj kaj ilia interago kun la salicila acida vojo por mediacii alergiajn reagojn 90,94.
Konklude, defendaj respondmekanismoj proponitaj por la plej rezistema genlinio (83A:476) inkluzivas rapidan patogenrekonon de la R-geno (supozeble TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) kaj alergian respond-mediaciitan salicilacidon kaj etilenan signaladon, sekvitan de establado de longdistanca SAR.ago estas subtenata de la DIR-1-proteino.Oni devas rimarki, ke la biotrofa periodo por C. lupini-infekto estas tre mallonga (ĉirkaŭ 2 tagoj), sekvata de nekroza kresko95.La transiro inter tiuj stadioj povas esti rilata al nekrozo kaj esprimo de etilen-indukteblaj proteinoj kiuj funkcias kiel ellasiloj por hipersentemaj reagoj en gastigaj plantoj.Tial, la tempofenestro por sukcesa kapto de C. lupini en la biotrofa stadio estas tre mallarĝa.La reprogramado de genoj asociitaj kun redox kaj fotosintezo observita en 83A:476 ĉe 6 hpi estas kongrua kun la progresado de fungaj hifoj kaj anoncas la evoluon de sukcesa protekta respondo en la biotrofa stadio.La transcriptomic respondoj de Mandelup kaj la 22660 populacio povas esti tro prokrastitaj por kapti la fungon antaŭ ŝanĝado al nekroza kresko, tamen, Mandelup povas esti pli efika ol la 22660 populacio ĉar la relative rapida reguligo de la PR-10-proteino antaŭenigas horizontalan reziston.
ETI, movita per la kanona R-geno, ŝajnas esti ofta mekanismo por fabrezisto al antraknozo.Tiel, en la modela guŝo Medicago truncatula, rezisto al antraknozo estas transigita per la RCT1-geno, membro de la TIR-NBS-LRR97-planta R-genklaso.Tiu geno ankaŭ transigas larĝspektran antraknozreziston en luzerno kiam transdonite al sentemaj plantoj.En la ordinara fazeolo (P. vulgaris), pli ol du dekduoj da antraknozorezistaj genoj estis identigitaj ĝis nun.Kelkaj el tiuj genoj estas trovitaj en regionoj malhavantaj iujn ajn kanonikaj R-genoj, aliflanke multaj aliaj situas ĉe la randoj de kromosomoj portantaj la NBS-LRR-genareton, inkluzive de TIR-NBS-LRRs99.La genar-kovranta SSR-studo ankaŭ konfirmis la asocion de la NBS-LRR-geno kun antraknozorezisto en la ordinara fabo.La kanonika R-geno ankaŭ estis trovita en la genoma regiono portanta la plej gravan antraknozrezistlokuson en blanka lupino 101.
Nia laboro montras, ke tuja rezista reago, aktivigita en frua stadio de planta infekto (prefere ne pli malfrue ol 12 hpi), efike protektas mallarĝfolian lupinon kontraŭ antraknozo kaŭzita de la patogena fungo Collelotrichum lupini.Uzante altan traigan sekvencon, ni pruvis diferencigajn esprimprofilojn de antraknozaj rezistgenoj en NLL-plantoj mediaciitaj de la Lanr1 kaj AnMan-rezistgenoj.Sukcesa defendo implikas singarde dizajni la genojn por proteinoj implikitaj en redox, fotosintezo kaj patogenezo ene de horoj de la unua kontakto de la planto kun patogeno.Similaj protektaj reagoj, sed prokrastitaj en la tempo, estas multe malpli efikaj por protekti plantojn kontraŭ malsanoj.Antrakso-rezisto mediaciita per la Lanr1-geno similas la tipan rapidan respondon de la R-geno (efiki-ekigita imuneco), dum la AnMan-geno plej verŝajne disponigas horizontalan respondon (imuneco ekigita per mikrob-rilata molekula padrono), disponigante moderan nivelon de daŭripovo.
La 215 NLL-linioj uzitaj por ekzameni antraknozsignojn konsistis el 74 kulturvarioj, 60 linioj akiritaj per kruciĝo aŭ reproduktado, 5 mutaciuloj, kaj 76 sovaĝaj aŭ originaj ĝermoplasmoj.La linioj venis el 17 landoj, ĉefe el Pollando (58), Hispanio (47), Germanio (27), Aŭstralio (26), Rusio (19), Belorusio (7), Italio (5) kaj aliaj linioj.el 10 landoj.La aro ankaŭ inkludas referencorezistajn liniojn: 83A:476, Tanjil, Wonga portanta la Lanr1-alelon, kaj Mandelup portanta la AnMan-alelon.La linioj estis akiritaj de la Eŭropa Lupine Genetic Resource Database prizorgata de Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pollando (Suplementa Tabelo S1).
Plantoj estis kultivitaj en kontrolitaj kondiĉoj (fotoperiodo 16 horoj, temperaturo 25 °C tage kaj 18 °C nokte).Du biologiaj kopioj estis analizitaj.DNA estis izolita de trisemajnaj folioj uzante la DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germanio) laŭ la protokolo.La kvalito kaj koncentriĝo de la izolita DNA estis taksitaj per spektrofotometriaj metodoj (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Usono).La markilo AnManM1 markanta la genon de rezisto al antraknozo AnMan (derivita de cv. Mandelup) kaj la signoj Anseq3 kaj Anseq4 laŭflankante la genon Lanr1 (derivitan de cv. Tanjil) estis analizitaj 11,26,28.Homozigotoj por la imuna alelo estis notitaj kiel "1", sentemaj - kiel "0" kaj heterozigotoj - kiel 0.5.
Surbaze de la rezultoj de ekzamenado por markiloj AnManM1, AnSeq3 kaj AnSeq4 kaj la havebleco de semoj por finaj sekvaj eksperimentoj, 50 NLL-linioj estis elektitaj por antraknozorezista fenotipado.La analizo estis farita duplikate en komputila regata forcejo kun 14-hora fotoperiodo kun temperaturo de 22 °C tage kaj 19 °C nokte.Semoj estas gratitaj (tranĉante la semkovraĵon sur la kontraŭa flanko de la embrio per akra klingo) antaŭ semado por malhelpi semdormon pro la semkovraĵo estas tro malmola kaj por certigi unuforman ĝermadon.Plantoj estis kultivitaj en potoj (11 × 11 × 21 cm) kun sterila grundo (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovio, Pollando).Inokulado estis farita kun la Colletotrichum lupini Col-08-trostreĉiĝo, kreskigita en 1999 de la tigoj de mallarĝfoliaj lupinplantoj kultivitaj en kampo en Verĵeniça, Granda Pollando (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Akiru areon.La izolitaĵoj estis kultivitaj en SNA-medio je 20° C. sub nigra lumo dum 21 tagoj por stimuli sporuladon.Kvar semajnojn post semado, kiam la plantoj atingis la 4-6 folian fazon, inokulado estis farita per ŝprucaĵo per suspendo de konidioj en koncentriĝo de 0,5 x 106 konidioj per ml.Post inokulado, la plantoj estis konservitaj en la mallumo dum 24 horoj je humideco de ĉirkaŭ 98% kaj temperaturo de 25 °C por faciligi la ĝermadon de konidioj kaj la infektan procezon.La plantoj tiam estis kultivitaj sub 14-hora fotoperiodo je 22 °C tage/19 °C nokte kaj 70% humido.La malsanpoentaro estis farita 22 tagojn post inokulado kaj variis de 0 (imuna) ĝis 9 (tre sentema) depende de la ĉeesto aŭ foresto de nekrozaj lezoj sur tigoj kaj folioj.Krome, post poentado, la pezo de la plantoj estis mezurita.Rilatoj inter signogenotipoj kaj malsanfenotipoj estis kalkulitaj kiel punktaj du-sinsekvaj korelacioj (foresto de heterozigozaj signoj en la aro de linioj por analizo de la antraknozorezistfenotipo).