Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Estas bezono de fidinda en vitro-sistemo kiu povas precize reprodukti la fiziologian medion de la koro por drogtestado.La limigita havebleco de homaj korhistokultursistemoj kondukis al malprecizaj interpretoj de kormedikamentefikoj.Ĉi tie, ni evoluigis koran histokulturmodelon (CTCM), kiu elektromeĥanike stimulas kortranĉaĵojn kaj spertas fiziologian streĉadon dum la sistola kaj diastola fazoj de la kora ciklo.Post 12 tagoj da kulturo, tiu aliro parte plibonigis la daŭrigeblecon de korsekcioj, sed ne plene konservis ilian strukturan integrecon.Tial, post ekzamenado de malgranda molekulo, ni trovis, ke la aldono de 100 nM triiodotironino (T3) kaj 1 μM deksametazono (Dex) al nia medio konservis la mikrostrukturon de la sekcioj dum 12 tagoj.En kombinaĵo kun T3/Dex-traktado, la CTCM-sistemo konservis transskribajn profilojn, daŭrigeblecon, metabolan agadon kaj strukturan integrecon je la sama nivelo kiel freŝa korhisto dum 12 tagoj.Krome, troa streĉado de korhisto en kulturo induktas hipertrofian korsignaladon, disponigante indicon por la kapablo de CTCM imiti hipertrofajn kondiĉojn induktitajn per korstreĉado.En konkludo, CTCM povas modeligi la fiziologion kaj patofiziologion de la koro en kulturo dum longaj tempodaŭroj, ebligante fidindan drogkrimenton.
Antaŭ klinika esplorado necesas fidindaj en vitro-sistemoj, kiuj povas precize reprodukti la fiziologian medion de la homa koro.Tiaj sistemoj devus imiti ŝanĝitan mekanikan streĉadon, korfrekvencon kaj elektrofiziologiajn trajtojn.Bestaj modeloj estas ofte utiligitaj kiel kribra platformo por korfiziologio kun limigita fidindeco en reflektado de la efikoj de drogoj en la homa koro1,2.Finfine, la Ideala Kardiohista Kulturo Eksperimenta Modelo (CTCM) estas modelo tre sentema kaj specifa por diversaj terapiaj kaj farmakologiaj intervenoj, precize reproduktante la fiziologion kaj patofiziologion de la homa koro3.La foresto de tia sistemo limigas la malkovron de novaj traktadoj por korinsuficienco4,5 kaj kondukis al drogkardiotokseco kiel ĉefa kialo por eliri la merkaton6.
Dum la pasinta jardeko, ok ne-kardiovaskulaj medikamentoj estis retiritaj de klinika uzo ĉar ili kaŭzas QT-intervalan plilongigon kondukantan al ventriklaj aritmioj kaj subita morto7.Tiel, ekzistas kreskanta bezono de fidindaj antaŭklinikaj ekzamenaj strategioj por taksi kardiovaskulan efikecon kaj toksecon.La lastatempa uzo de hom-induktitaj pluripotentaj stamĉel-derivitaj kardiomiocitoj (hiPS-CM) en drogkribrado kaj toksectestado disponigas partan solvon al tiu problemo.Tamen, la nematura naturo de hiPS-CMs kaj la manko de multĉela komplekseco de korhisto estas gravaj limigoj de tiu metodo.Lastatempaj studoj montris, ke ĉi tiu limigo povas esti parte venkita uzante fruan hiPS-CM por formi korhistajn hidroĝelojn baldaŭ post la komenco de spontaneaj kuntiriĝoj kaj iom post iom pliigante elektran stimulon laŭlonge de la tempo.Tamen, al ĉi tiuj hiPS-CM-mikrohistoj mankas la maturaj elektrofiziologiaj kaj kuntiriĝaj trajtoj de la plenkreska miokardio.Krome, homa korhisto havas pli kompleksan strukturon, konsistante el heterogena miksaĵo de malsamaj ĉeltipoj, inkluzive de endotelaj ĉeloj, neŭronoj, kaj stromaj fibroblastoj, interligitaj per specifaj aroj de eksterĉelaj matricaj proteinoj.Tiu heterogeneco de ne-kardiomiocitaj populacioj11,12,13 en la plenkreska mamula koro estas grava baro al modeligado de korhisto uzanta individuajn ĉeltipojn.Tiuj gravaj limigoj emfazas la gravecon de evoluigado de metodoj por kultivado de nerompita miokardia histo sub fiziologiaj kaj patologiaj kondiĉoj.
Kulturitaj maldikaj (300 µm) sekcioj de la homa koro pruvis esti promesplena modelo de sendifekta homa miokardio.Ĉi tiu metodo disponigas aliron al kompleta 3D plurĉela sistemo simila al homa korhisto.Tamen, ĝis 2019, la uzo de kleraj korsekcioj estis limigita per la mallonga (24 h) kultursupervivo.Ĉi tio ŝuldiĝas al kelkaj faktoroj inkluzive de la manko de fizika-mekanika streĉado, la aero-likva interfaco, kaj la uzo de simplaj amaskomunikiloj kiuj ne subtenas la bezonojn de korhisto.En 2019, pluraj esplorgrupoj pruvis, ke korpigi mekanikajn faktorojn en korajn histajn kultursistemojn povas plilongigi kulturvivon, plibonigi koresprimon kaj imiti korpatologion.Du elegantaj studoj 17 kaj 18 montras, ke unuaksa mekanika ŝarĝo havas pozitivan efikon al kora fenotipo dum kulturo.Tamen, ĉi tiuj studoj ne uzis la dinamikan tridimensian fiziko-mekanikan ŝarĝon de la kora ciklo, ĉar koraj sekcioj estis ŝarĝitaj per aŭ izometriaj tirfortoj 17 aŭ lineara aŭtotona ŝarĝo 18 .Tiuj metodoj de histostreĉado rezultigis la subpremadon de multaj korgenoj aŭ la troesprimon de genoj asociitaj kun nenormalaj streĉaj respondoj.Precipe, Pitoulis et al.19 evoluigis dinamikan kortranĉan kulturbanon por korcikla rekonstruo uzante fortotransduktilan retrosciigon kaj streĉilojn.Kvankam tiu sistemo enkalkulas pli precizan en-vitran korciklomodeladon, la komplekseco kaj malalta trairo de la metodo limigas la aplikon de tiu sistemo.Nia laboratorio lastatempe evoluigis simpligitan kultursistemon uzante elektran stimulon kaj optimumigitan medion por konservi la daŭrigeblecon de sekcioj de porka kaj homa korhisto dum ĝis 6 tagoj20,21.
En la nuna manuskripto, ni priskribas koran histokulturmodelon (CTCM) uzante sekciojn de la porka koro, kiu enhavas humurajn signalojn por resumi tridimensian korfiziologion kaj patofiziologian distension dum la kora ciklo.Tiu CTCM povas pliigi la precizecon de antaŭ-klinika drogprognozo al nivelo neniam antaŭe atingita disponigante kostefikan, mez-trafian korsistemon kiu imitas la fiziologion/patofiziologion de la mamula koro por antaŭ-klinika drogtestado.
Hemoddinamikaj mekanikaj signaloj ludas kritikan rolon en konservado de kardiomiocitfunkcio en vitro 22,23,24.En la nuna manuskripto, ni evoluigis CTCM (Figuro 1a), kiu povas imiti la plenkreskan koran medion induktante kaj elektran kaj mekanikan stimulon ĉe fiziologiaj frekvencoj (1.2 Hz, 72 taktoj por minuto).Por eviti troan histan streĉadon dum diastolo, 3D-presa aparato estis uzata por pliigi histan grandecon je 25% (Fig. 1b).Elektra paŝado induktita per la C-PACE-sistemo estis tempigita por komenci 100 ms antaŭ sistolo uzante datuman akirsistemon por plene reprodukti la korciklon.La histokultursistemo uzas programeblan pneŭmatikan aktuarion (LB Engineering, Germanio) por cikle vastigi flekseblan silikonmembranon por kaŭzi vastiĝon de la kortranĉaĵoj en la supra kamero.La sistemo estis konektita al ekstera aerlinio per premo-transduktilo, kiu ebligis precize ĝustigi la premon (± 1 mmHg) kaj tempon (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Aligu la histan sekcion al la 7 mm subtenringo, montrita en blua, ene de la kulturĉambro de la aparato.La kulturĉambro estas apartigita de la aerkamero per maldika fleksebla silikona membrano.Metu garkon inter ĉiu ĉambro por malhelpi likojn.La kovrilo de la aparato enhavas grafitajn elektrodojn, kiuj provizas elektran stimulon.b Skema reprezentado de la granda hista aparato, gvidringo kaj subtenringo.La histosekcioj (brunaj) estas metitaj sur la superdimensian aparaton kun la gvidringo metita en la sulkon sur la ekstera rando de la aparato.Uzante la gvidilon, zorge metu la subtenan ringon kovritan per hista akrila gluaĵo super la sekcio de kora histo.c Grafiko montranta la tempon de elektra stimulo kiel funkcio de aerkamera premo kontrolita per programebla pneŭmatika aktuario (PPD).Datenakira aparato estis uzita por sinkronigi elektran stimulon uzante premsensilojn.Kiam la premo en la kulturĉambro atingas la fiksitan sojlon, pulssignalo estas sendita al la C-PACE-EM por ekigi elektran stimulon.d Bildo de kvar CTCM-oj metitaj sur inkubatorbreto.Kvar aparatoj estas konektitaj al unu PPD per pneŭmatika cirkvito, kaj premsensiloj estas enigitaj en la hemostatan valvon por kontroli la premon en la pneŭmatika cirkvito.Ĉiu aparato enhavas ses histajn sekciojn.
Uzante ununuran pneŭmatikan aktuarion, ni povis kontroli 4 CTCM-aparatojn, ĉiu el kiuj povis teni 6 histajn sekciojn (Fig. 1d).En CTCM, la aerpremo en la aerkamero estas konvertita al sinkrona premo en la fluida ĉambro kaj induktas fiziologian ekspansion de la kortranĉaĵo (Figuro 2a kaj Suplementa Filmo 1).Taksado de histostreĉado ĉe 80 mm Hg.Arto.montris streĉadon de histosekcioj je 25% (Fig. 2b).Ĉi tiu elcenta streĉado estis montrita respondi al fiziologia sarkomerlongo de 2.2-2.3 µm por normala korsekcia kuntiriĝo17,19,25.La movo de histo estis taksita per kutimaj fotilaj agordoj (Kuldona Figuro 1).La amplekso kaj rapideco de histomovado (Fig. 2c, d) respondis al streĉado dum la kora ciklo kaj tempo dum sistolo kaj diastolo (Fig. 2b).Streĉado kaj rapideco de kora histo dum kuntiriĝo kaj malstreĉiĝo restis konstantaj dum 12 tagoj en kulturo (Fig. 2f).Por taksi la efikon de elektra stimulo sur kuntiriĝo dum kulturo, ni evoluigis metodon por determini aktivan misformiĝon per ombra algoritmo (Suplementa Fig. 2a,b) kaj povis distingi inter misformaĵoj kun kaj sen elektra stimulo.La sama sekcio de la koro (Fig. 2f).En la movebla regiono de la kortego (R6-9), la tensio dum elektra stimulo estis 20% pli alta ol en foresto de elektra stimulo, kio indikas la kontribuon de elektra stimulo al kuntiriĝa funkcio.
Reprezentaj spuroj de aerkamerpremo, fluida kamerpremo, kaj histomovadmezuradoj konfirmas ke kamerpremo ŝanĝas fluidan kamerpremon, kaŭzante ekvivalentan movadon de la histotranĉaĵo.b Reprezentaj spuroj de procenta streĉado (blua) de histosekcioj respondaj al procenta streĉado (oranĝa).c La mezurita movo de la kortranĉaĵo kongruas kun la mezurita movorapido.(d) Reprezentaj trajektorioj de cikla moviĝo (blua linio) kaj rapideco (oranĝa punktlinio) en tranĉaĵo de la koro.e Kvantigo de ciklotempo (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj), kuntiriĝo tempo (n = 19 tranĉaĵoj por grupo), malstreĉiĝotempo (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj), histo movado (n = 25 ).tranĉaĵoj)/grupo de malsamaj porkoj), pinta sistola rapideco (n = 24(D0), 25(D12) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj) kaj pinta malstreĉiĝofrekvenco (n=24(D0), 25(D12) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj).La t-testo de Duvosta Studento montris neniun signifan diferencon en iu parametro.f Reprezentaj streĉaj analizo spuroj de histosekcioj kun (ruĝa) kaj sen (blua) elektra stimulo, dek regionaj areoj de histosekcioj de la sama sekcio.La malsupraj paneloj montras la kvantigon de la procentdiferenco en trostreĉiĝo en histosekcioj kun kaj sen elektra stimulo en dek areoj de malsamaj sekcioj. (n = 8 tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Duvosta Studenta t-testo estas farita; ****p < 0.0001, **p < 0.01, * p < 0.05). (n = 8 tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Duvosta Studenta t-testo estas farita; ****p < 0.0001, **p < 0.01, * p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,<p<0,000,**p<0,000). (n = 8 sekcioj/grupo el malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,01, *). (n = 8 sekcioj/grupo, el malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Eraraj stangoj reprezentas la meznombran ± norman devion.
En nia antaŭa statika biomimetika kortranĉaĵokultursistemo [20, 21], ni konservis la daŭrigeblecon, funkcion kaj strukturan integrecon de kortranĉaĵoj dum 6 tagoj aplikante elektran stimulon kaj optimumigante la mezan komponadon.Tamen, post 10 tagoj, ĉi tiuj ciferoj falis akre.Ni referencos al sekcioj kulturitaj en nia antaŭa statika biomimetika kultursistemo 20, 21 kontrolkondiĉoj (Ctrl) kaj ni uzos nian antaŭe optimumigitan medion kiel MC-kondiĉojn kaj kulturon sub samtempa mekanika kaj elektra stimulo (CTCM).vokis .Unue, ni determinis, ke mekanika stimulo sen elektra stimulo estis nesufiĉa por konservi histan daŭrigeblecon dum 6 tagoj (Suplementa Fig. 3a,b).Kurioze, kun la enkonduko de fizika-mekanika kaj elektra stimulo uzante STCM, la vivebleco de 12-tagaj koraj sekcioj restis la sama kiel en freŝaj koraj sekcioj sub MS-kondiĉoj, sed ne sub Ctrl-kondiĉoj, kiel montrite per MTT-analizo (Fig. 1).3a).Ĉi tio sugestas, ke mekanika stimulo kaj simulado de la kora ciklo povas konservi histajn sekciojn viveblaj dum duoble pli longe ol raportite en nia antaŭa statika kultursistemo.Tamen, taksado de la struktura integreco de histosekcioj per imunomarkado de kora troponino T kaj koneksin 43 montris ke koneksin 43-esprimo estis signife pli alta en MC-histoj en la tago 12 ol en kontroloj en la sama tago.Tamen, unuforma koneksin 43-esprimo kaj Z-diska formado ne estis plene konservitaj (Fig. 3b).Ni uzas artefaritan inteligentecon (AI) kadron por kvantigi histan strukturan integrecon26, bild-bazitan profundan lernan dukton bazitan sur troponin-T kaj koneksin-makulado43 por aŭtomate kvantigi la strukturan integrecon kaj fluoreskecon de kortranĉaĵoj laŭ forto de lokalizo.Ĉi tiu metodo uzas Konvolucian Neŭralan Reton (CNN) kaj profundan lernan kadron por fidinde kvantigi la strukturan integrecon de korhisto en aŭtomatigita kaj senantaŭjuĝa maniero, kiel priskribite en la referenco.26. MC-histo montris plibonigitan strukturan similecon al tago 0 kompare kun statikaj kontrolaj sekcioj.Krome, la trikroma makulo de Masson malkaŝis signife pli malaltan procenton de fibrozo sub MS-kondiĉoj kompare kun kontrolkondiĉoj en la tago 12 de kulturo (Fig. 3c).Dum CTCM pliigis la daŭrigeblecon de korhistosekcioj je la tago 12 al nivelo simila al tiu de freŝa korhisto, ĝi ne signife plibonigis la strukturan integrecon de la korsekcioj.
Bar-grafiko montras kvantigon de la MTT-vivebleco de freŝaj kortranĉaĵoj (D0) aŭ kortranĉaĵoj-kulturo dum 12 tagoj aŭ en senmova kulturo (D12 Ctrl) aŭ en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC/grupo estas farita unudirekte de ### testoj/grupoj) 0.0001 kompare kun D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl). Bar-grafiko montras kvantigon de la MTT-vivebleco de freŝaj kortranĉaĵoj (D0) aŭ kortranĉaĵoj-kulturo dum 12 tagoj aŭ en senmova kulturo (D12 Ctrl) aŭ en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl MC, unudirekta testoj/grupoj estas farita unudirekte #pg#p); < 0,0001 kompare kun D0 kaj **p < 0,01 kompare kun D12 Ctrl).la histogramo montras la kvantigon de la daŭrigebleco de MTT freŝaj korsekcioj (D0) aŭ kulturo de korsekcioj dum 12 tagoj en aŭ senmova kulturo (D12-kontrolo) aŭ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrolo). ) ), 12 (D12 MC) sekcioj/grupoj, testo estas unudirekta AgNOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kompare kun D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片切爇)或切)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测#0.#0 测踕#0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刌新鲜心脏刌捇)刌切)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl ，**比。histogramo montranta la kvantigon de MTT-vivebleco en freŝaj korsekcioj (D0) aŭ korsekcioj kulturitaj dum 12 tagoj en senmova kulturo (D12-kontrolo) aŭ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrolo)), 12 (D12 MC) sekcioj/grupo de malsamaj unudirektaj porkoj-testo,;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kompare kun D0, **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl).b Troponin-T (verda), koneksin 43 (ruĝa) kaj DAPI (blua) en freŝe izolitaj korsekcioj (D0) aŭ korsekcioj kulturitaj sub senmovaj kondiĉoj (Ctrl) aŭ CTCM-kondiĉoj (MC) dum 12 tagoj) de reprezentaj imunfluoreskecaj bildoj (malplena skalo = 100 µm). Artefarita inteligenteco-kvantigo de la korhista struktura integreco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu de malsama porko, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0.0001 kompare kun D0 kaj ****p < 0.0012 C kompare al D). Artefarita inteligenteco-kvantigo de la korhista struktura integreco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0.0001 kompare kun D0 kaj ****p < 0.001 C kompare al D001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n =177), (n =1) (D02), (n =177) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненей, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Kvantigo de la struktura integreco de korhisto per artefarita inteligenteco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcioj/grupoj de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; ####p < 0.0001 vs. kun D0 kaj ****p < 0.0001 C kompare al D).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsama porko, unudirekta ANOVA-testo <1 人工智 ; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo <D0##0#0 人工智; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткан (D12), (D12), =77нl (D12), (D12), MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 kontraŭ D0 Для сран0 вне1 <сран0 вне1 с D12 Ctrl). Artefarita inteligenteco por kvantigi la strukturan integrecon de korhisto (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcioj/grupo ĉiu el malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo; ####p<0.0001 vs .D0 Por komparo ****p < 0.0001 C kompare kun D). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) por kortranĉaĵoj makulitaj kun la trikroma makulo de Masson (Skalo nuda = 500 µm) (n = 10 tranĉaĵoj/grupo ĉiu de malsama porko, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0.0001 kompare kun D0 kaj ***l 0.10p < D0 kaj ***l). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) por kortranĉaĵoj makulitaj kun la trikroma makulo de Masson (Skalo nuda = 500 µm) (n = 10 tranĉaĵoj/grupo ĉiu de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; #### p < 0.0001 kompare kun C0.10.10.0.0.0.0.0.0.0. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окличественная оценка (справа) срезов сердца, окрамы сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свинтей покрытия, вестоной, вестоной ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) de korsekcioj makulitaj per la trikroma makulo de Masson (netegita skalo = 500 µm) (n = 10 sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; #### p < 0.0001 kompare kun D0 kaj *** 2 p < 0.1000p < 0 . c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺（裸尺化（右）（裸尪（裸尺（10µ=（裸尺 010µ=切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比与D0 相比与D0 相比与D0 相比，D***1 测试； 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度尺度尺度尺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向#0 单向 Anova ．#0.#0 浛#0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окличественный анализ (справа) срезов сердца, окрамы сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод прозов/группа) факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantado (dekstre) de korsekcioj makulitaj kun la trikroma makulo de Masson (malplena = 500 µm) (n = 10 sekcioj/grupo, ĉiu de malsama porko, testita per unudirekta analizo de varianco ;### # p < 0.0001 kompare kun D0, *** 0 p < 0.0.Eraraj stangoj reprezentas la meznombran ± norman devion.
Ni hipotezis, ke aldonante malgrandajn molekulojn al la kultura medio, kardiomiocita integreco povus esti plibonigita kaj fibroza disvolviĝo reduktita dum CTCM-kulturo.Ni do ekzamenis malgrandajn molekulojn uzante niajn senmovajn kontrolkulturojn20,21 pro la malgranda nombro da konfuzaj faktoroj.Deksametazono (Dex), trijodotironino (T3), kaj SB431542 (SB) estis elektitaj por tiu ekrano.Tiuj malgrandaj molekuloj antaŭe estis uzitaj en hiPSC-CM-kulturoj por stimuli maturiĝon de kardiomiocitoj pliigante sarkomerlongon, T-tubulojn, kaj kondukrapidecon.Krome, kaj Dex (glukokortikoido) kaj SB povas subpremi inflamon29,30.Tial ni testis ĉu la inkludo de unu aŭ kombinaĵo de ĉi tiuj malgrandaj molekuloj plibonigus la strukturan integrecon de koraj sekcioj.Por komenca ekzamenado, la dozo de ĉiu komponaĵo estis elektita surbaze de la koncentriĝoj kutime uzataj en ĉelkulturmodeloj (1 μM Dex27, 100 nM T327 kaj 2.5 μM SB31).Post 12 tagoj da kulturo, la kombinaĵo de T3 kaj Dex rezultigis optimuman strukturan integrecon de kardiomiocitoj kaj minimuman fibron restrukturadon (Suplementaj Figuroj 4 kaj 5).Krome, uzo de duoblaj aŭ duoblaj ĉi tiuj koncentriĝoj de T3 kaj Dex produktis malutilajn efikojn kompare kun normalaj koncentriĝoj (Kuldona Fig. 6a,b).
Post komenca ekzamenado, ni faris kap-al-kapan komparon de 4 kulturaj kondiĉoj (Figuro 4a): Ctrl: koraj sekcioj kulturitaj en nia antaŭe priskribita statika kulturo uzante nian optimumigitan medion;20.21 TD: T3 kaj Ctrl s Aldonita Dex merkrede;MC: koraj sekcioj kulturitaj en CTCM uzante nian antaŭe optimumigitan medion;kaj MT: CTCM kun T3 kaj Dex aldonita al la medio.Post 12 tagoj da kultivado, la daŭrigebleco de MS kaj MT-ŝtofoj restis la sama kiel en freŝaj histoj taksitaj per MTT-analizo (Fig. 4b).Interese, la aldono de T3 kaj Dex al transwell-kulturoj (TD) ne rezultigis signifan plibonigon en daŭrigebleco kompare kun Ctrl-kondiĉoj, indikante gravan rolon de mekanika stimulo en konservado de la daŭrigebleco de korsekcioj.
Eksperimenta dezajnodiagramo prezentanta la kvar kulturkondiĉojn uzitajn por taksi la efikojn de mekanika stimulo kaj T3/Dex-suplemento sur medio dum 12 tagoj. b Trinkgrafiko montras kvantigon de daŭrigebleco 12 tagojn post kulturo en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12), 12 (D12 MC, MC, kaj MT) unu-maniero elfarita <p## s; 0.0001, ###p < 0.001 kompare kun D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl). b Trinkgrafiko montras kvantigon de daŭrigebleco 12 tagojn post kulturo en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12), 12 (D12 MC, MC, kaj MT) unu-maniero elfarita <p## s; 0.0001, ###p < 0.001 kompare kun D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней послественную оценку жизнеспособности через 12 дней послественную кулрьта ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D01, D018) (D01, D018) (D01, D018) (D01 = D018) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,00001 со, #0# по 0,0001 по 0,0001 D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b La strekgrafiko montras la kvantigon de daŭrigebleco je 12 tagoj post kulturo en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (kontrolo, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj korsekcioj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, kaj D12 MT), 12 (D12 MC, MC, kaj MT) sekcioj de malsamaj provoj /#0; 1, ###p < 0.001 kontraŭ D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)D1、tD12、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，#，，，，#0#p 01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнению сравнению сравнению сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, однопа, одно,##0сторо,##0стор ; p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramo montranta ĉiujn 4 kulturkondiĉojn (kontrolo, TD, MC kaj MT) kompare kun freŝaj koraj sekcioj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MT), de malsamaj porkoj 12 (D12 MC) sekcioj/grupo, unudirekta ANOVA-testo <; ##0.#0.p.0. **p<0,01 kontraŭ kontrolo D12). c Bar-grafiko montras la kvantigon de glukozofluo 12 tagojn post kulturo en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 6 tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ###p < 0.001, kompare kun C2 D0 kaj ***0 p < 0.001, kompare kun D0. c Bar-grafiko montras la kvantigon de glukozofluo 12 tagojn post kulturo en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 6 tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ###p < 0.001, kompare kun C2 D0 kaj ***0 p < 0.001, kompare kun D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвто кульвта овиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = сравнению со свежими срезами сердца (D0) свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравненению C. D0). c Histogramo montras kvantigon de glukozofluo 12 tagojn post-kulturo sub ĉiuj 4 kulturaj kondiĉoj (kontrolo, TD, MC kaj MT) kompare kun freŝaj koraj sekcioj (D0) (n = 6 sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; ###p < 0.001 kompare kun D0 kaj ***p < 0.101 kompare kun D0 kaj ***p < 0 al D0). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 ，与D0 ， 与D0 ， ， 0 *** l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片片 新鲜后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 定量 ， A试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней последи верез 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (пра, правнению со свежими срезами сердца (D0) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сниро по снию с D0, ***p < 0,001 по сниро по сниро по свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA. c Histogramo montranta kvantigon de glukozofluo je 12 tagoj post-kulturo por ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (kontrolo, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj koraj sekcioj (D0) (n = 6 sekcioj/grupo, de malsamaj porkoj, unuflankaj Estis ANOVA-testoj estis faritaj, ###p < 0.001 kompare kun D0, 10.101p < 0.101p < D0, 10.01p < D0, 10.101).d Streĉanalizaj intrigoj de freŝaj (bluaj), tago 12 MC (verda), kaj tago 12 MT (ruĝaj) histoj ĉe dek regionaj histosekciopunktoj (n = 4 tranĉaĵoj/grupo, unudirekta ANOVA-testo; estis neniu signifa diferenco inter grupoj).e Vulkanintrigo montrante diferencige esprimitajn genojn en freŝaj korsekcioj (D0) kompare kun korsekcioj kultivitaj sub senmovaj kondiĉoj (Ctrl) aŭ sub MT kondiĉoj (MT) dum 10-12 tagoj.f Varmomapo de sarkomergenoj por korsekcioj kultivitaj sub ĉiu el la kulturkondiĉoj.Eraraj stangoj reprezentas la meznombran ± norman devion.
Metabola dependeco de la ŝanĝo de grasacida oksigenado ĝis glikolizo estas markostampo de kardiomiocitmaldiferencigo.Nematuraj kardiomiocitoj ĉefe uzas glukozon por ATP-produktado kaj havas hipoplastajn mitokondriojn kun malmultaj kristae5,32.Glukozo-uzo-analizoj montris, ke sub MC kaj MT-kondiĉoj, glukozo-uzo estis simila al tiu en tago 0-histoj (Figuro 4c).Tamen, Ctrl-provaĵoj montris signifan pliiĝon en glukoza utiligo kompare kun freŝa histo.Ĉi tio indikas, ke la kombinaĵo de CTCM kaj T3/Dex plibonigas histan daŭrigeblecon kaj konservas la metabolan fenotipon de 12-tagaj kulturitaj korsekcioj.Krome, streĉa analizo montris, ke streĉaj niveloj restis la samaj kiel en freŝa kora histo dum 12 tagoj sub MT kaj MS-kondiĉoj (Fig. 4d).
Por analizi la ĝeneralan efikon de CTCM kaj T3/Dex sur la tutmonda transskriba pejzaĝo de kora tranĉaĵa histo, ni elfaris RNAseq sur koraj tranĉaĵoj de ĉiuj kvar malsamaj kulturaj kondiĉoj (Suplementaj Datumoj 1).Interese, MT-sekcioj montris altan transskriban similecon al freŝa korhisto, kun nur 16 diferencige esprimitaj el 13,642 genoj.Tamen, kiel ni montris pli frue, Ctrl-tranĉaĵoj montris 1229 diferencige esprimitajn genojn post 10-12 tagoj en kulturo (Fig. 4e).Ĉi tiuj datumoj estis konfirmitaj de qRT-PCR de koraj kaj fibroblastaj genoj (Suplementa Fig. 7a-c).Interese, la Ctrl-sekcioj montris subreguligo de koraj kaj ĉelciklogenoj kaj aktivigo de inflamaj genprogramoj.Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke maldiferencigo, kiu kutime okazas post longtempa kulturado, estas tute mildigita sub MT-kondiĉoj (Suplementa Fig. 8a,b).Zorgema studo de sarkomergenoj montris, ke nur sub MT-kondiĉoj konserviĝas la genoj kodantaj la sarkomero (Fig. 4f) kaj jona kanalo (Suplementa Fig. 9), protektante ilin kontraŭ subpremado sub Ctrl, TD kaj MC-kondiĉoj.Tiuj datenoj pruvas ke kun kombinaĵo de mekanika kaj humura stimulo (T3/Dex), la kortranĉaĵotranskriptomo povas resti simila al freŝaj kortranĉaĵoj post 12 tagoj en kulturo.
Ĉi tiuj transskribaj trovoj estas subtenataj de la fakto, ke la struktura integreco de kardiomiocitoj en koraj sekcioj estas plej bone konservita sub MT-kondiĉoj dum 12 tagoj, kiel montrite per nerompita kaj lokalizita koneksino 43 (Fig. 5a).Krome, fibrozo en koraj sekcioj sub MT-kondiĉoj estis signife reduktita kompare kun Ctrl kaj simila al freŝaj koraj sekcioj (Fig. 5b).Ĉi tiuj datumoj pruvas, ke la kombinaĵo de mekanika stimulo kaj T3/Dex-traktado efike konservas korstrukturon en korsekcioj en kulturo.
a Reprezentaj imunfluoreskecaj bildoj de troponin-T (verda), koneksin 43 (ruĝa), kaj DAPI (blua) en ĵus izolitaj korsekcioj (D0) aŭ kulturitaj dum 12 tagoj en ĉiuj kvar korsekciaj kulturkondiĉoj (skaldrinkejo = 100 µm).). Artefarita inteligenteco-kvantigo de la korhista struktura integreco (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0.0001 kompare kun D0 kaj * 5 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 1. trl). Kvantigo de artefarita inteligenteco de la korhista struktura integreco (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; #### p < 0.0001 kompare kun D0 kaj * 5 0.0.0.0.0.0.0.0.0. trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = интr1 (D01) 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantification of the structural integrity of heart tissue using artificial intelligence (n = 7 (D0 and D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC and D12 MT) sections/group from different pigs, one-way ANOVA test performed; #### p < 0.0001 compared to D0 and *p < 0.05 or ****p < 0.0001 compared to D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和，D12（廿艺建廿艺建建艺耧工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 或****p < 0,00001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 与D01对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 mc （一 和 d12 ）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比， 0,05 相 0,0 0 0 0 0 0 0相比）。Kvantigo de la struktura integreco de kora histo uzante artefaritan inteligentecon en malsamaj porkoj (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) sekcioj / grupo) kun unudirekta ANOVA-testo;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 kompare kun D0 kaj *p < 0.05 aŭ ****p < 0.0001 kompare kun D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo por kortranĉaĵoj makulitaj per la trikroma makulo de Masson (Skaldrinkejo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, kaj D12 MC), 9 (D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekte komparas ANOVA#0#0p; < 0.001, aŭ ****p < 0.0001 kompare kun D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo por kortranĉaĵoj makulitaj per la trikroma makulo de Masson (Skaldrinkejo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, kaj D12 MC), 9 (D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekte komparas ANOVA#0#0p; < 0.001, aŭ ****p < 0.0001 kompare kun D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от раснно разно разновя сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo de koraj sekcioj makulitaj per la trikroma makulo de Masson (skaldrinkejo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MC), 9 (D12 MT) sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, plenumis unudirektan ANOVAn <; #0##0.001 <; #0##0.0. ****p < 0.0001 kontraŭ D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D120100）㼈D1201010（D12010和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 分析； 个 析； 个 析； 个 析； 个 析； 个 析； 01 析； 01 析； 01 析； 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（10 （ （ （ ） （ （ （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析，中分析， 析， 析， 片 切片/组，进行单因素方差分析，攸#001 < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных траш ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусней / грусопи по,#0 срезов, 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo de korsekcioj makulitaj per la trikromo de Masson (skaldrinkejo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MC), 9 (D12 MT) sekcioj de malsamaj porkoj/grupo, unu ANOVA-metodo; ####p<***0000, 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0.0001 kompare kun D12 Ctrl).Eraraj stangoj reprezentas la meznombran ± norman devion.
Fine, la kapablo de CTCM imiti koran hipertrofion estis taksita pliigante korhistostreĉadon.En CTCM, pinta aerkamerpremo pliiĝis de 80 mmHg ĝis 80 mmHg.Arto.(normala streĉado) ĝis 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Ĉi tio respondas al 32% pliiĝo en streĉado (Fig. 6b), kiu antaŭe estis montrita kiel la responda procenta streĉado necesa por korsekcioj por atingi sarkomeran longon similan al tio vidita en hipertrofio.Streĉado kaj rapideco de kora histo dum kuntiriĝo kaj malstreĉiĝo restis konstantaj dum ses tagoj da kulturo (Fig. 6c).Kora histo de MT-kondiĉoj estis submetita al normala streĉado (MT (Normala)) aŭ trostreĉaj kondiĉoj (MT (OS)) dum ses tagoj.Jam post kvar tagoj en kulturo, la hipertrofa biomarkilo NT-ProBNP estis signife levita en la medio sub MT (OS) kondiĉoj kompare kun MT (normalaj) kondiĉoj (Fig. 7a).Krome, post ses tagoj da kulturado, la ĉela grandeco en MT (OS) (Fig. 7b) signife pliiĝis kompare al sekcioj de MT-koro (normala).Krome, NFATC4 nuklea translokado estis signife pliigita en trostreĉitaj histoj (Fig. 7c).Ĉi tiuj rezultoj montras la progreseman disvolviĝon de patologia restrukturado post hiperdistensio kaj subtenas la koncepton, ke la CTCM-aparato povas esti uzata kiel platformo por studi signaladon de kora hipertrofio induktita de streĉiĝo.
Reprezentaj spuroj de aerkamerpremo, fluida kamerpremo, kaj histomovadmezuradoj konfirmas ke kamerpremo ŝanĝas fluidan kamerpremon, kaŭzante ekvivalentan movadon de la histotranĉaĵo.b Reprezentaj streĉaj procentoj kaj streĉaj kurboj por normale streĉitaj (oranĝaj) kaj trostreĉitaj (bluaj) histosekcioj.c Bar-grafiko montranta ciklotempon (n = 19 tranĉaĵoj per grupo, de malsamaj porkoj), kuntiriĝotempon (n = 18-19 tranĉaĵoj per grupo, de malsamaj porkoj), malstreĉtempon (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj) ), amplitudo de histomovado (n = 14 tranĉaĵoj/grupo), peak = 14 tranĉaĵoj/grupo, rapido de malsamaj piloj/grupo, 4 peaks = 1-rapideco de malsamaj porkoj) kaj pinta malstreĉiĝofteco (n = 14 (D0), 15 (D6) ) sekcioj/grupoj) de malsamaj porkoj), duvosta Studenta t-testo montris neniun signifan diferencon en iu parametro, indikante ke tiuj parametroj restis konstantaj dum 6 tagoj da kulturo kun trotensio.Eraraj stangoj reprezentas la meznombran ± norman devion.
a Bargrafa kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kulturmedioj de kortranĉaĵoj kultivitaj sub MT normala streĉado (Normo) aŭ trostreĉado (OS) kondiĉoj (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, kaj D4 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Dudirekta ANOVA estas farita < 0 normala.**1p. Bargrafa kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kulturmedioj de kortranĉaĵoj kultivitaj sub MT normala streĉado (Normo) aŭ trostreĉado (OS) kondiĉoj (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, kaj D4 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Dudirekta ANOVA estas farita < 0.**1p estas farita al normala streĉado).Kvanta histogramo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kultura medio de kortranĉaĵoj kulturitaj sub kondiĉoj de normala MT-streĉado (normo) aŭ trostreĉado (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, kaj D4).MTOS) tranĉaĵoj /grupo de malsamaj porkoj, dufaktora analizo de varianco estas farita;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 kompare kun normala streĉado). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡度浓坡培养的心脏切片培养基中N (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析方差分析方差分析；来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析方差分析方分枎；攸丯攛攸攛攛攸攛0.01）。 Kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kortranĉaĵoj kultivitaj sub MT normala streĉado (Normo) aŭ trostreĉado (OS) kondiĉoj (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de malsamaj 猪的切片/组切片/组，可摥叹滄可报叹抏抏叹; kompare kun normala streĉado, p < 0.01).histograma Kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝoj en kortranĉaĵoj kultivitaj sub kondiĉoj de normala MT-streĉado (normo) aŭ trostreĉado (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) kaj D4 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, dudirekta analizo de varianco;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 kompare kun normala streĉado). b Reprezentaj bildoj por kortranĉaĵoj makulitaj per troponin-T kaj WGA (maldekstre) kaj ĉelgranda kvantigo (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ĉeloj/grupo el 10 malsamaj tranĉaĵoj de malsamaj porkoj, Duvosta Student t-testo estas farita; ****0 p < 0 kompare al normala streĉado). b Reprezentaj bildoj por kortranĉaĵoj makulitaj per troponin-T kaj WGA (maldekstre) kaj ĉelgranda kvantigo (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ĉeloj/grupo el 10 malsamaj tranĉaĵoj de malsamaj porkoj, Duvosta Studenta t-testo estas farita; 0****p <10 kompare al normala streĉado. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) срезов сердца ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезов от срезов от срезов от виры тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentaj bildoj de korsekcioj makulitaj per troponin-T kaj AZP (maldekstre) kaj ĉelgranda kvantigo (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ĉeloj/grupo de 10 malsamaj sekcioj de malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo estis farita; ****p < 0 kompare kun normala 000000000000000000000000000 b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表性30大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表性30大小量化，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生t 棸学生t 棸帛锟 漋学生t 漸学生，****p < 0.0001）。 b Reprezentaj bildoj de kortranĉaĵoj makulitaj per kalcareino-T kaj WGA (maldekstre) kaj ĉelgrandeco (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 el 10 malsamaj tranĉaĵoj (D6 MTNorm)) Ĉeloj/组，两方法有尾学尾学10 komparitaj kun normala testo. ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестнава) и АЗП (слестнава) размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Курнед пи, Курнет писо критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentaj bildoj de korsekcioj makulitaj per troponin-T kaj AZP (maldekstre) kaj kvantigo de ĉela grandeco (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) el 10 malsamaj sekcioj de malsamaj porkoj) Ĉeloj/grupo, duvosta kriterio Studenta t;****p <0.0001 kompare kun normala streĉo). c Reprezentaj bildoj por tago 0 kaj tago 6 MTOS kortranĉaĵoj imunomarkitaj por troponin-T kaj NFATC4 kaj kvantigo de la translokigo de NFATC4 al la kernoj de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Duvosta Student t-testo estas farita.005 *). c Reprezentaj bildoj por tago 0 kaj tago 6 MTOS kortranĉaĵoj imunomarkitaj por troponin-T kaj NFATC4 kaj kvantigo de la translokigo de NFATC4 al la kernoj de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj , * Duvosta Student t-testo estas farita.00;5). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон тропон и тропов и трозов сердца енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу срезов/группу осви нырта озных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentaj bildoj por koraj sekcioj je 0 kaj 6 tagoj MTOS, imunomarkitaj por troponin-T kaj NFATC4, kaj kvantigo de NFATC4-translokigo en la kerno de kavernaj ĉeloj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj) elfaris du-testajn Studentojn;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏的代表怏，标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏，标记的第杻的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生t 05锟t 05锟t 05)) <0. c Reprezentaj bildoj de kalkanin-T kaj NFATC4 imunomarkado 第0天和第6天MTOS-kortranĉaĵoj, kaj NFATC4 de malsama NFATC4 易位至CM-ĉelkerno的kvanto化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,) 天天弗廰族日有学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки троповки троповки троповки троповки тропон 4 день енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статры хтры юдента; *p < 0,05). c Reprezentaj bildoj de MTOS kortranĉaĵoj je la tago 0 kaj 6 por troponin-T kaj NFATC4 imunomarkado kaj kvantigo de NFATC4-translokigo en la nukleo de CM de malsamaj porkoj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo, duvostaj t-kriterioj de Studento.Eraraj stangoj reprezentas mezumon ± norma devio.
Traduka kardiovaskula esplorado postulas ĉelajn modelojn, kiuj precize reproduktas la koran medion.En ĉi tiu studo, CTCM-aparato estis evoluigita kaj karakterizita, kiu povas stimuli ultramaldikaj sekcioj de la koro.La CTCM-sistemo inkluzivas fiziologie sinkronigitan elektromekanikan stimulon kaj T3 kaj Dex-likvaĵriĉigon.Kiam porkaj korsekcioj estis eksponitaj al ĉi tiuj faktoroj, ilia daŭrigebleco, struktura integreco, metabola agado kaj transskriba esprimo restis la sama kiel en freŝa korhisto post 12 tagoj da kulturo.Krome, troa streĉado de kora histo povas kaŭzi hipertrofion de la koro kaŭzita de hiperetendo.Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj subtenas la kritikan rolon de fiziologiaj kulturkondiĉoj en konservado de normala korfenotipo kaj disponigas platformon por drogkribrado.
Multaj faktoroj kontribuas al kreado de optimuma medio por la funkciado kaj supervivo de kardiomiocitoj.La plej evidentaj el ĉi tiuj faktoroj rilatas al (1) interĉelaj interagoj, (2) elektromekanika stimulo, (3) humuraj faktoroj, kaj (4) metabolaj substratoj.Fiziologiaj ĉel-al-ĉelaj interagoj postulas kompleksajn tridimensiajn retojn de multoblaj ĉeltipoj apogitaj per eksterĉela matrico.Tiajn kompleksajn ĉelajn interagojn malfacilas rekonstrui en vitro per kunkulturo de individuaj ĉeltipoj, sed povas esti facile atingitaj uzante la organotipan naturon de korsekcioj.
Mekanika streĉado kaj elektra stimulo de kardiomiocitoj estas kritikaj por konservi korfenotipon33,34,35.Dum mekanika stimulo estis vaste uzita por hiPSC-CM kondiĉado kaj maturiĝo, pluraj elegantaj studoj ĵus provis mekanikan stimulon de kortranĉaĵoj en kulturo uzante unuaksan ŝarĝadon.Ĉi tiuj studoj montras, ke 2D unuaksa mekanika ŝarĝo havas pozitivan efikon al la fenotipo de la koro dum kulturo.En ĉi tiuj studoj, sekcioj de la koro estis aŭ ŝarĝitaj kun izometriaj tirfortoj17, linia aŭtotona ŝarĝo18, aŭ la korciklo estis rekreita uzante fortotransduktilajn religojn kaj streĉilojn.Tamen, tiuj metodoj uzas unuaksan histostreĉadon sen media optimumigo, rezultigante la subpremadon de multaj korgenoj aŭ troesprimon de genoj asociitaj kun nenormalaj streĉaj respondoj.La CTCM priskribita ĉi tie disponigas 3D elektromekanikan stimulon kiu imitas la naturan korciklon laŭ ciklotempo kaj fiziologia streĉado (25% streĉado, 40% sistolo, 60% diastolo, kaj 72 taktoj je minuto).Kvankam ĉi tiu tridimensia mekanika stimulo sole ne sufiĉas por konservi histan integrecon, kombinaĵo de humura kaj mekanika stimulo uzanta T3/Dex estas postulata por adekvate konservi histan daŭrigeblecon, funkcion kaj integrecon.
Humoralaj faktoroj ludas gravan rolon en modulado de la plenkreska korfenotipo.Ĉi tio estis elstarigita en HiPS-CM-studoj en kiuj T3 kaj Dex estis aldonitaj al kulturmedioj por akceli ĉelmaturiĝon.T3 povas influi la transporton de aminoacidoj, sukeroj kaj kalcio tra ĉelaj membranoj36.Krome, T3 antaŭenigas MHC-α-esprimon kaj MHC-β-subreguligo, antaŭenigante la formadon de rapidaj tiriĝaj miofibriloj en maturaj kardiomiocitoj kompare kun malrapidaj tiriĝmiofibriloj en feta CM.T3-manko en hipotiroidaj pacientoj rezultigas la perdon de miofibrilaj bendoj kaj reduktitan rapidecon de tona evoluo37.Dex agas sur glukokortikoidaj receptoroj kaj pruviĝis pliigi miokardian kuntiriĝon en izolitaj perfuzitaj koroj;38 ĉi tiu plibonigo supozeble rilatas al la efiko al kalcia deponaĵo-movita eniro (SOCE) 39,40.Krome, Dex ligas al siaj riceviloj, kaŭzante larĝan intraĉelan respondon, kiu subpremas imunan funkcion kaj inflamon30.
Niaj rezultoj indikas, ke fizika mekanika stimulo (MS) plibonigis ĝeneralan kulturan rendimenton kompare kun Ctrl, sed ne sukcesis konservi daŭrigeblecon, strukturan integrecon kaj koresprimon dum 12 tagoj en kulturo.Kompare kun Ctrl, aldono de T3 kaj Dex al CTCM (MT) kulturoj plibonigis daŭrigeblecon kaj konservis similajn transskribajn profilojn, strukturan integrecon kaj metabolan aktivecon kun freŝa korhisto dum 12 tagoj.Krome, kontrolante la gradon da histostreĉado, hiperetend-induktita kora hipertrofia modelo estis kreita uzante STCM, ilustrante la ĉiuflankecon de la STCM-sistemo.Oni devas rimarki, ke kvankam korrestrukturado kaj fibrozo kutime implikas sendifektajn organojn kies cirkulantaj ĉeloj povas disponigi la taŭgajn citokinojn same kiel fagocitozon kaj aliajn restrukturajn faktorojn, sekcioj de la koro daŭre povas imiti la fibrozprocezon en respondo al streso kaj traŭmato.en miofibroblastojn.Ĉi tio estis antaŭe taksita en ĉi tiu kortranĉa modelo.Oni devas rimarki, ke CTCM-parametroj povas esti modulitaj ŝanĝante premon/elektran amplitudon kaj frekvencon por simuli multajn kondiĉojn kiel takikardio, bradikardio kaj mekanika cirkulada subteno (mekanika malŝarĝita koro).Tio igas la sistemon mezan trairon por drogtestado.La kapablo de CTCM modeligi troforton-induktitan korhipertrofion pavimas la vojon por testado de tiu sistemo por personigita terapio.Konklude, la nuna studo pruvas, ke mekanika streĉado kaj humura stimulo estas kritikaj por konservi la kulturon de koraj histaj sekcioj.
Kvankam la datumoj prezentitaj ĉi tie sugestas, ke CTCM estas tre promesplena platformo por modeligado de nerompita miokardio, ĉi tiu kulturmetodo havas kelkajn limigojn.La ĉeflimigo de CTCM-kulturo estas ke ĝi trudas kontinuajn dinamikajn mekanikajn stresojn sur la tranĉaĵoj, kiu malhelpas la kapablon aktive monitori kortranĉaĵkuntiriĝojn dum ĉiu ciklo.Krome, pro la eta grandeco de korsekcioj (7 mm), la kapablo analizi sistolfunkcion ekstere de kultursistemoj uzantaj tradiciajn fortsensilojn estas limigita.En la nuna manuskripto, ni parte venkas ĉi tiun limigon taksante optikan tension kiel indikilon de kuntiriĝa funkcio.Tamen, ĉi tiu limigo postulos plian laboron kaj povas esti traktita en la estonteco enkondukante metodojn por optika monitorado de la funkcio de kortranĉaĵoj en kulturo, kiel optika mapado uzanta kalcion kaj tensi-sentemajn tinkturojn.Alia limigo de CTCM estas ke la labormodelo ne manipulas fiziologian streson (antaŭŝarĝo kaj postŝarĝo).En CTCM, premo estis induktita en kontraŭaj direktoj por reprodukti 25% fiziologian streĉadon en diastolo (plena streĉado) kaj sistolo (longo de kuntiriĝo dum elektra stimulo) en tre grandaj histoj.Ĉi tiu limigo devus esti forigita en estontaj CTCM-dezajnoj per adekvata premo sur la korhisto de ambaŭ flankoj kaj aplikante la precizajn premo-volumenajn rilatojn kiuj okazas en la kameroj de la koro.
La trostreĉa restrukturado raportita en ĉi tiu manuskripto estas limigita al imitado de hipertrofaj hiperstreĉaj signaloj.Tiel, ĉi tiu modelo povas helpi en la studo de streĉiĝo-induktita hipertrofa signalado sen la bezono de humuraj aŭ neŭralaj faktoroj (kiuj ne ekzistas en ĉi tiu sistemo).Pliaj studoj estas necesaj por pliigi la oblecon de CTCM, ekzemple, kunkulturi kun imunĉeloj, cirkulantaj plasmajn humurajn faktorojn, kaj nervizadon kiam kunkulturi kun neŭronaj ĉeloj plibonigos la eblecojn de malsanmodelado kun CTCM.
Dek tri porkoj estis uzitaj en ĉi tiu studo.Ĉiuj bestaj proceduroj estis faritaj laŭ instituciaj gvidlinioj kaj estis aprobitaj de la Institucia Prizorgado kaj Uzo-Komitato de la Universitato de Louisville.La aorta arko estis fiksita kaj la koro estis perfuzita kun 1 L da sterila kardioplegio (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparino, pH ĝis 7.4); la koroj estis konservitaj en glacimalvarma kardioplegia solvo ĝis transportitaj al la laboratorio sur glacio kiu estas kutime <10 min. la koroj estis konservitaj en glacimalvarma kardioplegia solvo ĝis transportitaj al la laboratorio sur glacio kiu estas kutime <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдию на, лчдон на ет <10 мин. koroj estis stokitaj en glacimalvarma kardioplegia solvo ĝis transporto al la laboratorio sur glacio, kiu kutime daŭras <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10. Konservu korojn sur glacio kardioplegio ĝis transporto al la laboratorio sur glacio, kutime <10 min.
La CTCM-aparato estis evoluigita en SolidWorks komputil-helpata dezajno (CAD) softvaro.La kulturaj ĉambroj, disigiloj kaj aerĉambroj estas faritaj el CNC-klara akrila plasto.La 7mm-diametra rezervringo estas farita el alta denseca polietileno (HDPE) en la centro kaj havas o-ringan kanelon por alĝustigi la silikonan o-ringon uzatan por sigeli la amaskomunikilaron sube.Maldika silicoksidmembrano apartigas la kulturkameron de la apartigplato.La silikona membrano estas lasero tranĉita el 0.02″ dika silikona folio kaj havas malmolecon de 35A.La malsupraj kaj supraj silikonaj paketoj estas lasertranĉitaj el 1/16″ dika silikona folio kaj havas malmolecon de 50A.316L neoksideblaj ŝraŭboj kaj flugilnuksoj estas uzataj por fiksi la blokon kaj krei hermetikan sigelon.
Diligenta presita cirkvito (PCB) estas dizajnita por esti integrita kun la C-PACE-EM-sistemo.La svisaj maŝinkonektiloj sur la PCB estas konektitaj al grafitaj elektrodoj per arĝentkovritaj kupraj dratoj kaj bronzaj 0-60 ŝraŭboj ŝraŭbitaj en la elektrodojn.La presita cirkvito estas metita en la kovrilon de la 3D presilo.
La CTCM-aparato estas kontrolita per programebla pneŭmatika aktuario (PPD) kiu kreas kontrolitan cirkulan premon similan al korciklo.Ĉar la premo ene de la aerkamero pliiĝas, la fleksebla silikona membrano disetendiĝas supren, devigante la medion sub la histoloko.La areo de histo tiam estos etendita per ĉi tiu elpelo de fluido, imitante la fiziologian ekspansion de la koro dum diastolo.Ĉe la pinto de malstreĉiĝo, elektra stimulo estis aplikita tra grafitaj elektrodoj, kiuj reduktis la premon en la aerkamero kaj kaŭzis kuntiriĝon de histosekcioj.Ene de la pipo estas hemostatika valvo kun prema sensilo por detekti la premon en la aersistemo.La premo sentita per la premosensilo estas aplikita al datumkolektilo ligita al la tekokomputilo.Tio permesas kontinuan monitoradon de la premo ene de la gasĉambro.Kiam la maksimuma ĉambra premo estis atingita (norma 80 mmHg, 140 mmHg OS), la datumakira aparato estis ordonita sendi signalon al la C-PACE-EM-sistemo por generi dufazan tensiosignalon por 2 ms, fiksita al 4 V.
Koraj sekcioj estis akiritaj kaj kulturaj kondiĉoj en 6 putoj estis faritaj jene: Transloki la rikoltitajn korojn de la transiga vazo al pleto enhavanta malvarman (4° C.) kardioplegion.La maldekstra ventriklo estis izolita per sterila klingo kaj tranĉita en pecojn de 1-2 cm3.Ĉi tiuj histoblokoj estis alkroĉitaj al histosubtenoj kun histogluo kaj metitaj en vibran mikrotoman histan bano enhavanta la solvon de Tyrode kaj kontinue oksigenitaj (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), (6 mM-164M (DKM 8,18 g) ), 6 mM (K814Cl) ), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solvaĵo), 1,8 mM CaCl2 ( 1,8 ml 1 M solvo), ĝis 1 L ddH2O).La vibra mikrotomo estis metita tranĉi 300 µm dikaj tranĉaĵoj kun frekvenco de 80 Hz, horizontala vibradamplitudo de 2 mm, kaj antaŭrapideco de 0.03 mm/s.La histobano estis ĉirkaŭita de glacio por konservi la solvon malvarmeta kaj la temperaturo estis konservita je 4 °C.Transloku histosekciojn de la mikrotoma bano al kova bano enhavanta kontinue oksigenitan Tyrode-solvon sur glacio ĝis sufiĉaj sekcioj estas akiritaj por unu kulturplato.Por transwell-kulturoj, histosekcioj estis alfiksitaj al sterilaj 6 mm larĝaj poliuretansubtenoj kaj metitaj en 6 ml da optimumigita medio (199 medio, 1x ITS-suplemento, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkala kaj 2X antibiotika-kontraŭfunga).Elektra stimulo (10 V, frekvenco 1.2 Hz) estis aplikita al la histosekcioj tra la C-Pace.Por TD-kondiĉoj, freŝaj T3 kaj Dex estis aldonitaj je 100 nM kaj 1 μM ĉe ĉiu meza ŝanĝo.La medio estas saturita per oksigeno antaŭ anstataŭigo 3 fojojn tage.Histosekcioj estis kultivitaj en inkubatoro je 37 °C kaj 5% CO2.
Por CTCM-kulturoj, histosekcioj estis metitaj sur specialfaritan 3D-presilon en Petri-pladon enhavanta modifitan solvon de Tyrode.La aparato estas desegnita por pliigi la grandecon de la tranĉaĵo de la koro je 25% de la areo de la subtena ringo.Ĉi tio estas farita por ke la sekcioj de la koro ne streĉu post estado transdonitaj de la solvo de Tyrode al la medio kaj dum diastolo.Uzante histoakrilan gluon, sekcioj 300 µm dikaj estis fiksitaj sur subtenringo 7 mm en diametro.Post alfiksado de la histosekcioj al la subtena ringo, fortranĉu la troajn histajn sekciojn kaj metu la alfiksajn histajn sekciojn reen en la banon de Tyrode-solvo sur glacio (4 °C) ĝis sufiĉe da sekcioj estas preparitaj por unu aparato.La tuta pretigtempo por ĉiuj aparatoj ne devus superi 2 horojn.Post kiam 6 histosekcioj estis fiksitaj al siaj subtenringoj, la CTCM-aparato estis kunvenita.La CTCM-kulturĉambro estas antaŭplenigita per 21 ml antaŭ-oksigenita medio.Transloku la histajn sekciojn al la kulturĉambro kaj zorge forigu iujn ajn aervezikojn per pipeto.La histosekcio tiam estas gvidita en la truon kaj milde premita en lokon.Fine, metu la elektrodan ĉapon sur la aparaton kaj translokigu la aparaton al la inkubatoro.Poste konektu la CTCM al la aertubo kaj la C-PACE-EM-sistemo.La pneŭmatika aktuario malfermiĝas kaj la aervalvo malfermas la CTCM.La C-PACE-EM-sistemo estis agordita por liveri 4 V je 1.2 Hz dum bifaza paŝado dum 2 ms.La medio estis ŝanĝita dufoje tage kaj la elektrodoj estis ŝanĝitaj unufoje tage por eviti amasiĝon de grafito sur la elektrodoj.Se necese, histosekcioj povas esti forigitaj de siaj kulturputoj por forpeli iujn ajn aervezikojn kiuj eble falis sub ili.Por MT-traktadoj, T3/Dex estis aldonita freŝa kun ĉiu meza ŝanĝo kun 100 nM T3 kaj 1 μM Dex.La CTCM-aparatoj estis kultivitaj en inkubatoro je 37 °C kaj 5% CO2.
Por akiri streĉitajn trajektoriojn de kortranĉaĵoj, speciala fotilsistemo estis evoluigita.SLR-fotilo (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japanio) estis uzita per Navitar Zoom 7000 18-108mm makrolenso (Navitar, San Francisco, CA).Bildigo estis farita ĉe ĉambra temperaturo post anstataŭigi la medion per freŝa medio.La fotilo estas poziciigita je 51° angulo kaj vidbendo estas registrita je 30 kadroj je sekundo.Unue, malfermkoda programaro (MUSCLEMOTION43) estis uzata kun Image-J por kvantigi la moviĝon de kortranĉaĵoj.La masko estis kreita uzante MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Usono) por difini regionojn de intereso por bati kortranĉaĵojn por eviti bruon.Mane segmentitaj maskoj estas aplikataj al ĉiuj bildoj en kadrosinsekvo kaj poste pasitaj al la kromprogramo MUSCLEMOTION.Muskola Movo uzas la mezan intensecon de la pikseloj en ĉiu kadro por kvantigi ĝian movadon relative al la referenca kadro.Datumoj estis registritaj, filtritaj kaj uzataj por kvantigi ciklotempon kaj taksi histan streĉadon dum la kora ciklo.La registrita vidbendo estis post-prilaborita uzante unuaordan nul-fazan ciferecan filtrilon.Por kvantigi histostreĉadon (pinto-al-pinto), pinto-al-pinta analizo estis farita por distingi inter pintoj kaj trogoj en la registrita signalo.Krome, malstreĉado estas farita uzante 6-an ordan polinomon por elimini signalan drivon.Programkodo estis evoluigita en MATLAB por determini tutmondan histan movon, ciklotempon, malstreĉtempon kaj kuntiriĝtempon (Suplementa Programo-Kodo 44).
Por streĉa analizo, uzante la samajn filmetojn kreitajn por mekanika streĉiĝo-takso, ni unue spuris du bildojn reprezentantajn moviĝpintojn (la plej altaj (superaj) kaj plej malaltaj (malsupraj) punktoj de moviĝo) laŭ la programaro MUSCLEMOTION.Ni tiam segmentis la histajn regionojn kaj aplikis formon de ombra algoritmo al la segmentita histo (Suplementa Fig. 2a).La segmentita histo tiam estis dividita en dek subsurfacojn, kaj la streĉo sur ĉiu surfaco estis kalkulita uzante la sekvan ekvacion: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kie Sup kaj Sdown estas la distancoj de la formo de la supraj kaj malsupraj ombroj de la ŝtofo, respektive (Suplementa Fig. .2b).
Korsekcioj estis fiksitaj en 4% paraformaldehido dum 48 horoj.Fiksaj histoj estis senhidratigitaj en 10% kaj 20% sakarozo dum 1 h, tiam en 30% sakarozo dum la nokto.La sekcioj tiam estis enkonstruitaj en optimuma tranĉa temperaturkunmetaĵo (OCT-kunmetaĵo) kaj iom post iom frostigitaj en izopentano/sekglacia bano.Konservu OCT-enkonstruajn blokojn ĉe -80 °C ĝis apartigo.Diapozitivoj estis preparitaj kiel sekcioj kun dikeco de 8 μm.
Por forigi OCT el koraj sekcioj, varmigu la lumbildojn sur hejta bloko je 95 °C dum 5 minutoj.Aldonu 1 ml de PBS al ĉiu glito kaj kovu dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo, tiam trapenetru la sekciojn metante 0,1% Triton-X en PBS dum 15 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Por malhelpi nespecifajn antikorpojn ligi al la specimeno, aldonu 1 ml da 3% BSA-solvo al lumbildoj kaj kovu dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo.La BSA tiam estis forigita kaj la lumbildoj estis lavitaj kun PBS.Marku ĉiun specimenon per krajono.Primaraj antikorpoj (diluitaj 1:200 en 1% BSA) (koneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) kaj troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) estis aldonitaj dum 90 minutoj, tiam sekundaraj antikorpoj (Abcam; #AB18200) aldonis en muso 1148200 (Alexa28200) (Thermo Scientific; #A16079), kontraŭ kuniklo Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) dum pliaj 90 minutoj Lavita 3 fojojn kun PBS Por distingi celmakuladon de fono, ni uzis nur la malĉefan antikorpon kiel kontrolon. Fine, DAPI nuklea makulo estis aldonita kaj la diapozitivoj estis metitaj en pligrandigo kaj polurita laboratorio. kaj Keyence-mikroskopo kun 40x pligrandigo.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) je 5 μg/ml en PBS estis uzata por WGA-makulado kaj aplikita al fiksaj sekcioj dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.La lumbildoj tiam estis lavitaj per PBS kaj Sudan-nigro estis aldonita al ĉiu lumbildo kaj kovitaj dum 30 minutoj.La diapozitivoj estis tiam lavitaj per PBS kaj vectashield enkorpiganta medio estis aldonita.Diapozitivoj estis bildigitaj sur Keyence-mikroskopo ĉe 40x pligrandigo.
OCT estis forigita de la specimenoj kiel priskribite supre.Post forigo de la OCT, mergu la lumbildojn en la solvo de Bouin dum la nokto.La diapozitivoj tiam estis lavitaj per distilita akvo dum 1 horo kaj poste metitaj en Bibrich-aloacida fuksina solvo dum 10 minutoj.Tiam la diapozitivoj estis lavitaj per distilita akvo kaj metitaj en solvaĵon de 5% fosfomolibdeno/5% fosfotungsta acido dum 10 minutoj.Sen lavado, transiru la lumbildojn rekte en la anilinan bluan solvon dum 15 minutoj.Tiam la diapozitivoj estis lavitaj per distilita akvo kaj metitaj en 1% acetacidan solvon dum 2 minutoj.Glitbildoj estis sekigitaj en 200 N etanolo kaj transdonitaj al xileno.Makulitaj lumbildoj estis bildigitaj per Keyence-mikroskopo kun 10x celo.Fibroza areoprocento estis kvantigita per Keyence Analyzer-softvaro.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogo numero V13154, laŭ la protokolo de la fabrikanto kun kelkaj modifoj.Aparte, kirurgia stampilo kun diametro de 6 mm estis uzita por certigi unuforman histograndecon dum MTT-analizo.Histoj estis individue tegitaj en la putojn de 12-puta plato enhavanta MTT-substraton laŭ la protokolo de la produktanto.La sekcioj estas kovataj je 37° C. dum 3 horoj kaj la vivanta histo metaboligas la MTT-substraton por formi purpuran formazan kunmetaĵon.Anstataŭigu la MTT-solvon per 1 ml de DMSO kaj kovu je 37 °C dum 15 minutoj por ĉerpi purpuran formazanon el koraj sekcioj.Provaĵoj estis diluitaj 1:10 en DMSO en 96-bone klaraj malsupraj teleroj kaj purpura kolorintenseco mezurita je 570 nm per Cytation-platleganto (BioTek).Legadoj estis normaligitaj al la pezo de ĉiu tranĉaĵo de la koro.
Kortranĉaj amaskomunikiloj estis anstataŭigitaj per amaskomunikilaro enhavantaj 1 μCi/ml [5-3H]-glukozon (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Usono) por glukoza utiliga analizo kiel antaŭe priskribite.Post 4 horoj da kovado, aldonu 100 µl da medio al malfermita mikrocentrifuga tubo enhavanta 100 µl da 0,2 N HCl.Tiam la tubo estis metita en scintila tubo enhavanta 500 μl da dH2O por vaporiĝi [3H]2O dum 72 horoj je 37 °C.Poste forigu la mikrocentrifugan tubon el la scintila tubo kaj aldonu 10 ml da scintila fluido.Scintilaj kalkuloj estis faritaj per Tri-Carb 2900TR likva scintila analizilo (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Usono).Glukozo-utiligo tiam estis kalkulita konsiderante [5-3H]-glukozan specifan agadon, nekompletan ekvilibron kaj fonon, diluon de [5-3H]-al neetikedita glukozo, kaj scintila nombrila efikeco.La datumoj estas normaligitaj al la maso de sekcioj de la koro.
Post histohomogenigo en Trizol, RNA estis izolita de korsekcioj uzante la Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 laŭ la protokolo de la produktanto.RNAsec-biblioteka preparo, sekvencado kaj datuma analizo estis faritaj jene:
1 μg da RNA per specimeno estis uzata kiel komenca materialo por la preparado de la RNA-biblioteko.Sekvencaj bibliotekoj estis generitaj uzante la NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, Usono) sekvante la rekomendojn de la fabrikanto, kaj indekskodoj estis aldonitaj al la atributsekvencoj por ĉiu specimeno.Mallonge, mRNA estis purigita de totala RNA uzante magnetajn bidojn alkroĉitajn kun poli-T-oligonukleotidoj.Fragmentado estas efektivigita uzante divalentajn katjonojn ĉe alta temperaturo en NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Unua fadena cDNA estis sintezita uzante hazardajn heksamer-enkondukojn kaj M-MuLV inversan transkriptazon (RNase H-).La dua fadeno cDNA tiam estas sintezita uzante DNA-polimerazon I kaj RNase H. La ceteraj superpendaĵoj estas transformitaj al malakraj finoj per eksonukleazo/polimerazo-agado.Post adeniligo de la 3′ fino de la DNA-fragmento, NEBNext Adaptilo kun harpingla buklostrukturo estas alkroĉita al ĝi por prepari ĝin por hibridiĝo.Por elekto de cDNA fragmentoj de preferata longo 150-200 bp.bibliotekfragmentoj estis purigitaj uzante la AMPure XP-sistemon (Beckman Coulter, Beverly, Usono).Poste, 3 μl UZANTA Enzimo (NEB, Usono) kun grandec-elektita cDNA ligita per adaptilo estis uzataj dum 15 minutoj je 37 °C kaj poste dum 5 minutoj je 95 °C antaŭ PCR.PCR tiam estis farita uzante Phusion High-Fidelity DNA-polimerazon, universalajn PCR-enkondukojn, kaj Index (X) enkondukojn.Fine, PCR-produktoj estis purigitaj (AMPure XP-sistemo) kaj bibliotekkvalito taksita sur Agilent Bioanalyzer 2100-sistemo.La cDNA-biblioteko tiam estis sekvencita uzante Novaseq-sekvencilon.Krudaj bilddosieroj de Illumina estis konvertitaj al krudaj legaĵoj uzante CASAVA Base Calling.Krudaj datumoj estas stokitaj en FASTQ(fq) formataj dosieroj, kiuj enhavas legitajn sekvencojn kaj respondajn bazajn kvalitojn.Elektu HISAT2 por kongrui filtritajn sinsekvajn legadojn al la referenca genaro de Sscrofa11.1.Ĝenerale, HISAT2 subtenas genamojn de ajna grandeco, inkluzive de genamoj pli grandaj ol 4 miliardoj da bazoj, kaj defaŭltaj valoroj estas fiksitaj por la plej multaj parametroj.Splisaj legadoj de RNA Seq-datenoj povas esti efike vicigitaj uzante HISAT2, la plej rapidan sistemon nuntempe havebla, kun la sama aŭ pli bona precizeco ol iu ajn alia metodo.
La abundo de transskribaĵoj rekte reflektas la nivelon de genekspresio.Geneksprimniveloj estas taksitaj per la abundo de transskribaĵoj (sekvenckalkulo) asociitaj kun la genaro aŭ eksonoj.La nombro da legaĵoj estas proporcia al genesprimniveloj, genlongo, kaj sekvenca profundo.FPKM (fragmentoj por mil bazaj paroj de transskribaĵo sekvencita per miliono da bazaj paroj) estis kalkulitaj kaj P-valoroj de diferenciga esprimo estis determinitaj uzante la pakaĵon DESeq2.Ni tiam kalkulis la malveran malkovran indicon (FDR) por ĉiu P-valoro uzante la Benjamini-Hochberg-metodon9 bazitan sur la enkonstruita R-funkcio "p.adjust".
RNA izolita de korsekcioj estis konvertita al cDNA ĉe koncentriĝo de 200 ng/μl uzante la SuperScript IV Vilo Master-miksaĵon de Thermo (Thermo, kat. n-ro 11756050).Kvanta RT-PCR estis farita uzante Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-bone travidebla reagplato (Thermo, kat. n-ro 4483319) kaj mikroamp optika gluaĵo (Thermo, kat. n-ro 4311971).La reakcia miksaĵo konsistis el 5 µl Taqman Fast Advanced Master-miksaĵo (Thermo, kato numero 4444557), 0,5 µl Taqman Primer kaj 3,5 µl H2O miksita per puto.Normaj qPCR-cikloj estis kuritaj kaj CT-valoroj estis mezuritaj per Applied Biosystems Quantstudio 5 realtempa PCR-instrumento (384-putomodulo; produkto # A28135).Taqman-enkondukoj estis aĉetitaj de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_mS), ACTN901_mS900 (Ss0686_mS), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) estis normaligitaj al ĉiuj specimenoj de la valoro de CTDHAP normaligitaj.
Amaskomunikila eldono de NT-ProBNP estis taksita uzante la NT-ProBNP-ilaron (porko) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) laŭ la protokolo de la fabrikanto.Mallonge, 250 µl de ĉiu specimeno kaj normo estis aldonitaj duoble al ĉiu puto.Tuj post aldoni la specimenon, aldonu 50 µl da Testa Reaktivo A al ĉiu puto.Milde skuu la teleron kaj sigelu per sigelilo.Poste la tablojdoj estis kovataj je 37 °C dum 1 horo.Poste aspiru la solvaĵon kaj lavu la putojn 4 fojojn kun 350 µl da 1X lavsolvo, kovante la lavsolvaĵon dum 1-2 minutoj ĉiufoje.Poste aldonu 100 µl de Assay Reagent B per puto kaj sigelu per plato sigelilo.La tablojdo estis milde skuita kaj kovita je 37 °C dum 30 minutoj.Aspiru la solvon kaj lavu la putojn 5 ​​fojojn kun 350 µl da 1X lavsolvo.Aldonu 90 µl da substrata solvaĵo al ĉiu puto kaj sigelu la teleron.Kovu la teleron je 37 °C dum 10-20 minutoj.Aldonu 50 µl de Haltiga Solvo al ĉiu puto.La telero tuj estis mezurita per Cytation (BioTek) platolegilo fiksita ĉe 450 nm.
Potencaj analizoj estis faritaj por elekti la grupajn grandecojn, kiuj provizos >80% potencon por detekti 10% absolutan ŝanĝon en la parametro kun 5% Tipo I-erara indico. Potencaj analizoj estis faritaj por elekti la grupajn grandecojn, kiuj provizos >80% potencon por detekti 10% absolutan ŝanĝon en la parametro kun 5% Tipo I-erara indico. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя ти10% солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Potenca analizo estis farita por elekti grupajn grandecojn, kiuj donus >80% potencon por detekti 10% absolutan parametran ŝanĝon kun 5% Tipo I-erara indico.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的型和5％的型玥检测参数中10进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的型和5％的型玥检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мобора группы абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Potenca analizo estis farita por elekti grupgrandecon, kiu donus >80% potencon por detekti 10% absolutan parametron ŝanĝon kaj 5% tipo I-eraroprocenton.Histosekcioj estis hazarde elektitaj antaŭ la eksperimento.Ĉiuj analizoj estis kondiĉe blindaj kaj specimenoj estis malkoditaj nur post kiam ĉiuj datumoj estis analizitaj.GraphPad Prism-programaro (San-Diego, CA) estis uzata por plenumi ĉiujn statistikajn analizojn. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsideritaj signifaj ĉe valoroj <0.05. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsideritaj signifaj ĉe valoroj <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsideritaj signifaj ĉe valoroj <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsideritaj signifaj ĉe valoroj <0.05.La t-testo de Duvosta Studento estis farita sur la datumoj kun nur 2 komparoj.Unudirekta aŭ dudirekta ANOVA estis uzata por determini signifon inter multoblaj grupoj.Dum elfarado de post hoc testoj, la korekto de Tukey estis aplikita por respondeci pri multoblaj komparoj.RNAsec-datenoj havas specialajn statistikajn konsiderojn dum kalkulado de FDR kaj p.adjust kiel priskribite en la sekcio Metodoj.
Por pliaj informoj pri studdezajno, vidu la abstraktaĵon pri Natura Esplora Raporto ligita al ĉi tiu artikolo.