Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu la Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni prezentos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Novaj imunologiaj kaj amasspektrometriaj metodoj por kompleksa analizo de persistaj oligosakaridoj en maizrastroj antaŭtraktitaj per AFEX. Lignoceluloza biomaso estas daŭrigebla alternativo al fosiliaj brulaĵoj kaj estas vaste uzata por disvolvi bioteknologiojn por la produktado de produktoj kiel nutraĵoj, furaĝoj, brulaĵoj kaj kemiaĵoj. La ŝlosilo al ĉi tiuj teknologioj estas la disvolviĝo de kost-konkurencaj procezoj por konverti kompleksajn karbonhidratojn ĉeestantajn en plantĉelaj muroj en simplajn sukerojn kiel glukozo, ksilozo kaj arabinozo. Ĉar lignoceluloza biomaso estas tre obstina, ĝi devas esti submetita al termokemiaj traktadoj (ekz., amoniaka fibro-deskvamiĝo (AFEX), diluitaj acidoj (DA), jonaj likvaĵoj (IL)) kaj biologiaj traktadoj (ekz., enzima hidrolizo kaj mikroba fermentado) en kombinaĵo por akiri la deziratan produkton. Tamen, kiam komercaj fungaj enzimoj estas uzataj en la hidroliza procezo, nur 75-85% de la solveblaj sukeroj formitaj estas monosakaridoj, kaj la ceteraj 15-25% estas solveblaj, nesolveblaj oligosakaridoj, kiuj ne ĉiam estas haveblaj al mikroorganismoj. Antaŭe, ni sukcese izolis kaj purigis solveblajn obstinajn oligosakaridojn uzante kombinaĵon de karbona kaj diatomitera apartigo kaj grandec-ekskluda kromatografio, kaj ankaŭ esploris iliajn enzimajn inhibiciajn ecojn. Ni trovis, ke oligosakaridoj enhavantaj metiligitajn uronacidajn anstataŭigojn kun pli alta grado de polimerigo (DP) estas pli malfacile prilaboreblaj per komercaj enzimaj miksaĵoj ol kun malalta DP kaj neŭtralaj oligosakaridoj. Ĉi tie ni raportas la uzon de pluraj pliaj metodoj, inkluzive de glikana profilado uzante monoklonajn antikorpojn (mAb-ojn) specifajn por plantbiomasaj glikanoj por karakterizi glikanajn ligojn en plantĉelmuroj kaj enzimaj hidrolizaĵoj, matric-helpata lasera desorba jonigo, tempo-de-flugmasa spektrometrio. MALDI-TOF-MS) uzas struktur-informajn diagnozajn pintojn akiritajn per spektroskopio post sekundara disfalo de negativaj jonoj, gasa kromatografio kaj masa spektrometrio (GC-MS) por karakterizi oligosakaridajn ligojn kun kaj sen derivado. Pro la eta grandeco de oligosakaridoj (DP 4–20), ĉi tiujn molekulojn malfacilas uzi por ligado kaj karakterizado de mAb-oj. Por solvi ĉi tiun problemon, ni aplikis novan metodon de imobiligo de oligosakaridoj bazitan sur biotina konjugacio, kiu sukcese etikedis la plimulton de malalt-DP-solveblaj oligosakaridoj sur la mikroplata surfaco, kiu poste estis uzita en alt-traira mAb-sistemo por specifa ligada analizo. Ĉi tiu nova metodo faciligos la disvolvon de pli progresintaj alt-trairaj glikomaj analizoj en la estonteco, kiuj povos esti uzataj por izoli kaj karakterizi oligosakaridojn ĉeestantajn en biosignoj por diagnozaj celoj.
Lignoceluloza biomaso, konsistanta el agrikulturaj, forstaj, herbaj kaj lignecaj materialoj, estas ebla krudmaterialo por la produktado de biobazitaj produktoj, inkluzive de nutraĵoj, furaĝoj, fueloj kaj kemiaj antaŭuloj por produkti pli altvalorajn produktojn1. Karbonhidratoj (kiel celulozo kaj hemicelulozo) ĉeestantaj en plantĉelaj muroj estas depolimerigitaj en monosakaridojn per kemia prilaborado kaj biotransformo (kiel enzima hidrolizo kaj mikroba fermentado). Oftaj antaŭtraktadoj inkluzivas amoniakan fibro-ekspansion (AFEX), diluitan acidon (DA), jonan likvaĵon (IL) kaj vaporeksplodon (SE), kiuj uzas kombinaĵon de kemiaĵoj kaj varmo por redukti lignocelulozan produktadon malfermante plantĉelajn murojn3,4. obstineco de materio, 5. Enzima hidrolizo estas efektivigita je alta solida ŝarĝo uzante komercajn aktivajn karbonhidrat-entenantajn enzimojn (CAZimojn) kaj mikroban fermentadon uzante transgenajn gistojn aŭ bakteriojn por produkti biobazitajn fuelojn kaj kemiaĵojn6.
CAZimoj en komercaj enzimoj konsistas el kompleksa miksaĵo de enzimoj, kiuj sinergie fendas kompleksajn karbonhidrat-sukerajn ligojn por formi monosakaridojn2,7. Kiel ni raportis antaŭe, la kompleksa reto de aromaj polimeroj de lignino kun karbonhidratoj igas ilin tre nesolveblaj, kio kondukas al nekompleta sukerkonverto, akumulante 15-25% da seksaj oligosakaridoj, kiuj ne estas produktitaj dum enzima hidrolizo de la antaŭtraktita biomaso. Ĉi tio estas ofta problemo kun diversaj antaŭtraktadmetodoj de biomaso. Kelkaj kialoj por ĉi tiu proplempunkto inkluzivas enziman inhibicion dum hidrolizo, aŭ la foreston aŭ malaltajn nivelojn de esencaj enzimoj, kiuj necesas por rompi sukerligojn en planta biomaso. Kompreni la konsiston kaj strukturajn karakterizaĵojn de sukeroj, kiel ekzemple la sukerligoj en oligosakaridoj, helpos nin plibonigi sukerkonverton dum hidrolizo, igante bioteknologiajn procezojn kosto-konkurencaj kun nafto-derivitaj produktoj.
Determini la strukturon de karbonhidratoj estas malfacila kaj postulas kombinaĵon de metodoj kiel likva kromatografio (LC)11,12, nuklea magneta resonanca spektroskopio (NMR)13, kapilara elektroforezo (CE)14,15,16 kaj masspektrometrio (MS)17. ,dek ok. MS-metodoj kiel tempo-de-flugmasspektrometrio kun lasera desorbado kaj jonigo uzante matricon (MALDI-TOF-MS) estas multflanka metodo por identigi karbonhidratajn strukturojn. Lastatempe, Kolizi-Induktita Disociiĝo (CID) tandema MS de natriaj jonaj aduktoj estis plej vaste uzata por identigi fingrospurojn respondantajn al oligosakaridaj alligaj pozicioj, anomeraj konfiguracioj, sekvencoj kaj branĉiĝaj pozicioj20, 21.
Glikana analizo estas bonega ilo por profunda identigo de karbonhidrataj ligoj22. Ĉi tiu metodo uzas monoklonajn antikorpojn (mAbs) direktitajn al glikano de la plantĉela muro kiel sondilojn por kompreni kompleksajn karbonhidratajn ligojn. Pli ol 250 mAbs estas haveblaj tutmonde, desegnitaj kontraŭ diversaj liniaj kaj branĉitaj oligosakaridoj uzante diversajn sakaridojn24. Pluraj mAbs estis vaste uzitaj por karakterizi la strukturon, konsiston kaj modifojn de la plantĉela muro, ĉar ekzistas signifaj diferencoj depende de plantĉela tipo, organo, aĝo, evolua stadio kaj kreskomedio25,26. Pli lastatempe, ĉi tiu metodo estis uzita por kompreni veziklajn populaciojn en plantaj kaj bestaj sistemoj kaj iliajn respektivajn rolojn en glikana transporto kiel determinite de subĉelaj markiloj, evoluaj stadioj aŭ mediaj stimuloj, kaj por determini enziman agadon. Kelkaj el la malsamaj strukturoj de glikanoj kaj ksilanoj, kiuj estis identigitaj, inkluzivas pektinon (P), ksilanon (X), mananon (M), ksiloglukanojn (XylG), miksitajn ligajn glukanojn (MLG), arabinoksilanon (ArbX), galaktomananon (GalG), glukuronan acidon-arabinoksilanon (GArbX) kaj arabino-galaktanon (ArbG)29.
Tamen, malgraŭ ĉiuj ĉi tiuj esplorklopodoj, nur kelkaj studoj fokusiĝis al la naturo de oligosakarida amasiĝo dum hidrolizo kun alta solida ŝarĝo (HSL), inkluzive de oligosakarida liberigo, ŝanĝoj en oligomeraj ĉenlongoj dum hidrolizo, diversaj malaltaj DP-polimeroj, kaj iliaj kurboj. distribuoj 30,31,32. Dume, kvankam glikana analizo pruviĝis utila ilo por ampleksa analizo de glikana strukturo, estas malfacile taksi akvosolveblajn malaltajn DP-oligosakaridojn uzante antikorpajn metodojn. Pli malgrandaj DP-oligosakaridoj kun molekula pezo malpli ol 5-10 kDa ne ligiĝas al ELISA-platoj 33, 34 kaj estas forlavitaj antaŭ antikorpa aldono.
Ĉi tie, por la unua fojo, ni demonstras ELISA-analizon sur avidin-kovritaj platoj uzante monoklonajn antikorpojn, kombinante unu-paŝan biotinigan proceduron por solveblaj obstinaj oligosakaridoj kun glikoma analizo. Nia aliro al glikoma analizo estis validigita per MALDI-TOF-MS kaj GC-MS-bazita analizo de komplementaj oligosakaridaj ligiloj uzante trimetilsililan (TMS) derivadon de hidroligitaj sukeraj konsistoj. Ĉi tiu noviga aliro povas esti evoluigita kiel alt-traira metodo en la estonteco kaj trovi pli vastan aplikon en biomedicina esplorado35.
Post-tradukadaj modifoj de enzimoj kaj antikorpoj, kiel ekzemple glikosiligo,36 influas ilian biologian aktivecon. Ekzemple, ŝanĝoj en glikosiligo de serumproteinoj ludas gravan rolon en inflama artrito, kaj ŝanĝoj en glikosiligo estas uzataj kiel diagnozaj indikiloj37. Diversaj glikanoj estas raportitaj en la literaturo kiel facile aperantaj en diversaj malsanoj, inkluzive de kronikaj inflamaj malsanoj de la gastrointesta vojo kaj hepato, virusaj infektoj, ovariaj, mamaj kaj prostatkanceroj38,39,40. Kompreni la strukturon de glikanoj uzante antikorp-bazitajn glikanajn ELISA-metodojn donos plian fidon en malsandiagnozo sen la uzo de kompleksaj MS-metodoj.
Nia antaŭa studo montris, ke obstinaj oligosakaridoj restis nehidrolizitaj post antaŭtraktado kaj enzima hidrolizo (Figuro 1). En nia antaŭe publikigita laboro, ni evoluigis aktivigitan lignokarban solid-fazan ekstraktan metodon por izoli oligosakaridojn el AFEX-antaŭtraktita maizramena hidrolizato (ACSH)8. Post komenca ekstraktado kaj apartigo, la oligosakaridoj estis plue frakciitaj per grandeca ekskluda kromatografio (SEC) kaj kolektitaj laŭ ordo de molekula pezo. Sukermonomeroj kaj oligomeroj liberigitaj de diversaj antaŭtraktadoj estis analizitaj per sukerkonsista analizo. Kiam oni komparas la enhavon de sukeroligoj akiritaj per diversaj antaŭtraktaj metodoj, la ĉeesto de obstinaj oligosakaridoj estas ofta problemo en la konverto de biomaso al monosakaridoj kaj povas konduki al redukto de sukerrendimento de almenaŭ 10-15% kaj eĉ ĝis 18%. Ĉi tiu metodo estas uzata por plia grandskala produktado de oligosakaridaj frakcioj. La rezulta ACH kaj ĝiaj postaj frakcioj kun malsamaj molekulaj pezoj estis uzataj kiel eksperimenta materialo por la karakterizado de oligosakaridoj en ĉi tiu laboro.
Post antaŭtraktado kaj enzima hidrolizo, persistaj oligosakaridoj restis nehidrolizitaj. Jen (A) metodo por apartigi oligosakaridojn, en kiu oligosakaridoj estas izolitaj el AFEX-antaŭtraktita maizrastruma hidrolizaĵo (ACSH) uzante pakitan liton el aktivigita karbono kaj diatomito; (B) Metodo por apartigi oligosakaridojn. La oligosakaridoj estis plue apartigitaj per grandeca ekskluda kromatografio (SEC); (C) Sakaridaj monomeroj kaj oligomeroj liberigitaj el diversaj antaŭtraktadoj (diluita acido: DA, jona likvaĵo: IL kaj AFEX). Kondiĉoj de enzima hidrolizo: alta ŝarĝo de solidoj de 25% (p/p) (ĉirkaŭ 8% glukana ŝarĝo), 96 horoj da hidrolizo, 20 mg/g komerca enzima ŝarĝo (proporcio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) kaj (D) Sukermonomeroj kaj oligomeroj de glukozo, ksilozo kaj arabinozo liberigitaj el AFEX-antaŭtraktita maizrastrumo (ACS).
Glikana analizo pruviĝis utila ilo por ampleksa struktura analizo de glikanoj en ekstraktoj izolitaj el solidaj biomasaj restaĵoj. Tamen, akvosolveblaj sakaridoj estas subreprezentitaj uzante ĉi tiun tradician metodon41 ĉar malalt-molekulaj oligosakaridoj malfacile senmovigeblas sur ELISA-platoj kaj estas ellavitaj antaŭ aldono de antikorpo. Tial, por antikorpa ligado kaj karakterizado, unu-paŝa biotiniga metodo estis uzata por kovri solveblajn, nekonformajn oligosakaridojn sur avidin-kovritaj ELISA-platoj. Ĉi tiu metodo estis testita uzante nian antaŭe produktitan ACSH kaj frakcion bazitan sur ĝia molekula pezo (aŭ grado de polimerigo, DP). Unu-paŝa biotinigo estis uzata por pliigi oligosakaridan ligan afinecon aldonante biotino-LC-hidrazido al la redukta fino de la karbonhidrato (Fig. 2). En solvaĵo, la hemiacetala grupo ĉe la redukta fino reagas kun la hidrazida grupo de biotino-LC-hidrazido por formi hidrazonan ligon. Ĉeestante la redukta agento NaCNBH3, la hidrazona ligo estas reduktita al stabila biotinilita fina produkto. Kun la modifo de la sukero-reduktanta fino, ligado de malalt-DP-oligosakaridoj al ELISA-platoj fariĝis ebla, kaj en nia studo tio estis farita sur avidin-kovritaj platoj uzante glikan-celitajn mAb-ojn.
Rastrumo de monoklonaj antikorpoj bazitaj sur ELISA por biotinilitaj oligosakaridoj. Ĉi tie (A) kombinita biotiniligo de oligosakaridoj kaj posta ELISA-rastrumo kun glikan-celitaj monoklonaj antikorpoj sur NeutrAvidin-kovritaj platoj kaj (B) montras unu-paŝan proceduron por biotiniligo de reakciaj produktoj.
Avidin-kovritaj platoj kun oligosakarid-konjugitaj antikorpoj estis poste aldonitaj al primaraj kaj sekundaraj antikorpoj kaj lavitaj en lum- kaj tempo-sentema medio. Post kiam la ligado de la antikorpoj finiĝas, aldonu TMB-substraton por kovi la platon. La reakcio estis fine haltigita per sulfata acido. La kovitaj platoj estis analizitaj per ELISA-legilo por determini la ligforton de ĉiu antikorpo por detekti antikorpo-specifan krucligadon. Por detaloj kaj parametroj de la eksperimento, vidu la respondan sekcion "Materialoj kaj Metodoj".
Ni montras la utilecon de ĉi tiu nove evoluigita metodo por specifaj aplikoj per karakterizado de la solveblaj oligosakaridoj ĉeestantaj en ACSH same kiel en krudaj kaj purigitaj oligosakaridaj frakcioj izolitaj de lignocelulozaj hidrolizaĵoj. Kiel montrite en Figuro 3, la plej oftaj epitop-anstataŭigitaj ksilanoj identigitaj en ACSH uzante bioacilitajn glikomajn analizmetodojn estas kutime uronaj (U) aŭ metiluronaj (MeU) kaj pektaj arabinogalaktanoj. La plej multaj el ili ankaŭ estis trovitaj en nia antaŭa studo pri la analizo de glikanoj de ne-hidrolizitaj solidoj (UHS)43.
Detekto de rezistemaj oligosakaridaj epitopoj uzante monoklonan antikorpon direktitan al la glikano de la ĉelmuro. La "neŭtrala" frakcio estas la ACN-frakcio kaj la "acida" frakcio estas la FA-frakcio. Pli helaj ruĝoj sur la varmomapo indikas pli altan epitopan enhavon, kaj pli helaj bluoj indikas malplenan fonon. Kolorvaloroj sur la skalo baziĝas sur krudaj OD-valoroj por formuliĝoj N=2. La ĉefaj epitopoj rekonitaj de la antikorpoj estas montritaj dekstre.
Tiuj ne-celulozaj strukturoj ne povis esti fenditaj per la plej oftaj celulazoj kaj hemicelulazoj en la testita komerca enzimmiksaĵo, kiu inkluzivas la plej ofte uzatajn komercajn enzimojn. Tial, novaj helpenzimoj estas necesaj por ilia hidrolizo. Sen la necesaj ne-celulozaj akcesoraj enzimoj, tiuj ne-celulozaj ligoj malhelpas kompletan konvertiĝon al monosakaridoj, eĉ se iliaj gepatraj sukerpolimeroj estas amplekse hidrolizitaj en pli mallongajn fragmentojn kaj solvitaj uzante komercajn enzimmiksaĵojn.
Plia studo pri signaldistribuo kaj ĝia ligforto montris, ke ligantaj epitopoj estis pli malaltaj en sukerfrakcioj kun alta DP (A, B, C, DP ĝis 20+) ol en frakcioj kun malalta DP (D, E, F, DP) en dimeroj (Fig. 1). Acidaj fragmentoj estas pli oftaj en ne-celulozaj epitopoj ol neŭtralaj fragmentoj. Ĉi tiuj fenomenoj kongruas kun la ŝablono observita en nia antaŭa studo, kie alta DP kaj acidaj partoj estis pli rezistemaj al enzima hidrolizo. Tial, la ĉeesto de ne-celulozaj glikanaj epitopoj kaj U- kaj MeU-anstataŭigoj povas multe kontribui al la stabileco de la oligosakaridoj. Notindas, ke lig- kaj detektefikeco povas esti problemaj por malalta DP-oligosakaridoj, precipe se la epitopo estas dimera aŭ trimera oligosakarido. Ĉi tio povas esti testita uzante komercajn oligosakaridojn de malsamaj longoj, ĉiu enhavanta nur unu epitopon, kiu ligas al specifa mAb.
Tiel, la uzo de struktur-specifaj antikorpoj rivelis certajn tipojn de rezistemaj ligoj. Depende de la tipo de uzita antikorpo, la taŭga ligpadrono, kaj la forto de la signalo, kiun ĝi produktas (plej kaj malplej abunda), novaj enzimoj povas esti identigitaj kaj aldonitaj duonkvante al la enzima miksaĵo por pli kompleta glikokonverto. Prenante la analizon de ACSH-oligosakaridoj kiel ekzemplon, ni povas krei datumbazon de glikanaj ligoj por ĉiu biomasa materialo. Notindas ĉi tie, ke la malsama afineco de antikorpoj devas esti konsiderata, kaj se ilia afineco estas nekonata, tio kreos certajn malfacilaĵojn dum komparado de la signaloj de malsamaj antikorpoj. Krome, komparo de glikanaj ligoj povas funkcii plej bone inter specimenoj por la sama antikorpo. Ĉi tiuj obstinaj ligoj povas tiam esti ligitaj al la CAZyme-datumbazo, el kiu ni povas identigi enzimojn, elekti kandidatajn enzimojn kaj testi lig-rompantajn enzimojn, aŭ evoluigi mikrobajn sistemojn por esprimi ĉi tiujn enzimojn por uzo en biorafinejoj44.
Por taksi kiel imunologiaj metodoj kompletigas alternativajn metodojn por karakterizi malalt-molekulajn oligosakaridojn ĉeestantajn en lignocelulozaj hidrolizaĵoj, ni efektivigis MALDI (Fig. 4, S1-S8) kaj analizon de TMS-derivitaj sakaridoj bazitan sur GC-MS sur la sama panelo (Fig. 5) de oligosakarida parto. MALDI estas uzata por kompari ĉu la amasdistribuo de oligosakaridaj molekuloj kongruas kun la celita strukturo. En fig. 4 estas montrita MS de la neŭtralaj komponantoj ACN-A kaj ACN-B. ACN-A analizo konfirmis gamon da pentozaj sukeroj de DP 4-8 (Fig. 4) ĝis DP 22 (Fig. S1), kies pezoj respondas al MeU-ksilanaj oligosakaridoj. ACN-B analizo konfirmis la pentozajn kaj glukoksilanajn seriojn kun DP 8-15. En suplementa materialo kiel ekzemple Figuro S3, FA-C acidaj partoj amasdistribuaj mapoj montras gamon da (Me)U-anstataŭigitaj pentozaj sukeroj kun DP de 8-15, kiuj kongruas kun la anstataŭigitaj ksilanoj trovitaj en ELISA-bazita mAb-rastrumo. La epitopoj estas kongruaj.
MALDI-MS-spektro de solveblaj nekonformaj oligosakaridoj ĉeestantaj en ACS. Ĉi tie, (A) ACN-A malaltpezaj frakcioj enhavantaj metiligitajn uronatajn acidajn (DP 4-8) anstataŭigitajn glukuroksilanajn oligosakaridojn kaj (B) ACN-B ksilanajn kaj metiligitajn uronatajn acidajn oligosakaridojn anstataŭigitajn per glukuroksilano (DP 8-15).
Analizo de la konsisto de la glikana restaĵo de obstinaj oligosakaridoj. Jen (A) TMS-sakarida konsisto de diversaj oligosakaridaj frakcioj akiritaj per GC-MS-analizo. (B) Strukturoj de diversaj TMS-derivitaj sukeroj ĉeestantaj en oligosakaridoj. ACN - acetonitrila frakcio enhavanta neŭtralajn oligosakaridojn kaj FA - ferulacida frakcio enhavanta acidajn oligosakaridojn.
Alia interesa konkludo estis tirita el la LC-MS-analizo de la oligosakarida frakcio, kiel montrite en Figuro S9 (metodoj videblas en la elektronika suplementa materialo). Fragmentoj de heksozo kaj -OAc-grupoj estis plurfoje observitaj dum ligado de la ACN-B-frakcio. Ĉi tiu trovo ne nur konfirmas la fragmentiĝon observitan en glikomo kaj MALDI-TOF-analizo, sed ankaŭ provizas novajn informojn pri eblaj karbonhidrataj derivaĵoj en antaŭtraktita lignoceluloza biomaso.
Ni ankaŭ faris analizon de la konsisto de glikanoj en oligosakaridaj frakcioj uzante TMS-glikanan derivadon. Uzante GC-MS, ni determinis la konsiston de neŭralaj (nederivitaj) kaj acidaj sukeroj (GluA kaj GalA) en la oligosakarida frakcio (Fig. 5). Glukurona acido troviĝas en acidaj komponantoj C kaj D, dum galakturona acido troviĝas en acidaj komponantoj A kaj B, kiuj ambaŭ estas alt-DP-komponantoj de acidaj sukeroj. Ĉi tiuj rezultoj ne nur konfirmas niajn ELISA- kaj MALDI-datumojn, sed ankaŭ kongruas kun niaj antaŭaj studoj pri oligosakarida amasiĝo. Tial, ni kredas, ke modernaj imunologiaj metodoj uzantaj biotinigon de oligosakaridoj kaj postan ELISA-rastrumon sufiĉas por detekti solveblajn rezistemajn oligosakaridojn en diversaj biologiaj specimenoj.
Ĉar ELISA-bazitaj mAb-rastrummetodoj estis validigitaj per pluraj malsamaj metodoj, ni volis plue esplori la potencialon de ĉi tiu nova kvanta metodo. Du komercaj oligosakaridoj, ksiloheksasakarida oligosakarido (XHE) kaj 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotriozo (A2XX), estis aĉetitaj kaj testitaj uzante novan mAb-aliron celantan la ĉelmuran glikanon. Figuro 6 montras linian korelacion inter la biotinilita ligsignalo kaj la logaritma koncentriĝo de oligosakarida koncentriĝo, sugestante eblan Langmuir-adsorban modelon. Inter la mAb-oj, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, kaj CCRC-M151 korelaciis kun XHE, kaj CCRC-M108, CCRC-M109, kaj LM11 korelaciis kun A2XX trans intervalo de 1 nm ĝis 100 nano. Pro la limigita havebleco de antikorpoj dum la eksperimento, limigitaj eksperimentoj estis faritaj kun ĉiu oligosakarida koncentriĝo. Notindas ĉi tie, ke iuj antikorpoj reagas tre malsame al la sama oligosakarido kiel substrato, supozeble ĉar ili ligiĝas al iomete malsamaj epitopes kaj povas havi tre malsamajn ligkapablojn. La mekanismoj kaj implicoj de preciza epitope-identigo estos multe pli kompleksaj kiam la nova mAb-aliro estos aplikita al realaj specimenoj.
Du komercaj oligosakaridoj estis uzitaj por determini la detektintervalon de diversaj glikan-celantaj monoklonaj antikorpoj. Ĉi tie, linearaj korelacioj kun logaritma koncentriĝo de oligosakarida koncentriĝo indikas Langmuir-adsorbajn ŝablonojn por (A) XHE kun monoklona antikorpo kaj (B) A2XX kun monoklona antikorpo. La respondaj epitopoj indikas la strukturojn de la komercaj oligosakaridoj uzitaj kiel substratoj en la analizo.
La uzo de glikan-celitaj monoklonaj antikorpoj (glikokomika analizo aŭ ELISA-bazita mAb-rastrumo) estas potenca ilo por profunda karakterizado de la plej multaj el la ĉefaj ĉelmuraj glikanoj, kiuj konsistigas plantbiomason. Tamen, klasika glikananalizo karakterizas nur pli grandajn ĉelmurajn glikanojn, ĉar la plej multaj oligosakaridoj ne estas efike imobilizitaj sur ELISA-platoj. En ĉi tiu studo, AFEX-antaŭtraktita maizrastrumo estis enzimece hidrolizita je alta solida enhavo. Sukeranalizo estis uzata por determini la konsiston de rezistemaj ĉelmuraj karbonhidratoj en la hidrolizaĵo. Tamen, mAb-analizo de pli malgrandaj oligosakaridoj en hidrolizaĵoj estas subtaksita, kaj pliaj iloj estas necesaj por efike imobilizi oligosakaridojn sur ELISA-platoj.
Ni raportas ĉi tie novan kaj efikan metodon de oligosakarida senmovigigo por mAb-rastrumo kombinante oligosakaridan biotiniligon sekvatan de ELISA-rastrumo sur NeutrAvidin™-kovritaj platoj. La senmovigitaj biotinilitaj oligosakaridoj montris sufiĉan afinecon por la antikorpo por ebligi rapidan kaj efikan detekton de rezistemaj oligosakaridoj. Analizo de la konsisto de ĉi tiuj obstinaj oligosakaridoj bazita sur masspektrometrio konfirmis la rezultojn de ĉi tiu nova aliro al imuno-rastrumo. Tiel, ĉi tiuj studoj montras, ke la kombinaĵo de oligosakarida biotiniligo kaj ELISA-rastrumo kun glikan-celitaj monoklonaj antikorpoj povas esti uzata por detekti krucligojn en oligosakaridoj kaj povas esti vaste aplikata en aliaj biokemiaj studoj karakterizantaj la strukturon de oligosakaridoj.
Ĉi tiu biotin-bazita glikana profilmetodo estas la unua raporto kapabla esplori la rezistemajn karbonhidratajn ligojn de solveblaj oligosakaridoj en planta biomaso. Ĉi tio helpas kompreni kial iuj partoj de biomaso estas tiel obstinaj kiam temas pri biofuelproduktado. Ĉi tiu metodo plenigas gravan mankon en glikomaj analizaj metodoj kaj etendas sian aplikon al pli vasta gamo de substratoj preter plantaj oligosakaridoj. En la estonteco, ni eble uzos robotikon por biotiniligo kaj uzos la metodon, kiun ni disvolvis, por alt-traira analizo de specimenoj uzante ELISA.
Maizpajlo (MA) kultivita el hibridaj semoj Pioneer 33A14 estis rikoltita en 2010 de Kramer Farms en Ray, Kolorado. Kun la permeso de la terposedanto, ĉi tiu biomaso povas esti uzata por esplorado. La specimenoj estis konservitaj sekaj kun humideco < 6% en zip-fermeblaj sakoj je ĉambra temperaturo. La specimenoj estis konservitaj sekaj kun humideco < 6% en zip-fermeblaj sakoj je ĉambra temperaturo. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнатной комтнахп. Specimenoj estis konservitaj seke je <6% humideco en zipfermitaj sakoj je ĉambra temperaturo.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Specimenoj estas konservataj en zip-sakoj je ĉambra temperaturo kun humideco < 6%.La studo konformis al lokaj kaj naciaj gvidlinioj. Komponaĵa analizo estis farita uzante la NREL-protokolon. La komponaĵo enhavis 31.4% glukanon, 18.7% ksilanon, 3.3% arabinanon, 1.2% galaktanon, 2.2% acetilon, 14.3% ligninon, 1.7% proteinon kaj 13.4% cindron.
Cellic® CTec2 (138 mg proteino/ml, loto VCNI 0001) estas kompleksa miksaĵo de celulazo, β-glukozidazo kaj Cellic® HTec2 (157 mg proteino/ml, loto VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, Usono)). Multifect Pectinase® (72 mg proteino/mL), kompleksa miksaĵo de pektino-malkonstruantaj enzimoj, estis donacita de DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Usono). Enzimaj proteinaj koncentriĝoj estis determinitaj per takso de proteina enhavo (kaj subtraho de la kontribuo de neproteina nitrogeno) uzante Kjeldahl-nitrogenan analizon (AOAC-metodo 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Usono). Diatoma tero 545 estis aĉetita de EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivigita karbono (DARCO, 100-maŝaj granuloj), Avicel (PH-101), faga ksilano, kaj ĉiuj aliaj kemiaĵoj estis aĉetitaj de Sigma-Aldrich (Sankta Luiso, Misurio).
Antaŭtraktado per AFEX estis efektivigita ĉe GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Usono). La antaŭtraktado estis efektivigita je 140 °C dum 15 minutoj. 46-cola restadtempo kun proporcio 1:1 de anhidra amoniako al biomaso je 60% (p/p) ŝarĝo en rustorezistŝtala labortabla reaktoro (Parr Instruments Company). Ĝi daŭris 30 minutojn. La reaktoro estis varmigita ĝis 140 °C kaj la amoniako estis rapide liberigita, permesante al la biomaso rapide reveni al ĉambra temperaturo. La konsisto de antaŭtraktita maizrastrumo per AFEX (ACS) estis simila al tiu de netraktita maizrastrumo (UT-CS).
Alt-solidaj ACSH 25% (p/p) (ĉirkaŭ 8% dekstrana ŝarĝo) estis preparita kiel startmaterialo por grandskala produktado de oligosakaridoj. Enzimata hidrolizo de ACS estis efektivigita uzante komercan enziman miksaĵon inkluzive de Cellic® Ctec2 10 mg proteino/g glukano (en antaŭtraktita biomaso), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteino/g glukano, kaj Multifect Pectinase (Genencor Inc, Usono). ), 5 mg proteino/g dekstrano. Enzimata hidrolizo estis efektivigita en 5-litra bioreaktoro kun laborvolumeno de 3 litroj, pH 4.8, 50°C kaj 250 rpm. Post hidrolizo dum 96 horoj, la hidrolizaĵo estis kolektita per centrifugado je 6000 rpm dum 30 minutoj kaj poste je 14000 rpm dum 30 minutoj por forigi nehidrolizitajn solidojn. La hidrolizaĵo estis poste submetita al sterila filtrado tra 0,22 mm filtra beko. La filtrita hidrolizaĵo estis konservita en sterilaj boteloj je 4°C kaj poste frakciita sur karbono.
Analizo de la konsisto de ekstrakt-bazitaj biomasaj specimenoj laŭ la laboratorioanalizaj proceduroj de NREL: preparado de specimenoj por konsistoanalizo (NREL/TP-510-42620) kaj determinado de strukturaj karbonhidratoj kaj lignino en biomaso (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analizo de oligosakaridoj de la hidroliza fluo estis farita je 2 ml skalo uzante aŭtoklav-bazitan acidan hidrolizan metodon. Miksu la hidrolizan specimenon kun 69.7 µl da 72% sulfata acido en 10 ml ŝraŭbkovrila kulturtubo kaj kovu dum 1 horo sur labortablo je 121 °C, malvarmigu sur glacio kaj filtru en alt-efikecan likvaĵkromatografian (HPLC) fioleton. La koncentriĝo de oligosakaridoj estis determinita subtrahante la koncentriĝon de monosakaridoj en la ne-hidrolizita specimeno de la totala sukerkoncentriĝo en la acido-hidrolizita specimeno.
Glukozo, ksilozo, kaj arabinozo-koncentriĝoj en la acido-hidrolizita biomaso estis analizitaj uzante Shimadzu HPLC-sistemon ekipitan per aŭtomata specimenigilo, kolumna hejtilo, izokrata pumpilo, kaj refraktaindica detektilo sur Bio-Rad Aminex HPX-87H kolumno. La kolumno estis konservita je 50 °C kaj eluvita per 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 en akvofluo.
La hidrolizata supernatanto estis diluita kaj analizita pri monomera kaj oligosakarida enhavo. Monomeraj sukeroj akiritaj post enzima hidrolizo estis analizitaj per HPLC ekipita per Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolono kaj cindrogardista kolono. La kolontemperaturo estis konservita je 80°C, akvo estis uzata kiel la movebla fazo kun flukvanto de 0.6 ml/min. Oligosakaridoj estis determinitaj per hidrolizo en diluita acido je 121°C laŭ la metodoj priskribitaj en ref. 41, 48, 49.
Sakarida analizo estis farita sur krudaj, AFEX-antaŭtraktitaj kaj ĉiuj ne-hidrolizitaj biomasaj restaĵoj (inkluzive de produktado de seriaj ĉelmuraj ekstraktoj kaj ilia mAb-rastrumo) uzante antaŭe priskribitajn procedurojn 27, 43, 50, 51. Por glikoma analizo, alkohol-nesolveblaj restaĵoj de plantĉelmura materialo estas preparitaj el biomasaj restaĵoj kaj submetitaj al seria ekstraktado kun ĉiam pli agresemaj reakciiloj kiel amonia oksalato (50 mM), natria karbonato (50 mM kaj 0.5% p/v), CON. (1M kaj 4M, ambaŭ kun 1% p/v natria borohidrido) kaj acida klorito kiel antaŭe priskribite 52,53. La ekstraktoj estis poste submetitaj al ELISA kontraŭ kompleksa panelo de mAb50-oj direktitaj al la ĉelmura glikano, kaj la mAb-ligaj reakcioj estis prezentitaj kiel varmomapo. mAb-oj celantaj plantĉelmuran glikanon estis aĉetitaj el laboratoriaj provizoj (CCRC, JIM kaj MAC-serioj).
Unupaŝa biotiniligo de oligosakaridoj. La konjugacio de karbonhidratoj kun biotino-LC-hidrazido estis efektivigita per la sekva proceduro. Biotino-LC-hidrazido (4,6 mg/12 μmol) estis solvita en dimetilsulfoksido (DMSO, 70 μl) per forta kirlado kaj varmigo je 65°C dum 1 minuto. Glacieja acetata acido (30 µl) estis aldonita kaj la miksaĵo estis verŝita sur natrian cianoborohidridon (6,4 mg/100 µmol) kaj tute solvita post varmigo je 65°C dum ĉirkaŭ 1 minuto. Poste, de 5 ĝis 8 μl de la reakcia miksaĵo estis aldonita al la sekigita oligosakarido (1-100 nmol) por akiri 10-oblan aŭ pli molan eksceson de la etikedo super la reduktanta fino. La reakcio estis efektivigita je 65°C dum 2 horoj, post kio la specimenoj estis tuj purigitaj. Neniu natria cianoborohidrido estis uzata en la etikedaj eksperimentoj sen redukto, kaj la specimenoj reagis je 65 °C dum 2,5 horoj.
ELISA-tegaĵo kaj lavado de specimenoj de biotinilitaj oligosakaridoj. 25 μl da biotinilitaj specimenoj (100 μl de ĉiu koncentrita specimeno diluita en 5 ml da 0.1 M Tris-bufrosolvaĵo (TBS)) estis aldonitaj al ĉiu puto de la avidin-tegita plato. Kontrolaj putoj estis tegitaj per 50 μl da biotino je koncentriĝo de 10 μg/ml en 0.1 M TBS. Senjonigita akvo estis uzata kiel tegaĵo por blankaj mezuradoj. La tableto estis inkubaciita dum 2 horoj je ĉambra temperaturo en mallumo. Lavu la platon 3 fojojn per 0.1% senkremigita lakto en 0.1 M TBS uzante programon n-ro 11 por Grenier-plata 3A.
Aldono kaj lavado de primaraj antikorpoj. Aldonu 40 µl da primara antikorpo al ĉiu puto. Kovu la mikroplaton dum 1 horo je ĉambra temperaturo en mallumo. La platoj estis poste lavitaj 3 fojojn per 0.1% lakto en 0.1M TBS uzante lavprogramon n-ro 11 por Grenier Flat 3A.
Aldonu sekundaran antikorpon kaj lavu. Aldonu 50 µl da musa/rata sekundara antikorpo (diluita 1:5000 en 0.1%-a lakto en 0.1 M TBS) al ĉiu puto. Kovu la mikroplaton dum 1 horo je ĉambra temperaturo en mallumo. La mikroplatoj estis poste lavitaj 5 fojojn per 0.1%-a lakto en 0.1 M TBS uzante Grenier Flat 5A platlavprogramon #12.
Aldonante substraton. Aldonu 50 µl da 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidino (TMB) al la baza substrato (aldonante 2 gutojn da bufrosolvaĵo, 3 gutojn da TMB, 2 gutojn da hidrogena peroksido al 15 ml da dejonigita akvo). Preparu la TMB-substraton kaj kirlu antaŭ uzo). Kovu la mikroplaton je ĉambra temperaturo dum 30 minutoj. En mallumo.
Kompletigu la paŝon kaj legu la tableton. Aldonu 50 µl da 1 N sulfata acido al ĉiu puto kaj registru la absorbadon de 450 ĝis 655 nm uzante ELISA-legilon.
Preparu 1 mg/ml solvaĵojn de ĉi tiuj analitoj en dejonigita akvo: arabinozo, ramnozo, fukozo, ksilozo, galakturona acido (GalA), glukurona acido (GlcA), manozo, glukozo, galaktozo, laktozo, N-acetilmanosamino (manNAc), N-acetilglukozamino (glcNAc), N-acetilgalaktozamino (galNAc), inozitolo (interna normo). Du normoj estis preparitaj aldonante la 1 mg/mL sukersolvaĵojn montritajn en Tabelo 1. Specimenoj estas frostigitaj kaj liofiligitaj je -80°C ĝis la tuta akvo estas forigita (kutime ĉirkaŭ 12-18 horoj).
Aldonu 100–500 µg da specimeno al ŝraŭbkovrilaj tuboj sur analiza pesilo. Registru la aldonitan kvanton. Plej bone estas solvi la specimenon en specifa koncentriĝo de solvilo kaj aldoni ĝin al la tubo kiel likvan alikvoton. Uzu 20 µl da 1 mg/ml inozitolo kiel internan normon por ĉiu specimentubo. La kvanto de interna normo aldonita al la specimeno devas esti la sama kiel la kvanto de interna normo aldonita al la norma tubo.
Aldonu 8 ml da anhidra metanolo al ŝraŭbkovrila fiolo. Poste 4 ml da 3 N. metanola HCl-solvaĵo, kovru kaj skuu. Ĉi tiu procezo ne uzas akvon.
Aldonu 500 µl da 1 M HCl-metanola solvaĵo al la oligosakaridaj specimenoj kaj normaj TMS-tuboj. La specimenoj estis inkubaciitaj dumnokte (168 horoj) je 80°C en termika bloko. Sekigu la metanolizan produkton je ĉambra temperaturo uzante sekigan multtubon. Aldonu 200 µl da MeOH kaj sekigu denove. Ĉi tiu procezo estas ripetata dufoje. Aldonu 200 µl da metanolo, 100 µl da piridino kaj 100 µl da aceta anhidrido al la specimeno kaj bone miksu. Inkubu la specimenojn je ĉambra temperaturo dum 30 minutoj. kaj sekigu. Aldonu 200 µl da metanolo kaj sekigu denove.
Aldonu 200 µl da Tri-Sil kaj varmigu la tubon kun la kovrilo dum 20 minutoj. 80°C, poste malvarmigu ĝin ĝis ĉambra temperaturo. Uzu sekigan dukton por plue sekigi la specimenon ĝis volumeno de proksimume 50 µl. Gravas noti, ke ni ne lasis la specimenojn tute sekiĝi.
Aldonu 2 ml da heksano kaj bone miksu per kirlikado. Plenigu la pintojn de Pasteur-pipetoj (5-8 mm) per peco da vitrolano enmetante la vitrolanon sur pipeton kun diametro de 5-3/4 coloj. Specimenoj estis centrifugitaj je 3000 g dum 2 minutoj. Ĉiuj nesolveblaj restaĵoj precipitiĝas. Sekigu la specimenon ĝis 100-150 µl. Volumeno de proksimume 1 μl estis injektita en la GC-MS je komenca temperaturo de 80 °C kaj komenca tempo de 2.0 minutoj (Tabelo 2).