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La morfogénesis del intestino humano establece características de cripta-vellosidad de microarquitectura epitelial 3D y organización espacial. Esta estructura única es necesaria para mantener la homeostasis intestinal al proteger el nicho de células madre en la cripta basal de antígenos microbianos exógenos y sus metabolitos. Además, las vellosidades intestinales y el moco secretor presentan células epiteliales funcionalmente diferenciadas con una barrera protectora en la superficie de la mucosa intestinal. Por lo tanto, recrear estructuras epiteliales 3D es crucial para la construcción de intestino in vitro En particular, el intestino en un chip mimético orgánico puede inducir la morfogénesis 3D espontánea del epitelio intestinal con funciones fisiológicas y biomecánicas mejoradas. Morfogénesis 3D y caracterización de epitelios 3D establecidos utilizando múltiples modalidades de imágenes. Este protocolo logra la regeneración de la microarquitectura intestinal funcional mediante el control del flujo de fluido basolateral durante 5 días. capas in vitro para aplicaciones biomédicas, clínicas y farmacéuticas.
Los experimentos demuestran que las células Caco-2 epiteliales intestinales cultivadas en gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o dispositivos de microfluidos bicapa6,7 pueden sufrir una morfogénesis 3D espontánea in vitro sin una comprensión clara del mecanismo subyacente. Organoides intestinales vivos.Se validaron las células epiteliales. En este estudio, nos centramos específicamente en la producción celular y la distribución de la concentración de un potente antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en gut-on-a-chip y dispositivos microfluídicos modificados que contienen insertos de Transwell, denominados "Chip híbrido". inhibe la morfogénesis o interrumpe la capa epitelial 3D preestructurada, lo que sugiere que el estrés antagónico durante el cultivo es responsable de la morfogénesis intestinal in vitro. Por lo tanto, un enfoque práctico para lograr una morfogénesis robusta en la interfaz epitelial es eliminar o mantener mínimamente los niveles de antagonistas de Wnt en el compartimento basolateral mediante lavado activo (p. ej., en plataformas gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip) o difusión. s en grandes depósitos basolaterales en pozos).
En este protocolo, proporcionamos un método detallado para fabricar microdispositivos gut-on-a-chip y chips híbridos insertables Transwell (pasos 1-5) para cultivar células epiteliales intestinales en membranas porosas basadas en polidimetilsiloxano (PDMS) (pasos 6A, 7A, 8, 9) o membranas de poliéster de insertos Transwell (pasos 6B, 7B, 8, 9) y morfogénesis 3D inducida in vitro (paso 10). También identificamos características celulares y moleculares indicativas de histogénesis específica de tejido y diferenciación celular dependiente del linaje mediante la aplicación de múltiples modalidades de imagen (pasos 11-24). Inducimos la morfogénesis utilizando células epiteliales intestinales humanas, como Caco-2 u organoides intestinales, en dos formatos de cultivo con detalles técnicos que incluyen la modificación de la superficie de las membranas porosas, la creación de monocapas 2D y la bioquímica intestinal y la reproducción del microambiente biomecánico. in vitro. Para inducir 3D morfogénesis a partir de monocapas epiteliales 2D, eliminamos los antagonistas de morfógenos en ambas formas cultivadas haciendo fluir el medio hacia el compartimento basolateral del cultivo. Finalmente, proporcionamos una representación de la utilidad de una capa epitelial 3D regenerable que se puede utilizar para modelar el crecimiento epitelial dependiente de morfógenos, cocultivos longitudinales de microbioma huésped, infección patógena, lesión inflamatoria, disfunción de la barrera epitelial y terapias basadas en probióticos Ejemplo.influencias.
Nuestro protocolo puede ser útil para una amplia gama de científicos en investigación básica (p. ej., biología de la mucosa intestinal, biología de células madre y biología del desarrollo) y aplicada (p. ej., pruebas preclínicas de fármacos, modelado de enfermedades, ingeniería de tejidos y gastroenterología). estasis. Además, nuestro protocolo es útil para interrogar la infección bajo varios agentes infecciosos como el norovirus 8, el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae.Las audiencias de patología y patogenia de la enfermedad también son útiles. El uso de un sistema de microfisiología intestinal en el chip puede permitir el cocultivo longitudinal 10 y la evaluación posterior de la defensa del huésped, las respuestas inmunitarias y la reparación de lesiones relacionadas con patógenos en el tracto gastrointestinal (GI) 11 . Capas epiteliales intestinales en 3D, estas enfermedades incluyen atrofia de las vellosidades, acortamiento de las criptas, daño de la mucosa o deterioro de la barrera epitelial. Biopsia u organoides intestinales derivados de células madre.células inmunitarias específicas de tejido, 5.
Dado que la microestructura epitelial en 3D puede fijarse y visualizarse sin el proceso de corte, los espectadores que trabajen en transcriptómica espacial e imágenes de alta resolución o superresolución pueden estar interesados ​​en nuestro mapeo de la dinámica espaciotemporal de genes y proteínas en nichos epiteliales.Interesado en la tecnología. Respuesta a estímulos microbianos o inmunitarios. Además, la diafonía longitudinal entre el microbioma y el huésped 10, 14 que coordina la homeostasis intestinal se puede establecer en la capa de la mucosa intestinal en 3D mediante el cultivo conjunto de varias especies microbianas, comunidades microbianas o microbiota fecal, especialmente en el intestino en un chip.en la plataforma. Este enfoque es particularmente atractivo para las audiencias que estudian inmunología de la mucosa, gastroenterología, microbioma humano, culturómica y microbiología clínica que buscan cultivar microbiota intestinal no cultivada previamente en el laboratorio. Si nuestro protocolo de morfogénesis in vitro se puede adaptar a formatos de cultivo escalables, como inserciones de múltiples pocillos en placas de 24, 96 o 384 pocillos que reponen continuamente los compartimentos basolaterales, el protocolo también se puede difundir a aquellos que desarrollan productos farmacéuticos, biomédicos o de alto rendimiento. poner plataformas de detección o validación para la industria alimentaria. Como prueba de principio, demostramos recientemente la viabilidad de un sistema multiplex de morfogénesis de alto rendimiento escalable a un formato de placa de 24 pocillos. morfogénesis a nivel transcriptómico para probar fármacos o productos bioterapéuticos La absorción y el transporte de fármacos candidatos se evaluó utilizando sustitutos intestinales 3D o utilizando modelos de órganos en un chip comerciales o personalizados para evaluar la reproducibilidad del proceso de morfogénesis intestinal.
Se ha utilizado un número limitado de modelos experimentales relevantes para humanos para estudiar la morfogénesis epitelial intestinal, principalmente debido a la falta de protocolos implementables para inducir la morfogénesis 3D in vitro. De hecho, gran parte del conocimiento actual sobre la morfogénesis intestinal se basa en estudios con animales (p. ej., pez cebra20, ratones21 o pollos22). los modelos también tienen una capacidad muy limitada para probarse de una manera escalable de múltiples vías. Por lo tanto, nuestro protocolo para regenerar estructuras tisulares 3D in vitro supera a los modelos animales in vivo, así como a otros modelos de cultivo celular 2D estáticos tradicionales. formar nichos espaciales y la evolución ecológica en respuesta a los factores del huésped (p. ej., capas de moco internas versus externas, secreción de IgA y péptidos antimicrobianos). Además, la morfología epitelial 3D puede permitirnos comprender cómo la microbiota intestinal estructura sus comunidades y produce sinérgicamente metabolitos microbianos (p. ej., ácidos grasos de cadena corta) que dan forma a la organización celular y los nichos de células madre en las criptas basales. Estas características solo pueden demostrarse cuando las capas epiteliales 3D se establecen in vitro .
Además de nuestro método de creación de estructuras epiteliales intestinales en 3D, existen varios métodos in vitro. El cultivo de organoides intestinales es una técnica de ingeniería de tejidos de última generación basada en el cultivo de células madre intestinales en condiciones específicas de morfógenos23,24,25. los antígenos exógenos son limitados.El acceso a los lúmenes de los organoides se puede mejorar usando un microinyector, 26,27 pero este método es invasivo y laborioso y requiere conocimientos especializados para su realización. Además, los cultivos de organoides tradicionales mantenidos en andamios de hidrogel en condiciones estáticas no reflejan con precisión la biomecánica activa in vivo.
Otros enfoques empleados por varios grupos de investigación utilizan andamios de hidrogel 3D preestructurados para imitar la estructura epitelial intestinal mediante el cultivo de células intestinales humanas aisladas en la superficie del gel. Fabrique andamios de hidrogel utilizando moldes fabricados litográficamente, micromolidos o impresos en 3D. Este método muestra la disposición autoorganizada de células epiteliales aisladas in vitro con gradientes de morfógeno fisiológicamente diafonía epitelial mediante la inclusión de células estromales en el andamio. Sin embargo, la naturaleza de los andamios preestructurados puede impedir la visualización del proceso morfogenético espontáneo en sí. Estos modelos tampoco proporcionan un flujo luminal o intersticial dinámico, ya que carecen de la tensión de cizallamiento del fluido que las células intestinales necesitan para experimentar la morfogénesis y obtener una función fisiológica. Los organoides intestinales de ratón siguen patrones grabados para formar estructuras tubulares intestinales, y el flujo de fluido intraluminal se puede recapitular usando un módulo de microfluidos. Sin embargo, este modelo no exhibe procesos morfogenéticos espontáneos ni incluye movimientos mecanobiológicos intestinales. Las técnicas de impresión 3D del mismo grupo pudieron crear tubos intestinales en miniatura con procesos morfogenéticos espontáneos. A pesar de la compleja fabricación de diferentes segmentos intestinales dentro del tubo, este modelo también carece de flujo de fluido luminal y deformación mecánica. puede ser limitado, especialmente después de que se completa el proceso de bioimpresión, perturbando las condiciones experimentales o las interacciones de célula a célula. En cambio, nuestro protocolo propuesto proporciona morfogénesis intestinal espontánea, tensión de corte fisiológicamente relevante, biomecánica que imita la motilidad intestinal, accesibilidad de compartimentos apicales y basolaterales independientes y recreación de microambientes biológicos complejos de modularidad. Por lo tanto, nuestro protocolo de morfogénesis 3D in vitro puede proporcionar un enfoque complementario para superar los desafíos de los métodos existentes.
Nuestro protocolo se centra completamente en la morfogénesis epitelial 3D, con solo células epiteliales en cultivo y ningún otro tipo de células circundantes, como células mesenquimales, células endoteliales y células inmunitarias. Para recrear la capa epitelial 3D ondulante, quedan por considerar más complejidades biológicas adicionales, como las interacciones epitelio-mesénquima33,34, el depósito de matriz extracelular (MEC)35 y, en nuestro modelo, las características de cripta-vellosidades que transportan nichos de células madre en las criptas basales. 7,38. La adición de células mesenquimales a nuestro modelo mejoró el proceso morfogenético y la eficiencia de unión celular. La capa endotelial (es decir, capilares o linfáticos) juega un papel importante en la regulación del transporte molecular39 y el reclutamiento de células inmunitarias40 en el microambiente intestinal. Además, los componentes de la vasculatura que se pueden conectar entre modelos de tejido son un requisito previo cuando los modelos de tejido están diseñados para demostrar interacciones multiorgánicas. resolución a nivel de órgano. Las células inmunitarias derivadas del paciente también son esenciales para mostrar respuestas inmunitarias innatas, presentación de antígenos, diafonía inmunitaria adaptativa innata e inmunidad específica de tejido en el contexto de la imitación de enfermedades intestinales.
El uso de chips híbridos es más sencillo que gut-on-a-chip porque la configuración del dispositivo es más simple y el uso de insertos Transwell permite un cultivo escalable del epitelio intestinal. Sin embargo, los insertos Transwell disponibles comercialmente con membranas de poliéster no son elásticos y no pueden simular movimientos de tipo peristáltico. Además, el compartimento apical del inserto Transwell colocado en el chip híbrido permaneció estacionario sin esfuerzo cortante en el lado apical. Claramente, las propiedades estáticas en el compartimento apical rara vez permiten cocultivo bacteriano en chips híbridos. Si bien podemos inducir sólidamente la morfogénesis 3D en insertos Transwell cuando se utilizan chips híbridos, la escasez de biomecánica fisiológicamente relevante y flujo de fluido apical puede limitar la viabilidad de las plataformas de chips híbridos para aplicaciones potenciales.
Las reconstrucciones a gran escala del eje humano de cripta-vellosidad en cultivos gut-on-a-chip e híbrido-on-a-chip no se han establecido por completo. Dado que la morfogénesis comienza a partir de una monocapa epitelial, las microarquitecturas 3D no proporcionan necesariamente una similitud morfológica con las criptas in vivo. Aunque los canales superiores más altos en el chip conducen a una mayor altura del epitelio creado por microingeniería, la altura máxima todavía está limitada a ~300–400 µm. La profundidad real de las criptas intestinales humanas en los intestinos delgado y grueso es de ~135 µm y ~400 µm, respectivamente, y la altura de las vellosidades del intestino delgado es de ~600 µm41.
Desde el punto de vista de la imagen, la imagen de súper resolución in situ de microarquitecturas 3D puede estar limitada al intestino en un chip, ya que la distancia de trabajo requerida desde la lente del objetivo hasta la capa epitelial es del orden de unos pocos milímetros. Para superar este problema, es posible que se requiera un objetivo distante. es extremadamente difícil abrir o quitar la capa superior para examinar la estructura de la superficie de la capa epitelial. Por ejemplo, mediante el uso de un microscopio electrónico de barrido (SEM).
La hidrofobicidad del PDMS ha sido un factor limitante en los estudios basados ​​en microfluidos que tratan con moléculas pequeñas hidrofóbicas, ya que el PDMS puede adsorber de manera no específica tales moléculas hidrofóbicas. Se pueden considerar alternativas al PDMS con otros materiales poliméricos. Como alternativa, se puede considerar la modificación de la superficie del PDMS (p. ej., recubrimiento con materiales lipofílicos 42 o poli(etilenglicol) 43 ) para minimizar la adsorción de moléculas hidrofóbicas.
Finalmente, nuestro método no ha sido bien caracterizado en términos de proporcionar un cribado de alto rendimiento o una plataforma experimental fácil de usar "talla única". El protocolo actual requiere una bomba de jeringa por microdispositivo, lo que ocupa espacio en una incubadora de CO2 y evita experimentos a gran escala. Esta limitación puede mejorarse significativamente mediante la escalabilidad de formatos de cultivo innovadores (p. medios).
Para inducir la morfogénesis 3D del epitelio intestinal humano in vitro, utilizamos un dispositivo intestinal de chip microfluídico que contiene dos microcanales paralelos y una membrana porosa elástica en el medio para crear una interfaz entre la luz y el capilar. También demostramos el uso de un dispositivo microfluídico de un solo canal (un chip híbrido) que proporciona un flujo basolateral continuo debajo de capas epiteliales polarizadas cultivadas en insertos Transwell. para eliminar los antagonistas de morfógenos del compartimento basolateral. Todo el procedimiento experimental (Figura 1) consta de cinco partes: (i) microfabricación del chip intestinal o chip híbrido insertable Transwell (pasos 1-5; cuadro 1), (ii) preparación de células epiteliales intestinales (células Caco-2) u organoides intestinales humanos;recuadros 2-5), (iii) cultivo de células epiteliales intestinales en chips intestinales o chips híbridos (pasos 6-9), (iv) inducción de morfogénesis 3D in vitro (paso 10) y (v)) para caracterizar la microestructura epitelial 3D (pasos 11-24). controles temporales, condicionales o de procedimiento.
Utilizamos dos plataformas de cultivo diferentes: gut-on-a-chip con canales rectos o canales contorneados no lineales, o chips híbridos que contienen insertos Transwell (TW) en un dispositivo de microfluidos, fabricados como se describe en el Cuadro 1, y el paso 1 -5. "Fabricación del dispositivo" muestra los pasos principales para hacer un solo chip o un chip híbrido. morfogénesis in vitro” muestra los pasos generales en los que Caco-2 o células epiteliales derivadas de organoides se cultivan en un chip intestinal o en insertos Transwell de un chip híbrido, seguido de la inducción de morfogénesis 3D y la formación de una estructura epitelial caracterizada. El número de paso del programa o número de cuadro se muestra debajo de cada flecha. , y modelado de enfermedades. las imágenes superpuestas en "Host-Microbe Co-Cultures" muestran cocultivos representativos del microbioma del huésped en el intestino en un chip. clei (azul). El modelo de enfermedad ilustra intestino sano versus permeable en chips de inflamación intestinal bajo desafío fisiológico con antígenos bacterianos (p. ej., lipopolisacárido, LPS) y células inmunitarias (p. ej., PBMC;verde). Se cultivaron células Caco-2 para establecer una capa epitelial 3D. Barra de escala, 50 µm. Imágenes en la fila inferior: "Diferenciación de células" adaptada con permiso de la referencia.Prensa de la Universidad de Oxford;Reproducido con permiso de Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” adaptado con permiso de la ref.3.NAS;“Modelado de enfermedades” adaptado con permiso de la referencia.5.NAS.
Tanto los chips de trip-on-chip como los híbridos se fabricaron utilizando réplicas de PDMS que se desmoldaron a partir de moldes de silicio mediante litografía blanda1,44 y se modelaron con SU-8. El diseño de los microcanales en cada chip se determina considerando la hidrodinámica, como la tensión de cizallamiento y la presión hidrodinámica1,4,12. a-chip (datos extendidos Fig. 1b) que incluye un par de microcanales curvos para inducir un mayor tiempo de residencia del fluido, patrones de flujo no lineales y deformación multiaxial de células cultivadas (Fig. 2a–f) en comparación con el Gut-Chip original, independientemente del tipo de célula cultivada. Por lo tanto, para inducir la morfogénesis 3D, los diseños de tripa en chip lineales y complejos son intercambiables. Las réplicas de PDMS curadas en moldes de silicona con patrones SU-8 proporcionaron características negativas después del desmoldeo (Fig.2a). Para fabricar el intestino en un chip, la capa superior de PDMS preparada se unió secuencialmente a una película porosa de PDMS y luego se alineó con la capa inferior de PDMS mediante unión irreversible utilizando un tratador corona (Fig. 2b-f). superficies de la réplica de PDMS y vidrio con plasma de oxígeno o tratamiento corona. Después de la esterilización del dispositivo microfabricado unido al tubo de silicona, la configuración del dispositivo estaba lista para realizar la morfogénesis 3D del epitelio intestinal (Figura 2g).
a, Ilustración esquemática de la preparación de piezas de PDMS a partir de moldes de silicona con patrón SU-8. La solución de PDMS sin curar se vertió en un molde de silicona (izquierda), se curó a 60 °C (centro) y se desmoldó (derecha). La PDMS desmoldeada se cortó en pedazos y se limpió para su uso posterior. b, Fotografía del molde de silicona utilizado para preparar la capa superior de PDMS. c, Fotografía del molde de silicona utilizado para fabricar la membrana porosa de PDMS. , Una serie de fotografías de los componentes superior e inferior del PDMS y el dispositivo intestinal ensamblado en el chip. e, Esquema de la alineación de los componentes superior, de membrana e inferior del PDMS. Cada capa está unida de manera irreversible mediante tratamiento con plasma o corona. f, Esquema del dispositivo gut-on-a-chip fabricado con microcanales superpuestos y cámaras de vacío. y la jeringa se colocó en un cubreobjetos. El dispositivo de chip se colocó en la tapa de una placa de Petri de 150 mm para su procesamiento. El aglutinante se usa para cerrar el tubo de silicona. cale bar, 1 cm.h Reimpreso con permiso de la referencia.4.Elsevier.
En este protocolo, la línea celular Caco-2 y los organoides intestinales se usaron como fuentes epiteliales (Fig. 3a). Ambos tipos de células se cultivaron de forma independiente (Cuadro 2 y Cuadro 5) y se usaron para sembrar microcanales recubiertos con ECM de tripa en chip o insertos Transwell. Se cultivaron organoides intestinales humanos de biopsias intestinales o resecciones quirúrgicas en cúpulas de andamio Matrigel en placas de 24 pocillos para soportar el microambiente estructural. El medio que contenía morfógenos esenciales (como Wnt, R-spondin y Noggin) y factores de crecimiento preparados como se describe en el Cuadro 3 se complementó cada dos días hasta que los organoides crecieron a ~ 500 µm de diámetro. Organoides completamente desarrollados se recolectan y se disocian en células individuales para sembrar en el intestino o en insertos Transwell en un chip (Cuadro 5). Como hemos informado anteriormente, se puede diferenciar según el tipo de enfermedad12,13 (p. ej., colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, cáncer colorrectal o donante normal), el sitio de la lesión (p. ej., lesión versus área no lesionada) y la ubicación gastrointestinal en el tracto (p. ej., duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon o recto). Brindamos un protocolo optimizado en el Cuadro 5 para el cultivo de organoides colónicos (coloides) que normalmente requieren concentraciones más altas de morfógenos que los organoides del intestino delgado.
a, Flujo de trabajo para la inducción de la morfogénesis intestinal en el chip intestinal. En este protocolo se utilizan organoides intestinales y epitelio intestinal humano Caco-2 para demostrar la morfogénesis 3D. Las células epiteliales aisladas se sembraron en el dispositivo gut-on-a-chip preparado (preparación del chip). días (flujo, AP, D0-D2). El flujo basolateral (BL) también se inicia junto con los movimientos de estiramiento cíclicos (estiramiento, flujo, AP y BL) cuando se forma una monocapa 2D completa. La morfogénesis intestinal 3D ocurrió espontáneamente después de 5 días de cultivo microfluídico (morfogénesis, D5). Las imágenes de contraste de fase muestran la morfología representativa de las células Caco-2 en cada paso experimental o punto de tiempo (gráfico de barras, 100 µm). que ilustran las cascadas correspondientes de la morfogénesis intestinal (arriba a la derecha). Las flechas discontinuas en el esquema representan la dirección del flujo de fluido. b, imagen SEM que muestra la topología de la superficie del epitelio 3D Caco-2 establecido (izquierda). Membranas con borde de cepillo etiquetadas con F-actina (verde) y núcleos (azul) Visualización confocal de inmunofluorescencia de células epiteliales en chips intestinales. Las flechas que apuntan al esquema central indican la ubicación del plano focal para cada vista confocal. e, microfotografía DIC del epitelio organoide 3D establecido en el intestino en un corte tomado el día 7.f, imágenes de inmunofluorescencia superpuestas que muestran marcadores para células madre (LGR5;magenta), células caliciformes (MUC2; verde), actina F (gris) y núcleos (cian) cultivados en chips intestinales durante 3 días, respectivamente (izquierda) y organoides de 13 días (centro) en la capa epitelial. Consulte también la Figura 3 de datos extendidos, que destaca la señalización LGR5 sin señalización MUC2. ing la membrana plasmática con colorante CellMask (derecha) el día 13 de cultivo. La barra de escala es de 50 μm a menos que se indique lo contrario. b Reimpreso con permiso de la referencia.Prensa de la Universidad de Oxford;c Adaptado con permiso de Reference.2.Prensa de la Universidad de Oxford;e y f adaptados con permiso por referencia.12 Bajo Creative Commons License CC BY 4.0.
En el intestino de un chip, es necesario modificar la superficie hidrofóbica de la membrana porosa de PDMS para lograr un recubrimiento exitoso de ECM. En este protocolo, aplicamos dos métodos diferentes para modificar la hidrofobicidad de las membranas de PDMS. funcionalización de la superficie basada en productos químicos para lograr una deposición eficiente de las proteínas ECM mediante la aplicación secuencial de polietilenimina (PEI) y glutaraldehído a los microcanales de PDMS. Después de la modificación de la superficie, las proteínas de ECM se depositaron para cubrir la superficie funcionalizada del PDMS y luego se introdujeron en el epitelio organoide aislado. El recubrimiento de ECM permite la unión del epitelio organoide para inducir la morfogénesis 3D en la superficie del PDMS.
Los cultivos Transwell también requieren un recubrimiento de ECM antes de la siembra celular;sin embargo, los cultivos Transwell no requieren pasos de pretratamiento complejos para activar la superficie de los insertos porosos. Para cultivar células Caco-2 en insertos Transwell, el recubrimiento de ECM en insertos porosos acelera la unión de células Caco-2 disociadas (<1 hora) y la formación de barreras de uniones estrechas (<1-2 días). con integridad de barrera. Los cultivos Transwell se realizan en placas de 24 pozos sin el uso de chips híbridos.
La morfogénesis 3D in vitro se puede iniciar aplicando un flujo de líquido a la cara basolateral de una capa epitelial establecida. En el intestino en un chip, la morfogénesis epitelial comenzó cuando el medio se perfundió en los microcanales superior e inferior (Fig. 3a). estrés de cizallamiento, generalmente aplicamos flujo dual en el intestino en un chip. En chips híbridos, se insertaron insertos Transwell que contenían monocapas epiteliales en los chips híbridos. Luego, el medio se aplicó debajo del lado basolateral del inserto poroso Transwell a través del microcanal. La morfogénesis intestinal ocurrió 3-5 días después del inicio del flujo basolateral en ambas plataformas de cultivo.
Las características morfológicas de las capas epiteliales 3D creadas con microingeniería se pueden analizar mediante la aplicación de diversas modalidades de imagen, incluida la microscopía de contraste de fase, la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), SEM o la microscopía confocal de inmunofluorescencia (Figuras 3 y 4). La imagen DIC o de contraste de fase se puede realizar fácilmente en cualquier momento durante el cultivo para controlar la forma y la protuberancia de las capas epiteliales 3D. Las plataformas de chip híbrido y en un chip pueden proporcionar imágenes in situ en tiempo real sin necesidad de seccionar o desmontar el dispositivo. Al realizar imágenes de inmunofluorescencia (Figuras 1, 3c, f y 4b, c), las células se fijan normalmente con paraformaldehído (PFA) al 4 % (peso/vol), seguido de Triton X-100 y albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % (peso/vol), en orden. Según el tipo de célula, diferentes fijadores, Se pueden usar permeabilizadores y agentes bloqueantes. Los anticuerpos primarios dirigidos a marcadores de células o regiones dependientes del linaje se usan para resaltar las células inmovilizadas in situ en el chip, seguidos de anticuerpos secundarios junto con un tinte de contraste dirigido al núcleo (p. ej., 4′,6-diamidino-2-fenileno) indol, DAPI) o actina F (p. ej., faloidina marcada con fluorescencia). También se pueden realizar imágenes en vivo basadas en fluorescencia in situ para detectar la producción de moco (Fig.1, "Diferenciación celular" y "Fisiología intestinal"), la colonización aleatoria de células microbianas (Fig. 1, "Cocultivo huésped-microbio"), el reclutamiento de células inmunitarias (Fig. 1, 'Modelado de la enfermedad') o los contornos de la morfología epitelial en 3D (Fig. 3c,f y 4b,c). 2, la morfología epitelial en 3D, así como las microvellosidades en el borde en cepillo apical, se pueden visualizar mediante SEM (Fig. 3b). La expresión de los marcadores de diferenciación se puede evaluar mediante PCR5 cuantitativa o secuenciación de ARN de una sola célula.
a, Flujo de trabajo para la inducción de morfogénesis intestinal en un chip híbrido. Caco-2 y organoides intestinales se utilizan en este protocolo para demostrar la morfogénesis 3D en una plataforma de chip híbrido. Las células epiteliales disociadas se sembraron en insertos Transwell preparados (preparación TW; consulte la figura a continuación). que contenía una monocapa 2D de células epiteliales se integró en un chip híbrido para introducir un flujo basolateral (Flow, BL), que finalmente llevó a la generación de una capa epitelial 3D (morfogénesis). Morfogénesis 3D de células epiteliales organoides con vistas de microscopía confocal de arriba hacia abajo tomadas en diferentes posiciones Z (superior, media e inferior;véase el esquema de la derecha y las líneas de puntos correspondientes).micrografías confocales de fluorescencia (vista en ángulo 3D) de células epiteliales derivadas de organoide cultivadas en Transwell estático (TW; inserto dentro del recuadro blanco discontinuo) versus chip híbrido (toma completa más grande) comparando morfología 2D versus 3D, respectivamente. Características 3D. Barra de escala, 100 µm.c Reimpreso con permiso de la referencia.4.Elsevier.
Los controles se pueden preparar cultivando las mismas células (Caco-2 o células epiteliales de organoides intestinales) en monocapas bidimensionales en condiciones de cultivo estático convencionales. En particular, puede producirse un agotamiento de nutrientes debido a la capacidad de volumen limitada de los microcanales (es decir, ~4 µl en el canal superior en el diseño original del chip intestinal). Por lo tanto, también se puede comparar la morfología epitelial antes y después de la aplicación del flujo basolateral.
El proceso de litografía blanda debe realizarse en una sala limpia. Para cada capa del chip (capas superior e inferior y membranas) y chips híbridos, se usaron diferentes fotomáscaras y se fabricaron en obleas de silicio separadas porque las alturas de los microcanales eran diferentes. Las alturas objetivo de los microcanales superior e inferior del intestino en el chip son 500 µm y 200 µm, respectivamente. La altura objetivo del canal del chip híbrido es 200 µm.
Coloque una oblea de silicona de 3 pulgadas en un plato con acetona. Gire suavemente la placa durante 30 segundos, luego seque la oblea al aire. Transfiera la oblea a una placa con alcohol isopropílico, luego gire la placa durante 30 s para limpiarla.
Se puede utilizar opcionalmente una solución de piraña (mezcla de peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (vol/vol)) para maximizar la eliminación de residuos orgánicos de la superficie de la oblea de silicio.
La solución Piranha es extremadamente corrosiva y genera calor. Se requieren precauciones de seguridad adicionales. Para la eliminación de desechos, deje que la solución se enfríe y transfiérala a un contenedor de desechos limpio y seco. Use recipientes secundarios y etiquete correctamente los contenedores de desechos. Siga las pautas de seguridad de la instalación para obtener procedimientos más detallados.
Deshidratar las obleas colocándolas en una placa caliente a 200 °C durante 10 min.Después de la deshidratación, la oblea se agitó cinco veces al aire para enfriarla.
Vierta ~10 g de fotorresistente SU-8 2100 en el centro de la oblea de silicio limpia. Use pinzas para esparcir el fotorresistente uniformemente sobre la oblea. Ocasionalmente, coloque la oblea en una placa caliente a 65 °C para que la fotorresistencia sea menos pegajosa y más fácil de esparcir. No coloque la oblea directamente sobre la placa caliente.
El SU-8 se distribuyó uniformemente en la oblea ejecutando el recubrimiento por centrifugado. Programe una rotación entrante del SU-8 durante 5 a 10 s para que se propague a 500 rpm con una aceleración de 100 rpm/s. Establezca el centrifugado principal para un patrón de 200 µm de espesor a 1500 rpm, o alcance un grosor de 250 µm (haciendo una altura de 500 µm para la capa superior de la tripa en el chip; consulte "Pasos críticos" a continuación) establecido en una aceleración de 300 rpm/s 30 segundos a 1.200 rpm.
La velocidad de giro principal se puede ajustar de acuerdo con el grosor objetivo del patrón SU-8 en la oblea de silicio.
Para fabricar patrones de SU-8 de 500 µm de altura para la capa superior de la tripa en el chip, se repitieron secuencialmente los pasos de revestimiento por rotación y horneado suave de esta caja (pasos 7 y 8) (ver paso 9) para producir dos capas de 250 µm de espesor de SU-8, que se pueden colocar en capas y unir mediante exposición UV en el paso 12 de esta caja, formando una capa de 500 µm de altura.
Hornee suavemente las obleas recubiertas con SU-8 colocando cuidadosamente las obleas en una placa caliente a 65 °C durante 5 min, luego cambie la configuración a 95 °C e incube durante 40 min adicionales.
Para lograr una altura de 500 μm del patrón SU-8 en el microcanal superior, repita los pasos 7 y 8 para generar dos capas SU-8 de 250 μm de espesor.
Con el alineador de máscara UV, realice una prueba de lámpara de acuerdo con las instrucciones del fabricante para calcular el tiempo de exposición de la oblea. (tiempo de exposición, ms) = (dosis de exposición, mJ/cm2)/(potencia de la lámpara, mW/cm2).
Después de determinar el tiempo de exposición, coloque la fotomáscara en el soporte de la máscara del alineador de máscara UV y coloque la fotomáscara en la oblea recubierta de SU-8.
Coloque la superficie impresa de la fotomáscara directamente sobre el lado recubierto de SU-8 de la oblea de silicio para minimizar la dispersión UV.
Exponga la oblea recubierta con SU-8 y la fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz ultravioleta durante el tiempo de exposición predeterminado (consulte el paso 10 de este cuadro).
Después de la exposición a los rayos UV, las obleas de silicio recubiertas con SU-8 se hornearon a 65 °C durante 5 min y 95 °C durante 15 min en cada placa caliente para fabricar patrones con una altura de 200 μm. Extienda el tiempo posterior al horneado a 95 °C a 30 min para fabricar patrones con una altura de 500 μm.
El revelador se vierte en un plato de vidrio y la oblea horneada se coloca en el plato. El volumen de revelador SU-8 puede variar según el tamaño de la placa de vidrio. Asegúrese de usar suficiente revelador SU-8 para eliminar completamente el SU-8 no expuesto. Por ejemplo, cuando use un plato de vidrio de 150 mm de diámetro con una capacidad de 1 litro, use ~300 ml de revelador SU-8. Desarrolle el molde durante 25 minutos con rotación suave ocasional.
Enjuague el molde desarrollado con ~ 10 mL de desarrollador fresco seguido de IPA rociando la solución con una pipeta.
Coloque la oblea en un limpiador de plasma y expóngala a plasma de oxígeno (gas atmosférico, presión objetivo 1 × 10−5 Torr, potencia 125 W) durante 1,5 min.
Coloque la oblea en un desecador al vacío con un portaobjetos de vidrio en el interior. Las obleas y los portaobjetos se pueden colocar uno al lado del otro. Si el desecador al vacío está dividido en varias capas por una placa, coloque los portaobjetos en la cámara inferior y las obleas en la cámara superior. Coloque 100 μL de solución de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano en un portaobjetos de vidrio y aplique vacío para la silanización.
Descongele un vial de células Caco-2 congeladas en un baño de agua a 37 °C y, a continuación, transfiera las células descongeladas a un matraz T75 que contenga 15 ml de medio Caco-2 precalentado a 37 °C.
Para pasar las células Caco-2 con una confluencia de ~90 %, primero caliente el medio Caco-2, PBS y tripsina al 0,25 %/EDTA 1 mM en un baño de agua a 37 °C.
Aspire el medio mediante aspiración al vacío. Lave las células dos veces con 5 ml de PBS tibio repitiendo la aspiración al vacío y agregando PBS fresco.