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La morfogénesis intestinal humana establece las características de la microarquitectura epitelial tridimensional y la organización espacial de las criptas y vellosidades. Esta estructura única es necesaria para mantener la homeostasis intestinal al proteger el nicho de células madre en la cripta basal de antígenos microbianos exógenos y sus metabolitos. Además, las vellosidades intestinales y el moco secretor presentan células epiteliales funcionalmente diferenciadas con una barrera protectora en la superficie de la mucosa intestinal. Por lo tanto, la recreación de estructuras epiteliales tridimensionales es crucial para la construcción de modelos intestinales in vitro. Cabe destacar que el intestino en chip, mimético orgánico, puede inducir la morfogénesis tridimensional espontánea del epitelio intestinal con funciones fisiológicas y biomecánicas mejoradas. Aquí, proporcionamos un protocolo reproducible para inducir de forma robusta la morfogénesis intestinal en el intestino tanto en un chip microfluídico como en un chip híbrido con Transwell integrado. Describimos métodos detallados para la fabricación de dispositivos, el cultivo de células epiteliales Caco-2 o organoides intestinales en entornos convencionales, así como en una plataforma microfluídica. Inducción de morfogénesis 3D y caracterización de epitelios 3D establecidos utilizando múltiples modalidades de imágenes. Este protocolo logra la regeneración de la microarquitectura intestinal funcional al controlar el flujo de fluido basolateral durante 5 días. Nuestro método de morfogénesis in vitro emplea un esfuerzo cortante y un movimiento mecánico fisiológicamente relevantes y no requiere ingeniería o manipulación celular compleja, lo que puede superar a otras técnicas existentes. Prevemos que nuestro protocolo propuesto podría tener amplias implicaciones para la comunidad de investigación biomédica, proporcionando un método para regenerar capas epiteliales intestinales 3D in vitro para aplicaciones biomédicas, clínicas y farmacéuticas.
Los experimentos demuestran que las células epiteliales intestinales Caco-2 cultivadas en dispositivos microfluídicos de doble capa o en un chip intestinal1,2,3,4,56,7 pueden experimentar morfogénesis 3D espontánea in vitro sin una comprensión clara del mecanismo subyacente. En nuestro estudio reciente, descubrimos que la eliminación de antagonistas de morfógenos secretados basolateralmente de los dispositivos de cultivo es necesaria y suficiente para inducir la morfogénesis epitelial 3D in vitro, lo que ha sido demostrado por Caco-2 y organoides intestinales derivados de pacientes. Se validaron las células epiteliales. En este estudio, nos centramos específicamente en la producción celular y la distribución de la concentración de un potente antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en dispositivos microfluídicos modificados y de intestino en un chip que contienen insertos Transwell, denominados "Hybrid Chip". Demostramos que la adición de antagonistas exógenos de Wnt (como DKK-1, represor de Wnt 1, proteína secretada relacionada con frizzled 1 o Soggy-1) al intestino en chip inhibe la morfogénesis o altera la capa epitelial 3D preestructurada, lo que sugiere que el estrés antagónico durante el cultivo es responsable de la morfogénesis intestinal in vitro. Por lo tanto, un enfoque práctico para lograr una morfogénesis robusta en la interfaz epitelial es eliminar o mantener mínimamente los niveles de antagonistas de Wnt en el compartimento basolateral mediante lavado activo (p. ej., en plataformas de intestino en un chip o híbrido en un chip) o difusión. Medios basolaterales (p. ej., de Transwell Se inserta en grandes reservorios basolaterales en pozos).
En este protocolo, proporcionamos un método detallado para fabricar microdispositivos de intestino en un chip y chips híbridos insertables en Transwell (pasos 1-5) para cultivar células epiteliales intestinales en membranas porosas basadas en polidimetilsiloxano (PDMS) (pasos 6A, 7A, 8, 9) o membranas de poliéster de insertos Transwell (pasos 6B, 7B, 8, 9) e inducir morfogénesis 3D in vitro (paso 10). También identificamos características celulares y moleculares indicativas de histogénesis específica de tejido y diferenciación celular dependiente del linaje mediante la aplicación de múltiples modalidades de imagen (pasos 11-24). Inducimos la morfogénesis utilizando células epiteliales intestinales humanas, como Caco-2 u organoides intestinales, en dos formatos de cultivo con detalles técnicos que incluyen modificación de la superficie de membranas porosas, creación de monocapas 2D y reproducción bioquímica intestinal y del microambiente biomecánico. vitro. Para inducir la morfogénesis 3D a partir de monocapas epiteliales 2D, eliminamos los antagonistas de los morfógenos en ambas formas cultivadas haciendo fluir el medio hacia el compartimento basolateral del cultivo. Finalmente, proporcionamos una representación de la utilidad de una capa epitelial 3D regenerable que se puede utilizar para modelar el crecimiento epitelial dependiente de morfógenos, cocultivos longitudinales de hospedador-microbioma, infección por patógenos, lesión inflamatoria, disfunción de la barrera epitelial y terapias basadas en probióticos. Ejemplo.influencias.
Nuestro protocolo puede ser útil para una amplia gama de científicos en investigación básica (por ejemplo, biología de la mucosa intestinal, biología de células madre y biología del desarrollo) y aplicada (por ejemplo, pruebas de fármacos preclínicos, modelado de enfermedades, ingeniería de tejidos y gastroenterología) de amplio impacto. Debido a la reproducibilidad y robustez de nuestro protocolo para inducir la morfogénesis 3D del epitelio intestinal in vitro, prevemos que nuestra estrategia técnica se puede difundir a audiencias que estudian la dinámica de la señalización celular durante el desarrollo intestinal, la regeneración o la homeostasis. Además, nuestro protocolo es útil para interrogar la infección bajo varios agentes infecciosos como el Norovirus 8, el Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. Las audiencias de patología y patogénesis de enfermedades también son útiles. El uso de un sistema de microfisiología intestinal en chip puede permitir el co-cultivo longitudinal 10 y la evaluación posterior de la defensa del huésped, las respuestas inmunes y la reparación de lesiones relacionadas con patógenos en el tracto gastrointestinal (GI) 11. Otros trastornos GI asociados con el síndrome del intestino permeable, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pouchitis o síndrome del intestino irritable se pueden simular cuando se preparan capas epiteliales intestinales en 3D utilizando las capas epiteliales intestinales en 3D del paciente, estas enfermedades incluyen atrofia de las vellosidades, acortamiento de las criptas, daño de la mucosa o barrera epitelial deteriorada. Biopsia u organoides intestinales derivados de células madre12,13. Para modelar mejor la mayor complejidad del entorno de la enfermedad, los lectores pueden considerar agregar tipos de células relevantes para la enfermedad, como células mononucleares de sangre periférica del paciente (PBMC), a modelos que contienen microarquitecturas de vellosidades y criptas intestinales en 3D. células inmunes específicas de tejido, 5.
Dado que la microestructura epitelial 3D puede fijarse y visualizarse sin necesidad de seccionar, quienes trabajan en transcriptómica espacial e imágenes de alta o superresolución podrían estar interesados ​​en nuestro mapeo de la dinámica espaciotemporal de genes y proteínas en nichos epiteliales. Interés en la tecnología. Respuesta a estímulos microbianos o inmunitarios. Además, la comunicación longitudinal entre el huésped y el microbioma 10, 14 que coordina la homeostasis intestinal puede establecerse en la capa 3D de la mucosa intestinal mediante el cocultivo de diversas especies microbianas, comunidades microbianas o microbiota fecal, especialmente en el intestino en un chip. en la plataforma. Este enfoque es particularmente atractivo para las audiencias que estudian inmunología de las mucosas, gastroenterología, microbioma humano, culturómica y microbiología clínica que buscan cultivar microbiota intestinal previamente no cultivada en el laboratorio. Si nuestro protocolo de morfogénesis in vitro se puede adaptar a formatos de cultivo escalables, como insertos multipocillo en placas de 24, 96 o 384 pocillos que reponen continuamente los compartimentos basolaterales, el protocolo también se puede difundir a quienes desarrollan plataformas de cribado o validación de alto rendimiento para la industria farmacéutica, biomédica o alimentaria. Como prueba de principio, recientemente demostramos la viabilidad de un sistema de morfogénesis multiplex de alto rendimiento escalable a un formato de placa de 24 pocillos. Además, se han comercializado múltiples productos de órgano en un chip16,17,18. Por lo tanto, la validación de nuestro método de morfogénesis in vitro puede acelerarse y potencialmente ser adoptada por muchos laboratorios de investigación, la industria o agencias gubernamentales y reguladoras para comprender la reprogramación celular de Morfogénesis intestinal in vitro a nivel transcriptómico para probar fármacos o bioterapéuticos La absorción y el transporte de fármacos candidatos se evaluaron utilizando sustitutos intestinales 3D o utilizando modelos de órgano en un chip personalizados o comerciales para evaluar la reproducibilidad del proceso de morfogénesis intestinal.
Se ha utilizado un número limitado de modelos experimentales relevantes para humanos para estudiar la morfogénesis epitelial intestinal, principalmente debido a la falta de protocolos implementables para inducir la morfogénesis 3D in vitro. De hecho, gran parte del conocimiento actual sobre la morfogénesis intestinal se basa en estudios con animales (p. ej., pez cebra20, ratones21 o pollos22). Sin embargo, requieren mucha mano de obra y son costosos, pueden ser éticamente cuestionables y, lo que es más importante, no determinan con precisión los procesos de desarrollo humano. Estos modelos también tienen una capacidad muy limitada para ser probados de manera escalable en múltiples vías. Por lo tanto, nuestro protocolo para regenerar estructuras tisulares 3D in vitro supera a los modelos animales in vivo, así como a otros modelos tradicionales de cultivo celular estático 2D. Como se describió previamente, el uso de estructuras epiteliales 3D nos permitió examinar la localización espacial de células diferenciadas en el eje cripta-vellosidad en respuesta a diversos estímulos mucosos o inmunitarios. Las capas epiteliales 3D pueden proporcionar un espacio para estudiar cómo las células microbianas compiten para formarse. Nichos espaciales y evolución ecológica en respuesta a factores del huésped (por ejemplo, capas de moco internas versus externas, secreción de IgA y péptidos antimicrobianos). Además, la morfología epitelial 3D puede permitirnos comprender cómo la microbiota intestinal estructura sus comunidades y produce sinérgicamente metabolitos microbianos (por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta) que dan forma a la organización celular y a los nichos de células madre en las criptas basales. Estas características solo se pueden demostrar cuando las capas epiteliales 3D se establecen in vitro.
Además de nuestro método para crear estructuras epiteliales intestinales tridimensionales, existen varios métodos in vitro. El cultivo de organoides intestinales es una técnica de ingeniería tisular de vanguardia basada en el cultivo de células madre intestinales en condiciones morfógenas específicas.23,24,25 Sin embargo, el uso de modelos de organoides tridimensionales para el análisis del transporte o para cocultivos entre el huésped y el microbioma suele ser complejo, ya que el lumen intestinal está encerrado dentro del organoide y, por lo tanto, la introducción de componentes luminales, como células microbianas o antígenos exógenos, es limitada. El acceso al lumen de los organoides se puede mejorar mediante un microinyector.26,27 Sin embargo, este método es invasivo, laborioso y requiere conocimientos especializados. Además, los cultivos tradicionales de organoides mantenidos en andamios de hidrogel en condiciones estáticas no reflejan con precisión la biomecánica activa in vivo.
Otros enfoques empleados por varios grupos de investigación utilizan andamios de hidrogel 3D preestructurados para imitar la estructura epitelial intestinal mediante el cultivo de células intestinales humanas aisladas en la superficie del gel. Se pueden fabricar andamios de hidrogel utilizando moldes impresos en 3D, microfresados ​​o fabricados litográficamente. Este método muestra la disposición autoorganizada de células epiteliales aisladas in vitro con gradientes de morfógenos fisiológicamente relevantes, estableciendo una estructura epitelial de alta relación de aspecto y una diafonía estroma-epitelial mediante la inclusión de células estromales en el andamio. Sin embargo, la naturaleza de los andamios preestructurados puede impedir la visualización del proceso morfogenético espontáneo en sí. Estos modelos tampoco proporcionan un flujo luminal o intersticial dinámico, ya que carecen de la tensión de cizallamiento del fluido que las células intestinales necesitan para experimentar la morfogénesis y adquirir la función fisiológica. Otro estudio reciente utilizó andamios de hidrogel en una plataforma microfluídica y modeló estructuras epiteliales intestinales mediante técnicas de grabado láser. Los organoides intestinales de ratón siguen las instrucciones grabadas. patrones para formar estructuras tubulares intestinales y el flujo de fluido intraluminal se pueden recapitular utilizando un módulo de microfluidos. Sin embargo, este modelo no exhibe procesos morfogenéticos espontáneos ni incluye movimientos mecanobiológicos intestinales. Las técnicas de impresión 3D del mismo grupo pudieron crear tubos intestinales en miniatura con procesos morfogenéticos espontáneos. A pesar de la compleja fabricación de diferentes segmentos intestinales dentro del tubo, este modelo también carece de flujo de fluido luminal y deformación mecánica. Además, la operatividad del modelo puede ser limitada, especialmente después de que se complete el proceso de bioimpresión, perturbando las condiciones experimentales o las interacciones de célula a célula. En cambio, nuestro protocolo propuesto proporciona morfogénesis intestinal espontánea, esfuerzo cortante fisiológicamente relevante, biomecánica que imita la motilidad intestinal, accesibilidad de compartimentos apicales y basolaterales independientes y recreación de microambientes biológicos complejos de modularidad. Por lo tanto, nuestro protocolo de morfogénesis 3D in vitro puede proporcionar un enfoque complementario para superar los desafíos de los métodos existentes.
Nuestro protocolo se centra completamente en la morfogénesis epitelial 3D, con solo células epiteliales en cultivo y ningún otro tipo de células circundantes, como células mesenquimales, células endoteliales y células inmunes. Como se describió anteriormente, el núcleo de nuestro protocolo es la inducción de la morfogénesis epitelial mediante la eliminación de inhibidores de morfógenos secretados en el lado basolateral del medio introducido. Si bien la robusta modularidad de nuestro intestino en un chip y nuestro híbrido en un chip nos permite recrear la capa epitelial 3D ondulada, aún quedan por considerar complejidades biológicas adicionales, como las interacciones epiteliales-mesenquimales33,34, la deposición de la matriz extracelular (ECM) 35 y, en nuestro modelo, las características de las criptas y las vellosidades que transmiten nichos de células madre en las criptas basales. Las células del estroma (p. ej., fibroblastos) en el mesénquima desempeñan un papel clave en la producción de proteínas de la ECM y la regulación de la morfogénesis intestinal en vivo35,37,38.La adición de células mesenquimales a nuestro modelo mejoró el proceso morfogenético y la eficiencia de unión celular.La capa endotelial (es decir, capilares o linfáticos) juega un papel importante en la regulación del transporte molecular39 y el reclutamiento de células inmunes40 en el microambiente intestinal.Además, los componentes de la vasculatura que se pueden conectar entre los modelos de tejido son un prerrequisito cuando los modelos de tejido están diseñados para demostrar interacciones multiorgánicas.Por lo tanto, puede ser necesario incluir células endoteliales para modelar características fisiológicas más precisas con resolución a nivel de órgano.Las células inmunes derivadas del paciente también son esenciales para mostrar respuestas inmunes innatas, presentación de antígenos, diafonía inmune adaptativa innata e inmunidad específica de tejido en el contexto de la imitación de la enfermedad intestinal.
El uso de chips híbridos es más directo que el de intestino en un chip porque la configuración del dispositivo es más sencilla y el uso de insertos Transwell permite un cultivo escalable del epitelio intestinal. Sin embargo, los insertos Transwell disponibles comercialmente con membranas de poliéster no son elásticos y no pueden simular movimientos peristálticos. Además, el compartimento apical del inserto Transwell colocado en el chip híbrido permaneció estacionario sin esfuerzo cortante en el lado apical. Claramente, las propiedades estáticas en el compartimento apical rara vez permiten el co-cultivo bacteriano a largo plazo en chips híbridos. Si bien podemos inducir de manera robusta la morfogénesis 3D en insertos Transwell cuando usamos chips híbridos, la escasez de biomecánica fisiológicamente relevante y flujo de fluido apical puede limitar la viabilidad de las plataformas de chips híbridos para aplicaciones potenciales.
No se han establecido completamente las reconstrucciones a escala real del eje cripta-vellosidad humana en cultivos de intestino en un chip e híbridos en un chip. Dado que la morfogénesis comienza a partir de una monocapa epitelial, las microarquitecturas 3D no necesariamente proporcionan una similitud morfológica con las criptas in vivo. Aunque caracterizamos la población de células proliferantes cerca del dominio de la cripta basal en el epitelio 3D microingenierizado, las regiones de criptas y vellosidades no estaban claramente demarcadas. Aunque los canales superiores más altos en el chip conducen a una mayor altura del epitelio microingenierizado, la altura máxima todavía está limitada a ~300–400 µm. La profundidad real de las criptas intestinales humanas en los intestinos delgado y grueso es de ~135 µm y ~400 µm, respectivamente, y la altura de las vellosidades del intestino delgado es de ~600 µm41.
Desde el punto de vista de la obtención de imágenes, la obtención de imágenes in situ con súper resolución de microarquitecturas 3D puede estar limitada al intestino en un chip, ya que la distancia de trabajo requerida desde la lente del objetivo hasta la capa epitelial es del orden de unos pocos milímetros. Para superar este problema, puede requerirse un objetivo distante. Además, realizar secciones delgadas para la preparación de muestras para la obtención de imágenes es un desafío debido a la alta elasticidad del PDMS. Además, dado que la microfabricación capa por capa del intestino en un chip implica una adhesión permanente entre cada capa, es extremadamente difícil abrir o quitar la capa superior para examinar la estructura de la superficie de la capa epitelial, por ejemplo, utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM).
La hidrofobicidad del PDMS ha sido un factor limitante en los estudios basados ​​en microfluidos que tratan con pequeñas moléculas hidrófobas, ya que el PDMS puede adsorber de manera no específica dichas moléculas hidrófobas. Se pueden considerar alternativas al PDMS con otros materiales poliméricos. Alternativamente, se puede considerar la modificación de la superficie del PDMS (por ejemplo, recubrimiento con materiales lipofílicos 42 o poli(etilenglicol) 43) para minimizar la adsorción de moléculas hidrófobas.
Finalmente, nuestro método no ha sido bien caracterizado en términos de proporcionar una detección de alto rendimiento o una plataforma experimental fácil de usar de “talla única”. El protocolo actual requiere una bomba de jeringa por microdispositivo, lo que ocupa espacio en una incubadora de CO2 y evita experimentos a gran escala. Esta limitación se puede mejorar significativamente con la escalabilidad de formatos de cultivo innovadores (por ejemplo, insertos porosos de 24, 96 o 384 pocillos que permiten la reposición y la eliminación continuas de medios basolaterales).
Para inducir la morfogénesis 3D del epitelio intestinal humano in vitro, utilizamos un dispositivo intestinal con chip microfluídico que contiene dos microcanales paralelos y una membrana porosa elástica en el medio para crear una interfaz lumen-capilar. También demostramos el uso de un dispositivo microfluídico de un solo canal (un chip híbrido) que proporciona un flujo basolateral continuo debajo de capas epiteliales polarizadas cultivadas en insertos Transwell. En ambas plataformas, la morfogénesis de varias células epiteliales intestinales humanas se puede demostrar aplicando manipulación direccional del flujo para eliminar antagonistas morfógenos del compartimento basolateral. Todo el procedimiento experimental (Figura 1) consta de cinco partes: (i) microfabricación del chip intestinal o chip híbrido insertable Transwell (pasos 1-5; Cuadro 1), (ii) preparación de células epiteliales intestinales (células Caco-2) u organoides intestinales humanos; cajas 2-5), (iii) cultivo de células epiteliales intestinales en chips intestinales o chips híbridos (pasos 6-9), (iv) inducción de morfogénesis 3D in vitro (paso 10) y (v) ) para caracterizar la microestructura epitelial 3D (pasos 11-24). Finalmente, se diseñó un grupo de control apropiado (que se analiza más adelante) para validar la eficacia de la morfogénesis in vitro comparando la morfogénesis epitelial con controles espaciales, temporales, condicionales o de procedimiento.
Utilizamos dos plataformas de cultivo diferentes: intestino en un chip con canales rectos o canales contorneados no lineales, o chips híbridos que contienen insertos Transwell (TW) en un dispositivo microfluídico, fabricados como se describe en el Recuadro 1. El paso 1-5, "Fabricación del dispositivo", muestra los pasos principales para fabricar un chip único o un chip híbrido. "Cultivo de células epiteliales intestinales humanas" explica la fuente celular (Caco-2 u organoides intestinales humanos) y el procedimiento de cultivo utilizado en este protocolo. "Morfogénesis in vitro" muestra los pasos generales en los que se cultivan células epiteliales derivadas de Caco-2 o organoides en un chip intestinal o en insertos Transwell de un chip híbrido, seguido de la inducción de la morfogénesis 3D y la formación de una estructura epitelial caracterizada. El número de paso del programa o el número de recuadro se muestra debajo de cada flecha. La aplicación proporciona ejemplos de cómo se pueden utilizar las capas epiteliales intestinales establecidas, por ejemplo, en la caracterización de la diferenciación celular, estudios de fisiología intestinal y el establecimiento del microbioma del huésped. Ecosistemas y modelado de enfermedades. Las imágenes de inmunofluorescencia en "Diferenciación celular" muestran la expresión de núcleos, F-actina y MUC2 en la capa epitelial Caco-2 tridimensional generada en el chip intestinal. La señalización de MUC2 está presente en las células caliciformes y el moco secretado por las superficies mucosas. Las imágenes fluorescentes en Fisiología intestinal muestran el moco producido mediante tinción para residuos de ácido siálico y N-acetilglucosamina con aglutinina fluorescente de germen de trigo. Las dos imágenes superpuestas en "Cocultivos huésped-microbioma" muestran cocultivos representativos de huésped-microbioma en el intestino en un chip. El panel izquierdo muestra el cocultivo de E. coli que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) con células epiteliales Caco-2 tridimensionales microdiseñadas. El panel derecho muestra la localización de E. coli GFP cocultivada con células epiteliales Caco-2 tridimensionales, seguida de tinción de inmunofluorescencia con F-actina. (rojo) y núcleos (azul). El modelado de la enfermedad ilustra el intestino sano frente al intestino permeable en chips de inflamación intestinal sometidos a un desafío fisiológico con antígenos bacterianos (p. ej., lipopolisacárido, LPS) y células inmunitarias (p. ej., PBMC; verde). Se cultivaron células Caco-2 para establecer una capa epitelial tridimensional. Barra de escala, 50 µm. Imágenes en la fila inferior: «Diferenciación de células», adaptada con autorización de la referencia 2. Oxford University Press; reproducida con autorización de la referencia 5. NAS; «Cocultivo huésped-microbio», adaptado con autorización de la referencia 3. NAS; «Modelado de la enfermedad», adaptado con autorización de la referencia 5. NAS.
Tanto los chips de intestino en chip como los chips híbridos se fabricaron utilizando réplicas de PDMS que se desmoldaron de moldes de silicio mediante litografía suave1,44 y se modelaron con SU-8. El diseño de los microcanales en cada chip se determina considerando la hidrodinámica, como el esfuerzo cortante y la presión hidrodinámica1,4,12. El diseño original de intestino en chip (Fig. 1a de Datos Extendidos), que consistía en dos microcanales rectos paralelos yuxtapuestos, ha evolucionado hasta convertirse en un complejo intestino en chip (Fig. 1b de Datos Extendidos) que incluye un par de microcanales curvos para inducir un mayor tiempo de residencia del fluido, patrones de flujo no lineales y deformación multiaxial de las células cultivadas (Fig. 2a–f) 12. Cuando es necesario recrear una biomecánica intestinal más compleja, se puede optar por un complejo intestino en chip. Hemos demostrado que el Gut-Chip convoluto también induce fuertemente la morfogénesis 3D en un período de tiempo similar con un grado similar de epitelio. Crecimiento en comparación con el Gut-Chip original, independientemente del tipo de célula cultivada. Por lo tanto, para inducir la morfogénesis 3D, los diseños intestinales lineales y complejos en chip son intercambiables. Las réplicas de PDMS curadas en moldes de silicio con patrones SU-8 proporcionaron características negativas después del desmoldeo (Fig. 2a). Para fabricar el intestino en un chip, la capa superior de PDMS preparada se unió secuencialmente a una película porosa de PDMS y luego se alineó con la capa inferior de PDMS mediante unión irreversible utilizando un tratador corona (Fig. 2b-f). Para fabricar chips híbridos, las réplicas de PDMS curadas se unieron a portaobjetos de vidrio para crear dispositivos microfluídicos de un solo canal que pudieran acomodar insertos Transwell (Fig. 2h y Datos Extendidos Fig. 2). El proceso de unión se realiza tratando las superficies de la réplica de PDMS y el vidrio con plasma de oxígeno o tratamiento corona. Después de la esterilización del dispositivo microfabricado unido al tubo de silicona, la configuración del dispositivo estaba lista para realizar la morfogénesis 3D del epitelio intestinal (Figura 2 gramos).
a, Ilustración esquemática de la preparación de piezas de PDMS a partir de moldes de silicio con patrón SU-8. La solución de PDMS sin curar se vertió sobre un molde de silicio (izquierda), se curó a 60 °C (centro) y se desmoldó (derecha). El PDMS desmoldado se cortó en trozos y se limpió para su uso posterior. b, Fotografía del molde de silicio utilizado para preparar la capa superior de PDMS. c, Fotografía del molde de silicio utilizado para fabricar la membrana porosa de PDMS. d, Una serie de fotografías de los componentes superior e inferior de PDMS y del dispositivo intestinal en chip ensamblado. e, Esquema de la alineación de los componentes superior, de membrana e inferior de PDMS. Cada capa está unida irreversiblemente mediante tratamiento de plasma o corona. f, Esquema del dispositivo de intestino en chip fabricado con microcanales contorneados superpuestos y cámaras de vacío. g, Configuración del intestino en chip para cultivo celular microfluídico. El intestino en chip fabricado, ensamblado con un tubo de silicona y una jeringa, se colocó sobre un cubreobjetos. El dispositivo en chip se colocó sobre la tapa. Placa de Petri de 150 mm para su procesamiento. El aglutinante se utiliza para cerrar el tubo de silicona. Imágenes visuales de la fabricación de chips híbridos y morfogénesis 3D mediante chips híbridos. Se insertaron en el chip híbrido insertos Transwell, preparados independientemente para cultivar monocapas 2D de células epiteliales intestinales, para inducir la morfogénesis intestinal 3D. El medio se perfunde a través de microcanales bajo la capa celular establecida en el inserto Transwell. Escala: 1 cm. Reimpreso con autorización de la referencia. 4. Elsevier.
En este protocolo, la línea celular Caco-2 y los organoides intestinales se utilizaron como fuentes epiteliales (Fig. 3a). Ambos tipos de células se cultivaron de forma independiente (Recuadro 2 y Recuadro 5) y se utilizaron para sembrar los microcanales recubiertos de matriz extracelular (ECM) de insertos de intestino en chip o Transwell. Cuando las células son confluentes (>95 % de cobertura en matraces), las células Caco-2 cultivadas rutinariamente (entre los pases 10 y 50) en matraces T se recolectan para preparar suspensiones celulares disociadas mediante líquido de tripsinización (Recuadro 2). Los organoides intestinales humanos de biopsias intestinales o resecciones quirúrgicas se cultivaron en cúpulas de andamiaje Matrigel en placas de 24 pocillos para mantener el microambiente estructural. El medio que contenía morfógenos esenciales (como Wnt, R-espondina y Noggin) y factores de crecimiento preparados como se describe en el Recuadro 3 se complementó cada dos días hasta que los organoides crecieron hasta alcanzar un diámetro de aproximadamente 500 µm. Los organoides se cosechan y se disocian en células individuales para sembrarlos en el intestino o en insertos Transwell en un chip (Cuadro 5). Como hemos informado anteriormente, se pueden diferenciar según el tipo de enfermedad12,13 (p. ej., colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, cáncer colorrectal o donante normal), el sitio de la lesión (p. ej., área lesionada versus área no lesionada) y la ubicación gastrointestinal en el tracto (p. ej., duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon o recto). Proporcionamos un protocolo optimizado en el Cuadro 5 para cultivar organoides colónicos (coloides) que normalmente requieren concentraciones más altas de morfógenos que los organoides del intestino delgado.
a, Flujo de trabajo para la inducción de la morfogénesis intestinal en el chip intestinal. El epitelio intestinal humano Caco-2 y los organoides intestinales se utilizan en este protocolo para demostrar la morfogénesis 3D. Las células epiteliales aisladas se sembraron en el dispositivo de intestino en un chip preparado (preparación del chip). Una vez que las células se siembran (sembradas) y se unen (se unen) a la membrana porosa de PDMS el día 0 (D0), se inicia el flujo apical (AP) y se mantiene durante los primeros 2 días (flujo, AP, D0-D2). El flujo basolateral (BL) también se inicia junto con los movimientos de estiramiento cíclicos (estiramiento, flujo, AP y BL) cuando se forma una monocapa 2D completa. La morfogénesis intestinal 3D se produjo espontáneamente después de 5 días de cultivo microfluídico (morfogénesis, D5). Las imágenes de contraste de fase muestran la morfología representativa de las células Caco-2 en cada paso experimental o punto de tiempo (gráfico de barras, 100 µm). Cuatro Diagramas esquemáticos que ilustran las cascadas correspondientes de la morfogénesis intestinal (arriba a la derecha). Las flechas discontinuas en el esquema representan la dirección del flujo de fluido. b, Imagen SEM que muestra la topología de la superficie del epitelio Caco-2 3D establecido (izquierda). El recuadro que resalta el área ampliada (recuadro discontinuo blanco) muestra las microvellosidades regeneradas en la capa Caco-2 3D (derecha). c, Vista frontal horizontal de Caco-2 3D establecido, claudina (ZO-1, rojo) y membranas de borde en cepillo continuo marcadas con F-actina (verde) y núcleos (azul). Visualización confocal de inmunofluorescencia de células epiteliales en chips intestinales. Las flechas que apuntan al esquema central indican la ubicación del plano focal para cada vista confocal. d, Evolución temporal de los cambios morfológicos en organoides cultivados en un chip obtenidos por microscopía de contraste de fases en los días 3, 7, 9, 11 y 13. El recuadro (arriba a la derecha) muestra la alta ampliación de la imagen proporcionada.e, Fotomicrografía DIC de epitelio organoide 3D establecido en el intestino en un corte tomado el día 7.f, Imágenes de inmunofluorescencia superpuestas que muestran marcadores de células madre (LGR5; magenta), células caliciformes (MUC2; verde), F-actina (gris) y núcleos (cian) cultivados en chips intestinales durante 3 días, respectivamente (izquierda) y organoides de 13 días (centro) en la capa epitelial.Véase también Datos ampliados Figura 3, que destaca la señalización de LGR5 sin la señalización de MUC2.Imágenes de fluorescencia que muestran la microestructura epitelial (derecha) de epitelio organoide 3D establecido en el intestino en un chip mediante la tinción de la membrana plasmática con el colorante CellMask (derecha) el día 13 de cultivo.La barra de escala es de 50 μm a menos que se indique lo contrario.b Reimpreso con permiso de la referencia.2. Oxford University Press; c Adaptado con permiso de la Referencia.2. Oxford University Press; e y f adaptados con permiso por referencia.12 Bajo licencia Creative Commons CC BY 4.0.
En el intestino en un chip, es necesario modificar la superficie hidrofóbica de la membrana porosa de PDMS para un recubrimiento exitoso de la matriz extracelular (ECM). En este protocolo, aplicamos dos métodos diferentes para modificar la hidrofobicidad de las membranas de PDMS. Para el cultivo de células Caco-2, la activación superficial mediante tratamiento UV/ozono por sí sola fue suficiente para reducir la hidrofobicidad de la superficie de PDMS, recubrir la ECM y unir las células Caco-2 a la membrana de PDMS. Sin embargo, el cultivo microfluídico del epitelio organoide requiere una funcionalización superficial basada en productos químicos para lograr una deposición eficiente de las proteínas de la ECM mediante la aplicación secuencial de polietilenimina (PEI) y glutaraldehído a los microcanales de PDMS. Después de la modificación de la superficie, las proteínas de la ECM se depositaron para cubrir la superficie de PDMS funcionalizada y luego se introdujeron en el epitelio organoide aislado. Una vez unidas las células, el cultivo celular microfluídico comienza perfundiendo solo el medio en el microcanal superior hasta que las células forman una monocapa completa, mientras que el microcanal inferior mantiene las condiciones estáticas. Este método optimizado para la activación superficial y el recubrimiento de la ECM permite la unión del epitelio organoide para inducir la morfogénesis 3D en la superficie del PDMS.
Los cultivos Transwell también requieren un recubrimiento de ECM antes de la siembra de células; sin embargo, los cultivos Transwell no requieren pasos de pretratamiento complejos para activar la superficie de los insertos porosos. Para el crecimiento de células Caco-2 en insertos Transwell, el recubrimiento de ECM en insertos porosos acelera la unión de células Caco-2 disociadas (<1 hora) y la formación de la barrera de unión estrecha (<1-2 días). Para cultivar organoides en insertos Transwell, los organoides aislados se siembran en insertos recubiertos de ECM, se adhieren a la superficie de la membrana (<3 h) y se mantienen hasta que los organoides forman una monocapa completa con integridad de barrera. Los cultivos Transwell se realizan en placas de 24 pocillos sin el uso de chips híbridos.
La morfogénesis 3D in vitro se puede iniciar aplicando un flujo de fluido al aspecto basolateral de una capa epitelial establecida. En el intestino en un chip, la morfogénesis epitelial comenzó cuando el medio se perfundió en los microcanales superior e inferior (Fig. 3a). Como se describió anteriormente, es fundamental introducir un flujo de fluido en el compartimento inferior (basolateral) para la eliminación continua de inhibidores de morfógenos secretados direccionales. Para proporcionar suficientes nutrientes y suero a las células unidas en membranas porosas y generar tensión de corte luminal, generalmente aplicamos un flujo dual en el intestino en un chip. En chips híbridos, se insertaron insertos Transwell que contenían monocapas epiteliales en los chips híbridos. Luego, el medio se aplicó debajo del lado basolateral del inserto Transwell poroso a través del microcanal. La morfogénesis intestinal ocurrió de 3 a 5 días después del inicio del flujo basolateral en ambas plataformas de cultivo.
Las características morfológicas de las capas epiteliales tridimensionales microdiseñadas se pueden analizar mediante la aplicación de diversas modalidades de obtención de imágenes, como la microscopía de contraste de fase, la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), la microscopía electrónica de barrido (SEM) o la microscopía confocal de inmunofluorescencia (Figuras 3 y 4). La obtención de imágenes de contraste de fase o DIC se puede realizar fácilmente en cualquier momento durante el cultivo para monitorizar la forma y la protrusión de las capas epiteliales tridimensionales. Debido a la transparencia óptica de las películas de PDMS y poliéster, tanto las plataformas de chip híbrido como las de intestino en un chip pueden proporcionar imágenes in situ en tiempo real sin necesidad de seccionar ni desmontar el dispositivo. Al realizar imágenes de inmunofluorescencia (Figuras 1, 3c, f y 4b, c), las células se fijan típicamente con paraformaldehído (PFA) al 4 % (peso/vol), seguido de Triton X-100 y albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % (peso/vol), en orden. Dependiendo del tipo de célula, se pueden utilizar diferentes Se pueden utilizar fijadores, permeabilizadores y agentes bloqueantes. Los anticuerpos primarios dirigidos a marcadores celulares o regionales dependientes del linaje se utilizan para resaltar las células inmovilizadas in situ en el chip, seguidos de anticuerpos secundarios junto con un tinte de contratinción dirigido al núcleo (p. ej., 4',6-diamidino-2-fenileno) indol, DAPI) o F-actina (p. ej., faloidina marcada con fluorescencia). También se pueden realizar imágenes en vivo basadas en fluorescencia in situ para detectar la producción de moco (Fig. 1, "Diferenciación celular" y "Fisiología intestinal"), la colonización aleatoria de células microbianas (Fig. 1, "Cocultivo huésped-microbio"), el reclutamiento de células inmunitarias (Fig. 1, "Modelado de enfermedades") o los contornos de la morfología epitelial 3D (Fig. 3c,f y 4b,c). Al modificar el intestino en el chip para separar la capa superior de la capa inferior de microcanales, como se describe en la referencia. Como se muestra en Fig. 2, la morfología epitelial 3D así como las microvellosidades en el borde en cepillo apical se pueden visualizar por SEM (Fig. 3b). La expresión de marcadores de diferenciación se puede evaluar realizando PCR5 cuantitativa o secuenciación de ARN de una sola célula. En este caso, las capas 3D de células epiteliales cultivadas en chips intestinales o chips híbridos se recolectan por tripsinización y luego se utilizan para análisis molecular o genético.
a, Flujo de trabajo para la inducción de la morfogénesis intestinal en un chip híbrido. En este protocolo se utilizan Caco-2 y organoides intestinales para demostrar la morfogénesis 3D en una plataforma de chip híbrido. Se sembraron células epiteliales disociadas en insertos Transwell preparados (preparación TW; véase la figura a continuación). Una vez sembradas las células (sembradas) y unidas a las membranas de poliéster en los insertos Transwell, todas las células se cultivaron en condiciones estáticas (cultivo TW). Después de 7 días, se integró un único inserto Transwell que contenía una monocapa 2D de células epiteliales en un chip híbrido para introducir un flujo basolateral (Flujo, BL), que finalmente condujo a la generación de una capa epitelial 3D (morfogénesis). Micrografías de contraste de fase que muestran las características morfológicas de las células epiteliales de órganos humanos derivadas del colon ascendente de un donante normal (línea C103) en cada paso experimental o punto temporal. Los esquemas en las capas superiores ilustran la configuración experimental para cada paso. b, Los chips híbridos (esquema de la izquierda) pueden conducir a Morfogénesis 3D de células epiteliales organoides con vistas de microscopía confocal de arriba a abajo tomadas en diferentes posiciones Z (superior, media e inferior; ver esquema derecho y líneas punteadas correspondientes). mostró características morfológicas obvias. F-actina (cian), núcleo (gris). c, Micrografías confocales de fluorescencia (vista angulada 3D) de células epiteliales derivadas de organoides cultivadas en Transwell estático (TW; recuadro dentro de recuadro discontinuo blanco) versus chip híbrido (toma completa más grande) comparando morfología 2D versus 3D, respectivamente. Un par de vistas transversales verticales 2D (recuadro en la esquina superior derecha; “XZ”) también muestran características 2D y 3D. Barra de escala, 100 µm. c Reimpreso con permiso de la referencia. 4. Elsevier.
Los controles se pueden preparar cultivando las mismas células (Caco-2 o células epiteliales organoides intestinales) en monocapas bidimensionales en condiciones de cultivo estático convencionales. En particular, el agotamiento de nutrientes puede resultar debido a la capacidad de volumen limitada de los microcanales (es decir, ~4 µL en el canal superior en el diseño original del chip intestinal). Por lo tanto, también se puede comparar la morfología epitelial antes y después de la aplicación del flujo basolateral.
El proceso de litografía suave debe realizarse en una sala limpia. Para cada capa del chip (capas superior e inferior y membranas) y chips híbridos, se utilizaron diferentes fotomáscaras y se fabricaron en obleas de silicio separadas porque las alturas de los microcanales eran diferentes. Las alturas objetivo de los microcanales superior e inferior del intestino del chip son 500 µm y 200 µm, respectivamente. La altura objetivo del canal del chip híbrido es de 200 µm.
Coloque una oblea de silicio de 3 pulgadas en un plato con acetona. Gire suavemente la placa durante 30 segundos, luego seque la oblea al aire. Transfiera la oblea a una placa con IPA, luego gire la placa durante 30 segundos para limpiarla.
Opcionalmente, se puede utilizar una solución de piraña (mezcla de peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (vol/vol)) para maximizar la eliminación de residuos orgánicos de la superficie de la oblea de silicio.
La solución de piraña es extremadamente corrosiva y genera calor. Son necesarias precauciones de seguridad adicionales. Para la eliminación de desechos, deje que la solución se enfríe y transfiérala a un contenedor de desechos limpio y seco. Utilice contenedores secundarios y etiquete adecuadamente los contenedores de desechos. Siga las pautas de seguridad de la instalación para obtener procedimientos más detallados.
Deshidrate las obleas colocándolas en una placa caliente a 200 °C durante 10 minutos. Después de la deshidratación, la oblea se agitó cinco veces en el aire para enfriarla.
Vierta ~10 g de fotorresistencia SU-8 2100 en el centro de la oblea de silicio limpia. Use pinzas para esparcir la fotorresistencia uniformemente sobre la oblea. Ocasionalmente, coloque la oblea sobre una placa caliente a 65 °C para que la fotorresistencia sea menos pegajosa y más fácil de esparcir. No coloque la oblea directamente sobre la placa caliente.
El SU-8 se distribuyó uniformemente sobre la oblea mediante la ejecución de un recubrimiento por centrifugación. Programe una rotación entrante del SU-8 durante 5 a 10 s para propagarse a 500 rpm con una aceleración de 100 rpm/s. Configure el giro principal para un patrón de espesor de 200 µm a 1500 rpm, o logre un espesor de 250 µm (logrando una altura de 500 µm para la capa superior del intestino en el chip; consulte "Pasos críticos" a continuación) configurado a una aceleración de 300 rpm/s durante 30 segundos a 1200 rpm.
La velocidad de giro principal se puede ajustar de acuerdo con el espesor objetivo del patrón SU-8 en la oblea de silicio.
Para fabricar patrones de SU-8 de 500 µm de altura para la capa superior del intestino del chip, se repitieron secuencialmente los pasos de recubrimiento por centrifugación y horneado suave de este cuadro (pasos 7 y 8) (ver paso 9) para producir dos capas de 250 µm de espesor. Una capa gruesa de SU-8, que se puede superponer y unir mediante exposición a rayos UV en el paso 12 de este cuadro, forma una capa de 500 µm de alto.
Hornee suavemente las obleas recubiertas de SU-8 colocándolas con cuidado en una placa caliente a 65 °C durante 5 minutos, luego cambie la configuración a 95 °C e incube durante 40 minutos más.
Para lograr una altura de 500 μm del patrón SU-8 en el microcanal superior, repita los pasos 7 y 8 para generar dos capas de SU-8 de 250 μm de espesor.
Utilizando el alineador de máscara UV, realice una prueba de lámpara según las instrucciones del fabricante para calcular el tiempo de exposición de la oblea. (tiempo de exposición, ms) = (dosis de exposición, mJ/cm2)/(potencia de la lámpara, mW/cm2).
Después de determinar el tiempo de exposición, coloque la fotomáscara en el soporte de máscara del alineador de máscara UV y coloque la fotomáscara sobre la oblea recubierta de SU-8.
Coloque la superficie impresa de la fotomáscara directamente sobre el lado recubierto de SU-8 de la oblea de silicio para minimizar la dispersión de los rayos UV.
Exponga la oblea recubierta de SU-8 y la fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz UV durante el tiempo de exposición predeterminado (consulte el paso 10 de este cuadro).
Después de la exposición a los rayos UV, las obleas de silicio revestidas con SU-8 se hornearon a 65 °C durante 5 minutos y a 95 °C durante 15 minutos en cada placa caliente para fabricar patrones con una altura de 200 μm. Extienda el tiempo de poshorneado a 95 °C a 30 minutos para fabricar patrones con una altura de 500 µm.
El revelador se vierte en un plato de vidrio y la oblea horneada se coloca en el plato. El volumen del revelador SU-8 puede variar dependiendo del tamaño de la placa de vidrio. Asegúrese de usar suficiente revelador SU-8 para eliminar completamente el SU-8 no expuesto. Por ejemplo, cuando utilice un plato de vidrio de 150 mm de diámetro con una capacidad de 1 L, use ~300 mL de revelador SU-8. Revele el molde durante 25 minutos con una rotación suave ocasional.
Enjuague el molde revelado con ~10 ml de revelador fresco seguido de IPA rociando la solución con una pipeta.
Coloque la oblea en un limpiador de plasma y expóngala al plasma de oxígeno (gas atmosférico, presión objetivo 1 × 10−5 Torr, potencia 125 W) durante 1,5 min.
Coloque la oblea en un desecador de vacío con un portaobjetos de vidrio en su interior. Las obleas y los portaobjetos se pueden colocar uno al lado del otro. Si el desecador de vacío está dividido en varias capas por una placa, coloque los portaobjetos en la cámara inferior y las obleas en la cámara superior. Deje caer 100 μL de solución de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil)silano sobre un portaobjetos de vidrio y aplique vacío para la silanización.
Descongele un vial de células Caco-2 congeladas en un baño de agua a 37 °C, luego transfiera las células descongeladas a un matraz T75 que contenga 15 ml de medio Caco-2 precalentado a 37 °C.
Para pasar células Caco-2 a ~90% de confluencia, primero caliente el medio Caco-2, PBS y 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA en un baño de agua a 37 °C.
Aspirar el medio mediante aspiración al vacío. Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS tibio repitiendo la aspiración al vacío y agregando PBS fresco.