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La evolución de los parásitos microbianos implica una contrapartida entre la selección natural, que hace que los parásitos mejoren, y la deriva genética, que hace que los parásitos pierdan genes y acumulen mutaciones perjudiciales.Aquí, para comprender cómo se produce esta contrarrestación en la escala de una sola macromolécula, describimos la estructura crio-EM del ribosoma de Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariota con uno de los genomas más pequeños de la naturaleza.La reducción extrema del ARNr en los ribosomas de E. cuniculi va acompañada de cambios estructurales sin precedentes, como la evolución de conectores de ARNr fusionados previamente desconocidos y ARNr sin protuberancias.Además, el ribosoma de E. cuniculi sobrevivió a la pérdida de fragmentos de ARNr y proteínas al desarrollar la capacidad de usar moléculas pequeñas como imitadores estructurales de fragmentos de ARNr y proteínas degradados.En general, mostramos que las estructuras moleculares que durante mucho tiempo se pensó que estaban reducidas, degeneradas y sujetas a mutaciones debilitantes tienen una serie de mecanismos compensatorios que las mantienen activas a pesar de las contracciones moleculares extremas.
Debido a que la mayoría de los grupos de parásitos microbianos tienen herramientas moleculares únicas para explotar a sus huéspedes, a menudo tenemos que desarrollar diferentes terapias para diferentes grupos de parásitos1,2.Sin embargo, nueva evidencia sugiere que algunos aspectos de la evolución del parásito son convergentes y en gran medida predecibles, lo que indica una base potencial para intervenciones terapéuticas amplias en parásitos microbianos3,4,5,6,7,8,9.
El trabajo anterior ha identificado una tendencia evolutiva común en los parásitos microbianos llamada reducción del genoma o descomposición del genoma10,11,12,13.Las investigaciones actuales muestran que cuando los microorganismos abandonan su estilo de vida libre y se convierten en parásitos intracelulares (o endosimbiontes), sus genomas sufren metamorfosis lentas pero asombrosas durante millones de años9,11.En un proceso conocido como descomposición del genoma, los parásitos microbianos acumulan mutaciones nocivas que convierten muchos genes que antes eran importantes en pseudogenes, lo que lleva a la pérdida gradual de genes y al colapso mutacional14,15.Este colapso puede destruir hasta el 95% de los genes en los organismos intracelulares más antiguos en comparación con las especies de vida libre estrechamente relacionadas.Así, la evolución de los parásitos intracelulares es un tira y afloja entre dos fuerzas opuestas: la selección natural darwiniana, que conduce a la mejora de los parásitos, y el colapso del genoma, que arroja a los parásitos al olvido.No está claro cómo el parásito logró emerger de este tira y afloja y retener la actividad de su estructura molecular.
Aunque el mecanismo de descomposición del genoma no se comprende completamente, parece ocurrir principalmente debido a la frecuente deriva genética.Debido a que los parásitos viven en poblaciones pequeñas, asexuales y genéticamente limitadas, no pueden eliminar de manera efectiva las mutaciones nocivas que a veces ocurren durante la replicación del ADN.Esto conduce a la acumulación irreversible de mutaciones dañinas y la reducción del genoma del parásito.Como resultado, el parásito no sólo pierde genes que ya no son necesarios para su supervivencia en el entorno intracelular.Es la incapacidad de las poblaciones de parásitos para eliminar de manera efectiva las mutaciones nocivas esporádicas lo que hace que estas mutaciones se acumulen en todo el genoma, incluidos sus genes más importantes.
Gran parte de nuestra comprensión actual de la reducción del genoma se basa únicamente en las comparaciones de las secuencias del genoma, con menos atención a los cambios en las moléculas reales que realizan funciones de mantenimiento y sirven como objetivos potenciales de fármacos.Estudios comparativos han demostrado que la carga de mutaciones microbianas intracelulares nocivas parece predisponer a las proteínas y los ácidos nucleicos a plegarse incorrectamente y agregarse, haciéndolos más dependientes de chaperonas e hipersensibles al calor19,20,21,22,23.Además, varios parásitos (evolución independiente a veces separada por hasta 2500 millones de años) experimentaron una pérdida similar de centros de control de calidad en su síntesis de proteínas5,6 y mecanismos de reparación de ADN24.Sin embargo, se sabe poco sobre el impacto del estilo de vida intracelular en todas las demás propiedades de las macromoléculas celulares, incluida la adaptación molecular a una carga cada vez mayor de mutaciones nocivas.
En este trabajo, con el fin de comprender mejor la evolución de las proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos intracelulares, determinamos la estructura de los ribosomas del parásito intracelular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi es un organismo similar a un hongo que pertenece a un grupo de microsporidios parásitos que tienen genomas eucarióticos inusualmente pequeños y, por lo tanto, se utilizan como organismos modelo para estudiar el deterioro del genoma25,26,27,28,29,30.Recientemente, se determinó la estructura del ribosoma crio-EM para genomas moderadamente reducidos de Microsporidia, Paranosema locustae y Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb de genoma).Estas estructuras sugieren que parte de la pérdida de amplificación del ARNr se compensa con el desarrollo de nuevos contactos entre proteínas ribosómicas vecinas o la adquisición de nuevas proteínas ribosómicas msL131,32.La especie Encephalitozoon (genoma ~2,5 millones de pb), junto con su pariente más cercano, Ordospora, demuestra el máximo grado de reducción del genoma en eucariotas: tienen menos de 2000 genes que codifican proteínas, y se espera que sus ribosomas no solo estén desprovistos de fragmentos de expansión de ARNr (fragmentos de ARNr que distinguen los ribosomas eucariotas de los ribosomas bacterianos) también tienen cuatro proteínas ribosómicas debido a su falta de homólogos en E. cuniculi genoma26,27,28.Por lo tanto, concluimos que el ribosoma de E. cuniculi puede revelar estrategias previamente desconocidas para la adaptación molecular al deterioro del genoma.
Nuestra estructura crio-EM representa el ribosoma citoplásmico eucariótico más pequeño que se ha caracterizado y proporciona información sobre cómo el grado final de reducción del genoma afecta la estructura, el ensamblaje y la evolución de la maquinaria molecular que es parte integral de la célula.Descubrimos que el ribosoma de E. cuniculi viola muchos de los principios ampliamente conservados del plegamiento del ARN y el ensamblaje del ribosoma, y ​​descubrimos una nueva proteína ribosómica previamente desconocida.De manera bastante inesperada, mostramos que los ribosomas de microsporidios han desarrollado la capacidad de unirse a moléculas pequeñas y planteamos la hipótesis de que los truncamientos en el ARNr y las proteínas desencadenan innovaciones evolutivas que, en última instancia, pueden conferir cualidades útiles al ribosoma.
Para mejorar nuestra comprensión de la evolución de proteínas y ácidos nucleicos en organismos intracelulares, decidimos aislar esporas de E. cuniculi de cultivos de células de mamíferos infectados para purificar sus ribosomas y determinar la estructura de estos ribosomas.Es difícil obtener una gran cantidad de microsporidios parásitos porque los microsporidios no se pueden cultivar en un medio nutritivo.En cambio, crecen y se reproducen solo dentro de la célula huésped.Por lo tanto, para obtener biomasa de E. cuniculi para la purificación de ribosomas, infectamos la línea celular de riñón de mamífero RK13 con esporas de E. cuniculi y cultivamos estas células infectadas durante varias semanas para permitir que E. cuniculi crezca y se multiplique.Usando una monocapa de células infectadas de aproximadamente medio metro cuadrado, pudimos purificar alrededor de 300 mg de esporas de Microsporidia y usarlas para aislar ribosomas.Luego rompimos las esporas purificadas con perlas de vidrio y aislamos los ribosomas crudos usando el fraccionamiento paso a paso de polietilenglicol de los lisados.Esto nos permitió obtener aproximadamente 300 µg de ribosomas crudos de E. cuniculi para el análisis estructural.
Luego recolectamos imágenes crio-EM usando las muestras de ribosomas resultantes y procesamos estas imágenes usando máscaras correspondientes a la subunidad ribosómica grande, la cabeza de la subunidad pequeña y la subunidad pequeña.Durante este proceso, recolectamos imágenes de alrededor de 108 000 partículas ribosomales y computamos imágenes crio-EM con una resolución de 2,7 Å (Figuras complementarias 1-3).Luego usamos imágenes cryoEM para modelar el ARNr, la proteína ribosómica y el factor de hibernación Mdf1 asociado con los ribosomas de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estructura del ribosoma de E. cuniculi en complejo con el factor de hibernación Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa del factor de hibernación Mdf1 asociado con el ribosoma de E. cuniculi.c Mapa de estructura secundaria que compara el ARNr recuperado en especies de Microsporidian con estructuras ribosómicas conocidas.Los paneles muestran la ubicación de los fragmentos de ARNr amplificados (ES) y los sitios activos de los ribosomas, incluido el sitio de decodificación (DC), el bucle de sarcinicina (SRL) y el centro de peptidil transferasa (PTC).d La densidad de electrones correspondiente al centro de peptidil transferasa del ribosoma de E. cuniculi sugiere que este sitio catalítico tiene la misma estructura en el parásito E. cuniculi y sus huéspedes, incluido H. sapiens.e, f La densidad electrónica correspondiente del centro de decodificación (e) y la estructura esquemática del centro de decodificación (f) indican que E. cuniculi tiene residuos U1491 en lugar de A1491 (numeración de E. coli) en muchos otros eucariotas.Este cambio sugiere que E. cuniculi puede ser sensible a los antibióticos que se dirigen a este sitio activo.
A diferencia de las estructuras previamente establecidas de los ribosomas de V. necatrix y P. locustae (ambas estructuras representan la misma familia de microsporidios Nosematidae y son muy similares entre sí), 31,32 los ribosomas de E. cuniculi sufren numerosos procesos de fragmentación de ARNr y proteínas.Desnaturalización adicional (Figuras complementarias 4-6).En el ARNr, los cambios más llamativos incluyeron la pérdida completa del fragmento de ARNr 25S amplificado ES12L y la degeneración parcial de las hélices h39, h41 y H18 (Fig. 1c, Fig. 4 complementaria).Entre las proteínas ribosómicas, los cambios más llamativos incluyeron la pérdida completa de la proteína eS30 y el acortamiento de las proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 y eS7 (Figuras complementarias 4, 5).
Por lo tanto, la reducción extrema de los genomas de las especies de Encephalotozoon/Ordospora se refleja en su estructura de ribosomas: los ribosomas de E. cuniculi experimentan la pérdida más dramática de contenido de proteínas en los ribosomas citoplasmáticos eucariotas sujetos a caracterización estructural, y ni siquiera tienen esos fragmentos de ARNr y proteínas que se conservan ampliamente no solo en eucariotas, sino también en los tres dominios de la vida.La estructura del ribosoma de E. cuniculi proporciona el primer modelo molecular para estos cambios y revela eventos evolutivos que han sido pasados ​​por alto tanto por la genómica comparativa como por los estudios de la estructura biomolecular intracelular (Fig. 7 complementaria).A continuación, describimos cada uno de estos eventos junto con sus probables orígenes evolutivos y su posible impacto en la función de los ribosomas.
Luego descubrimos que, además de los grandes truncamientos de ARNr, los ribosomas de E. cuniculi tienen variaciones de ARNr en uno de sus sitios activos.Aunque el centro de peptidil transferasa del ribosoma de E. cuniculi tiene la misma estructura que otros ribosomas eucariotas (Fig. 1d), el centro de decodificación difiere debido a la variación de secuencia en el nucleótido 1491 (numeración de E. coli, Fig. 1e, f).Esta observación es importante porque el sitio de decodificación de los ribosomas eucarióticos normalmente contiene residuos G1408 y A1491 en comparación con los residuos de tipo bacteriano A1408 y G1491.Esta variación subyace a la diferente sensibilidad de los ribosomas bacterianos y eucariotas a la familia de antibióticos ribosómicos aminoglucósidos y otras moléculas pequeñas que se dirigen al sitio de decodificación.En el sitio de decodificación del ribosoma de E. cuniculi, el residuo A1491 se reemplazó con U1491, creando potencialmente una interfaz de unión única para moléculas pequeñas que se dirigen a este sitio activo.La misma variante A14901 también está presente en otros microsporidios como P. locustae y V. necatrix, lo que sugiere que está muy extendida entre las especies de microsporidios (Fig. 1f).
Debido a que nuestras muestras de ribosomas de E. cuniculi se aislaron de esporas metabólicamente inactivas, probamos el mapa crio-EM de E. cuniculi para la unión de ribosomas descrita anteriormente en condiciones de estrés o inanición.Factores de hibernación 31,32,36,37, 38. Combinamos la estructura previamente establecida del ribosoma en hibernación con el mapa crio-EM del ribosoma de E. cuniculi.Para el acoplamiento, se utilizaron ribosomas de S. cerevisiae en complejo con el factor de hibernación Stm138, ribosomas de langosta en complejo con el factor Lso232 y ribosomas de V. necatrix en complejo con los factores Mdf1 y Mdf231.Al mismo tiempo, encontramos la densidad crio-EM correspondiente al factor de reposo Mdf1.Al igual que Mdf1 se une al ribosoma de V. necatrix, Mdf1 también se une al ribosoma de E. cuniculi, donde bloquea el sitio E del ribosoma, lo que posiblemente ayuda a que los ribosomas estén disponibles cuando las esporas del parásito se vuelven metabólicamente inactivas tras la inactivación del cuerpo (Figura 2).).
Mdf1 bloquea el sitio E del ribosoma, lo que parece ayudar a inactivar el ribosoma cuando las esporas del parásito se vuelven metabólicamente inactivas.En la estructura del ribosoma de E. cuniculi, encontramos que Mdf1 forma un contacto previamente desconocido con el tallo del ribosoma L1, la parte del ribosoma que facilita la liberación del ARNt desacilado del ribosoma durante la síntesis de proteínas.Estos contactos sugieren que Mdf1 se disocia del ribosoma utilizando el mismo mecanismo que el ARNt desacetilado, lo que proporciona una posible explicación de cómo el ribosoma elimina Mdf1 para reactivar la síntesis de proteínas.
Sin embargo, nuestra estructura reveló un contacto desconocido entre Mdf1 y la pata del ribosoma L1 (la parte del ribosoma que ayuda a liberar el ARNt desacilado del ribosoma durante la síntesis de proteínas).En particular, Mdf1 usa los mismos contactos que el segmento del codo de la molécula de ARNt desacilado (Fig. 2).Este modelo molecular previamente desconocido mostró que Mdf1 se disocia del ribosoma utilizando el mismo mecanismo que el ARNt desacetilado, lo que explica cómo el ribosoma elimina este factor de hibernación para reactivar la síntesis de proteínas.
Al construir el modelo de ARNr, encontramos que el ribosoma de E. cuniculi tiene fragmentos de ARNr plegados de forma anormal, a los que llamamos ARNr fusionado (Fig. 3).En los ribosomas que abarcan los tres dominios de la vida, el ARNr se pliega en estructuras en las que la mayoría de las bases del ARNr se aparean y se pliegan entre sí o interactúan con las proteínas ribosómicas38,39,40.Sin embargo, en los ribosomas de E. cuniculi, los ARNr parecen violar este principio de plegamiento al convertir algunas de sus hélices en regiones de ARNr desplegadas.
Estructura de la hélice de ARNr H18 25S en S. cerevisiae, V. necatrix y E. cuniculi.Por lo general, en los ribosomas que abarcan los tres dominios de vida, este enlazador se enrolla en una hélice de ARN que contiene de 24 a 34 residuos.En Microsporidia, por el contrario, este enlazador de ARNr se reduce gradualmente a dos enlazadores ricos en uridina monocatenarios que contienen solo 12 residuos.La mayoría de estos residuos están expuestos a disolventes.La figura muestra que los microsporidios parásitos parecen violar los principios generales del plegamiento del rRNA, donde las bases del rRNA generalmente se acoplan a otras bases o participan en las interacciones rRNA-proteína.En los microsporidios, algunos fragmentos de ARNr adquieren un pliegue desfavorable, en el que la antigua hélice de ARNr se convierte en un fragmento monocatenario alargado casi en línea recta.La presencia de estas regiones inusuales permite que el ARNr de microsporidia se una a fragmentos distantes de ARNr utilizando un número mínimo de bases de ARN.
El ejemplo más llamativo de esta transición evolutiva se puede observar en la hélice de ARNr H18 25S (Fig. 3).En especies desde E. coli hasta humanos, las bases de esta hélice de ARNr contienen de 24 a 32 nucleótidos, formando una hélice ligeramente irregular.En estructuras ribosómicas previamente identificadas de V. necatrix y P. locustae,31,32 las bases de la hélice H18 están parcialmente desenrolladas, pero se conserva el apareamiento de bases de nucleótidos.Sin embargo, en E. cuniculi este fragmento de rRNA se convierte en los enlazadores más cortos 228UUUGU232 y 301UUUUUUUUUU307.A diferencia de los fragmentos de ARNr típicos, estos enlazadores ricos en uridina no se enrollan ni hacen un contacto extenso con las proteínas ribosómicas.En su lugar, adoptan estructuras abiertas al disolvente y completamente desplegadas en las que las hebras de ARNr se extienden casi en línea recta.Esta conformación estirada explica cómo E. cuniculi usa solo 12 bases de ARN para llenar el espacio de 33 Å entre las hélices de ARNr H16 y H18, mientras que otras especies requieren al menos el doble de bases de ARNr para llenar el espacio.
Por lo tanto, podemos demostrar que, a través del plegamiento energéticamente desfavorable, los microsporidios parásitos han desarrollado una estrategia para contraer incluso aquellos segmentos de ARNr que permanecen ampliamente conservados entre especies en los tres dominios de la vida.Aparentemente, mediante la acumulación de mutaciones que transforman las hélices de ARNr en enlazadores poli-U cortos, E. cuniculi puede formar fragmentos de ARNr inusuales que contienen la menor cantidad de nucleótidos posible para la ligación de fragmentos de ARNr distales.Esto ayuda a explicar cómo los microsporidios lograron una reducción drástica de su estructura molecular básica sin perder su integridad estructural y funcional.
Otra característica inusual del rRNA de E. cuniculi es la apariencia del rRNA sin engrosamientos (Fig. 4).Los bultos son nucleótidos sin pares de bases que salen de la hélice de ARN en lugar de esconderse en ella.La mayoría de las protuberancias de ARNr actúan como adhesivos moleculares, lo que ayuda a unir proteínas ribosómicas adyacentes u otros fragmentos de ARNr.Algunas de las protuberancias actúan como bisagras, lo que permite que la hélice del ARNr se flexione y pliegue de manera óptima para la síntesis productiva de proteínas 41 .
a No hay una protuberancia de ARNr (numeración de S. cerevisiae) en la estructura del ribosoma de E. cuniculi, pero está presente en la mayoría de los otros eucariotas b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens y ribosomas internos de E. cuniculi.los parásitos carecen de muchas de las protuberancias de ARNr antiguas y altamente conservadas.Estos engrosamientos estabilizan la estructura del ribosoma;por lo tanto, su ausencia en microsporidios indica una estabilidad reducida del plegamiento del ARNr en parásitos microsporidios.La comparación con los tallos P (tallos L7/L12 en bacterias) muestra que la pérdida de protuberancias de ARNr a veces coincide con la aparición de nuevas protuberancias junto a las protuberancias perdidas.La hélice H42 en el ARNr 23S/28S tiene una protuberancia antigua (U1206 en Saccharomyces cerevisiae) que se estima tiene al menos 3500 millones de años debido a su protección en tres dominios de la vida.En microsporidia, este bulto se elimina.Sin embargo, apareció un nuevo bulto junto al bulto perdido (A1306 en E. cuniculi).
Sorprendentemente, encontramos que los ribosomas de E. cuniculi carecen de la mayoría de las protuberancias de ARNr que se encuentran en otras especies, incluidas más de 30 protuberancias conservadas en otros eucariotas (Fig. 4a).Esta pérdida elimina muchos contactos entre las subunidades ribosómicas y las hélices de ARNr adyacentes, lo que a veces crea grandes huecos huecos dentro del ribosoma, lo que hace que el ribosoma de E. cuniculi sea más poroso en comparación con los ribosomas más tradicionales (Fig. 4b).En particular, encontramos que la mayoría de estas protuberancias también se perdieron en las estructuras de ribosomas de V. necatrix y P. locustae previamente identificadas, que fueron pasadas por alto en análisis estructurales previos31,32.
A veces, la pérdida de protuberancias de ARNr se acompaña del desarrollo de nuevas protuberancias junto a la protuberancia perdida.Por ejemplo, el tallo P ribosómico contiene una protuberancia U1208 (en Saccharomyces cerevisiae) que sobrevivió desde E. coli hasta los humanos y, por lo tanto, se estima que tiene 3500 millones de años.Durante la síntesis de proteínas, esta protuberancia ayuda al tallo P a moverse entre conformaciones abiertas y cerradas para que el ribosoma pueda reclutar factores de traducción y llevarlos al sitio activo.En los ribosomas de E. cuniculi, este engrosamiento está ausente;sin embargo, un nuevo engrosamiento (G883) ubicado solo en tres pares de bases puede contribuir a la restauración de la flexibilidad óptima del vástago P (Fig. 4c).
Nuestros datos sobre rRNA sin protuberancias sugieren que la minimización de rRNA no se limita a la pérdida de elementos de rRNA en la superficie del ribosoma, sino que también puede involucrar el núcleo del ribosoma, creando un defecto molecular específico del parásito que no se ha descrito en células de vida libre.se observan especies vivas.
Después de modelar las proteínas ribosómicas canónicas y el ARNr, descubrimos que los componentes ribosómicos convencionales no pueden explicar las tres partes de la imagen crio-EM.Dos de estos fragmentos son moléculas de tamaño pequeño (Fig. 5, Fig. 8 complementaria).El primer segmento está intercalado entre las proteínas ribosómicas uL15 y eL18 en una posición que suele ocupar el extremo C-terminal de eL18, que se acorta en E. cuniculi.Aunque no podemos determinar la identidad de esta molécula, el tamaño y la forma de esta isla de densidad se explican bien por la presencia de moléculas de espermidina.Su unión al ribosoma está estabilizada por mutaciones específicas de microsporidia en las proteínas uL15 (Asp51 y Arg56), que parecen aumentar la afinidad del ribosoma por esta pequeña molécula, ya que permiten que uL15 envuelva la pequeña molécula en una estructura ribosómica.Figura complementaria 2).8, datos adicionales 1, 2).
Imágenes crio-EM que muestran la presencia de nucleótidos fuera de la ribosa unida al ribosoma de E. cuniculi.En el ribosoma de E. cuniculi, este nucleótido ocupa el mismo lugar que el nucleótido 25S rRNA A3186 (numeración de Saccharomyces cerevisiae) en la mayoría de los demás ribosomas eucariotas.b En la estructura ribosómica de E. cuniculi, este nucleótido se encuentra entre las proteínas ribosómicas uL9 y eL20, estabilizando así el contacto entre ambas proteínas.Análisis de conservación de secuencias de cd eL20 entre especies de microsporidios.El árbol filogenético de las especies de Microsporidia (c) y la alineación de secuencias múltiples de la proteína eL20 (d) muestran que los residuos de unión a nucleótidos F170 y K172 se conservan en la mayoría de los Microsporidios típicos, con la excepción de S. lophii, con la excepción de los Microsporidios de ramificación temprana, que conservaron la extensión del ARNr de ES39L.e Esta figura muestra que los residuos de unión a nucleótidos F170 y K172 están presentes solo en eL20 del genoma de microsporidia altamente reducido, pero no en otros eucariotas.En general, estos datos sugieren que los ribosomas microsporidianos han desarrollado un sitio de unión de nucleótidos que parece unir moléculas de AMP y usarlas para estabilizar las interacciones proteína-proteína en la estructura ribosomal.La alta conservación de este sitio de unión en Microsporidia y su ausencia en otros eucariotas sugiere que este sitio puede proporcionar una ventaja de supervivencia selectiva para Microsporidia.Por lo tanto, el bolsillo de unión de nucleótidos en el ribosoma de los microsporidios no parece ser una característica degenerada o una forma final de degradación del ARNr como se describió anteriormente, sino una innovación evolutiva útil que permite que el ribosoma de los microsporidios se una directamente a las moléculas pequeñas, usándolas como bloques de construcción molecular.bloques de construcción para los ribosomas.Este descubrimiento convierte al ribosoma de los microsporidios en el único ribosoma conocido que utiliza un solo nucleótido como componente estructural.f Vía evolutiva hipotética derivada de la unión de nucleótidos.
La segunda densidad de bajo peso molecular se encuentra en la interfaz entre las proteínas ribosómicas uL9 y eL30 (Fig. 5a).Esta interfase fue previamente descrita en la estructura del ribosoma de Saccharomyces cerevisiae como sitio de unión para el nucleótido 25S del rRNA A3186 (parte de la extensión del rRNA ES39L)38.Se demostró que en los ribosomas ES39L de P. locustae degenerados, esta interfaz se une a un solo nucleótido 31 desconocido, y se supone que este nucleótido es una forma final reducida de ARNr, en la que la longitud del ARNr es ~130-230 bases.ES39L se reduce a un solo nucleótido 32.43.Nuestras imágenes crio-EM respaldan la idea de que los nucleótidos pueden explicar la densidad.Sin embargo, la mayor resolución de nuestra estructura mostró que este nucleótido es una molécula extraribosómica, posiblemente AMP (Fig. 5a, b).
Luego preguntamos si el sitio de unión de nucleótidos aparecía en el ribosoma de E. cuniculi o si existía previamente.Dado que la unión de nucleótidos está mediada principalmente por los residuos Phe170 y Lys172 en la proteína ribosomal eL30, evaluamos la conservación de estos residuos en 4396 eucariotas representativos.Como en el caso de uL15 anterior, encontramos que los residuos de Phe170 y Lys172 están altamente conservados solo en Microsporidia típicos, pero están ausentes en otros eucariotas, incluidos Microsporidia Mitosporidium y Amphiamblys atípicos, en los que el fragmento de ARNr ES39L no se reduce 44, 45, 46 (Fig. 5c).-mi).
En conjunto, estos datos respaldan la idea de que E. cuniculi y posiblemente otros microsporidios canónicos han desarrollado la capacidad de capturar de manera eficiente una gran cantidad de pequeños metabolitos en la estructura del ribosoma para compensar la disminución en los niveles de proteína y ARNr.Al hacerlo, han desarrollado una capacidad única para unir nucleótidos fuera del ribosoma, lo que demuestra que las estructuras moleculares parásitas compensan al capturar abundantes metabolitos pequeños y usarlos como imitadores estructurales de fragmentos de proteínas y ARN degradados..
La tercera parte no simulada de nuestro mapa crio-EM, que se encuentra en la subunidad ribosómica grande.La resolución relativamente alta (2,6 Å) de nuestro mapa sugiere que esta densidad pertenece a proteínas con combinaciones únicas de residuos de cadenas laterales grandes, lo que nos permitió identificar esta densidad como una proteína ribosómica previamente desconocida que identificamos como MSL2 (Microsporidia-specific protein L2) (métodos, figura 6).Nuestra búsqueda de homología mostró que msL2 se conserva en el clado Microsporidia del género Encephaliter y Orosporidium, pero está ausente en otras especies, incluidos otros Microsporidia.En la estructura ribosomal, msL2 ocupa un hueco formado por la pérdida del rRNA ES31L extendido.En este vacío, msL2 ayuda a estabilizar el plegamiento del ARNr y puede compensar la pérdida de ES31L (Figura 6).
a Densidad de electrones y modelo de la proteína ribosómica MSL2 específica de Microsporidia que se encuentra en los ribosomas de E. cuniculi.b La mayoría de los ribosomas eucarióticos, incluido el ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, pierden la amplificación del ARNr de ES19L en la mayoría de las especies de Microsporidian.La estructura previamente establecida del ribosoma microsporidia de V. necatrix sugiere que la pérdida de ES19L en estos parásitos se compensa con la evolución de la nueva proteína ribosómica msL1.En este estudio, encontramos que el ribosoma de E. cuniculi también desarrolló una proteína imitadora de ARN ribosómico adicional como una aparente compensación por la pérdida de ES19L.Sin embargo, msL2 (actualmente anotada como la hipotética proteína ECU06_1135) y msL1 tienen diferentes orígenes estructurales y evolutivos.c Este descubrimiento de la generación de proteínas ribosómicas msL1 y msL2 evolutivamente no relacionadas sugiere que si los ribosomas acumulan mutaciones perjudiciales en su ARNr, pueden alcanzar niveles sin precedentes de diversidad composicional incluso en un pequeño subconjunto de especies estrechamente relacionadas.Este descubrimiento podría ayudar a aclarar el origen y la evolución del ribosoma mitocondrial, que es conocido por su ARNr muy reducido y su variabilidad anormal en la composición de proteínas entre especies.
Luego comparamos la proteína msL2 con la proteína msL1 descrita anteriormente, la única proteína ribosómica específica de microsporidia conocida que se encuentra en el ribosoma de V. necatrix.Queríamos probar si msL1 y msL2 están relacionados evolutivamente.Nuestro análisis mostró que msL1 y msL2 ocupan la misma cavidad en la estructura ribosomal, pero tienen diferentes estructuras primarias y terciarias, lo que indica su origen evolutivo independiente (Fig. 6).Por lo tanto, nuestro descubrimiento de msL2 proporciona evidencia de que grupos de especies eucariotas compactas pueden evolucionar de forma independiente proteínas ribosómicas estructuralmente distintas para compensar la pérdida de fragmentos de ARNr.Este hallazgo es notable porque la mayoría de los ribosomas eucarióticos citoplásmicos contienen una proteína invariable, incluida la misma familia de 81 proteínas ribosómicas.La aparición de msL1 y msL2 en varios clados de microsporidios en respuesta a la pérdida de segmentos extendidos de ARNr sugiere que la degradación de la arquitectura molecular del parásito hace que los parásitos busquen mutaciones compensatorias, lo que eventualmente puede conducir a su adquisición en diferentes poblaciones de parásitos.estructuras
Finalmente, cuando se completó nuestro modelo, comparamos la composición del ribosoma de E. cuniculi con la predicha a partir de la secuencia del genoma.Anteriormente se pensaba que varias proteínas ribosómicas, incluidas eL14, eL38, eL41 y eS30, faltaban en el genoma de E. cuniculi debido a la aparente ausencia de sus homólogos en el genoma de E. cuniculi.La pérdida de muchas proteínas ribosómicas también se predice en la mayoría de los otros parásitos y endosimbiontes intracelulares altamente reducidos.Por ejemplo, aunque la mayoría de las bacterias de vida libre contienen la misma familia de 54 proteínas ribosómicas, solo 11 de estas familias de proteínas tienen homólogos detectables en cada genoma analizado de bacterias restringidas al huésped.En apoyo de esta idea, se ha observado experimentalmente una pérdida de proteínas ribosómicas en microsporidios de V. necatrix y P. locustae, que carecen de las proteínas eL38 y eL4131,32.
Sin embargo, nuestras estructuras muestran que solo eL38, eL41 y eS30 se pierden en el ribosoma de E. cuniculi.La proteína eL14 se conservó y nuestra estructura mostró por qué esta proteína no se pudo encontrar en la búsqueda de homología (Fig. 7).En los ribosomas de E. cuniculi, la mayor parte del sitio de unión de eL14 se pierde debido a la degradación del ES39L amplificado con ARNr.En ausencia de ES39L, eL14 perdió la mayor parte de su estructura secundaria y solo el 18 % de la secuencia de eL14 era idéntica en E. cuniculi y S. cerevisiae.Esta conservación deficiente de la secuencia es notable porque incluso Saccharomyces cerevisiae y Homo sapiens, organismos que evolucionaron con 1500 millones de años de diferencia, comparten más del 51 % de los mismos residuos en eL14.Esta pérdida anómala de conservación explica por qué E. cuniculi eL14 se anota actualmente como la proteína putativa M970_061160 y no como la proteína ribosomal eL1427.
y El ribosoma de Microsporidia perdió la extensión del ARNr de ES39L, lo que eliminó parcialmente el sitio de unión a la proteína ribosomal eL14.En ausencia de ES39L, la proteína de microsporas eL14 sufre una pérdida de estructura secundaria, en la que la antigua hélice α de unión a ARNr degenera en un bucle de longitud mínima.b El alineamiento de secuencias múltiples muestra que la proteína eL14 está muy conservada en especies eucariotas (57 % de identidad de secuencia entre homólogos de levadura y humanos), pero poco conservada y divergente en microsporidios (en los que no más del 24 % de los residuos son idénticos al homólogo de eL14).de S. cerevisiae o H. sapiens).Esta escasa conservación de la secuencia y la variabilidad de la estructura secundaria explican por qué nunca se ha encontrado el homólogo de eL14 en E. cuniculi y por qué se cree que esta proteína se ha perdido en E. cuniculi.Por el contrario, E. cuniculi eL14 se anotó previamente como una proteína putativa M970_061160.Esta observación sugiere que la diversidad del genoma de los microsporidios se sobreestima actualmente: algunos genes que actualmente se cree que se han perdido en los microsporidios, de hecho, se conservan, aunque en formas muy diferenciadas;en cambio, se cree que algunos codifican genes de microsporidios para proteínas específicas de gusanos (p. ej., la proteína hipotética M970_061160) en realidad codifica las proteínas muy diversas que se encuentran en otros eucariotas.
Este hallazgo sugiere que la desnaturalización del ARNr puede conducir a una pérdida dramática de la conservación de la secuencia en las proteínas ribosómicas adyacentes, lo que hace que estas proteínas sean indetectables para las búsquedas de homología.Por lo tanto, podemos sobrestimar el grado real de degradación molecular en organismos de genoma pequeño, ya que algunas proteínas que se pensaba que se habían perdido en realidad persisten, aunque en formas muy alteradas.
¿Cómo pueden los parásitos conservar la función de sus máquinas moleculares en condiciones de reducción extrema del genoma?Nuestro estudio responde a esta pregunta describiendo la estructura molecular compleja (ribosoma) de E. cuniculi, un organismo con uno de los genomas eucariotas más pequeños.
Se sabe desde hace casi dos décadas que las moléculas de proteína y ARN en los parásitos microbianos a menudo difieren de sus moléculas homólogas en las especies de vida libre porque carecen de centros de control de calidad, se reducen al 50% de su tamaño en los microbios de vida libre, etc.muchas mutaciones debilitantes que afectan el plegamiento y la función.Por ejemplo, se espera que los ribosomas de organismos de genoma pequeño, incluidos muchos parásitos intracelulares y endosimbiontes, carezcan de varias proteínas ribosómicas y hasta un tercio de nucleótidos de ARNr en comparación con las especies de vida libre 27, 29, 30, 49. Sin embargo, la forma en que funcionan estas moléculas en el parásito sigue siendo en gran parte un misterio, estudiado principalmente a través de la genómica comparativa.
Nuestro estudio muestra que la estructura de las macromoléculas puede revelar muchos aspectos de la evolución que son difíciles de extraer de los estudios genómicos comparativos tradicionales de parásitos intracelulares y otros organismos restringidos al huésped (Fig. 7 complementaria).Por ejemplo, el ejemplo de la proteína eL14 muestra que podemos sobrestimar el grado real de degradación del aparato molecular en especies parásitas.Ahora se cree que los parásitos encefalíticos tienen cientos de genes específicos de microsporidios.Sin embargo, nuestros resultados muestran que algunos de estos genes aparentemente específicos son en realidad solo variantes muy diferentes de genes que son comunes en otros eucariotas.Además, el ejemplo de la proteína msL2 muestra cómo pasamos por alto las nuevas proteínas ribosómicas y subestimamos el contenido de las máquinas moleculares parásitas.El ejemplo de las moléculas pequeñas muestra cómo podemos pasar por alto las innovaciones más ingeniosas en las estructuras moleculares parásitas que pueden darles una nueva actividad biológica.
En conjunto, estos resultados mejoran nuestra comprensión de las diferencias entre las estructuras moleculares de los organismos restringidos al huésped y sus contrapartes en los organismos de vida libre.Mostramos que las máquinas moleculares, que durante mucho tiempo se pensó que estaban reducidas, degeneradas y sujetas a varias mutaciones debilitantes, en cambio tienen un conjunto de características estructurales inusuales sistemáticamente pasadas por alto.
Por otro lado, los fragmentos de ARNr no voluminosos y los fragmentos fusionados que encontramos en los ribosomas de E. cuniculi sugieren que la reducción del genoma puede cambiar incluso aquellas partes de la maquinaria molecular básica que se conservan en los tres dominios de la vida, después de casi 3500 millones de años.evolución independiente de las especies.
Los fragmentos de ARNr fusionados y libres de protuberancias en los ribosomas de E. cuniculi son de particular interés a la luz de estudios previos de moléculas de ARN en bacterias endosimbióticas.Por ejemplo, en el endosimbionte de áfidos Buchnera aphidicola, se ha demostrado que las moléculas de ARNr y ARNt tienen estructuras sensibles a la temperatura debido al sesgo de composición A+T y una alta proporción de pares de bases no canónicas20,50.Ahora se cree que estos cambios en el ARN, así como los cambios en las moléculas de proteína, son responsables de la dependencia excesiva de los endosimbiontes de sus socios y de la incapacidad de los endosimbiontes para transferir calor 21, 23 .Aunque el ARNr de microsporidios parásitos tiene cambios estructuralmente distintos, la naturaleza de estos cambios sugiere que la estabilidad térmica reducida y una mayor dependencia de las proteínas chaperonas pueden ser características comunes de las moléculas de ARN en organismos con genomas reducidos.
Por otro lado, nuestras estructuras muestran que los microsporidios del parásito han desarrollado una capacidad única para resistir fragmentos de proteínas y ARNr ampliamente conservados, desarrollando la capacidad de utilizar metabolitos pequeños abundantes y fácilmente disponibles como imitadores estructurales de fragmentos de proteínas y ARNr degenerados.Degradación de la estructura molecular..Esta opinión está respaldada por el hecho de que las pequeñas moléculas que compensan la pérdida de fragmentos de proteínas en el ARNr y los ribosomas de E. cuniculi se unen a residuos específicos de microsporidios en las proteínas uL15 y eL30.Esto sugiere que la unión de moléculas pequeñas a los ribosomas puede ser producto de una selección positiva, en la que se han seleccionado mutaciones específicas de Microsporidia en proteínas ribosómicas por su capacidad para aumentar la afinidad de los ribosomas por moléculas pequeñas, lo que puede conducir a organismos ribosómicos más eficientes.El descubrimiento revela una innovación inteligente en la estructura molecular de los parásitos microbianos y nos brinda una mejor comprensión de cómo las estructuras moleculares de los parásitos mantienen su función a pesar de la evolución reductiva.
En la actualidad, la identificación de estas pequeñas moléculas sigue sin estar clara.No está claro por qué la apariencia de estas pequeñas moléculas en la estructura ribosomal difiere entre las especies de microsporidios.En particular, no está claro por qué se observa la unión de nucleótidos en los ribosomas de E. cuniculi y P. locustae, y no en los ribosomas de V. necatrix, a pesar de la presencia del residuo F170 en las proteínas eL20 y K172 de V. necatrix.Esta eliminación puede ser causada por el residuo 43 uL6 (ubicado junto al bolsillo de unión de nucleótidos), que es tirosina en V. necatrix y no treonina en E. cuniculi y P. locustae.La voluminosa cadena lateral aromática de Tyr43 puede interferir con la unión de nucleótidos debido a la superposición estérica.Alternativamente, la aparente eliminación de nucleótidos puede deberse a la baja resolución de las imágenes crio-EM, lo que dificulta el modelado de fragmentos ribosómicos de V. necatrix.
Por otro lado, nuestro trabajo sugiere que el proceso de descomposición del genoma puede ser una fuerza inventiva.En particular, la estructura del ribosoma de E. cuniculi sugiere que la pérdida de rRNA y fragmentos de proteínas en el ribosoma de microsporidia crea una presión evolutiva que promueve cambios en la estructura del ribosoma.Estas variantes ocurren lejos del sitio activo del ribosoma y parecen ayudar a mantener (o restaurar) el ensamblaje óptimo del ribosoma que, de otro modo, se vería interrumpido por la reducción del ARNr.Esto sugiere que una importante innovación del ribosoma de microsporidia parece haber evolucionado hacia la necesidad de amortiguar la deriva genética.
Quizás esto se ilustre mejor con la unión de nucleótidos, que hasta ahora nunca se había observado en otros organismos.El hecho de que los residuos de unión de nucleótidos estén presentes en los microsporidios típicos, pero no en otros eucariotas, sugiere que los sitios de unión de nucleótidos no son solo reliquias que esperan desaparecer, o el sitio final para que el ARNr sea restaurado a la forma de nucleótidos individuales.En cambio, este sitio parece una característica útil que podría haber evolucionado a lo largo de varias rondas de selección positiva.Los sitios de unión de nucleótidos pueden ser un subproducto de la selección natural: una vez que se degrada ES39L, los microsporidios se ven obligados a buscar una compensación para restaurar la biogénesis óptima del ribosoma en ausencia de ES39L.Dado que este nucleótido puede imitar los contactos moleculares del nucleótido A3186 en ES39L, la molécula de nucleótido se convierte en un bloque de construcción del ribosoma, cuya unión mejora aún más mediante la mutación de la secuencia eL30.
Con respecto a la evolución molecular de los parásitos intracelulares, nuestro estudio muestra que las fuerzas de la selección natural darwiniana y la deriva genética del deterioro del genoma no operan en paralelo, sino que oscilan.Primero, la deriva genética elimina características importantes de las biomoléculas, lo que hace que la compensación sea muy necesaria.Solo cuando los parásitos satisfagan esta necesidad a través de la selección natural darwiniana, sus macromoléculas tendrán la oportunidad de desarrollar sus rasgos más impresionantes e innovadores.Es importante destacar que la evolución de los sitios de unión de nucleótidos en el ribosoma de E. cuniculi sugiere que este patrón de evolución molecular de pérdida por ganancia no solo amortiza las mutaciones perjudiciales, sino que a veces confiere funciones completamente nuevas a las macromoléculas parásitas.
Esta idea es consistente con la teoría del equilibrio móvil de Sewell Wright, que establece que un sistema estricto de selección natural limita la capacidad de los organismos para innovar51,52,53.Sin embargo, si la deriva genética interrumpe la selección natural, estas derivas pueden producir cambios que no son en sí mismos adaptativos (o incluso perjudiciales), pero que conducen a cambios adicionales que proporcionan una mayor aptitud o una nueva actividad biológica.Nuestro marco apoya esta idea al ilustrar que el mismo tipo de mutación que reduce el pliegue y la función de una biomolécula parece ser el principal desencadenante de su mejora.En línea con el modelo evolutivo de ganar-ganar, nuestro estudio muestra que la descomposición del genoma, tradicionalmente vista como un proceso degenerativo, también es un importante impulsor de la innovación, que a veces y quizás incluso a menudo permite que las macromoléculas adquieran nuevas actividades parasitarias.puede usarlos.