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La evolución de los parásitos microbianos implica una contrarreacción entre la selección natural, que hace que los parásitos mejoren, y la deriva genética, que hace que los parásitos pierdan genes y acumulen mutaciones deletéreas. Aquí, para entender cómo ocurre esta contrarrestación a escala de una sola macromolécula, describimos la estructura crio-EM del ribosoma de Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariota con uno de los genomas más pequeños de la naturaleza. La reducción extrema de ARNr en los ribosomas de E. cuniculi está acompañada de cambios estructurales sin precedentes, como la evolución de enlaces de ARNr fusionados previamente desconocidos y ARNr sin protuberancias. Además, el ribosoma de E. cuniculi sobrevivió a la pérdida de fragmentos de ARNr y proteínas al desarrollar la capacidad de usar pequeñas moléculas como imitadores estructurales de fragmentos de ARNr y proteínas degradados. En general, demostramos que las estructuras moleculares que durante mucho tiempo se creyó que estaban reducidas, degeneradas y sujetas a mutaciones debilitantes tienen una serie de mecanismos compensatorios que las mantienen activas a pesar de las contracciones moleculares extremas.
Dado que la mayoría de los grupos de parásitos microbianos poseen herramientas moleculares únicas para explotar a sus hospedadores, a menudo es necesario desarrollar diferentes terapias para cada grupo de parásitos1,2. Sin embargo, nueva evidencia sugiere que algunos aspectos de la evolución de los parásitos son convergentes y, en gran medida, predecibles, lo que indica una posible base para intervenciones terapéuticas más amplias en parásitos microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Trabajos previos han identificado una tendencia evolutiva común en parásitos microbianos llamada reducción genómica o decaimiento genómico10,11,12,13. La investigación actual muestra que cuando los microorganismos abandonan su estilo de vida libre y se convierten en parásitos intracelulares (o endosimbiontes), sus genomas experimentan metamorfosis lentas pero asombrosas a lo largo de millones de años9,11. En un proceso conocido como decaimiento genómico, los parásitos microbianos acumulan mutaciones deletéreas que convierten muchos genes previamente importantes en pseudogenes, lo que lleva a la pérdida gradual de genes y al colapso mutacional14,15. Este colapso puede destruir hasta el 95% de los genes en los organismos intracelulares más antiguos en comparación con especies de vida libre estrechamente relacionadas. Por lo tanto, la evolución de los parásitos intracelulares es un tira y afloja entre dos fuerzas opuestas: la selección natural darwiniana, que conduce a la mejora de los parásitos, y el colapso del genoma, que arroja a los parásitos al olvido. No está claro cómo el parásito logró salir de este tira y afloja y conservar la actividad de su estructura molecular.
Aunque el mecanismo de la degradación genómica no se comprende completamente, parece ocurrir principalmente debido a la deriva genética frecuente. Dado que los parásitos viven en poblaciones pequeñas, asexuales y genéticamente limitadas, no pueden eliminar eficazmente las mutaciones deletéreas que a veces ocurren durante la replicación del ADN. Esto conduce a la acumulación irreversible de mutaciones dañinas y a la reducción del genoma del parásito. Como resultado, el parásito no solo pierde genes que ya no son necesarios para su supervivencia en el entorno intracelular, sino que es la incapacidad de las poblaciones de parásitos para eliminar eficazmente las mutaciones deletéreas esporádicas lo que provoca que estas mutaciones se acumulen en todo el genoma, incluyendo sus genes más importantes.
Gran parte de nuestra comprensión actual de la reducción del genoma se basa únicamente en comparaciones de secuencias genómicas, con menos atención a los cambios en las moléculas reales que realizan funciones de mantenimiento y sirven como posibles dianas farmacológicas. Estudios comparativos han demostrado que la carga de mutaciones microbianas intracelulares deletéreas parece predisponer a las proteínas y los ácidos nucleicos a plegarse incorrectamente y agregarse, haciéndolos más dependientes de chaperonas e hipersensibles al calor19,20,21,22,23. Además, varios parásitos —evolución independiente a veces separada por hasta 2500 millones de años— experimentaron una pérdida similar de centros de control de calidad en su síntesis de proteínas5,6 y mecanismos de reparación del ADN24. Sin embargo, se sabe poco sobre el impacto del estilo de vida intracelular en todas las demás propiedades de las macromoléculas celulares, incluyendo la adaptación molecular a una carga creciente de mutaciones deletéreas.
En este trabajo, con el fin de comprender mejor la evolución de las proteínas y los ácidos nucleicos de los microorganismos intracelulares, determinamos la estructura de los ribosomas del parásito intracelular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi es un organismo similar a un hongo que pertenece a un grupo de microsporidios parásitos que tienen genomas eucariotas inusualmente pequeños y, por lo tanto, se utilizan como organismos modelo para estudiar la descomposición del genoma25,26,27,28,29,30. Recientemente, se determinó la estructura del ribosoma crio-EM para genomas moderadamente reducidos de Microsporidia, Paranosema locustae y Vairimorpha necatrix31,32 (genoma de ~3,2 Mb). Estas estructuras sugieren que cierta pérdida de amplificación del ARNr se compensa con el desarrollo de nuevos contactos entre proteínas ribosómicas vecinas o la adquisición de nuevas proteínas ribosómicas msL131,32. La especie Encephalitozoon (genoma de ~2,5 millones de pb), junto con su pariente más cercano, Ordospora, presenta el mayor grado de reducción genómica en eucariotas: posee menos de 2000 genes codificantes de proteínas, y se espera que sus ribosomas no solo carezcan de fragmentos de expansión de ARNr (fragmentos de ARNr que distinguen a los ribosomas eucariotas de los bacterianos), sino que también contengan cuatro proteínas ribosómicas debido a la falta de homólogos en el genoma de E. cuniculi26,27,28. Por lo tanto, concluimos que el ribosoma de E. cuniculi puede revelar estrategias previamente desconocidas para la adaptación molecular a la degradación genómica.
Nuestra estructura crio-EM representa el ribosoma citoplasmático eucariota más pequeño jamás caracterizado y proporciona información sobre cómo el grado máximo de reducción del genoma afecta la estructura, el ensamblaje y la evolución de la maquinaria molecular esencial para la célula. Descubrimos que el ribosoma de E. cuniculi viola muchos de los principios ampliamente conservados del plegamiento del ARN y el ensamblaje de ribosomas, y descubrimos una nueva proteína ribosomal previamente desconocida. De forma bastante inesperada, demostramos que los ribosomas de microsporidios han desarrollado la capacidad de unirse a moléculas pequeñas, y planteamos la hipótesis de que los truncamientos en el ARNr y las proteínas desencadenan innovaciones evolutivas que, en última instancia, podrían conferir cualidades útiles al ribosoma.
Para comprender mejor la evolución de las proteínas y los ácidos nucleicos en organismos intracelulares, decidimos aislar esporas de E. cuniculi a partir de cultivos de células de mamíferos infectadas para purificar sus ribosomas y determinar su estructura. Obtener una gran cantidad de microsporidios parásitos es difícil, ya que no pueden cultivarse en un medio nutritivo. En cambio, crecen y se reproducen únicamente dentro de la célula huésped. Por lo tanto, para obtener biomasa de E. cuniculi para la purificación de ribosomas, infectamos la línea celular de riñón de mamífero RK13 con esporas de E. cuniculi y cultivamos estas células infectadas durante varias semanas para permitir que E. cuniculi creciera y se multiplicara. Utilizando una monocapa de células infectadas de aproximadamente medio metro cuadrado, pudimos purificar aproximadamente 300 mg de esporas de Microsporidia y utilizarlas para aislar ribosomas. Posteriormente, rompimos las esporas purificadas con microesferas de vidrio y aislamos los ribosomas crudos mediante fraccionamiento gradual de los lisados ​​con polietilenglicol. Esto nos permitió obtener aproximadamente 300 µg de ribosomas crudos de E. cuniculi para análisis estructural.
A continuación, recopilamos imágenes de crio-EM con las muestras de ribosomas resultantes y las procesamos utilizando máscaras correspondientes a la subunidad ribosomal grande, la cabeza de la subunidad pequeña y la subunidad pequeña. Durante este proceso, recopilamos imágenes de aproximadamente 108 000 partículas ribosomales y calculamos imágenes de crio-EM con una resolución de 2,7 Å (Figuras Suplementarias 1-3). Posteriormente, utilizamos imágenes de crio-EM para modelar el ARNr, la proteína ribosomal y el factor de hibernación Mdf1 asociados a los ribosomas de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estructura del ribosoma de E. cuniculi en complejo con el factor de hibernación Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa del factor de hibernación Mdf1 asociado con el ribosoma de E. cuniculi. c Mapa de estructura secundaria que compara el ARNr recuperado en especies de microsporidios con estructuras ribosómicas conocidas. Los paneles muestran la ubicación de los fragmentos de ARNr amplificados (ES) y los sitios activos del ribosoma, incluyendo el sitio de decodificación (DC), el bucle de sarcinicina (SRL) y el centro de peptidil transferasa (PTC). d La densidad electrónica correspondiente al centro de peptidil transferasa del ribosoma de E. cuniculi sugiere que este sitio catalítico tiene la misma estructura en el parásito E. cuniculi y sus huéspedes, incluyendo H. sapiens. La densidad electrónica correspondiente del centro de decodificación (e) y su estructura esquemática (f) indican que E. cuniculi presenta los residuos U1491 en lugar de A1491 (numeración de E. coli) en muchos otros eucariotas. Este cambio sugiere que E. cuniculi podría ser sensible a los antibióticos que actúan sobre este sitio activo.
A diferencia de las estructuras previamente establecidas de los ribosomas de V. necatrix y P. locustae (ambas estructuras pertenecen a la misma familia de microsporidios, Nosematidae, y son muy similares entre sí), los ribosomas de E. cuniculi 31,32 experimentan numerosos procesos de fragmentación del ARNr y de proteínas. Posteriormente, se produce una desnaturalización (Figuras Suplementarias 4-6). En el ARNr, los cambios más notables incluyeron la pérdida completa del fragmento ES12L del ARNr 25S amplificado y la degeneración parcial de las hélices h39, h41 y H18 (Fig. 1c, Fig. Suplementaria 4). Entre las proteínas ribosomales, los cambios más llamativos incluyeron la pérdida completa de la proteína eS30 y el acortamiento de las proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 y eS7 (Figuras suplementarias 4, 5).
Así, la reducción extrema de los genomas de las especies de Encephalotozoon/Ordospora se refleja en la estructura de sus ribosomas: los ribosomas de E. cuniculi experimentan la pérdida más drástica de contenido proteico en ribosomas citoplasmáticos eucariotas sujetos a caracterización estructural, y ni siquiera presentan los fragmentos de ARNr y proteína que se conservan ampliamente no solo en eucariotas, sino también en los tres dominios de la vida. La estructura del ribosoma de E. cuniculi proporciona el primer modelo molecular para estos cambios y revela eventos evolutivos que han sido pasados ​​por alto tanto por la genómica comparativa como por los estudios de la estructura biomolecular intracelular (Fig. Suplementaria 7). A continuación, describimos cada uno de estos eventos junto con sus probables orígenes evolutivos y su posible impacto en la función ribosomal.
Luego descubrimos que, además de grandes truncamientos del ARNr, los ribosomas de E. cuniculi presentan variaciones del ARNr en uno de sus sitios activos. Si bien el centro de la peptidil transferasa del ribosoma de E. cuniculi comparte la misma estructura que otros ribosomas eucariotas (Fig. 1d), el centro de decodificación difiere debido a la variación de secuencia en el nucleótido 1491 (numeración de E. coli, Fig. 1e, f). Esta observación es importante porque el sitio de decodificación de los ribosomas eucariotas suele contener los residuos G1408 y A1491, en comparación con los residuos de tipo bacteriano A1408 y G1491. Esta variación subyace a la diferente sensibilidad de los ribosomas bacterianos y eucariotas a la familia de los aminoglucósidos de antibióticos ribosómicos y otras pequeñas moléculas que actúan sobre el sitio de decodificación. En el sitio de decodificación del ribosoma de E. cuniculi, el residuo A1491 fue reemplazado por U1491, lo que podría crear una interfaz de unión única para moléculas pequeñas dirigidas a este sitio activo. La misma variante A14901 también está presente en otros microsporidios como P. locustae y V. necatrix, lo que sugiere su amplia distribución entre las especies de microsporidios (Fig. 1f).
Debido a que nuestras muestras de ribosomas de E. cuniculi se aislaron de esporas metabólicamente inactivas, probamos el mapa crio-EM de E. cuniculi para la unión de ribosoma descrita previamente bajo condiciones de estrés o inanición. Factores de hibernación 31,32,36,37, 38. Coincidimos la estructura previamente establecida del ribosoma hibernante con el mapa crio-EM del ribosoma de E. cuniculi. Para el acoplamiento, se utilizaron ribosomas de S. cerevisiae en complejo con el factor de hibernación Stm138, ribosomas de langosta en complejo con el factor Lso232 y ribosomas de V. necatrix en complejo con los factores Mdf1 y Mdf231. Al mismo tiempo, encontramos la densidad crio-EM correspondiente al factor de reposo Mdf1. De manera similar a la unión de Mdf1 al ribosoma de V. necatrix, Mdf1 también se une al ribosoma de E. cuniculi, donde bloquea el sitio E del ribosoma, posiblemente ayudando a que los ribosomas estén disponibles cuando las esporas del parásito se vuelven metabólicamente inactivas tras la inactivación corporal (Figura 2). ).
Mdf1 bloquea el sitio E del ribosoma, lo que parece contribuir a su inactivación cuando las esporas del parásito se vuelven metabólicamente inactivas. En la estructura del ribosoma de E. cuniculi, observamos que Mdf1 forma un contacto previamente desconocido con el tallo L1 del ribosoma, la parte del ribosoma que facilita la liberación del ARNt desacetilado del ribosoma durante la síntesis de proteínas. Estos contactos sugieren que Mdf1 se disocia del ribosoma mediante el mismo mecanismo que el ARNt desacetilado, lo que podría explicar cómo el ribosoma elimina Mdf1 para reactivar la síntesis de proteínas.
Sin embargo, nuestra estructura reveló un contacto desconocido entre Mdf1 y la pata L1 del ribosoma (la parte del ribosoma que ayuda a liberar el ARNt desacetilado del ribosoma durante la síntesis de proteínas). En particular, Mdf1 utiliza los mismos contactos que el segmento de codo de la molécula de ARNt desacetilada (Fig. 2). Este modelado molecular, previamente desconocido, mostró que Mdf1 se disocia del ribosoma mediante el mismo mecanismo que el ARNt desacetilado, lo que explica cómo el ribosoma elimina este factor de hibernación para reactivar la síntesis de proteínas.
Al construir el modelo de ARNr, observamos que el ribosoma de E. cuniculi presenta fragmentos de ARNr con plegado anormal, denominados ARNr fusionado (Fig. 3). En los ribosomas que abarcan los tres dominios de la vida, el ARNr se pliega en estructuras donde la mayoría de sus bases se aparean y se pliegan entre sí o interactúan con proteínas ribosómicas38,39,40. Sin embargo, en los ribosomas de E. cuniculi, los ARNr parecen violar este principio de plegamiento al convertir algunas de sus hélices en regiones de ARNr desplegadas.
Estructura de la hélice de ARNr H18 25S en S. cerevisiae, V. necatrix y E. cuniculi. Típicamente, en ribosomas que abarcan los tres dominios de vida, este enlazador se enrolla en una hélice de ARN que contiene de 24 a 34 residuos. En Microsporidia, por el contrario, este enlazador de ARNr se reduce gradualmente a dos enlazadores monocatenarios ricos en uridina que contienen solo 12 residuos. La mayoría de estos residuos están expuestos a solventes. La figura muestra que los microsporidia parásitos parecen violar los principios generales del plegamiento del ARNr, donde las bases del ARNr generalmente están acopladas a otras bases o involucradas en interacciones ARNr-proteína. En microsporidia, algunos fragmentos de ARNr adquieren un plegamiento desfavorable, en el que la antigua hélice de ARNr se convierte en un fragmento monocatenario alargado casi en línea recta. La presencia de estas regiones inusuales permite que el ARNr de los microsporidios se una a fragmentos de ARNr distantes utilizando una cantidad mínima de bases de ARN.
El ejemplo más llamativo de esta transición evolutiva se puede observar en la hélice H18 25S del ARNr (Fig. 3). En especies desde E. coli hasta humanos, las bases de esta hélice del ARNr contienen de 24 a 32 nucleótidos, formando una hélice ligeramente irregular. En estructuras ribosómicas previamente identificadas de V. necatrix y P. locustae,31,32 las bases de la hélice H18 están parcialmente desenrolladas, pero el apareamiento de bases de nucleótidos se conserva. Sin embargo, en E. cuniculi este fragmento de ARNr se convierte en los enlazadores más cortos 228UUUGU232 y 301UUUUUUUU307. A diferencia de los fragmentos típicos de ARNr, estos enlazadores ricos en uridina no se enrollan ni hacen un contacto extenso con las proteínas ribosómicas. En su lugar, adoptan estructuras abiertas al disolvente y completamente desplegadas en las que las hebras del ARNr se extienden casi rectas. Esta conformación estirada explica cómo E. cuniculi utiliza sólo 12 bases de ARN para llenar el espacio de 33 Å entre las hélices de ARNr H16 y H18, mientras que otras especies requieren al menos el doble de bases de ARNr para llenar el espacio.
Así, podemos demostrar que, mediante un plegamiento energéticamente desfavorable, los microsporidios parásitos han desarrollado una estrategia para contraer incluso aquellos segmentos de ARNr que se mantienen ampliamente conservados entre especies en los tres dominios de la vida. Al parecer, mediante la acumulación de mutaciones que transforman las hélices de ARNr en enlaces poli-U cortos, E. cuniculi puede formar fragmentos inusuales de ARNr que contienen la menor cantidad posible de nucleótidos para la ligadura de fragmentos distales de ARNr. Esto ayuda a explicar cómo los microsporidios lograron una reducción drástica de su estructura molecular básica sin perder su integridad estructural y funcional.
Otra característica inusual del ARNr de E. cuniculi es su ausencia de engrosamientos (Fig. 4). Las protuberancias son nucleótidos sin pares de bases que se desvían de la hélice de ARN en lugar de ocultarse en ella. La mayoría de las protuberancias del ARNr actúan como adhesivos moleculares, ayudando a unir proteínas ribosómicas adyacentes u otros fragmentos de ARNr. Algunas protuberancias actúan como bisagras, permitiendo que la hélice de ARNr se flexione y pliegue de forma óptima para una síntesis proteica productiva.
a Una protrusión de ARNr (numeración de S. cerevisiae) está ausente de la estructura del ribosoma de E. cuniculi, pero presente en la mayoría de los demás eucariotas. b Los ribosomas internos de E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens y E. cuniculi. Los parásitos carecen de muchas de las antiguas y altamente conservadas protuberancias de ARNr. Estos engrosamientos estabilizan la estructura del ribosoma; por lo tanto, su ausencia en microsporidios indica una estabilidad reducida del plegamiento del ARNr en parásitos microsporidios. La comparación con los tallos P (tallos L7/L12 en bacterias) muestra que la pérdida de protuberancias de ARNr a veces coincide con la aparición de nuevas protuberancias junto a las protuberancias perdidas. La hélice H42 del ARNr 23S/28S presenta una protuberancia antigua (U1206 en Saccharomyces cerevisiae), cuya antigüedad se estima en al menos 3500 millones de años, debido a su protección en tres dominios vitales. En los microsporidios, esta protuberancia se ha eliminado. Sin embargo, junto a la protuberancia perdida (A1306 en E. cuniculi), ha aparecido una nueva protuberancia (A1306 en E. cuniculi).
Sorprendentemente, descubrimos que los ribosomas de E. cuniculi carecen de la mayoría de las protuberancias de ARNr presentes en otras especies, incluyendo más de 30 protuberancias conservadas en otros eucariotas (Fig. 4a). Esta pérdida elimina muchos contactos entre las subunidades ribosómicas y las hélices de ARNr adyacentes, creando en ocasiones grandes huecos dentro del ribosoma, lo que hace que el ribosoma de E. cuniculi sea más poroso en comparación con los ribosomas más tradicionales (Fig. 4b). Cabe destacar que también descubrimos que la mayoría de estas protuberancias se perdieron en las estructuras ribosómicas previamente identificadas de V. necatrix y P. locustae, que habían sido pasadas por alto en análisis estructurales previos31,32.
En ocasiones, la pérdida de protuberancias del ARNr se acompaña del desarrollo de nuevas protuberancias junto a la protuberancia perdida. Por ejemplo, el tallo P ribosómico contiene una protuberancia U1208 (en Saccharomyces cerevisiae) que sobrevivió desde E. coli hasta los humanos y, por lo tanto, se estima que tiene 3500 millones de años. Durante la síntesis de proteínas, esta protuberancia ayuda al tallo P a moverse entre conformaciones abiertas y cerradas para que el ribosoma pueda reclutar factores de traducción y entregarlos al sitio activo. En los ribosomas de E. cuniculi, este engrosamiento está ausente; sin embargo, un nuevo engrosamiento (G883), localizado solo en tres pares de bases, puede contribuir a la restauración de la flexibilidad óptima del tallo P (Fig. 4c).
Nuestros datos sobre el ARNr sin protuberancias sugieren que la minimización del ARNr no se limita a la pérdida de elementos del ARNr en la superficie del ribosoma, sino que también puede involucrar el núcleo del ribosoma, creando un defecto molecular específico del parásito que no se ha descrito en células de vida libre. se observan especies vivas.
Tras modelar las proteínas ribosomales canónicas y el ARNr, observamos que los componentes ribosomales convencionales no pueden explicar las tres partes de la imagen crio-EM. Dos de estos fragmentos son moléculas pequeñas (Fig. 5, Fig. 8 suplementaria). El primer segmento se encuentra entre las proteínas ribosomales uL15 y eL18, en una posición habitualmente ocupada por el extremo C-terminal de eL18, que se encuentra acortado en E. cuniculi. Aunque no podemos determinar la identidad de esta molécula, el tamaño y la forma de esta isla de densidad se explican bien por la presencia de moléculas de espermidina. Su unión al ribosoma se estabiliza mediante mutaciones específicas de microsporidios en las proteínas uL15 (Asp51 y Arg56), que parecen aumentar la afinidad del ribosoma por esta pequeña molécula, ya que permiten que uL15 la envuelva formando una estructura ribosomal. Figura suplementaria 2). 8, datos adicionales 1, 2).
Imágenes de crio-EM que muestran la presencia de nucleótidos fuera de la ribosa unida al ribosoma de E. cuniculi. En el ribosoma de E. cuniculi, este nucleótido ocupa la misma posición que el nucleótido 25S ARNr A3186 (numeración de Saccharomyces cerevisiae) en la mayoría de los demás ribosomas eucariotas. b En la estructura ribosómica de E. cuniculi, este nucleótido se encuentra entre las proteínas ribosómicas uL9 y eL20, lo que estabiliza el contacto entre ambas proteínas. cd Análisis de conservación de la secuencia de eL20 entre especies de microsporidios. El árbol filogenético de las especies de Microsporidia (c) y el alineamiento de secuencias múltiples de la proteína eL20 (d) muestran que los residuos de unión a nucleótidos F170 y K172 se conservan en la mayoría de los Microsporidia típicos, con la excepción de S. lophii, con la excepción de los Microsporidia de ramificación temprana, que retuvieron la extensión del ARNr ES39L. e Esta figura muestra que los residuos de unión a nucleótidos F170 y K172 están presentes solo en eL20 del genoma altamente reducido de microsporidia, pero no en otros eucariotas. En general, estos datos sugieren que los ribosomas de Microsporidia han desarrollado un sitio de unión de nucleótidos que parece unir moléculas de AMP y usarlas para estabilizar las interacciones proteína-proteína en la estructura ribosómica. La alta conservación de este sitio de unión en Microsporidia y su ausencia en otros eucariotas sugiere que este sitio puede proporcionar una ventaja de supervivencia selectiva para Microsporidia. Por lo tanto, la cavidad de unión de nucleótidos en el ribosoma de los microsporidios no parece ser una característica degenerada ni una forma terminal de la degradación del ARNr, como se describió previamente, sino más bien una innovación evolutiva útil que permite al ribosoma de los microsporidios unirse directamente a moléculas pequeñas, utilizándolas como bloques de construcción moleculares. Este descubrimiento convierte al ribosoma de los microsporidios en el único ribosoma conocido que utiliza un solo nucleótido como bloque estructural. f Vía evolutiva hipotética derivada de la unión de nucleótidos.
La segunda densidad de bajo peso molecular se encuentra en la interfaz entre las proteínas ribosómicas uL9 y eL30 (Fig. 5a). Esta interfaz se describió previamente en la estructura del ribosoma de Saccharomyces cerevisiae como un sitio de unión para el nucleótido 25S del ARNr A3186 (parte de la extensión del ARNr ES39L)38. Se demostró que en los ribosomas degenerados de P. locustae ES39L, esta interfaz se une a un único nucleótido desconocido 31, y se supone que este nucleótido es una forma final reducida del ARNr, en la que la longitud del ARNr es de ~130-230 bases. ES39L se reduce a un único nucleótido 32.43. Nuestras imágenes crio-EM apoyan la idea de que la densidad puede explicarse por los nucleótidos. Sin embargo, la mayor resolución de nuestra estructura mostró que este nucleótido es una molécula extrarribosómica, posiblemente AMP (Fig. 5a, b).
A continuación, nos preguntamos si el sitio de unión de nucleótidos aparecía en el ribosoma de E. cuniculi o si existía previamente. Dado que la unión de nucleótidos está mediada principalmente por los residuos Phe170 y Lys172 en la proteína ribosomal eL30, evaluamos la conservación de estos residuos en 4396 eucariotas representativos. Al igual que en el caso de uL15 mencionado anteriormente, encontramos que los residuos Phe170 y Lys172 están altamente conservados solo en Microsporidia típicos, pero ausentes en otros eucariotas, incluyendo Microsporidia atípicos Mitosporidium y Amphiamblys, en los que el fragmento de ARNr ES39L no está reducido 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
En conjunto, estos datos respaldan la idea de que E. cuniculi y posiblemente otros microsporidios canónicos han desarrollado la capacidad de capturar eficientemente grandes cantidades de metabolitos pequeños en la estructura del ribosoma para compensar la disminución de los niveles de ARNr y proteínas. De este modo, han desarrollado una capacidad única para unirse a nucleótidos fuera del ribosoma, lo que demuestra que las estructuras moleculares parásitas compensan esta situación capturando abundantes metabolitos pequeños y utilizándolos como imitadores estructurales de fragmentos de ARN y proteínas degradados.
La tercera parte no simulada de nuestro mapa crio-EM, encontrada en la subunidad ribosomal grande. La resolución relativamente alta (2,6 Å) de nuestro mapa sugiere que esta densidad pertenece a proteínas con combinaciones únicas de residuos grandes de cadena lateral, lo que nos permitió identificar esta densidad como una proteína ribosomal previamente desconocida que identificamos como Se denominó msL2 (proteína L2 específica de Microsporidia) (métodos, figura 6). Nuestra búsqueda de homología mostró que msL2 se conserva en el clado Microsporidia del género Encephaliter y Orosporidium, pero está ausente en otras especies, incluyendo otros Microsporidia. En la estructura ribosomal, msL2 ocupa un hueco formado por la pérdida del ARNr ES31L extendido. En este vacío, msL2 ayuda a estabilizar el plegamiento del ARNr y puede compensar la pérdida de ES31L (Figura 6).
a Densidad electrónica y modelo de la proteína ribosomal específica de Microsporidia msL2 encontrada en los ribosomas de E. cuniculi. b La mayoría de los ribosomas eucariotas, incluyendo el ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, tienen pérdida de la amplificación del ARNr ES19L en la mayoría de las especies de Microsporidia. La estructura previamente establecida del ribosoma de microsporidia de V. necatrix sugiere que la pérdida de ES19L en estos parásitos es compensada por la evolución de la nueva proteína ribosomal msL1. En este estudio, encontramos que el ribosoma de E. cuniculi también desarrolló una proteína imitadora de ARN ribosomal adicional como una aparente compensación por la pérdida de ES19L. Sin embargo, msL2 (actualmente anotado como la proteína hipotética ECU06_1135) y msL1 tienen diferentes orígenes estructurales y evolutivos. Este descubrimiento de la generación de proteínas ribosomales msL1 y msL2, evolutivamente no relacionadas, sugiere que si los ribosomas acumulan mutaciones perjudiciales en su ARNr, pueden alcanzar niveles sin precedentes de diversidad compositiva incluso en un pequeño subconjunto de especies estrechamente relacionadas. Este descubrimiento podría ayudar a esclarecer el origen y la evolución del ribosoma mitocondrial, conocido por su ARNr altamente reducido y su variabilidad anormal en la composición proteica entre especies.
Luego comparamos la proteína msL2 con la proteína msL1 descrita previamente, la única proteína ribosomal específica de microsporidios conocida que se encuentra en el ribosoma de V. necatrix. Queríamos probar si msL1 y msL2 están relacionadas evolutivamente. Nuestro análisis mostró que msL1 y msL2 ocupan la misma cavidad en la estructura ribosomal, pero tienen diferentes estructuras primarias y terciarias, lo que indica su origen evolutivo independiente (Fig. 6). Por lo tanto, nuestro descubrimiento de msL2 proporciona evidencia de que los grupos de especies eucariotas compactas pueden evolucionar independientemente proteínas ribosomales estructuralmente distintas para compensar la pérdida de fragmentos de ARNr. Este hallazgo es notable en que la mayoría de los ribosomas eucariotas citoplasmáticos contienen una proteína invariante, que incluye la misma familia de 81 proteínas ribosomales. La aparición de msL1 y msL2 en varios clados de microsporidios en respuesta a la pérdida de segmentos extendidos de ARNr sugiere que la degradación de la arquitectura molecular del parásito hace que los parásitos busquen mutaciones compensatorias, que eventualmente pueden conducir a su adquisición en diferentes poblaciones de parásitos. estructuras.
Finalmente, una vez completado nuestro modelo, comparamos la composición del ribosoma de E. cuniculi con la predicha a partir de la secuencia del genoma. Anteriormente, se creía que varias proteínas ribosomales, incluyendo eL14, eL38, eL41 y eS30, faltaban en el genoma de E. cuniculi debido a la aparente ausencia de sus homólogos en dicho genoma. La pérdida de muchas proteínas ribosomales también se predice en la mayoría de los demás parásitos intracelulares y endosimbiontes altamente reducidos. Por ejemplo, aunque la mayoría de las bacterias de vida libre contienen la misma familia de 54 proteínas ribosomales, solo 11 de estas familias de proteínas tienen homólogos detectables en cada genoma analizado de bacterias restringidas al hospedador. En apoyo de esta noción, se ha observado experimentalmente una pérdida de proteínas ribosomales en microsporidios de V. necatrix y P. locustae, que carecen de las proteínas eL38 y eL4131,32.
Sin embargo, nuestras estructuras muestran que solo eL38, eL41 y eS30 se pierden en el ribosoma de E. cuniculi. La proteína eL14 se conservó y nuestra estructura mostró por qué no se pudo encontrar en la búsqueda de homología (Fig. 7). En los ribosomas de E. cuniculi, la mayor parte del sitio de unión de eL14 se pierde debido a la degradación de ES39L amplificado con ARNr. En ausencia de ES39L, eL14 perdió la mayor parte de su estructura secundaria, y solo el 18% de la secuencia de eL14 fue idéntica en E. cuniculi y S. cerevisiae. Esta pobre conservación de la secuencia es notable porque incluso Saccharomyces cerevisiae y Homo sapiens (organismos que evolucionaron con 1500 millones de años de diferencia) comparten más del 51% de los mismos residuos en eL14. Esta pérdida anómala de conservación explica por qué E. cuniculi eL14 está actualmente anotada como la proteína putativa M970_061160 y no como la proteína ribosomal eL1427.
y el ribosoma de Microsporidia perdió la extensión ES39L del ARNr, lo que eliminó parcialmente el sitio de unión de la proteína ribosomal eL14. En ausencia de ES39L, la proteína eL14 de la microspora sufre una pérdida de estructura secundaria, en la que la antigua hélice α de unión al ARNr degenera en un bucle de longitud mínima. b El alineamiento de secuencias múltiples muestra que la proteína eL14 está altamente conservada en especies eucariotas (57% de identidad de secuencia entre homólogos de levadura y humanos), pero pobremente conservada y divergente en microsporidia (en la que no más del 24% de los residuos son idénticos al homólogo de eL14). de S. cerevisiae o H. sapiens). Esta pobre conservación de secuencia y variabilidad de la estructura secundaria explica por qué el homólogo de eL14 nunca se ha encontrado en E. cuniculi y por qué se piensa que esta proteína se ha perdido en E. cuniculi. En cambio, la proteína eL14 de E. cuniculi se había anotado previamente como una supuesta proteína M970_061160. Esta observación sugiere que la diversidad genómica de los microsporidios está actualmente sobreestimada: algunos genes que se creían perdidos en los microsporidios se conservan, aunque en formas muy diferenciadas; en cambio, se cree que algunos codifican genes de microsporidios para proteínas específicas de gusanos (p. ej., la hipotética proteína M970_061160) en realidad codifica para las muy diversas proteínas presentes en otros eucariotas.
Este hallazgo sugiere que la desnaturalización del ARNr puede provocar una pérdida drástica de la conservación de la secuencia en proteínas ribosómicas adyacentes, volviéndolas indetectables para las búsquedas de homología. Por lo tanto, podríamos sobreestimar el grado real de degradación molecular en organismos de genoma pequeño, ya que algunas proteínas que se creían perdidas persisten, aunque en formas muy alteradas.
¿Cómo pueden los parásitos conservar la función de sus máquinas moleculares en condiciones de reducción extrema del genoma? Nuestro estudio responde a esta pregunta describiendo la compleja estructura molecular (ribosoma) de E. cuniculi, un organismo con uno de los genomas eucariotas más pequeños.
Se sabe desde hace casi dos décadas que las moléculas de proteína y ARN en parásitos microbianos a menudo difieren de sus moléculas homólogas en especies de vida libre debido a la falta de centros de control de calidad, su reducción al 50% de su tamaño en microbios de vida libre, etc., y a muchas mutaciones debilitantes que afectan el plegamiento y la función. Por ejemplo, se espera que los ribosomas de organismos de genoma pequeño, incluyendo muchos parásitos intracelulares y endosimbiontes, carezcan de varias proteínas ribosomales y hasta un tercio de los nucleótidos de ARNr en comparación con las especies de vida libre 27, 29, 30, 49. Sin embargo, la forma en que estas moléculas funcionan en los parásitos sigue siendo en gran medida un misterio, estudiado principalmente a través de la genómica comparativa.
Nuestro estudio muestra que la estructura de las macromoléculas puede revelar muchos aspectos de la evolución que son difíciles de extraer de los estudios genómicos comparativos tradicionales de parásitos intracelulares y otros organismos restringidos al hospedador (Fig. Suplementaria 7). Por ejemplo, el ejemplo de la proteína eL14 muestra que podemos sobreestimar el grado real de degradación del aparato molecular en especies parasitarias. Actualmente se cree que los parásitos encefalíticos poseen cientos de genes específicos de microsporidios. Sin embargo, nuestros resultados muestran que algunos de estos genes aparentemente específicos son en realidad variantes muy diferentes de genes comunes en otros eucariotas. Además, el ejemplo de la proteína msL2 muestra cómo pasamos por alto las nuevas proteínas ribosomales y subestimamos el contenido de las máquinas moleculares parasitarias. El ejemplo de las moléculas pequeñas muestra cómo podemos pasar por alto las innovaciones más ingeniosas en las estructuras moleculares parasitarias que pueden conferirles nueva actividad biológica.
En conjunto, estos resultados mejoran nuestra comprensión de las diferencias entre las estructuras moleculares de los organismos con restricción de hospedador y sus contrapartes en organismos de vida libre. Demostramos que las máquinas moleculares, que durante mucho tiempo se creyeron reducidas, degeneradas y sujetas a diversas mutaciones debilitantes, presentan en cambio un conjunto de características estructurales inusuales que sistemáticamente se pasan por alto.
Por otra parte, los fragmentos de ARNr no voluminosos y los fragmentos fusionados que encontramos en los ribosomas de E. cuniculi sugieren que la reducción del genoma puede cambiar incluso aquellas partes de la maquinaria molecular básica que se conservan en los tres dominios de la vida, después de casi 3.500 millones de años de evolución independiente de las especies.
Los fragmentos de ARNr fusionados y sin abultamiento en los ribosomas de E. cuniculi son de particular interés a la luz de estudios previos de moléculas de ARN en bacterias endosimbióticas. Por ejemplo, en el endosimbionte del áfido Buchnera aphidicola, se ha demostrado que las moléculas de ARNr y ARNt tienen estructuras sensibles a la temperatura debido al sesgo de composición A+T y a una alta proporción de pares de bases no canónicos20,50. Ahora se piensa que estos cambios en el ARN, así como los cambios en las moléculas de proteína, son responsables de la sobredependencia de los endosimbiontes de sus parejas y de la incapacidad de los endosimbiontes para transferir calor 21, 23 . Aunque el ARNr de los microsporidios parásitos tiene cambios estructuralmente distintos, la naturaleza de estos cambios sugiere que la estabilidad térmica reducida y la mayor dependencia de las proteínas chaperonas pueden ser características comunes de las moléculas de ARN en organismos con genomas reducidos.
Por otro lado, nuestras estructuras muestran que los microsporidios parásitos han desarrollado una capacidad única para resistir fragmentos de ARNr y proteínas ampliamente conservados, desarrollando la capacidad de utilizar pequeños metabolitos abundantes y fácilmente disponibles como imitadores estructurales de fragmentos de ARNr y proteínas degenerados. Degradación de la estructura molecular. Esta opinión se sustenta en el hecho de que pequeñas moléculas que compensan la pérdida de fragmentos proteicos en el ARNr y los ribosomas de E. cuniculi se unen a residuos específicos de los microsporidios en las proteínas uL15 y eL30. Esto sugiere que la unión de pequeñas moléculas a los ribosomas puede ser producto de la selección positiva, en la cual las mutaciones específicas de los microsporidios en las proteínas ribosómicas se han seleccionado por su capacidad de aumentar la afinidad de los ribosomas por pequeñas moléculas, lo que puede conducir a organismos ribosómicos más eficientes. El descubrimiento revela una innovación inteligente en la estructura molecular de los parásitos microbianos y nos proporciona una mejor comprensión de cómo las estructuras moleculares de los parásitos mantienen su función a pesar de la evolución reductiva.
En la actualidad, la identificación de estas pequeñas moléculas sigue siendo incierta. No está claro por qué la apariencia de estas pequeñas moléculas en la estructura ribosómica difiere entre las especies de microsporidios. En particular, no está claro por qué se observa la unión de nucleótidos en los ribosomas de E. cuniculi y P. locustae, y no en los de V. necatrix, a pesar de la presencia del residuo F170 en las proteínas eL20 y K172 de V. necatrix. Esta deleción puede deberse al residuo 43 uL6 (ubicado adyacente al bolsillo de unión de nucleótidos), que es tirosina en V. necatrix y no treonina en E. cuniculi y P. locustae. La voluminosa cadena lateral aromática de Tyr43 puede interferir con la unión de nucleótidos debido al solapamiento estérico. Alternativamente, la aparente eliminación de nucleótidos puede deberse a la baja resolución de las imágenes crio-EM, lo que dificulta el modelado de los fragmentos ribosómicos de V. necatrix.
Por otro lado, nuestro trabajo sugiere que el proceso de desintegración genómica podría ser una fuerza inventiva. En particular, la estructura del ribosoma de E. cuniculi sugiere que la pérdida de ARNr y fragmentos proteicos en el ribosoma de microsporidios genera una presión evolutiva que promueve cambios en la estructura del ribosoma. Estas variantes se producen lejos del sitio activo del ribosoma y parecen ayudar a mantener (o restaurar) el ensamblaje óptimo del ribosoma, que de otro modo se vería alterado por la reducción del ARNr. Esto sugiere que una innovación importante del ribosoma de microsporidios parece haber evolucionado hacia la necesidad de amortiguar la deriva génica.
Quizás esto se ilustra mejor con la unión de nucleótidos, que nunca se ha observado en otros organismos hasta ahora. El hecho de que los residuos de unión de nucleótidos estén presentes en microsporidios típicos, pero no en otros eucariotas, sugiere que los sitios de unión de nucleótidos no son solo reliquias esperando desaparecer, o el sitio final para que el ARNr se restaure a la forma de nucleótidos individuales. En cambio, este sitio parece una característica útil que podría haber evolucionado a lo largo de varias rondas de selección positiva. Los sitios de unión de nucleótidos pueden ser un subproducto de la selección natural: una vez que ES39L se degrada, los microsporidios se ven obligados a buscar una compensación para restaurar la biogénesis óptima del ribosoma en ausencia de ES39L. Dado que este nucleótido puede imitar los contactos moleculares del nucleótido A3186 en ES39L, la molécula de nucleótido se convierte en un componente básico del ribosoma, cuya unión se mejora aún más mediante la mutación de la secuencia eL30.
Con respecto a la evolución molecular de los parásitos intracelulares, nuestro estudio demuestra que las fuerzas de la selección natural darwiniana y la deriva genética de la degradación genómica no operan en paralelo, sino que oscilan. En primer lugar, la deriva genética elimina características importantes de las biomoléculas, lo que hace muy necesaria una compensación. Solo cuando los parásitos satisfagan esta necesidad mediante la selección natural darwiniana, sus macromoléculas tendrán la oportunidad de desarrollar sus características más impresionantes e innovadoras. Cabe destacar que la evolución de los sitios de unión de nucleótidos en el ribosoma de E. cuniculi sugiere que este patrón de pérdida-ganancia de la evolución molecular no solo amortiza las mutaciones deletéreas, sino que en ocasiones confiere funciones completamente nuevas a las macromoléculas parasitarias.
Esta idea es consistente con la teoría del equilibrio móvil de Sewell Wright, la cual establece que un sistema estricto de selección natural limita la capacidad de los organismos para innovar51,52,53. Sin embargo, si la deriva genética altera la selección natural, estas derivas pueden producir cambios que no son en sí mismos adaptativos (o incluso perjudiciales) pero que conducen a cambios adicionales que proporcionan una mayor aptitud o nueva actividad biológica. Nuestro marco respalda esta idea al ilustrar que el mismo tipo de mutación que reduce el plegamiento y la función de una biomolécula parece ser el principal desencadenante de su mejora. En línea con el modelo evolutivo de beneficio mutuo, nuestro estudio muestra que la descomposición del genoma, tradicionalmente vista como un proceso degenerativo, también es un importante impulsor de la innovación, permitiendo a veces, e incluso quizás a menudo, que las macromoléculas adquieran nuevas actividades parasitarias. pueden usarlas.