La adquisición y distribución de nutrientes integra las características de alimentación e historia de vida de los insectos. Para compensar las deficiencias de nutrientes específicos en diferentes etapas de la vida, los insectos pueden obtener estos nutrientes a través de una alimentación suplementaria, por ejemplo, alimentándose de secreciones de vertebrados en un proceso conocido como charcos. El mosquito Anopheles arabiani parece estar desnutrido y, por lo tanto, requiere nutrientes tanto para el metabolismo como para la reproducción.arabiensis la agitación en la orina de vaca para la adquisición de nutrientes mejora las características de la historia de vida.
Asegúrese de que sea seguro. La arabiensis se sintió atraída por el olor de la orina fresca de vaca de 24, 72 y 168 horas de edad, y las hembras que buscaban huéspedes y alimentadas con sangre (48 horas después de la comida de sangre) se midieron en un olfatómetro de tubo en Y, y las hembras preñadas se evaluaron para la prueba de desove. Luego se utilizó un análisis químico y electrofisiológico combinado para identificar compuestos bioactivos en la orina de vaca en las cuatro clases de edad. Mezclas sintéticas de bioactivos Se evaluaron los compuestos en pruebas de tubo en Y y de campo. Para investigar la orina de vaca y su principal compuesto que contiene nitrógeno, la urea, como posibles dietas suplementarias para los vectores de la malaria, se midieron los parámetros de alimentación y las características de la historia de vida. Se evaluó la proporción de mosquitos hembra y la cantidad de orina de vaca y urea absorbida. Después de alimentarse, se evaluó la supervivencia, el vuelo atado y la reproducción de las hembras.
Busque la sangre y el alimento del huésped. En estudios de laboratorio y de campo, los árabes se sintieron atraídos por el aroma natural y sintético de la orina de vaca fresca y envejecida. Las hembras preñadas eran indiferentes a las respuestas de la orina de vaca en los sitios de desove.
Adquisición y distribución de Anopheles arabinis de orina de vaca para mejorar las características de la historia de vida. La alimentación suplementaria de orina de vaca afecta la capacidad del vector directamente al aumentar la supervivencia diaria y la densidad del vector, e indirectamente al alterar la actividad de vuelo y, por lo tanto, debe considerarse en modelos futuros.
La adquisición y distribución de nutrientes integra las características de búsqueda de alimento e historia de vida de los insectos [1,2,3]. Los insectos pueden seleccionar y adquirir alimentos y realizar una alimentación compensatoria basada en la disponibilidad de alimentos y los requisitos de nutrientes [1, 3]. La distribución de nutrientes depende del proceso de la historia de vida y puede conducir a diferentes requisitos para la calidad y cantidad de la dieta en diferentes etapas de la vida de los insectos [1, 2]. s, y carroña, un proceso conocido como charcos [2]. Aunque se describe principalmente una variedad de especies de mariposas y polillas, los abrevaderos también ocurren en otros órdenes de insectos, y la atracción y alimentación de este tipo de recursos puede tener efectos significativos en la salud y otros rasgos de la historia de vida [2, 4, 5, 6], 7]. papel en las características de su historia de vida, pero este comportamiento hasta ahora se ha descuidado. El uso de la agitación como un medio para aumentar la ingesta de nutrientes en este importante vehículo merece atención, ya que esto puede tener importantes consecuencias epidemiológicas.
La ingesta de nitrógeno en los mosquitos Anopheles hembra adultos es limitada debido a las bajas reservas calóricas transportadas desde la etapa larval y la utilización ineficiente de la harina de sangre [9]. La hembra Ann. gambiae sl generalmente compensa esto complementando con comidas de sangre suplementarias [10, 11], lo que pone a más personas en riesgo de contraer la enfermedad y pone a los mosquitos en mayor riesgo de depredación. demostrado por otros insectos [2]. A este respecto, es interesante la atracción fuerte y distinta de una de las especies hermanas dentro de An. El complejo de especies sl de Gambia, Anopheles arabinis, orina de vaca fresca y envejecida [12,13,14], es interesante. Anopheles arabinis es oportunista en sus preferencias de hospedador y se sabe que se asocia con el ganado y se alimenta de él. 15, 16]. A medida que la orina de la vaca envejece, los microorganismos utilizan estos recursos para reducir la complejidad de los compuestos nitrogenados en 24 horas [15]. Con el rápido aumento de amoníaco, asociado con una disminución del nitrógeno orgánico, prosperan los microorganismos alcalofílicos (muchos de los cuales producen compuestos tóxicos para los mosquitos) [15], que pueden ser hembras Ann. arabiensis que se sienten atraídas preferentemente por la orina de 24 horas o menos [13, 14].
En este estudio, se buscaron ans hospedantes y alimentados con sangre. Durante su primer ciclo de gonadotropina, se evaluó la adquisición de compuestos nitrogenados, incluida la urea, a través de la orina de arabiensis. A continuación, se realizaron una serie de experimentos para evaluar cómo los mosquitos hembra asignan este recurso potencial de nutrientes para mejorar la supervivencia, la reproducción y la alimentación adicional. arabiensis descubrió correlaciones químicas detrás del atractivo diferencial observado. Las mezclas de olores sintéticos de compuestos orgánicos volátiles (COV) identificados en la orina envejecida durante 24 horas se evaluaron más a fondo en condiciones de campo, ampliando los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio y demostrando el efecto del olor de la orina bovina en diferentes estados fisiológicos.Atracción de mosquitos. Los resultados obtenidos confirman que An.arabiensis adquiere y distribuye los compuestos nitrogenados que se encuentran en la orina de los vertebrados para influir en las características de la historia de vida. Estos resultados se analizan en el contexto de las posibles consecuencias epidemiológicas y cómo se pueden utilizar para la vigilancia y el control de vectores.
Anopheles arabicans (cepa Dongola) se mantuvieron a 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % de HR y un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 h. Åstorp, SE) y luego se transfirieron a jaulas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwán) para permitir la emergencia de los adultos. A los adultos se les proporcionó una solución de sacarosa al 10 % ad libitum hasta 4 días después de la emergencia (dpe), momento en el cual se ofreció dieta a las hembras que buscaban hospedador inmediatamente antes del experimento, o se las dejó sin alimento durante la noche con agua destilada antes del experimento, como se describe a continuación. con hambre durante solo 4 a 6 horas con agua ad libitum. Para preparar mosquitos chupadores de sangre para bioensayos posteriores, se suministró sangre de oveja defibrótica a 4 hembras dpe (Håtunalab, Bro, SE) utilizando un sistema de alimentación por membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Reino Unido). Las hembras completamente congestionadas se transfirieron luego a jaulas individuales y se les proporcionó dieta directamente, como se describe a continuación, o sacarosa al 10 % ad libitum durante 3 días antes de los experimentos que se describen a continuación. Estas últimas hembras se utilizaron para bioensayos en tubos de vuelo y se trasladaron al laboratorio, y luego se les administró agua destilada ad libitum durante 4 a 6 horas antes del experimento.
Se usaron ensayos de alimentación para cuantificar el consumo de orina y urea en hembras árabes adultas. A las hembras alimentadas con sangre y en busca de huéspedes se les suministró una dieta que contenía 1 % de orina de vaca fresca y envejecida diluida, varias concentraciones de urea y dos controles (10 % de sacarosa y agua) durante 48 h. Además, colorante alimentario (1 mg ml-1 de cianuro de xileno FF; CAS 2650-17-1; ) se agregó a la dieta y se suministró en una matriz de 4 × 4 en tubos de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EE. UU.; Figura 1A) Llene hasta el borde (~300 µl). cm °C y 65 ± 5% de humedad relativa. Estos experimentos se repitieron de 5 a 10 veces. Después de la exposición a la dieta, los mosquitos se colocaron a -20 °C hasta su posterior análisis.
Busque la orina bovina y la urea absorbida por el huésped y la hembra Anopheles arabianus que chupa sangre. En la prueba de alimentación (A), a los mosquitos hembra se les proporcionó una dieta que consistía en orina de vaca fresca y envejecida, varias concentraciones de urea, sacarosa (10%) y agua destilada (H2O). Orina de vaca de 168 horas (B). El contenido medio de nitrógeno total (± desviación estándar) de la orina se representa en el recuadro. Las hembras que buscan hospedador (D, F) y las que chupan sangre (E, G) toman urea de una manera dependiente de la dosis. la línea discontinua recta representa la línea de regresión log-lineal (F, G)
Para liberar los alimentos absorbidos, los mosquitos se colocaron individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contenían 230 µl de agua destilada y el tejido se rompió con un mortero desechable y un motor inalámbrico (VWR International, Lund, SE), seguido de centrifugación a 10 krpm durante 10 min. lector de microplacas basado en espectrofotómetro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativamente, los mosquitos se trituraron en 1 ml de agua destilada, 900 µl de los cuales se transfirieron a una cubeta para análisis espectrofotométrico (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). µl de 1 mg ml-1 de cianuro de xileno. Luego, se usó la densidad óptica de concentraciones de colorante conocidas para determinar la cantidad de alimento que ingirió cada mosquito.
Los datos de volumen se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de comparaciones por pares post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.).
Aproximadamente 20 µl de muestras de orina de cada grupo de edad se unieron en Chromosorb® W/AW (10 mg malla 80/100, Sigma Aldrich) y se encapsularon en cápsulas de estaño (8 mm × 5 mm). Las cápsulas se insertaron en la cámara de combustión de un analizador CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para determinar el contenido de nitrógeno en orina fresca y envejecida de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nitrógeno total (g N l-1) se cuantificó en función de las concentraciones de urea conocidas utilizadas como estándar.
Para evaluar el efecto de la dieta sobre la supervivencia de las hembras que buscan huéspedes y chupan sangre, los mosquitos se colocaron individualmente en placas de Petri grandes (12 cm de diámetro y 6 cm de altura; Semadeni) con un orificio cubierto con malla en la tapa (3 cm de diámetro) con ventilación y suministro de alimentos. sobre un tampón dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) insertado en una jeringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), se quitó el émbolo y se colocó encima de una placa de Petri (figura 1).1A). Cambie su dieta todos los días. Mantenga el laboratorio como se describió anteriormente. varias dietas se analizaron estadísticamente utilizando curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer y pruebas de rango logarítmico para comparar las comparaciones de distribución de supervivencia entre dietas (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un molino volador de mosquitos personalizado basado en Attisano et al. [17], hecho de paneles acrílicos transparentes de 5 mm de espesor (10 cm de ancho x 10 cm de largo x 10 cm de alto) sin paneles delanteros ni traseros (Fig. 3: arriba). 6,5 cm L) dividió en dos el tubo vertical para formar un brazo atado y un brazo que llevaba un pequeño trozo de papel de aluminio como una señal de interrupción de la luz.
A las hembras que pasaron hambre durante 24 horas se les dio la dieta anterior durante 30 minutos antes de la inmovilización. Los mosquitos hembra completamente alimentados se anestesiaron individualmente en hielo durante 2-3 minutos y se unieron a alfileres de insectos con cera de abejas (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) y luego se ataron a los brazos de los tubos horizontales. Software Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). El molino de vuelo se colocó en una habitación con temperatura regulada (12 h: 12 h, luz: oscuridad, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % de HR).
Para visualizar el patrón de actividad de vuelo, se calcularon la distancia total volada (m) y el número total de actividades de vuelo consecutivas por hora durante un período de 24 horas. Además, las distancias promedio voladas por hembras individuales se compararon entre tratamientos y se analizaron mediante ANOVA unidireccional y análisis post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), donde la distancia promedio se consideró una variable dependiente, mientras que el tratamiento es un factor independiente. Además, el número promedio de rondas se calcula en 1 incrementos de 0 minutos.
Para evaluar el efecto de la dieta en el rendimiento reproductivo de An.arabiensis, seis hembras (4 dpe) se transfirieron directamente a jaulas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) después de la extracción de sangre y luego se les proporcionó la dieta experimental durante 48 h como se describe anteriormente. Luego se retiraron las dietas y se proporcionaron copas de desove (30 ml; Nolato Hertila) llenas con 20 ml de agua destilada el tercer día durante 48 horas, cambiando cada 24 horas. Repetir cada régimen dietético 20-50 veces. Los huevos se contaron y registraron para cada jaula experimental. Se usaron submuestras de huevos para evaluar el tamaño medio y la variación de longitud de los huevos individuales (n ≥ 200 por dieta) usando un microscopio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) equipado con una cámara Leica (DFC) 320 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). Los huevos restantes se mantuvieron en una sala de clima controlado en condiciones de crianza estándar durante 24 h, y se midió una submuestra de larvas de primer estadio recientemente emergidas (n ≥ 200 por dieta), como se describió anteriormente. La cantidad de huevos y el tamaño de los huevos y las larvas se compararon entre tratamientos y utilizando ANOVA unidireccional y análisis post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Los volátiles del espacio de cabeza de orina fresca (1 hora después del muestreo), 24 horas, 72 horas y 168 horas envejecidas se recolectaron de muestras recolectadas de ganado cebú, razas Arsi. Por conveniencia, las muestras de orina se recolectaron temprano en la mañana mientras las vacas aún estaban en el establo. and Co., Minden, DE) en poliamida de 3 l con tapa En bidones de plástico de cloruro de vinilo. Los volátiles del espacio de cabeza de cada muestra de orina bovina se recogieron directamente (frescos) o después de la maduración a temperatura ambiente durante 24 h, 72 h y 168 h, es decir, cada muestra de orina era representativa de cada grupo de edad.
Para la recolección de volátiles en el espacio de cabeza, se usó un sistema de circuito cerrado para hacer circular una corriente de gas filtrado con carbón activado (100 ml min-1) a través de una bolsa de poliamida hasta la columna de adsorción durante 2,5 h usando una bomba de vacío de diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Como control, la recolección en el espacio de cabeza se realizó desde una bolsa de poliamida vacía. (malla 50/80; Waters Associates, Milford, MA, EE. UU.) entre tapones de lana de vidrio. Antes de su uso, la columna se enjuagó con 1 ml de n-hexano redestilado (Merck, Darmstadt, DE) y 1 ml de pentano (99,0 % de pureza de solvente grado GC, Sigma Aldrich). Los volátiles adsorbidos se eluyeron con 400 μl de pentano. °C hasta su uso para análisis posteriores.
Se analizaron las respuestas de comportamiento de An.Headspace volátiles recolectados de orina fresca, 24 h, 72 h y 168 h envejecida en extractos volátiles de mosquitos Arabidopsis usando un olfatómetro de tubo de vidrio recto [18]. Los experimentos se realizaron durante ZT 13-15, el período pico de la actividad de búsqueda de hogar de An. Arab [19]. 9,5 cm id) se iluminó con 3 ± 1 lx de luz roja desde arriba. El flujo de aire humidificado y filtrado con carbón (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % de humedad relativa) pasó el bioensayo a 30 cm s-1. El aire pasa a través de una serie de pantallas de malla de acero inoxidable, creando un flujo laminar y una estructura de penacho uniforme. Dispensador de tampones dentales (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspendido de un 5 cm en el extremo de barlovento del olfatómetro, con cambios de estimulador cada 5 minutos. Para el análisis, se usaron 10 μl de cada extracto de espacio de cabeza, diluido 1:10, como estímulo. Se usó una cantidad igual de pentano como control. para aclimatarse durante 1 minuto, y luego se abrió la válvula de mariposa de la jaula para liberar. La atracción al tratamiento o control se analizó como la proporción de mosquitos que entraron en contacto con la fuente dentro de los 5 minutos posteriores a la liberación. Cada control y extracto volátil de espacio de cabeza se repitieron al menos 30 veces, y para evitar los efectos de cualquier día, se probó la misma cantidad de tratamientos y controles en cada día experimental. mediante comparaciones por pares para proporciones impares (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Respuesta de desove de An. Se analizaron extractos de espacio de cabeza de orina de vaca fresca y envejecida en jaulas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Vasos de plástico (30 ml; Nolato Hertila) llenos con 20 ml de agua destilada proporcionaron el sustrato de desove y se colocaron en esquinas opuestas de la jaula, con una separación de 24 cm. Los vasos de tratamiento se ajustaron con 10 μl de cada extracto de espacio de cabeza a una proporción de 1:1. 0 dilución. Se usó una cantidad igual de pentano para ajustar la copa de control. Las copas de tratamiento y de control se intercambiaron entre cada experimento para controlar los efectos de la posición. Diez hembras alimentadas con sangre se liberaron en jaulas experimentales en ZT 9-11 y los huevos en las copas se contaron 24 horas después. veces
El análisis de cromatografía de gases y detección de patrón de antena de electrones (GC-EAD) de An. arabiensis hembra se realizó como se describió anteriormente [20]. Brevemente, los extractos volátiles frescos del espacio de cabeza se separaron utilizando un Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con una columna HP-5 (30 m × 0,25 mm de d.i., 0,25 μm de espesor de película, Agilent Technologies).y orina de envejecimiento. Se usó hidrógeno como fase móvil con una velocidad de flujo lineal promedio de 45 cm s-1. Cada muestra (2 μl) se inyectó durante 30 segundos en modo splitless con una temperatura de entrada de 225 °C. agregado y dividido 1:1 en un cruce de bajo volumen muerto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) entre el detector de ionización de llama y el EAD. El capilar de efluentes de GC para EAD se pasó a través de una línea de transferencia Gerstel ODP-2, que rastrea la temperatura del horno de GC más 5 °C, en un tubo de vidrio (10 cm × 8 mm), donde se mezcló con aire humidificado filtrado con carbón (1,5 l min−1). colocados a 0,5 cm de la salida del tubo. Cada mosquito individual representó una réplica, y para los mosquitos buscadores de huéspedes, se realizaron al menos tres réplicas en muestras de orina de cada edad.
Identificación de compuestos bioactivos en colecciones de espacio de cabeza de orina bovina fresca y envejecida utilizando un GC combinado y un espectrómetro de masas (GC-MS; 6890 GC y 5975 MS; Agilent Technologies) para obtener respuestas antenales en el análisis GC-EAD, operando en modo de ionización por impacto de electrones a 70 eV. 25 μm de espesor de película) usando helio como fase móvil con una velocidad de flujo lineal promedio de 35 cm s-1. Se inyectó una muestra de 2 μl usando la misma configuración del inyector y la misma temperatura del horno que para el análisis GC-EAD. Para la purificación, se inyectó acetato de heptilo (10 ng, 99,8 % de pureza química, Aldrich) como estándar externo.
Evaluación de la eficacia de una mezcla de olor sintético que consta de compuestos bioactivos identificados en orina fresca y envejecida para atraer a Ans.arabiensis, que busca huéspedes y chupa sangre, utilizando el mismo olfatómetro y protocolo que el anterior. 2). Para el análisis, use 10 μl de una dilución 1:100 de la mezcla totalmente sintética, con una tasa de liberación general que oscila entre aproximadamente 140-2400 ng h-1, para evaluar el atractivo para el huésped y los mosquitos chupadores de sangre. A partir de entonces, la prueba se realiza en mezclas completas, en las que se eliminan las mezclas sustractivas de compuestos únicos de la mezcla completa. regresión seguida de comparaciones por pares para proporciones impares (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Para evaluar si la orina de vaca podría servir como señal de hábitat de acogida para los mosquitos de la malaria, la orina de vaca fresca y envejecida, recolectada como se describe anteriormente, y el agua se colocaron en cubos con malla de 3 l (100 ml) y se colocaron en trampas de cebo para el huésped.(Versión BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Diez trampas colocadas a 50 m de distancia en pastizales, a 400 m de la comunidad de la aldea (Silay, Etiopía, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) y sin ganado, en criaderos permanentes y aldeas. Se calentaron cinco trampas para simular la presencia de un huésped, mientras que cinco trampas se dejaron sin calentar. Se comparó el número de pichones capturados en trampas cebadas con orina de diferentes edades mediante regresión logística con distribución binomial beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
En una aldea endémica de malaria cerca de la ciudad de Maki, región de Oromia, Etiopía (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). El estudio se realizó entre mediados de agosto y mediados de septiembre antes de la fumigación residual anual en interiores, junto con una larga temporada de lluvias. Se seleccionaron cinco pares de casas (entre 20 y 50 m de distancia) ubicadas en las afueras de la aldea para el estudio (Fig. 6A). Los criterios utilizados para seleccionar las casas fueron: no se permitía el ingreso de animales a la casa, no se permitía cocinar en el interior (tirar leña o carbón) (al menos durante el período de prueba), y casas con un máximo de dos habitantes, durmiendo en antiinsecticidas.bajo el mosquitero tratado. La Junta de Revisión de Ética en Investigación Institucional (IRB/022/2016) de la Facultad de Ciencias Naturales (CNS-IRB), Universidad de Addis Abeba, ha otorgado la aprobación ética, de acuerdo con las pautas establecidas por la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial. Se obtuvo el consentimiento de cada cabeza de familia con la asistencia del personal de extensión de salud. 2 Diseño de cuadrado latino, en el que las mezclas sintéticas y los controles se asignaron a casas pareadas en la primera noche y se intercambiaron entre casas en la siguiente noche experimental. Este proceso se repitió diez veces. Además, para estimar la actividad de los mosquitos en las casas seleccionadas, las trampas CDC se configuraron para funcionar cinco noches consecutivas al principio, a la mitad y al final de la prueba de campo a la misma hora del día.
Se disolvió una mezcla sintética que contenía seis compuestos bioactivos en heptano (97,0 % solvente de grado GC, Sigma Aldrich) y se liberó a 140 ng h-1 usando un dispensador de mecha de algodón [20]. El dispensador de mecha permitió que todos los compuestos se liberaran en proporciones constantes a lo largo del experimento de 12 horas. Se usó heptano como control. , EE. UU.; Figura 6A). Las trampas se colgaron entre 0,8 y 1 m sobre el suelo, cerca del pie de la cama, y ​​un voluntario durmió bajo un mosquitero sin tratar y se operó entre las 18:00 y las 06:30. Los mosquitos capturados por sexo y estado fisiológico (sin alimentar, alimentados, semiembarazados y preñados [21]) l. Miembros del complejo [23] En el estudio de campo, se analizó el trampeo de casas pareadas mediante un modelo de ajuste logístico nominal, donde la atracción fue la variable dependiente y el tratamiento (mezcla sintética vs control) el efecto fijo (JMP® 14.0.0. Instituto SAS Inc.).Aquí, informamos los valores de χ2 y p de la prueba de razón de verosimilitud.
Evalúe si es seguro. Arabiensis pudo obtener orina, su principal fuente de nitrógeno, la urea, mediante alimentación directa, dentro de las 48 h posteriores a la administración durante los 4 días posteriores (dpe) a las pruebas de alimentación de hembras alimentadas con sangre y en busca de hospedador (Fig. 1A). 99) = 56,00, p < 0,0001, respectivamente; Fig. 1B,C). Además, las hembras buscadoras de huésped comieron menos en la orina a las 72 horas en comparación con la orina a las 168 horas (Fig. 1B). (F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Esto contrastaba con la respuesta de las hembras alimentadas con sangre, que normalmente absorbían significativamente más dietas que contenían urea que agua, aunque significativamente menos del 10 % de sacarosa (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1).1E). estados fisiológicos, las hembras flebotomizadas absorbieron más urea que las hembras buscadoras de huésped en las concentraciones más bajas, y estas hembras absorbieron cantidades similares de urea en concentraciones más altas (F(1,953)= 78.82, p < 0.0001;Fig. 1F, G). Si bien la ingesta de una dieta que contenía urea parecía tener valores óptimos (Fig. 1D, E), las hembras en ambos estados fisiológicos pudieron modular la cantidad de urea absorbida en todo el rango de concentraciones de urea de forma logarítmica lineal (Fig. 1F, G).). De manera similar, los mosquitos parecen controlar su absorción de nitrógeno al regular la cantidad de orina absorbida, ya que la cantidad de nitrógeno en la orina se refleja en la cantidad absorbida (Figura 1B, recuadros C y B).
Para evaluar los efectos de la orina y la urea en la supervivencia de los mosquitos buscadores de huéspedes y chupadores de sangre, las hembras recibieron orina de las cuatro edades (fresca, 24 h, 72 h y 168 h después de la deposición) y un rango de concentraciones de urea, así como agua destilada y sacarosa al 10 % como control (Figura 2A). 108,5, df = 5, p < 0,0001, urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) y hembras alimentadas con sangre (orina: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E). En todos los experimentos, las hembras alimentadas con una dieta de orina, urea y agua tuvieron tasas de supervivencia significativamente más bajas en comparación con las hembras alimentadas con una dieta de sacarosa (Figura 2B-E). las hembras alimentadoras alimentadas con urea 135 mM sobrevivieron más tiempo que los controles de agua (p < 0,04) (Fig.2C). En comparación con agua, las mujeres alimentadas con orina fresca y orina de 24 horas sobrevivieron más tiempo (p = 0,001 y p = 0,012, respectivamente; Figura 2D), mientras que las mujeres alimentadas con orina de 72 horas sobrevivieron más tiempo que las alimentadas con orina fresca corta y orina envejecida de 24 horas (p < 0,0001 y p = 0,013, respectivamente; Figura 2D). sobrevivieron más tiempo que todas las demás concentraciones de urea y agua (p < 0,013; Figura 2E).
Supervivencia del huésped y de la hembra Anopheles arabinis que chupa sangre y se alimenta de orina de vaca y urea. E), y los controles, Sacarosa y agua, están muertos
La distancia total y el número de rondas determinados en la prueba del molino de vuelo durante un período de 24 horas difirieron entre los mosquitos buscadores de huéspedes y los mosquitos chupadores de sangre, que mostraron una menor actividad de vuelo en general (Fig. 3). urnal. Los mosquitos hembra que proporcionaron sacarosa u orina de 72 horas mostraron actividad durante todo el período de 24 horas, mientras que las hembras que proporcionaron agua fueron más activas durante el período medio. Los mosquitos alimentados con sacarosa exhibieron los niveles más altos de actividad a última hora de la noche y temprano en la mañana, mientras que los que ingirieron orina de 72 horas experimentaron una disminución constante de la actividad durante 24 horas (Figura 3).
Rendimiento de vuelo de Anopheles arabinis hembra cazadora y chupadora de sangre que se alimenta de orina de vaca y urea. (oscuro: gris; claro: blanco). La distancia promedio y el número promedio de episodios se muestran a la derecha del gráfico de actividad circadiana. Las barras de error representan el error estándar de la media. Análisis estadístico ver texto
En general, la actividad general de vuelo de las hembras en busca de hospedador siguió un patrón similar al de la distancia de vuelo durante un período de 24 horas. (p = 0,022) y mosquitos alimentados con orina de 24 horas (p = 0,022). En contraste con el patrón de actividad de vuelo descrito por la dieta con orina, las hembras buscadoras de hospedador alimentadas con urea exhibieron una actividad de vuelo persistente durante un período de 24 horas, alcanzando su punto máximo durante la segunda mitad de la fase oscura (Fig. 3). 138) = 1310,91, p < 0,0001). Las hembras que buscaban hospedador alimentadas con cualquier concentración de urea volaron más tiempo que las hembras alimentadas con agua o sacarosa (p < 0,03).
La actividad general de vuelo de los mosquitos chupadores de sangre fue estable y sostenida durante 24 horas con todas las dietas, con un aumento de la actividad de la orina durante la segunda mitad del período de oscuridad para las hembras alimentadas con agua, así como para las hembras alimentadas frescas y con 24 horas de vida (imagen 3). 1,36, p = 0,24) .con otra orina y dieta control (fresco, p = 0,0091; 72 horas, p = 0,0022; 168 horas, p = 0,001; sacarosa, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Los efectos de la alimentación con orina y urea sobre los parámetros reproductivos se evaluaron en bioensayos de puesta de huevos (Figura 4A) y se investigaron de acuerdo con el número de huevos puestos por cada hembra, el tamaño del huevo y las larvas de primer estadio recién nacidas. El número de huevos puestos. huevos que las hembras alimentadas con otras dietas de orina y fueron similares a las alimentadas con sacarosa (Fig. 4B). Asimismo, el tamaño de los huevos puestos por las hembras alimentadas con orina varió según la dieta (F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001), con hembras alimentadas con orina de 24 horas y sacarosa poniendo huevos significativamente más grandes que las hembras alimentadas con agua, mientras que los huevos de las hembras alimentadas con 168 h de orina fueron significativamente más pequeños (Fig. 4C). Además, la dieta con orina afectó significativamente el tamaño de las larvas (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), con larvas significativamente más grandes que emergieron de los huevos puestos por hembras alimentadas con orina de 24 y 72 horas de edad que de los huevos puestos por las hembras alimentadas con agua y orina de 168 horas (Figura 4D).
Desempeño reproductivo de hembras de Anopheles arabinis que se alimentan de orina de vaca y urea. Las hembras de mosquito alimentadas con sangre recibieron dietas que consistían en orina de vaca fresca y envejecida, varias concentraciones de urea, sacarosa (10%) y agua destilada (H2O) durante 48 horas antes de colocarlos en bioensayos y obtener sustratos para la puesta de huevos 48 horas (A). El número de huevos (B, E), el tamaño del huevo (C, F) y el tamaño de las larvas (D, G) se vieron afectados significativamente dieta suministrada (orina de vaca: BD; urea: EG). Las medias de cada parámetro medido usando diferentes nombres de letras fueron significativamente diferentes entre sí (ANOVA unidireccional usando el análisis post hoc de Tukey; p < 0.05). Las barras de error representan el error estándar de la media
Como principal componente nitrogenado de la orina, la urea, cuando se proporciona como dieta a las hembras alimentadas con sangre, afectó significativamente los parámetros reproductivos en todos los estudios. en concentraciones de urea de 134 µM o más, ponen huevos más grandes que las hembras alimentadas con agua (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), y el tamaño de las larvas, aunque afectado por concentraciones similares de urea en las madres (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) fue más variable (Fig. 4G).
Atracción general a los extractos volátiles del espacio de cabeza de la orina bovina que busca huéspedes. La arabiensis evaluada en el olfatómetro de tubo de vidrio (Fig. 5A) se vio significativamente afectada por la edad de la orina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). 168 horas: p = 0,012, pentano: p = 0,00070), excepto por el olor a orina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Orina de 72 horas en comparación con los controles (p = 0,0066; Figura 5C).
Respuestas conductuales a los olores de orina de vaca naturales y sintéticos en la búsqueda de Anopheles arabianus huésped y alimentado con sangre. Esquema del olfatómetro de tubo de vidrio (A). (G) se muestran orina de vaca envejecida. Las trazas de detección de antena de electrones (EAD) muestran cambios de voltaje en respuesta a compuestos bioactivos en el espacio de cabeza eluido del cromatógrafo de gases y detectado por un detector de ionización de llama (FID). La barra de escala representa la amplitud de respuesta (mV) versus el tiempo de retención (s). Se muestran las propiedades y tasas de liberación (µg h-1) de los compuestos biológicamente activos. respuestas. Encuentre el huésped (H) y el chupasangre (I) An. arabiensis tiene diferentes atractivos para las mezclas sintéticas de olores de orina de vaca fresca y añeja. Las proporciones medias de mosquitos atraídos por diferentes nombres de letras fueron significativamente diferentes entre sí (ANOVA unidireccional utilizando el análisis post hoc de Tukey;p < 0,05). Las barras de error representan el error estándar de la escala
Ann. arabiensis hembra, 72 h y 120 h después de la ingestión de sangre, durante el desove, no mostró preferencia por los extractos volátiles de headspace de orina de vaca fresca y envejecida en comparación con los controles de pentano (χ2 = 3.07, p> 0.05; Archivo adicional 1: Fig. S1).
Para las hembras Ann.arabiensis, los análisis GC-EAD y GC-MS identificaron ocho, seis, tres y tres compuestos bioactivos (Figura 5D-G). Aunque se observaron diferencias en la cantidad de compuestos que provocaron respuestas electrofisiológicas, la mayoría de estos compuestos estaban presentes en cada extracto volátil del espacio de cabeza recolectado de orina fresca y envejecida. Por lo tanto, para cada extracto, solo se incluyeron en análisis posteriores los compuestos que produjeron una respuesta fisiológica de las antenas femeninas por encima del umbral.
La tasa total de liberación de compuestos bioactivos volátiles en la colección de espacio de cabeza aumentó de 29 µg h-1 en orina fresca a 242 µg h-1 en orina de 168 horas, principalmente debido a p-cresol y m-formaldehído Aumentos de fenol y fenol. Por el contrario, las tasas de liberación de otros compuestos, como 2-ciclohexen-1-ona y decanal, disminuyeron con el aumento de la edad de la orina, lo que se correlacionó con la disminución observada en la intensidad de la señal (abundancia) en el cromatismo. (Fig. 5D)-G panel izquierdo) y respuestas fisiológicas a estos compuestos (Fig. 5D-G panel derecho).
En general, la mezcla sintética tenía una proporción natural similar de compuestos bioactivos identificados en extractos volátiles de espacios de cabeza de orina fresca y envejecida (Fig. 5D-G) y no pareció provocar un atractivo significativo en la búsqueda de un huésped (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; Fig. 5H) o mosquitos chupadores de sangre (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; Fig. 5I). Sin embargo, las comparaciones post hoc por pares entre los tratamientos mostraron que los mosquitos que buscaban huéspedes eran significativamente atractivos para la mezcla sintética de orina de 24 horas en comparación con los controles de pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Para evaluar el papel de los componentes individuales en mezclas sintéticas de orina de 24 horas, se evaluaron seis mezclas sustractivas frente a mezclas completas en el ensayo de tubo en Y, en el que se eliminaron los compuestos individuales. que completamente mezclado. Por el contrario, la eliminación de compuestos individuales de la mezcla completamente sintética no afectó las respuestas de comportamiento de los mosquitos chupadores de sangre (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077), con la excepción de decanal, que resultó en niveles más bajos en comparación con la mezcla completa Atracción (p = 0.022; Archivo adicional 1: Figura S2B).
En una aldea endémica de malaria en Etiopía, se evaluó durante diez noches la eficacia de una mezcla sintética de orina de vaca de 24 horas para atraer mosquitos en condiciones de campo (Fig. 6A). Se capturó e identificó un total de 4.861 mosquitos, de los cuales el 45,7 % eran Anthropus.gambiae sl, el 18,9 % Anopheles pharoensis y el 35,4 % Culex spp. 1). Anopheles arabinis es el único miembro del complejo de especies de An. Gambia identificado por análisis PCR. En promedio, se capturaron 320 mosquitos por noche, tiempo durante el cual las trampas con cebos de mezcla sintética capturaron más mosquitos que las trampas emparejadas sin mezcla (χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001). Se colocaron trampas sin cebo en cada una de las cinco noches de control al principio, a la mitad y al final de del ensayo. Se capturó un número similar de mosquitos en cada par de trampas, lo que indica que no hubo sesgo entre las casas (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) y que no disminuyó la población durante el período de estudio. ), alimentación de sangre reciente (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) y embarazo (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123;Archivo adicional 1: Tabla S1). Esto también se refleja en el número total de mosquitos capturados: buscadores de huéspedes > chupadores de sangre > embarazadas > semiembarazadas > macho.
Evaluación de campo de la eficacia de una mezcla sintética de olor a orina de vaca de 24 horas. Los ensayos de campo se realizaron en el centro-sur de Etiopía (mapa), cerca de la ciudad de Maki (insertar), usando una trampa de luz de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) (derecha) en casas pareadas, con un diseño de cuadrado latino (imagen aérea) (A). manera, un efecto fisiológico dependiente del estado. Además, estas trampas capturaron un número significativamente mayor de mosquitos Culex huéspedes. (D) En comparación con el control. Las barras de la izquierda representan el índice de selección promedio de mosquitos atrapados en pares de trampas con cebo odorante (verde) y control (abiertas) (N = 10), mientras que las barras de la derecha representan el índice de selección promedio en pares de trampas de control (abiertas; N = 5).).Los asteriscos indican niveles de significación estadística (*p = 0,01 y ***p < 0,0001)
Las tres especies fueron capturadas de manera diferente en trampas que contenían mezclas sintéticas. Buscando huésped (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), alimentación de sangre (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) y preñez (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) una .arabiensis quedó atrapada en la trampa liberando la mezcla sintética (Fig. 6B), mientras que la cantidad de An no difirió. Se encontraron Pharoensis en diferentes estados fisiológicos (Fig. 6C). Para Culex, solo se encontró un aumento significativo en el número de mosquitos que buscaban huéspedes en las trampas cebadas con la mezcla sintética (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; Fig. 6D), en comparación con las trampas de control.
Se usaron trampas de cebo para huéspedes ubicadas fuera de los huéspedes potenciales entre los criaderos y las comunidades rurales en Etiopía para evaluar si los mosquitos de la malaria utilizan el olor a orina de vaca como señal del hábitat del huésped. En ausencia de señales del huésped, calor y con o sin la presencia de olor a orina de vaca, no se capturaron mosquitos (Archivo adicional 1: Figura S3). 25) = 2.29, p = 0.13; Archivo adicional 1: Figura S3). Por el contrario, los controles de agua no capturaron mosquitos de la malaria a altas temperaturas (Archivo adicional 1: Figura S3).
Los mosquitos de la malaria adquieren y distribuyen compuestos que contienen nitrógeno a través de la alimentación compensatoria en la orina de vaca (es decir, charcos) para mejorar los rasgos de la historia de vida, similar a otros insectos [2, 4, 24, 25, 26]. La orina de vaca es un recurso renovable fácilmente disponible estrechamente asociado con lugares de descanso para los vectores de la malaria, como establos y vegetación alta cerca de casas rurales y sitios de desove. Los mosquitos hembra localizan este recurso por el olor y pueden regular la absorción de compuestos nitrogenados en la orina, incluida la orina. a, el principal componente nitrogenado en la orina [15, 16]. Según el estado fisiológico del mosquito hembra, los nutrientes de la orina se asignan para mejorar la actividad de vuelo y la supervivencia de los mosquitos hembra que buscan hospedador, así como la supervivencia y las características reproductivas de los individuos alimentados con sangre durante el primer ciclo gonadotrópico. Por lo tanto, la mezcla de la orina juega un papel nutricional importante para los vectores de la malaria que se cierran como adultos desnutridos [8], ya que proporciona a los mosquitos hembra la capacidad de adquirir importantes compuestos nitrogenados al participar en una alimentación de bajo riesgo. El hallazgo tiene importantes consecuencias epidemiológicas, ya que las hembras aumentan su esperanza de vida, actividad y rendimiento reproductivo, todo lo cual afecta la capacidad del vector. Además, este comportamiento puede ser el objetivo de futuros programas de control de vectores.