Gracias por visitar Nature.com. La versión de su navegador tiene compatibilidad limitada con CSS. Para una mejor experiencia, le recomendamos usar un navegador actualizado (o desactivar el modo de compatibilidad en Internet Explorer). Mientras tanto, para garantizar la compatibilidad continua, mostraremos el sitio sin estilos ni JavaScript.
Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana libre de químicos basada en nanotecnología que utiliza nanoestructuras artificiales de agua (EWNS). Las EWNS presentan una alta carga superficial y están saturadas de especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden interactuar con diversos microorganismos e inactivarlos, incluyendo patógenos transmitidos por alimentos. En este estudio, se demuestra que sus propiedades durante la síntesis pueden ajustarse y optimizarse para aumentar aún más su potencial antibacteriano. La plataforma de laboratorio EWNS se diseñó para ajustar las propiedades de las EWNS modificando los parámetros de síntesis. Se caracterizaron las propiedades de las EWNS (carga, tamaño y contenido de ROS) mediante métodos analíticos modernos. Además, se evaluó su potencial de inactivación microbiana contra microorganismos transmitidos por alimentos como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum y Saccharomyces cerevisiae. Los resultados presentados demuestran que las propiedades de las EWNS pueden ajustarse durante la síntesis, lo que resulta en un aumento exponencial de la eficiencia de inactivación. En particular, la carga superficial se cuadriplicó y las especies reactivas de oxígeno aumentaron. La tasa de eliminación microbiana dependió de la microbiota y osciló entre 1,0 y 3,8 log tras una exposición de 45 minutos a una dosis de aerosol de 40.000 #/cc de EWNS.
La contaminación microbiana es la principal causa de enfermedades transmitidas por los alimentos causadas por la ingestión de patógenos o sus toxinas. Solo en Estados Unidos, las enfermedades transmitidas por los alimentos causan alrededor de 76 millones de casos, 325.000 ingresos hospitalarios y 5.000 muertes cada año¹. Además, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) estima que el aumento del consumo de productos frescos es responsable del 48 % de todas las enfermedades transmitidas por los alimentos reportadas en Estados Unidos². El costo de las enfermedades y las muertes causadas por patógenos transmitidos por los alimentos en Estados Unidos es muy alto; los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) lo estiman en más de 15.600 millones de dólares estadounidenses al año³.
Actualmente, las intervenciones antimicrobianas químicas4, radiactivas5 y térmicas6 para garantizar la inocuidad alimentaria se llevan a cabo principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados a lo largo de la cadena de producción (generalmente después de la cosecha o durante el envasado) en lugar de hacerlo de forma continua. Por lo tanto, son propensas a la contaminación cruzada. 7. Un mejor control de las enfermedades transmitidas por los alimentos y el deterioro de los alimentos requiere intervenciones antimicrobianas que puedan aplicarse potencialmente en todo el proceso de la granja a la mesa, reduciendo al mismo tiempo el impacto ambiental y los costos.
Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana basada en nanotecnología y libre de químicos que puede inactivar bacterias superficiales y aéreas usando nanoestructuras artificiales de agua (EWNS). EWNS fue sintetizada usando dos procesos paralelos, electrospray e ionización de agua (Fig. 1a). Estudios previos han demostrado que EWNS tienen un conjunto único de propiedades físicas y biológicas8,9,10. EWNS tienen un promedio de 10 electrones por estructura y un tamaño promedio a nanoescala de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Además, la resonancia de espín electrónico (ESR) mostró que EWNS contiene una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente radicales hidroxilo (OH•) y superóxido (O2-) (Fig. 1c)8. EVNS está en el aire durante mucho tiempo y puede colisionar con microorganismos suspendidos en el aire y presentes en la superficie, liberando su carga útil de ROS y causando la inactivación de microorganismos (Fig. 1d). Estos primeros estudios también demostraron que el EWNS puede interactuar con diversas bacterias gramnegativas y grampositivas, incluyendo micobacterias, e inactivarlas en superficies y en el aire. La microscopía electrónica de transmisión mostró que la inactivación se debía a la ruptura de la membrana celular. Además, estudios de inhalación aguda han demostrado que dosis altas de EWNS no causan daño pulmonar ni inflamación.
(a) La electropulverización se produce cuando se aplica un alto voltaje entre un tubo capilar que contiene líquido y un contraelectrodo. (b) La aplicación de alta presión produce dos fenómenos diferentes: (i) electropulverización de agua y (ii) formación de especies reactivas de oxígeno (iones) atrapadas en el EWNS. (c) La estructura única del EWNS. (d) Debido a su naturaleza a nanoescala, los EWNS son altamente móviles y pueden interactuar con patógenos transportados por el aire.
Recientemente se ha demostrado la capacidad de la plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar microorganismos transmitidos por alimentos en la superficie de alimentos frescos. También se ha demostrado que la carga superficial de EWNS, en combinación con un campo eléctrico, puede utilizarse para lograr una administración dirigida. Además, los resultados preliminares para tomates orgánicos tras una exposición de 90 minutos a una EWNS de aproximadamente 50.000 #/cm3 fueron alentadores, con la observación de diversos microorganismos transmitidos por alimentos como E. coli y Listeria 11. Asimismo, las pruebas organolépticas preliminares no mostraron efectos sensoriales en comparación con los tomates de control. Aunque estos resultados iniciales de inactivación son alentadores para aplicaciones de seguridad alimentaria, incluso a dosis muy bajas de EWNS de 50.000 #/cc, es evidente que un mayor potencial de inactivación sería más beneficioso para reducir aún más el riesgo de infección y deterioro.
En este trabajo, centraremos nuestra investigación en el desarrollo de una plataforma de generación de EWNS que permita el ajuste preciso de los parámetros de síntesis y la optimización de sus propiedades fisicoquímicas para aumentar su potencial antibacteriano. En particular, la optimización se ha centrado en aumentar su carga superficial (para mejorar la administración dirigida) y el contenido de ROS (para mejorar la eficiencia de inactivación). Caracterizaremos las propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga y contenido de ROS) mediante métodos analíticos modernos y el uso de microorganismos alimentarios comunes como E.
El EVNS se sintetizó mediante electropulverización e ionización simultáneas de agua de alta pureza (18 MΩ cm–1). El nebulizador eléctrico 12 se utiliza habitualmente para la atomización de líquidos y la síntesis de partículas poliméricas y cerámicas 13 y fibras 14 de tamaño controlado.
Como se detalla en publicaciones anteriores 8, 9, 10, 11, en un experimento típico, se aplicó un alto voltaje entre un capilar metálico y un contraelectrodo conectado a tierra. Durante este proceso, ocurren dos fenómenos diferentes: i) electrospray y ii) ionización del agua. Un campo eléctrico intenso entre los dos electrodos provoca la acumulación de cargas negativas en la superficie del agua condensada, lo que da lugar a la formación de conos de Taylor. Como resultado, se forman gotitas de agua altamente cargadas, que continúan rompiéndose en partículas más pequeñas, como en la teoría de Rayleigh16. Al mismo tiempo, los campos eléctricos intensos hacen que algunas moléculas de agua se dividan y despojen electrones (ionicen), lo que conduce a la formación de una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS)17. Las ROS18 generadas simultáneamente se encapsularon en EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a muestra el sistema de generación de EWNS desarrollado y utilizado en la síntesis de EWNS en este estudio. El agua purificada, almacenada en una botella cerrada, se introdujo a través de un tubo de teflón (2 mm de diámetro interior) en una aguja de acero inoxidable de 30 G (capilar metálico). El flujo de agua se controla mediante la presión del aire dentro de la botella, como se muestra en la figura 2b. La aguja está montada en una consola de teflón y se puede ajustar manualmente a una distancia determinada del contraelectrodo. El contraelectrodo es un disco de aluminio pulido con un orificio central para el muestreo. Debajo del contraelectrodo se encuentra un embudo de muestreo de aluminio, conectado al resto del equipo experimental mediante un puerto de muestreo (figura 2b). Para evitar la acumulación de carga que podría interrumpir el funcionamiento del muestreador, todos sus componentes están conectados a tierra.
(a) Sistema de generación de nanoestructuras de agua diseñadas (EWNS). (b) Sección transversal del muestreador y del electrospray, que muestra los parámetros más importantes. (c) Configuración experimental para la inactivación de bacterias.
El sistema de generación de EWNS descrito anteriormente permite modificar parámetros operativos clave para facilitar el ajuste preciso de sus propiedades. Ajuste el voltaje aplicado (V), la distancia entre la aguja y el contraelectrodo (L) y el caudal de agua (φ) a través del capilar para ajustar las características del EWNS. Símbolos utilizados para representar diferentes combinaciones: [V (kV), L (cm)]. Ajuste el caudal de agua para obtener un cono de Taylor estable con un valor determinado [V, L]. Para este estudio, el diámetro de apertura del contraelectrodo (D) se mantuvo en 1,29 cm (0,5 pulgadas).
Debido a la geometría limitada y la asimetría, la intensidad del campo eléctrico no puede calcularse mediante principios básicos. En su lugar, se utilizó el software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 para calcularlo. El campo eléctrico no es uniforme, por lo que el valor del campo eléctrico en la punta del capilar se utilizó como valor de referencia para diversas configuraciones.
Durante el estudio, se evaluaron diversas combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación y estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de la producción de EWNS y reproducibilidad. Las diversas combinaciones se muestran en la Tabla Suplementaria S1.
La salida del sistema de generación de EWNS se conectó directamente a un Analizador de Tamaño de Partículas por Movilidad de Barrido (SMPS, Modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para la medición de la concentración del número de partículas, así como a un Electrómetro Faraday de Aerosoles (TSI, Modelo 3068B, Shoreview, MN). Las corrientes de aerosol se midieron como se describe en nuestra publicación anterior. Tanto el SMPS como el electrómetro de aerosoles muestrearon a un caudal de 0,5 L/min (caudal total de muestra: 1 L/min). La concentración del número de partículas y el caudal de aerosol se midieron durante 120 segundos. La medición se repitió 30 veces. Con base en las mediciones de corriente, se calculó la carga total de aerosol y se estimó la carga promedio de EWNS para un número total dado de partículas EWNS seleccionadas. El coste promedio de EWNS se puede calcular mediante la Ecuación (1):
donde IEl es la corriente medida, NSMPS es la concentración digital medida con el SMPS y φEl es el caudal por electrómetro.
Debido a que la humedad relativa (HR) afecta la carga superficial, la temperatura y la (HR) se mantuvieron constantes durante el experimento a 21 °C y 45 %, respectivamente.
Se utilizó un microscopio de fuerza atómica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, California) y una sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japón) para medir el tamaño y la vida útil de los EWNS. La frecuencia de escaneo del AFM fue de 1 Hz, el área de escaneo fue de 5 μm × 5 μm y se obtuvieron 256 líneas de escaneo. Todas las imágenes se sometieron a una alineación de primer orden mediante el software Asylum (rango de máscara: 100 nm, umbral: 100 pm).
Se retiró el embudo de prueba y la superficie de la mica se colocó a 2,0 cm del contraelectrodo durante un tiempo promedio de 120 s para evitar la aglomeración de partículas y la formación de gotitas irregulares. El EWNS se pulverizó directamente sobre la superficie de la mica recién cortada (Ted Pella, Redding, CA). Imagen de la superficie de la mica inmediatamente después de la pulverización catódica con AFM. El ángulo de contacto de la superficie de la mica recién cortada sin modificar es cercano a 0°, por lo que el EVNS se distribuye sobre la superficie de la mica en forma de domo. El diámetro (a) y la altura (h) de las gotitas que se difunden se midieron directamente a partir de la topografía del AFM y se utilizaron para calcular el volumen de difusión en domo del EWNS mediante nuestro método previamente validado. Suponiendo que los EWNS integrados tienen el mismo volumen, el diámetro equivalente se puede calcular mediante la ecuación (2):
Basándonos en nuestro método previamente desarrollado, se utilizó una trampa de espín de resonancia de espín electrónico (ESR) para detectar la presencia de intermediarios radicales de vida corta en EWNS. Los aerosoles se burbujearon a través de un burbujeador Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) que contenía una solución 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc.), Portland, Oregón. Todas las mediciones de ESR se realizaron utilizando un espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EE. UU.) y una celda de panel plano. Se utilizó el software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EE. UU.) para recopilar y analizar los datos. La determinación de las características de las ROS se realizó únicamente para un conjunto de condiciones de operación [-6,5 kV, 4,0 cm]. Las concentraciones de EWNS se midieron utilizando el SMPS después de tener en cuenta las pérdidas de EWNS en el impactador.
Los niveles de ozono se monitorearon utilizando un 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas las propiedades de EWNS, se utiliza la media como valor de medición y la desviación estándar como error de medición. Se realizaron pruebas t para comparar los valores de los atributos optimizados de EWNS con los valores correspondientes del EWNS base.
La Figura 2c muestra un sistema de “tracción” de precipitación electrostática (EPES) previamente desarrollado y caracterizado que puede utilizarse para la administración dirigida de EWNS a la superficie. La EPES utiliza cargas de EVNS que pueden “guiarse” directamente a la superficie del objetivo bajo la influencia de un campo eléctrico intenso. Los detalles del sistema EPES se presentan en una publicación reciente de Pyrgiotakis et al. 11 . Por lo tanto, la EPES consta de una cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos y contiene dos placas metálicas paralelas de acero inoxidable (acero inoxidable 304, con revestimiento de espejo) en el centro separadas 15,24 cm. Las placas se conectaron a una fuente externa de alto voltaje (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la placa inferior siempre estuvo conectada a voltaje positivo y la placa superior siempre estuvo conectada a tierra (tierra flotante). Las paredes de la cámara están cubiertas con papel de aluminio, que está conectado a tierra eléctricamente para evitar la pérdida de partículas. La cámara tiene una puerta de carga frontal sellada que permite colocar las superficies de prueba sobre soportes de plástico que las elevan por encima de la placa metálica inferior para evitar interferencias de alto voltaje.
La eficiencia de deposición de EWNS en EPES se calculó de acuerdo con un protocolo desarrollado previamente detallado en la Figura Suplementaria S111.
Como cámara de control, se conectó en serie al sistema EPES una segunda cámara de flujo cilíndrica, en la que se utilizó un filtro HEPA intermedio para eliminar el EWNS. Como se muestra en la Figura 2c, el aerosol de EWNS se bombeó a través de dos cámaras integradas. El filtro entre la sala de control y el EPES elimina cualquier EWNS restante, manteniendo los mismos niveles de temperatura (T), humedad relativa (HR) y ozono.
Se ha descubierto que importantes microorganismos transmitidos por los alimentos contaminan alimentos frescos, como E. coli (ATCC #27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), patógeno transmitido por los alimentos, Listeria harmless (ATCC #33090), sustituto de Listeria monocytogenes patógena, derivada de ATCC (Manassas, VA), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un sustituto de la levadura de descomposición, y una bacteria inactivada más resistente, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Compre cajas de tomates cherry orgánicos al azar en su mercado local y refrigérelas a 4 °C hasta su uso (hasta 3 días). Los tomates experimentales tenían el mismo tamaño, aproximadamente 1,27 cm de diámetro.
Los protocolos de cultivo, inoculación, exposición y recuento de colonias se detallan en nuestra publicación anterior y en los Datos Suplementarios. La eficacia de EWNS se evaluó exponiendo tomates inoculados a 40.000 #/cm³ durante 45 minutos. Brevemente, se utilizaron tres tomates para evaluar los microorganismos supervivientes en el tiempo t = 0 min. Tres tomates se colocaron en EPES y se expusieron a EWNS a 40.000 #/cc (tomates expuestos a EWNS) y los tres restantes se colocaron en la cámara de control (tomates control). No se realizó ningún procesamiento adicional de los tomates en ambos grupos. Los tomates expuestos a EWNS y los tomates control se retiraron después de 45 minutos para evaluar el efecto de EWNS.
Cada experimento se realizó por triplicado. El análisis de datos se realizó según el protocolo descrito en los Datos Suplementarios.
Los mecanismos de inactivación se evaluaron mediante sedimentación de muestras de EWNS expuestas (45 min a una concentración de aerosol de EWNS de 40 000 #/cm3) y muestras no irradiadas de bacterias inofensivas como E. coli, Salmonella enterica y Lactobacillus. Las partículas se fijaron en glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 1,25 % y ácido pícrico al 0,03 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, se realizó una fijación posterior con tetróxido de osmio (OsO4) al 1 %/ferrocianuro de potasio (KFeCN6) al 1,5 % durante 2 horas, se lavó 3 veces con agua y se incubó en acetato de uranilo al 1 % durante 1 hora; a continuación, se lavó dos veces con agua y se deshidrató durante 10 minutos en alcohol al 50 %, 70 %, 90 % y 100 %. Las muestras se colocaron en óxido de propileno durante una hora y se impregnaron con una mezcla 1:1 de óxido de propileno y TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). Se embebieron en TAAB Epon y se polimerizaron a 60 °C durante 48 horas. La resina granular curada se cortó y visualizó mediante TEM con un microscopio electrónico de transmisión convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EE. UU.).
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para cada punto temporal, se sembraron lavados bacterianos por triplicado, lo que resultó en un total de nueve puntos de datos por punto, cuyo promedio se utilizó como concentración bacteriana para ese microorganismo en particular. La desviación estándar se utilizó como error de medición. Todos los puntos cuentan.
El logaritmo de la disminución de la concentración de bacterias en comparación con t = 0 min se calculó utilizando la siguiente fórmula:
donde C0 es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo 0 (es decir, después de que la superficie se haya secado pero antes de colocarse en la cámara) y Cn es la concentración de bacterias en la superficie después de n minutos de exposición.
Para tener en cuenta la degradación natural de las bacterias durante la exposición de 45 minutos, la reducción logarítmica en comparación con el control después de 45 minutos también se calculó de la siguiente manera:
Donde Cn es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo n y Cn-Control es la concentración de bacterias de control en el tiempo n. Los datos se presentan como una reducción logarítmica en comparación con el control (sin exposición a EWNS).
Durante el estudio, se evaluaron varias combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación del cono de Taylor, estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de la producción de EWNS y reproducibilidad. Varias combinaciones se muestran en la Tabla Suplementaria S1. Se seleccionaron dos casos que mostraron propiedades estables y reproducibles (cono de Taylor, generación de EWNS y estabilidad en el tiempo) para un estudio exhaustivo. En la fig. La Figura 3 muestra los resultados para la carga, el tamaño y el contenido de ROS en ambos casos. Los resultados también se resumen en la Tabla 1. Como referencia, tanto la Figura 3 como la Tabla 1 incluyen las propiedades del EWNS no optimizado previamente sintetizado8, 9, 10, 11 (EWNS de línea base). Los cálculos de significancia estadística utilizando una prueba t de dos colas se republican en la Tabla Suplementaria S2. Además, los datos adicionales incluyen estudios del efecto del diámetro del orificio de muestreo del contraelectrodo (D) y la distancia entre el electrodo de tierra y la punta (L) (Figuras Suplementarias S2 y S3).
(ac) Distribución de tamaño medida por AFM. (df) Característica de carga superficial. (g) Caracterización ROS del EPR.
También es importante destacar que, en todas las condiciones mencionadas, la corriente de ionización medida se situó entre 2 y 6 μA y el voltaje entre -3,8 y -6,5 kV, lo que resultó en un consumo de energía inferior a 50 mW para este módulo de contacto de generación de EWNS. Si bien el EWNS se sintetizó a alta presión, los niveles de ozono fueron muy bajos, sin superar nunca las 60 ppb.
La Figura Suplementaria S4 muestra los campos eléctricos simulados para los escenarios de [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para estos escenarios, los cálculos de campo son de 2 × 10⁻¹ V/m y 4,7 × 10⁻¹ V/m, respectivamente. Esto es previsible, ya que en el segundo caso la relación tensión-distancia es mucho mayor.
Las figuras 3a y 3b muestran el diámetro del EWNS medido con el AFM8. Los diámetros promedio calculados del EWNS fueron de 27 nm y 19 nm para los esquemas de [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para los escenarios de [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], las desviaciones estándar geométricas de las distribuciones son de 1,41 y 1,45, respectivamente, lo que indica una distribución de tamaño estrecha. Tanto el tamaño medio como la desviación estándar geométrica son muy cercanos al EWNS de referencia, a 25 nm y 1,41, respectivamente. La figura 3c muestra la distribución de tamaño del EWNS de referencia, medido con el mismo método y en las mismas condiciones.
En la figura 3d,e se muestran los resultados de la caracterización de la carga. Los datos corresponden al promedio de 30 mediciones simultáneas de concentración (#/cm³) y corriente (I). El análisis muestra que la carga promedio en el EWNS es de 22 ± 6 e₀ y 44 ± 6 e₀ para [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Presentan cargas superficiales significativamente mayores en comparación con el EWNS de referencia (10 ± 2 e₀), dos veces mayores que en el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] y cuatro veces mayores que en el escenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f muestra los datos de carga para el EWNS de referencia.
De los mapas de concentración del número EWNS (Figuras Suplementarias S5 y S6), se observa que el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta significativamente más partículas que el escenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Cabe destacar también que la concentración del número EWNS se monitoreó hasta 4 horas (Figuras Suplementarias S5 y S6), donde la estabilidad de la generación de EWNS mostró los mismos niveles de concentración de partículas en ambos casos.
En la fig. 3g se muestra el espectro EPR después de la sustracción del control EWNS optimizado (fondo) a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Los espectros de ROS también se compararon con el escenario de línea base-EWNS en un trabajo publicado previamente. El número de EWNS que reaccionan con trampas de espín se calculó en 7,5 × 104 EWNS/s, que es similar al de la línea base-EWNS8 publicada previamente. Los espectros EPR mostraron claramente la presencia de dos tipos de ROS, siendo O2- la especie predominante y OH• la menos abundante. Además, una comparación directa de las intensidades de pico mostró que el EWNS optimizado tenía un contenido de ROS significativamente mayor en comparación con el EWNS de línea base.
La figura 4 muestra la eficiencia de deposición de EWNS en EPES. Los datos también se resumen en la Tabla I y se comparan con los datos originales de EWNS. En ambos casos de EUNS, la deposición es cercana al 100% incluso a un voltaje bajo de 3,0 kV. Normalmente, 3,0 kV es suficiente para una deposición del 100%, independientemente del cambio de carga superficial. En las mismas condiciones, la eficiencia de deposición de los EWNS de referencia fue de tan solo el 56% debido a su menor carga (un promedio de 10 electrones por EWNS).
En la figura 5 y la tabla 2 se resume el valor de inactivación de los microorganismos inoculados en la superficie de tomates tras la exposición a aproximadamente 40.000 #/cm³ de EWNS durante 45 minutos en el modo óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli y Lactobacillus inocuo inoculados mostraron una reducción significativa de 3,8 log durante la exposición de 45 minutos. En las mismas condiciones, S. enterica presentó una disminución de 2,2 log, mientras que S. cerevisiae y M. parafortutum presentaron una disminución de 1,0 log.
Las micrografías electrónicas (Figura 6) muestran los cambios físicos inducidos por EWNS en células inocuas de Escherichia coli, Streptococcus y Lactobacillus, que conducen a su inactivación. Las bacterias control presentaron membranas celulares intactas, mientras que las bacterias expuestas presentaron membranas externas dañadas.
Las imágenes microscópicas electrónicas de bacterias de control y expuestas revelaron daño a la membrana.
Los datos sobre las propiedades fisicoquímicas del EWNS optimizado muestran colectivamente que las propiedades (carga superficial y contenido de ROS) del EWNS mejoraron significativamente en comparación con los datos de referencia de EWNS publicados previamente8,9,10,11. Por otro lado, su tamaño se mantuvo en el rango nanométrico, muy similar a los resultados informados previamente, lo que les permite permanecer en el aire durante largos períodos de tiempo. La polidispersidad observada puede explicarse por los cambios en la carga superficial que determinan el tamaño del EWNS, la aleatoriedad del efecto Rayleigh y la coalescencia potencial. Sin embargo, como detallan Nielsen et al. 22, la alta carga superficial reduce la evaporación al aumentar efectivamente la energía/tensión superficial de la gota de agua. En nuestra publicación anterior8, esta teoría se confirmó experimentalmente para las microgotas 22 y el EWNS. La pérdida de carga durante el tiempo extra también puede afectar el tamaño y contribuir a la distribución de tamaño observada.
Además, la carga por estructura es de aproximadamente 22-44 e-, dependiendo de la situación, lo cual es significativamente mayor en comparación con el EWNS básico, que tiene una carga promedio de 10 ± 2 electrones por estructura. Sin embargo, cabe destacar que esta es la carga promedio del EWNS. Seto et al. han demostrado que la carga no es homogénea y sigue una distribución log-normal21. En comparación con nuestro trabajo previo, duplicar la carga superficial duplica la eficiencia de deposición en el sistema EPES hasta casi el 100 %11.