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La barrera hematoencefálica y la barrera hematoencefálica impiden que los agentes bioterapéuticos alcancen sus objetivos en el sistema nervioso central, lo que dificulta el tratamiento eficaz de enfermedades neurológicas.Para descubrir transportadores cerebrales novedosos in vivo, introdujimos una biblioteca de péptidos de fagos T7 y recolectamos sangre y líquido cefalorraquídeo (LCR) en serie utilizando un modelo canulado de ratas grandes y conscientes.Los clones de fagos específicos estaban altamente enriquecidos en LCR después de cuatro rondas de selección.Las pruebas de péptidos candidatos individuales revelaron un enriquecimiento de más de 1000 veces en LCR.La bioactividad del suministro al cerebro mediado por péptidos se confirmó mediante una reducción del 40 % en el nivel de amiloide-β en el líquido cefalorraquídeo utilizando un inhibidor del péptido BACE1 vinculado al nuevo péptido de tránsito identificado.Estos resultados sugieren que los péptidos identificados por métodos de selección de fagos in vivo pueden ser vehículos útiles para el suministro sistémico de macromoléculas al cerebro con un efecto terapéutico.
La investigación de terapias dirigidas al sistema nervioso central (SNC) se ha centrado en gran medida en identificar fármacos y agentes optimizados que muestren propiedades dirigidas al SNC, con menos esfuerzo en descubrir los mecanismos que impulsan la administración activa de fármacos al cerebro.Esto está empezando a cambiar ahora que la administración de fármacos, especialmente moléculas grandes, es una parte integral del desarrollo de fármacos de la neurociencia moderna.El entorno del sistema nervioso central está bien protegido por el sistema de barrera cerebrovascular, que consiste en la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la barrera hematoencefálica (BCBB)1, lo que dificulta la administración de fármacos al cerebro1,2.Se estima que casi todos los fármacos de molécula grande y más del 98% de los fármacos de molécula pequeña se eliminan del cerebro3.Por eso es muy importante identificar nuevos sistemas de transporte cerebral que proporcionen una entrega eficiente y específica de fármacos terapéuticos al SNC 4,5.Sin embargo, BBB y BCSFB también presentan una excelente oportunidad para la administración de fármacos, ya que penetran y entran en todas las estructuras del cerebro a través de su extensa vasculatura.Por lo tanto, los esfuerzos actuales para utilizar métodos no invasivos de administración al cerebro se basan en gran medida en el mecanismo de transporte mediado por receptor (PMT) que utiliza el receptor BBB6 endógeno.A pesar de los recientes avances clave que utilizan la vía del receptor de transferrina7,8, se requiere un mayor desarrollo de nuevos sistemas de administración con propiedades mejoradas.Con este fin, nuestro objetivo era identificar péptidos capaces de mediar en el transporte del LCR, ya que en principio podrían usarse para llevar macromoléculas al SNC o para abrir nuevas vías receptoras.En particular, los receptores y transportadores específicos del sistema cerebrovascular (BBB y BSCFB) pueden servir como objetivos potenciales para la administración activa y específica de fármacos bioterapéuticos.El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un producto secretor del plexo coroideo (CS) y está en contacto directo con el líquido intersticial del cerebro a través del espacio subaracnoideo y del espacio ventricular4.Recientemente se ha demostrado que el líquido cefalorraquídeo subaracnoideo difunde excesivamente en el intersticio del cerebro9.Esperamos acceder al espacio parenquimatoso utilizando este tracto de entrada subaracnoideo o directamente a través de la BBB.Para lograr esto, implementamos una sólida estrategia de selección de fagos in vivo que idealmente identifica los péptidos transportados por cualquiera de estas dos vías distintas.
Ahora describimos un método secuencial de detección de pantalla de fagos in vivo con muestreo de LCR junto con secuenciación de alto rendimiento (HTS) para monitorear rondas de selección inicial con la mayor diversidad de bibliotecas.El cribado se realizó en ratas conscientes con una cánula de cisterna grande (CM) implantada de forma permanente para evitar la contaminación con sangre.Es importante destacar que este enfoque selecciona tanto la orientación cerebral como los péptidos con actividad de transporte a través de la barrera cerebrovascular.Utilizamos fagos T7 debido a su pequeño tamaño (~60 nm)10 y sugerimos que son adecuados para el transporte de vesículas que permiten el cruce transcelular de la barrera endotelial y/o epitelial-medular.Después de cuatro rondas de selección, se aislaron poblaciones de fagos que mostraron un fuerte enriquecimiento de LCR in vivo y una asociación de microvasos cerebrales.Es importante destacar que pudimos confirmar nuestros hallazgos al demostrar que los mejores péptidos candidatos preferidos y sintetizados químicamente pueden transportar carga de proteínas al líquido cefalorraquídeo.En primer lugar, se establecieron los efectos farmacodinámicos del SNC mediante la combinación de un péptido de tránsito líder con un inhibidor del péptido BACE1.Además de demostrar que las estrategias de detección funcional in vivo pueden identificar péptidos de transporte cerebral novedosos como portadores de carga de proteína efectivos, esperamos que enfoques de selección funcional similares también sean importantes para identificar vías de transporte cerebral novedosas.
Sobre la base de las unidades formadoras de placas (PFU), después del paso de empaquetamiento de fagos, se diseñó y creó una biblioteca de péptidos de fagos T7 lineales de 12 meros aleatorios con una diversidad de aproximadamente 109 (ver Materiales y Métodos).Es importante tener en cuenta que analizamos cuidadosamente esta biblioteca antes de la panorámica in vivo.La amplificación por PCR de muestras de la biblioteca de fagos utilizando cebadores modificados generó amplicones que eran directamente aplicables a HTS (Fig. 1a complementaria).Debido a a) errores de secuenciación de HTS11, b) impacto en la calidad de los cebadores (NNK) 1-12, y c) la presencia de fagos de tipo salvaje (wt) (inserciones de esqueleto) en la biblioteca en espera, se implementó un procedimiento de filtrado de secuencias para extraer solo información de secuencia verificada (Fig. 1b complementaria).Estos pasos de filtrado se aplican a todas las bibliotecas de secuenciación HTS.Para la biblioteca estándar, se obtuvo un total de 233 868 lecturas, de las cuales el 39 % pasó los criterios de filtrado y se utilizó para el análisis y la selección de bibliotecas para rondas posteriores (Figura complementaria 1c-e).Las lecturas fueron predominantemente múltiplos de 3 pares de bases de longitud con un pico de 36 nucleótidos (Fig. 1c complementaria), lo que confirma el diseño de la biblioteca (NNK) 1-12.En particular, aproximadamente el 11 % de los miembros de la biblioteca contenían un inserto PAGISRELVDKL de columna vertebral de tipo salvaje (wt) de 12 dimensiones, y casi la mitad de las secuencias (49 %) contenían inserciones o deleciones.El HTS de la biblioteca de la biblioteca confirmó la gran diversidad de péptidos en la biblioteca: más del 81 % de las secuencias peptídicas se encontraron solo una vez y solo el 1,5 % se produjo en ≥4 copias (Fig. 2a complementaria).Las frecuencias de los aminoácidos (aa) en las 12 posiciones del repertorio se correlacionaron bien con las frecuencias esperadas para la cantidad de codones generados por el repertorio degenerado de NKK (Fig. 2b complementaria).La frecuencia observada de residuos aa codificados por estos insertos se correlacionó bien con la frecuencia calculada (r = 0.893) (Fig. 2c complementaria).La preparación de bibliotecas de fagos para inyección incluye los pasos de amplificación y eliminación de endotoxinas.Anteriormente se ha demostrado que esto reduce potencialmente la diversidad de bibliotecas de fagos12,13.Por lo tanto, secuenciamos una biblioteca de fagos amplificada en placa que se había sometido a la eliminación de endotoxinas y la comparamos con la biblioteca original para estimar la frecuencia de AA.Se observó una fuerte correlación (r = 0,995) entre el grupo original y el grupo amplificado y purificado (Fig. 2d complementaria), lo que indica que la competencia entre los clones amplificados en placas que usan el fago T7 no causó un sesgo importante.Esta comparación se basa en la frecuencia de los motivos tripeptídicos en cada biblioteca, ya que la diversidad de bibliotecas (~109) no puede capturarse completamente incluso con HTS.El análisis de frecuencia de aa en cada posición reveló un pequeño sesgo dependiente de la posición en las últimas tres posiciones del repertorio ingresado (Figura complementaria 2e).En conclusión, llegamos a la conclusión de que la calidad y la diversidad de la biblioteca eran aceptables y solo se observaron cambios menores en la diversidad debido a la amplificación y preparación de bibliotecas de fagos entre varias rondas de selección.
El muestreo de líquido cefalorraquídeo en serie se puede realizar implantando quirúrgicamente una cánula en el CM de ratas conscientes para facilitar la identificación del fago T7 inyectado por vía intravenosa (iv) a través de BBB y/o BCSFB (Fig. 1a-b).Usamos dos brazos de selección independientes (brazos A y B) en las primeras tres rondas de selección in vivo (Fig. 1c).Incrementamos gradualmente la rigurosidad de la selección al disminuir la cantidad total de fagos introducidos en las primeras tres rondas de selección.Para la cuarta ronda de paneo, combinamos muestras de las ramas A y B y realizamos tres selecciones independientes adicionales.Para estudiar las propiedades in vivo de las partículas del fago T7 en este modelo, se inyectó fago de tipo salvaje (inserto maestro PAGISRELVDKL) en ratas a través de la vena de la cola.La recuperación de fagos del líquido cefalorraquídeo y la sangre en diferentes puntos de tiempo mostró que los fagos icosaédricos T7 relativamente pequeños tenían una fase de eliminación inicial rápida del compartimento de la sangre (Fig. 3 complementaria).Con base en los títulos administrados y el volumen de sangre de las ratas, calculamos que solo aproximadamente el 1% en peso.el fago de la dosis administrada se detectó en la sangre 10 minutos después de la inyección intravenosa.Después de esta rápida disminución inicial, se midió un aclaramiento primario más lento con una vida media de 27,7 minutos.Es importante destacar que solo se recuperaron muy pocos fagos del compartimento del LCR, lo que indica un fondo bajo para la migración de fagos de tipo salvaje al compartimento del LCR (Fig. 3 complementaria).En promedio, solo alrededor de 1 x 10-3 % de los títulos de fagos T7 en la sangre y 4 x 10-8 % de los fagos infundidos inicialmente se detectaron en el líquido cefalorraquídeo durante todo el período de muestreo (0-250 min).En particular, la vida media (25,7 min) del fago de tipo salvaje en el líquido cefalorraquídeo fue similar a la observada en la sangre.Estos datos demuestran que la barrera que separa el compartimento del LCR de la sangre está intacta en ratas canuladas con CM, lo que permite la selección in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clones que se transportan fácilmente desde la sangre al compartimento del LCR.
(a) Establecer un método para volver a tomar muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de un grupo grande.(b) Diagrama que muestra la ubicación celular de la barrera del sistema nervioso central (SNC) y la estrategia de selección utilizada para identificar péptidos que cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la barrera hematoencefálica.( c ) Diagrama de flujo de selección de visualización de fagos in vivo .En cada ronda de selección, los fagos (identificadores de animales dentro de las flechas) se inyectaron por vía intravenosa.Dos ramas alternativas independientes (A, B) se mantienen separadas hasta la 4ª ronda de selección.Para las rondas de selección 3 y 4, cada clon de fago extraído del LCR se secuenció manualmente.(d) Cinética del fago aislado de sangre (círculos rojos) y líquido cefalorraquídeo (triángulos verdes) durante la primera ronda de selección en dos ratas canuladas después de la inyección intravenosa de la biblioteca de péptidos T7 (2 x 1012 fagos/animal).Los cuadrados azules indican la concentración inicial promedio de fagos en la sangre, calculada a partir de la cantidad de fagos inyectados, teniendo en cuenta el volumen total de sangre.Los cuadrados negros indican el punto de intersección de la línea y extrapolada de las concentraciones de fagos en sangre.( e, f ) Presente la frecuencia relativa y la distribución de todos los posibles motivos tripeptídicos superpuestos que se encuentran en el péptido.Se muestra el número de motivos encontrados en 1000 lecturas.Significativamente (p < 0,001) los motivos enriquecidos están marcados con puntos rojos.(e) Diagrama de dispersión de correlación que compara la frecuencia relativa del motivo tripéptido de la biblioteca inyectada con el fago derivado de la sangre de los animales #1.1 y #1.2.( f ) Diagrama de dispersión de correlación que compara las frecuencias relativas de los motivos de tripéptidos de fagos animales # 1.1 y # 1.2 aislados en sangre y líquido cefalorraquídeo.(g, h) Representación de ID de secuencia de fago enriquecido en sangre (g) frente a bibliotecas inyectadas y fago enriquecido en LCR (h) frente a sangre después de una ronda de selección in vivo en ambos animales.El tamaño del código de una letra indica con qué frecuencia aparece ese aminoácido en esa posición.Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, rojo = ácido y negro = aminoácidos hidrofóbicos.La figura 1a, b fue diseñada y producida por Eduard Urich.
Inyectamos una biblioteca de péptidos de fagos en dos ratas de instrumentos CM (clados A y B) y fagos aislados del líquido cefalorraquídeo y la sangre (Figura 1d).La rápida eliminación inicial de la biblioteca fue menos pronunciada en comparación con el fago de tipo salvaje.La semivida media de la biblioteca inyectada en ambos animales fue de 24,8 minutos en sangre, similar al fago de tipo salvaje, y de 38,5 minutos en LCR.Las muestras de fagos de sangre y líquido cefalorraquídeo de cada animal se sometieron a HTS y todos los péptidos identificados se analizaron para determinar la presencia de un motivo de tripéptido corto.Los motivos tripeptídicos se eligieron porque proporcionan una base mínima para la formación de estructuras y las interacciones péptido-proteína14,15.Encontramos una buena correlación en la distribución de motivos entre la biblioteca de fagos inyectados y los clones extraídos de la sangre de ambos animales (Fig. 1e).Los datos indican que la composición de la biblioteca está sólo marginalmente enriquecida en el compartimiento de sangre.Las frecuencias de aminoácidos y las secuencias de consenso se analizaron adicionalmente en cada posición utilizando una adaptación del software Weblogo16.Curiosamente, encontramos un fuerte enriquecimiento en los residuos de glicina en sangre (Fig. 1g).Cuando se comparó la sangre con clones seleccionados de LCR, se observó una fuerte selección y cierta deselección de motivos (Fig. 1f), y ciertos aminoácidos estaban preferentemente presentes en posiciones predeterminadas en los 12 miembros (Fig. 1h).En particular, los animales individuales diferían significativamente en el líquido cefalorraquídeo, mientras que en ambos animales se observó un enriquecimiento de glicina en la sangre (Fig. 4a-j complementaria).Después de un filtrado riguroso de los datos de secuencia en el líquido cefalorraquídeo de los animales n. ° 1.1 y n. ° 1.2, se obtuvieron un total de 964 y 420 péptidos 12-mer únicos (Figura complementaria 1d-e).Los clones de fagos aislados se amplificaron y se sometieron a una segunda ronda de selección in vivo.Los fagos extraídos de la segunda ronda de selección se sometieron a HTS en cada animal y todos los péptidos identificados se usaron como entrada para un programa de reconocimiento de motivos para analizar la aparición de motivos tripeptídicos (Fig. 2a, b, ef).En comparación con el primer ciclo del fago recuperado del LCR, observamos una mayor selección y deselección de muchos motivos en el LCR en las ramas A y B (Fig. 2).Se aplicó un algoritmo de identificación de redes para determinar si representaban diferentes patrones de secuencia consistente.Se observó una clara similitud entre las secuencias de 12 dimensiones recuperadas por LCR en el clado A alternativo (Fig. 2c, d) y el clado B (Fig. 2g, h).El análisis agrupado en cada rama reveló diferentes perfiles de selección para los péptidos de 12 unidades (Fig. 5c, d complementarias) y un aumento en la proporción de títulos en LCR/sangre a lo largo del tiempo para los clones agrupados después de la segunda ronda de selección en comparación con la primera ronda de selección (Fig. 5e complementaria).).
Enriquecimiento de motivos y péptidos en líquido cefalorraquídeo mediante dos rondas sucesivas de selección de presentación de fagos funcionales in vivo.
Todos los fagos de líquido cefalorraquídeo recuperados de la primera ronda de cada animal (animales n.º 1.1 y n.º 1.2) se agruparon, amplificaron, secuenciaron con HT y reinyectaron juntos (2 x 1010 fagos/animal) 2 ratas canuladas SM (n.º 1.1 → n.º).2.1 y 2.2, 1.2 → 2.3 y 2.4).(a, b, e, f) Gráficos de dispersión de correlación que comparan la frecuencia relativa de los motivos tripéptidos de todos los fagos derivados del LCR en la primera y segunda rondas de selección.Frecuencia relativa y distribución de motivos que representan todos los posibles tripéptidos superpuestos encontrados en péptidos en ambas orientaciones.Se muestra el número de motivos encontrados en 1000 lecturas.Los motivos que se seleccionaron o excluyeron significativamente (p < 0,001) en una de las bibliotecas comparadas se destacan con puntos rojos.(c, d, g, h) Representación del logotipo de secuencia de todas las secuencias largas de 12 aminoácidos ricas en LCR basadas en las rondas 2 y 1 de selección in vivo.El tamaño del código de una letra indica con qué frecuencia aparece ese aminoácido en esa posición.Para representar el logotipo, se compara la frecuencia de secuencias de LCR extraídas de animales individuales entre dos rondas de selección y se muestran las secuencias enriquecidas en la segunda ronda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 y (h) #1.2–#2.4.Los aminoácidos más enriquecidos en una posición dada en (c, d) animales no.2.1 y núm.2.2 o (g, h) en animales no.2.3 y núm.2.4 se muestran en color.Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, rojo = ácido y negro = aminoácidos hidrofóbicos.
Después de la tercera ronda de selección, identificamos 124 secuencias peptídicas únicas (# 3.1 y # 3.2) de 332 clones de fagos reconstituidos con LCR aislados de dos animales (Fig. 6a complementaria).La secuencia LGSVS (18,7 %) tuvo la mayor proporción relativa, seguida de los insertos de tipo salvaje PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) y SARGSWREIVSLS (2,2 %).En la cuarta ronda final, agrupamos dos ramas seleccionadas de forma independiente de tres animales separados (Fig. 1c).De los 925 clones de fagos secuenciados recuperados del LCR, en la cuarta ronda encontramos 64 secuencias peptídicas únicas (Fig. 6b complementaria), entre las cuales la proporción relativa de fagos de tipo salvaje se redujo al 0,8%.Los clones de LCR más comunes en la cuarta ronda fueron LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) y RLSSVDSDLSGC (3,2 %).%)).El rango de longitud de los péptidos seleccionados se debe a inserciones/eliminaciones de nucleótidos o codones de parada prematuros en los cebadores de la biblioteca cuando se usan codones degenerados para el diseño de la biblioteca NNK.Los codones de parada prematuros generan péptidos más cortos y se seleccionan porque contienen el motivo aa favorable.Los péptidos más largos pueden resultar de inserciones/deleciones en los cebadores de las bibliotecas sintéticas.Esto coloca el codón de parada diseñado fuera del marco y lo lee hasta que aparece un nuevo codón de parada aguas abajo.En general, calculamos los factores de enriquecimiento para las cuatro rondas de selección comparando los datos de entrada con los datos de salida de la muestra.Para la primera ronda de selección, utilizamos títulos de fagos de tipo salvaje como referencia de fondo no específica.Curiosamente, la selección de fagos negativos fue muy fuerte en el primer ciclo del LCR, pero no en la sangre (Fig. 3a), lo que puede deberse a la baja probabilidad de difusión pasiva de la mayoría de los miembros de la biblioteca de péptidos en el compartimento del LCR o a que los fagos relativos tienden a retenerse o eliminarse del torrente sanguíneo de manera más eficiente que los bacteriófagos.Sin embargo, en la segunda ronda de selección, se observó una fuerte selección de fagos en LCR en ambos clados, lo que sugiere que la ronda anterior se enriqueció en fagos que presentaban péptidos que promueven la captación de LCR (Fig. 3a).De nuevo, sin un enriquecimiento significativo de sangre.También en las rondas tercera y cuarta, los clones de fagos se enriquecieron significativamente en LCR.Al comparar la frecuencia relativa de cada secuencia peptídica única entre las dos últimas rondas de selección, encontramos que las secuencias se enriquecieron aún más en la cuarta ronda de selección (Fig. 3b).Se extrajo un total de 931 motivos tripeptídicos de las 64 secuencias peptídicas únicas utilizando ambas orientaciones peptídicas.Los motivos más enriquecidos en la cuarta ronda se examinaron más de cerca por sus perfiles de enriquecimiento en todas las rondas en comparación con la biblioteca inyectada (límite: 10% de enriquecimiento) (Fig. 6c complementaria).Los patrones generales de selección mostraron que la mayoría de los motivos estudiados se enriquecieron en todas las rondas anteriores de ambas ramas de selección.Sin embargo, algunos motivos (p. ej., SGL, VSG, LGS GSV) eran predominantemente del clado A alternativo, mientras que otros (p. ej., FGW, RTN, WGF, NTR) estaban enriquecidos en el clado B alternativo.
Validación del transporte en LCR de péptidos mostrados en fagos enriquecidos en LCR y péptidos líderes biotinilados conjugados con cargas útiles de estreptavidina.
(a) Proporciones de enriquecimiento calculadas en las cuatro rondas (R1-R4) basadas en títulos de fagos (PFU) inyectados (entrada = I) y títulos de fagos determinados en LCR (salida = O).Los factores de enriquecimiento para las últimas tres rondas (R2-R4) se calcularon por comparación con la ronda anterior y la primera ronda (R1) con datos de peso.Las barras abiertas son líquido cefalorraquídeo, las barras sombreadas son plasma.(***p<0,001, basado en la prueba t de Student).( b ) Lista de los péptidos de fagos más abundantes, clasificados según su proporción relativa a todos los fagos recolectados en LCR después de la ronda 4 de selección.Los seis clones de fagos más comunes están resaltados en color, numerados y sus factores de enriquecimiento entre las rondas 3 y 4 de selección (recuadros).( c, d ) Los seis clones de fagos más enriquecidos, fagos vacíos y bibliotecas de péptidos de fagos parentales de la ronda 4 se analizaron individualmente en un modelo de muestreo de LCR.Se recogieron muestras de LCR y de sangre en los puntos de tiempo indicados.(c) Cantidades iguales de 6 clones de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animales), fagos vacíos (n.º 1779) (2 x 1010 fagos/animales) y bibliotecas de péptidos de fagos stock (2 x 1012 fagos/animales) Inyectar al menos 3 CM al animal canulado por separado a través de la vena de la cola.Se muestra la farmacocinética del LCR de cada clon de fago inyectado y biblioteca de péptidos de fago a lo largo del tiempo.(d) muestra la proporción promedio de LCR/sangre para todos los fagos/mL recuperados durante el tiempo de muestreo.(e) Cuatro péptidos líderes sintéticos y un control codificado se unieron con biotina a estreptavidina a través de su extremo N (presentación de tetrámero) seguido de inyección (vena de la cola iv, 10 mg de estreptavidina/kg).Al menos tres ratas intubadas (N = 3).).Las muestras de LCR se recogieron en los puntos de tiempo indicados y las concentraciones de estreptavidina se midieron mediante ELISA anti-estreptavidina en LCR (nd = no detectado).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basado en la prueba ANOVA).(f) Comparación de la secuencia de aminoácidos del clon de péptido de fago más enriquecido #2002 (púrpura) con otros clones de péptido de fago seleccionados de la cuarta ronda de selección.Los fragmentos de aminoácidos idénticos y similares están codificados por colores.
De todos los fagos enriquecidos en la cuarta ronda (Fig. 3b), se seleccionaron seis clones candidatos para un análisis individual adicional en el modelo de muestreo de LCR.Se inyectaron cantidades iguales de seis fagos candidatos, fagos vacíos (sin inserto) y bibliotecas de péptidos de profagos en tres animales CM canulados, y se determinó la farmacocinética en LCR (Fig. 3c) y análisis de sangre (Fig. 7 complementaria).Todos los clones de fagos probados se dirigieron al compartimento del LCR a un nivel de 10 a 1000 veces mayor que el del fago de control vacío (#1779).Por ejemplo, los clones #2020 y #2077 tenían títulos de LCR aproximadamente 1000 veces más altos que el fago de control.El perfil farmacocinético de cada péptido seleccionado es diferente, pero todos ellos tienen una alta capacidad de localización en el LCR.Observamos una disminución constante a lo largo del tiempo para los clones #1903 y #2011, mientras que para los clones #2077, #2002 y #2009 un aumento durante los primeros 10 minutos podría indicar transporte activo, pero debe verificarse.Los clones n.° 2020, n.° 2002 y n.° 2077 se estabilizaron en niveles altos, mientras que la concentración en LCR del clon n.° 2009 disminuyó lentamente después del aumento inicial.Luego comparamos la frecuencia relativa de cada candidato a LCR con su concentración en sangre (Fig. 3d).La correlación del título medio de cada candidato a LCR con su título en sangre en todos los tiempos de muestreo mostró que tres de los seis candidatos estaban significativamente enriquecidos en LCR en sangre.Curiosamente, el clon n.º 2077 mostró una mayor estabilidad sanguínea (Figura 7 complementaria).Para confirmar que los propios péptidos son capaces de transportar activamente carga distinta de las partículas de fago al compartimento del LCR, sintetizamos cuatro péptidos líderes derivatizados con biotina en el extremo N donde los péptidos se unen a la partícula de fago.Los péptidos biotinilados (núms. 2002, 2009, 2020 y 2077) se conjugaron con estreptavidina (SA) para obtener formas multiméricas que imitaban algo la geometría del fago.Este formato también nos permitió medir la exposición de SA en sangre y líquido cefalorraquídeo como péptidos de proteínas transportadoras de carga.Es importante destacar que los datos de fagos a menudo se pueden reproducir cuando se administran péptidos sintéticos en este formato conjugado con SA (Fig. 3e).Los péptidos revueltos tuvieron una exposición inicial menor y una eliminación del LCR más rápida con niveles indetectables dentro de las 48 horas.Para obtener información sobre las vías de administración de estos clones de fagos peptídicos en el espacio del LCR, analizamos la localización de los hits peptídicos de fagos individuales mediante inmunohistoquímica (IHC) para detectar directamente las partículas de fagos 1 hora después de la inyección intravenosa in vivo.En particular, los clones n.° 2002, n.° 2077 y n.° 2009 pudieron detectarse mediante una fuerte tinción en los capilares cerebrales, mientras que el fago de control (n.° 1779) y el clon n.° 2020 no se detectaron (Figura 8 complementaria).Esto sugiere que estos péptidos contribuyen al efecto sobre el cerebro precisamente al cruzar la BHE.Se requiere un análisis más detallado para probar esta hipótesis, ya que la ruta BSCFB también puede estar involucrada.Al comparar la secuencia de aminoácidos del clon más enriquecido (#2002) con otros péptidos seleccionados, se observó que algunos de ellos tienen extensiones de aminoácidos similares, lo que puede indicar un mecanismo de transporte similar (Fig. 3f).
Debido a su perfil plasmático único y al aumento significativo de LCR con el tiempo, el clon de visualización de fagos n.° 2077 se exploró más a fondo durante un período más largo de 48 horas y pudo reproducir el rápido aumento de LCR observado en asociación con niveles sostenidos de SA (Fig. 4a).Con respecto a otros clones de fagos identificados, #2077 se tiñó fuertemente para los capilares cerebrales y mostró una colocalización significativa con lectina marcadora capilar cuando se vio a una resolución más alta y posiblemente algo de tinción en el espacio parenquimatoso (Figura 4b).Para investigar si se podían obtener efectos farmacológicos mediados por péptidos en el SNC, realizamos un experimento en el que se mezclaron versiones biotiniladas de i) el péptido de tránsito #2077 y ii) el péptido inhibidor de BACE1 con SA en dos proporciones diferentes.Para una combinación usamos solo el inhibidor del péptido BACE1 y para la otra usamos una proporción de 1:3 del inhibidor del péptido BACE1 al péptido #2077.Ambas muestras se administraron por vía intravenosa y se midieron los niveles de péptido beta-amiloide 40 (Abeta40) en sangre y líquido cefalorraquídeo a lo largo del tiempo.Abeta40 se midió en LCR ya que refleja la inhibición de BACE1 en el parénquima cerebral.Como era de esperar, ambos complejos redujeron significativamente los niveles en sangre de Abeta40 (Fig. 4c, d).Sin embargo, solo las muestras que contienen una mezcla del péptido no.2077 y un inhibidor del péptido BACE1 conjugado con SA provocaron una disminución significativa de Abeta40 en el líquido cefalorraquídeo (Fig. 4c).Los datos muestran que el péptido no.2077 es capaz de transportar la proteína SA de 60 kDa al SNC y también induce efectos farmacológicos con inhibidores del péptido BACE1 conjugados con SA.
(a) Inyección clonal (2 × 10 fagos/animal) de fago T7 que muestra perfiles farmacocinéticos a largo plazo del péptido CSF ​​n.º 2077 (RLSSVDSDLSGC) y fago de control no inyectado (n.º 1779) en al menos tres ratas intubadas con CM.(b) Imagen microscópica confocal de microvasos corticales representativos en ratas inyectadas con fagos (2 × 10 10 fagos/animal) que muestra contratinción del péptido #2077 y vasos (lectina).Estos clones de fagos se administraron a 3 ratas y se dejaron circular durante 1 hora antes de la perfusión.Los cerebros se seccionaron y se tiñeron con anticuerpos policlonales marcados con FITC contra la cápside del fago T7.Diez minutos antes de la perfusión y posterior fijación, se administró por vía intravenosa lectina marcada con DyLight594.Imágenes fluorescentes que muestran tinción con lectina (rojo) del lado luminal de microvasos y fagos (verde) en la luz de los capilares y tejido cerebral perivascular.La barra de escala corresponde a 10 µm.(c, d) El péptido inhibidor de BACE1 biotinilado solo o en combinación con el péptido de tránsito biotinilado #2077 se acopló a estreptavidina seguido de una inyección intravenosa de al menos tres ratas CM canuladas (10 mg de estreptavidina/kg).La reducción mediada por el inhibidor del péptido BACE1 en Aβ40 se midió mediante ELISA Aβ1-40 en sangre (rojo) y líquido cefalorraquídeo (naranja) en los puntos de tiempo indicados.Para una mayor claridad, se dibuja una línea de puntos en el gráfico a una escala del 100 %.(c) Reducción porcentual de Aβ40 en sangre (triángulos rojos) y líquido cefalorraquídeo (triángulos naranjas) en ratas tratadas con estreptavidina conjugada con el péptido de tránsito #2077 y el péptido inhibidor BACE1 en una proporción de 3:1.( d ) Reducción porcentual en sangre Aβ40 (círculos rojos) y líquido cefalorraquídeo (círculos naranjas) de ratas tratadas con estreptavidina acoplada a un péptido inhibidor de BACE1 solo.La concentración de Aβ en el control fue de 420 pg/ml (desviación estándar = 101 pg/ml).
La visualización de fagos se ha aplicado con éxito en varias áreas de la investigación biomédica17.Este método se ha utilizado para estudios de diversidad vascular in vivo18,19, así como estudios dirigidos a vasos cerebrales20,21,22,23,24,25,26.En este estudio, extendimos la aplicación de este método de selección no solo a la identificación directa de péptidos dirigidos a vasos cerebrales, sino también al descubrimiento de candidatos con propiedades de transporte activo para cruzar la barrera hematoencefálica.Ahora describimos el desarrollo de un procedimiento de selección in vivo en ratas intubadas con CM y demostramos su potencial para identificar péptidos con propiedades de orientación del LCR.Utilizando el fago T7 que muestra una biblioteca de péptidos aleatorios de 12 unidades, pudimos demostrar que el fago T7 es lo suficientemente pequeño (aproximadamente 60 nm de diámetro)10 para adaptarse a la barrera hematoencefálica, cruzando así directamente la barrera hematoencefálica o el plexo coroideo.Observamos que la recolección de LCR de ratas CM canuladas fue un método de detección funcional in vivo bien controlado, y que el fago extraído no solo se unió a la vasculatura sino que también funcionó como un transportador a través de la barrera hematoencefálica.Además, al recolectar sangre y aplicar simultáneamente HTS al LCR y fagos derivados de la sangre, confirmamos que nuestra elección de LCR no estuvo influenciada por el enriquecimiento de la sangre o la aptitud para la expansión entre rondas de selección.Sin embargo, el compartimiento de la sangre es parte del procedimiento de selección, ya que los fagos capaces de alcanzar el compartimiento del LCR deben sobrevivir y circular en el torrente sanguíneo el tiempo suficiente para enriquecerse en el cerebro.Con el fin de extraer información de secuencia confiable de los datos HTS sin procesar, implementamos filtros adaptados a los errores de secuenciación específicos de la plataforma en el flujo de trabajo de análisis.Al incorporar parámetros cinéticos en el método de detección, confirmamos la farmacocinética rápida de los fagos T7 de tipo salvaje (t½ ~ 28 min) en sangre24, 27, 28 y también determinamos su vida media en líquido cefalorraquídeo (t½ ~ 26 min) por minuto).A pesar de perfiles farmacocinéticos similares en sangre y LCR, solo el 0,001 % de la concentración de fagos en sangre pudo detectarse en LCR, lo que indica una baja movilidad de fondo del fago T7 de tipo salvaje a través de la barrera hematoencefálica.Este trabajo destaca la importancia de la primera ronda de selección cuando se utilizan estrategias de selección in vivo, especialmente para los sistemas de fagos que se eliminan rápidamente de la circulación, ya que pocos clones pueden llegar al compartimento del SNC.Por lo tanto, en la primera ronda, la reducción en la diversidad de la biblioteca fue muy grande, ya que finalmente solo se recolectó un número limitado de clones en este modelo CSF ​​muy estricto.Esta estrategia de selección in vivo incluyó varios pasos de selección, como la acumulación activa en el compartimento del LCR, la supervivencia de los clones en el compartimento de la sangre y la eliminación rápida de los clones del fago T7 de la sangre en los primeros 10 minutos (Fig. 1d y Suplementario Fig. 4M).).Por lo tanto, después de la primera ronda, se identificaron diferentes clones de fagos en LCR, aunque se usó el mismo grupo inicial para animales individuales.Esto sugiere que múltiples pasos estrictos de selección para bibliotecas de origen con un gran número de miembros de la biblioteca dan como resultado una reducción significativa de la diversidad.Por lo tanto, los eventos aleatorios se convertirán en una parte integral del proceso de selección inicial, lo que influirá en gran medida en el resultado.Es probable que muchos de los clones de la biblioteca original tuvieran una propensión al enriquecimiento del LCR muy similar.Sin embargo, incluso bajo las mismas condiciones experimentales, los resultados de la selección pueden diferir debido al pequeño número de cada clon particular en el grupo inicial.
Los motivos enriquecidos en LCR difieren de los de la sangre.Curiosamente, notamos el primer cambio hacia péptidos ricos en glicina en la sangre de animales individuales.(Fig. 1g, Figs. complementarias 4e, 4f).Los fagos que contienen péptidos de glicina pueden ser más estables y es menos probable que se eliminen de la circulación.Sin embargo, estos péptidos ricos en glicina no se detectaron en las muestras de líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que las bibliotecas seleccionadas pasaron por dos pasos de selección diferentes: uno en la sangre y otro que se dejó acumular en el líquido cefalorraquídeo.Los clones enriquecidos con LCR resultantes de la cuarta ronda de selección se han probado exhaustivamente.Se confirmó que casi todos los clones probados individualmente estaban enriquecidos en CSF en comparación con el fago de control en blanco.Se examinó con más detalle un éxito de péptido (nº 2077).Mostró una vida media plasmática más larga en comparación con otros éxitos (Figura 3d y Figura complementaria 7) y, curiosamente, este péptido contenía un residuo de cisteína en el extremo C-terminal.Recientemente se ha demostrado que la adición de cisteína a los péptidos puede mejorar sus propiedades farmacocinéticas al unirse a la albúmina 29 .Esto es actualmente desconocido para el péptido #2077 y requiere más estudio.Algunos péptidos mostraron una dependencia de la valencia en el enriquecimiento del LCR (datos no mostrados), lo que puede estar relacionado con la geometría de la superficie mostrada de la cápside T7.El sistema T7 que usamos mostró 5-15 copias de cada péptido por partícula de fago.La IHC se realizó en clones de fagos principales candidatos inyectados por vía intravenosa en la corteza cerebral de ratas (Fig. 8 complementaria).Los datos mostraron que al menos tres clones (No. 2002, No. 2009 y No. 2077) interactuaron con BBB.Queda por determinar si esta interacción BBB da como resultado la acumulación de CSF o el movimiento de estos clones directamente al BCSFB.Es importante destacar que mostramos que los péptidos seleccionados conservan su capacidad de transporte de CSF cuando se sintetizan y se unen a la carga de proteínas.La unión de péptidos biotinilados N-terminales a SA esencialmente repite los resultados obtenidos con sus respectivos clones de fagos en sangre y líquido cefalorraquídeo (Fig. 3e).Finalmente, mostramos que el péptido principal n.º 2077 puede promover la acción cerebral de un inhibidor peptídico biotinilado de BACE1 conjugado con SA, lo que provoca efectos farmacodinámicos pronunciados en el SNC al reducir significativamente los niveles de Abeta40 en el LCR (Fig. 4).No pudimos identificar ningún homólogo en la base de datos realizando una búsqueda de homología de secuencia peptídica de todos los resultados.Es importante tener en cuenta que el tamaño de la biblioteca T7 es de aproximadamente 109, mientras que el tamaño teórico de la biblioteca para 12 meros es 4 x 1015. Por lo tanto, solo seleccionamos una pequeña fracción del espacio de diversidad de la biblioteca de péptidos de 12 meros, lo que puede significar que se pueden identificar péptidos más optimizados al evaluar el espacio de secuencia adyacente de estos éxitos identificados.Hipotéticamente, una de las razones por las que no hemos encontrado ningún homólogo natural de estos péptidos puede ser la deselección durante la evolución para evitar la entrada incontrolada de ciertos motivos peptídicos en el cerebro.
En conjunto, nuestros resultados proporcionan una base para el trabajo futuro para identificar y caracterizar los sistemas de transporte de la barrera cerebrovascular in vivo con más detalle.La configuración básica de este método se basa en una estrategia de selección funcional que no solo identifica clones con propiedades de unión vascular cerebral, sino que también incluye un paso crítico en el que los clones exitosos tienen actividad intrínseca para cruzar barreras biológicas in vivo hacia el compartimento del SNC.es dilucidar el mecanismo de transporte de estos péptidos y su preferencia por unirse a la microvasculatura específica de la región cerebral.Esto puede conducir al descubrimiento de nuevas vías para el transporte de la BBB y los receptores.Esperamos que los péptidos identificados puedan unirse directamente a los receptores cerebrovasculares oa los ligandos circulantes transportados a través de la BBB o BCSFB.Los vectores de péptidos con actividad de transporte de LCR descubiertos en este trabajo se investigarán más a fondo.Actualmente estamos investigando la especificidad cerebral de estos péptidos por su capacidad para cruzar la BBB y/o BCSFB.Estos nuevos péptidos serán herramientas extremadamente valiosas para el descubrimiento potencial de nuevos receptores o vías y para el desarrollo de nuevas plataformas altamente eficientes para el suministro de macromoléculas, como productos biológicos, al cerebro.
Canule la cisterna grande (CM) usando una modificación del método descrito anteriormente.Se montaron ratas Wistar anestesiadas (200-350 g) en un aparato estereotáxico y se realizó una incisión mediana sobre el cuero cabelludo afeitado y preparado asépticamente para exponer el cráneo.Taladre dos agujeros en la zona de la hoja superior y fije los tornillos de fijación en los agujeros.Se perforó un orificio adicional en la cresta occipital lateral para la guía estereotáctica de una cánula de acero inoxidable en el CM.Aplique cemento dental alrededor de la cánula y asegúrelo con tornillos.Después del fotocurado y endurecimiento del cemento, la herida de la piel se cerró con sutura supramedia 4/0.La colocación correcta de la cánula se confirma mediante la fuga espontánea de líquido cefalorraquídeo (LCR).Retire la rata del aparato estereotáxico, reciba el cuidado postoperatorio adecuado y control del dolor, y permita que se recupere durante al menos una semana hasta que se observen signos de sangre en el líquido cefalorraquídeo.Se obtuvieron ratas Wistar (Crl:WI/Han) de Charles River (Francia).Todas las ratas se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos.Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina Veterinaria de la Ciudad de Basilea, Suiza, y se realizaron de acuerdo con la Licencia Animal No. 2474 (Evaluación del Transporte Cerebral Activo mediante la Medición de Niveles de Candidatos Terapéuticos en el Líquido Cefalorraquídeo y Cerebro de Rata).
Mantenga suavemente la rata consciente con la cánula CM en la mano.Retire Datura de la cánula y recoja 10 l de líquido cefalorraquídeo que fluya espontáneamente.Dado que la permeabilidad de la cánula finalmente se vio comprometida, en este estudio solo se incluyeron muestras claras de líquido cefalorraquídeo sin evidencia de contaminación con sangre o decoloración.Paralelamente, se extrajeron aproximadamente 10-20 μl de sangre de una pequeña incisión en la punta de la cola en tubos con heparina (Sigma-Aldrich).Se recogieron LCR y sangre en varios puntos de tiempo después de la inyección intravenosa de fago T7.Se descartaron aproximadamente de 5 a 10 μl de líquido antes de recolectar cada muestra de LCR, lo que corresponde al volumen muerto del catéter.
Las bibliotecas se generaron usando el vector T7Select 10-3b como se describe en el manual del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Brevemente, se sintetizó un inserto de ADN aleatorio de 12 unidades en el siguiente formato:
El codón NNK se usó para evitar los codones de terminación doble y la sobreexpresión de aminoácidos en el inserto.N es una proporción equimolar mezclada manualmente de cada nucleótido, y K es una proporción equimolar mezclada manualmente de nucleótidos de adenina y citosina.Las regiones monocatenarias se convirtieron en ADN bicatenario mediante incubación adicional con dNTP (Novagen) y enzima Klenow (New England Biolabs) en tampón Klenow (New England Biolabs) durante 3 horas a 37°C.Después de la reacción, se recuperó el ADN bicatenario mediante precipitación con EtOH.El ADN resultante se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII (ambas de Roche).El inserto escindido y purificado (QIAquick, Qiagen) (ligasa T4, New England Biolabs) se ligó luego en marco en un vector T7 preescindido después del aminoácido 348 del gen de la cápside 10B.Las reacciones de ligación se incubaron a 16 ºC durante 18 horas antes del envasado in vitro.El empaquetamiento de fagos in vitro se realizó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit de clonación T7Select 10-3b (Novagen) y la solución de empaquetamiento se amplificó una vez para lisis usando Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Los lisados ​​se centrifugaron, valoraron y congelaron a -80 ºC como solución madre de glicerol.
Amplificación directa por PCR de regiones variables de fagos amplificadas en caldo o placa utilizando cebadores de fusión 454/Roche-amplicón patentados.El cebador de fusión directa contiene secuencias que flanquean la región variable (NNK) 12 (específica de la plantilla), el adaptador A de titanio GS FLX y una secuencia clave de biblioteca de cuatro bases (TCAG) (Figura complementaria 1a):
El cebador de fusión inversa también contiene biotina unida a las perlas de captura y el adaptador B de titanio GS FLX necesario para la amplificación clonal durante la PCR en emulsión:
A continuación, los amplicones se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche según el protocolo 454 GS-FLX Titanium.Para la secuenciación manual de Sanger (Analizador de ADN Hitachi 3730 xl de Applied Biosystems), el ADN del fago T7 se amplificó mediante PCR y se secuenció con los siguientes pares de cebadores:
Los insertos de placas individuales se sometieron a amplificación por PCR utilizando el kit Roche Fast Start DNA Polymerase (según las instrucciones del fabricante).Realice un arranque en caliente (10 min a 95 °C) y 35 ciclos de refuerzo (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C y 1 min a 72 °C).
Se amplificaron fagos de bibliotecas, fagos de tipo salvaje, fagos rescatados de LCR y sangre o clones individuales en Escherichia coli BL5615 en caldo TB (Sigma Aldrich) o en placas de 500 cm2 (Thermo Scientific) durante 4 h a 37 °C.Los fagos se extrajeron de las placas lavando las placas con tampón Tris-EDTA (Fluka Analytical) o recogiendo las placas con puntas de pipeta estériles.Los fagos se aislaron del sobrenadante del cultivo o del tampón de extracción con una ronda de precipitación con polietilenglicol (PEG 8000) (Promega) y se resuspendieron en tampón Tris-EDTA.
El fago amplificado se sometió a 2-3 rondas de eliminación de endotoxinas utilizando perlas de eliminación de endotoxinas (Miltenyi Biotec) antes de la inyección intravenosa (IV) (500 µl/animal).En la primera ronda, se introdujeron 2x1012 fagos;en el segundo, 2x1010 fagos;en la tercera y cuarta ronda de selección, 2x109 fagos por animal.El contenido de fagos en LCR y muestras de sangre recogidas en los puntos de tiempo indicados se determinó mediante recuento de placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (manual del sistema T7Select).La selección de fagos se realizó mediante inyección intravenosa de bibliotecas purificadas en la vena de la cola o mediante reinyección de fagos extraídos del LCR de la ronda de selección anterior, y las cosechas posteriores se realizaron a los 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min y 240 min, respectivamente, muestras de LCR y sangre.Se realizaron un total de cuatro rondas de panning in vivo en las que las dos ramas seleccionadas se almacenaron y analizaron por separado durante las primeras tres rondas de selección.Todos los insertos de fagos extraídos del LCR de las dos primeras rondas de selección se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche, mientras que todos los clones extraídos del LCR de las dos últimas rondas de selección se secuenciaron manualmente.Todos los fagos sanguíneos de la primera ronda de selección también se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche.Para la inyección de clones de fagos, se amplificaron fagos seleccionados en E. coli (BL5615) en placas de 500 cm2 a 37°C durante 4 horas.Los clones seleccionados individualmente y secuenciados manualmente se propagaron en medio TB.Después de la extracción del fago, la purificación y la eliminación de la endotoxina (como se describe anteriormente), se inyectaron por vía intravenosa 2 x 1010 fagos/animal en 300 µl en una vena de la cola.
Preprocesamiento y filtrado cualitativo de datos de secuencia.Los datos sin procesar de 454/Roche se convirtieron de un formato de mapa de flujo estándar binario (sff) a un formato legible por humanos de Pearson (fasta) utilizando el software del proveedor.El procesamiento adicional de la secuencia de nucleótidos se realizó utilizando programas y secuencias de comandos C patentados (paquete de software inédito) como se describe a continuación.El análisis de datos primarios incluye estrictos procedimientos de filtrado en varias etapas.Para filtrar las lecturas que no contenían una secuencia de ADN de inserción 12mer válida, las lecturas se alinearon secuencialmente con la etiqueta de inicio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), la etiqueta de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) y la inserción de fondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizando la prueba global de Needleman-Wunsch.alineación que permite hasta 2 inconsistencias por alineación31.Por lo tanto, se eliminaron de la biblioteca las lecturas sin etiquetas de inicio y finalización y las lecturas que contenían inserciones en segundo plano, es decir, alineaciones que superaban el número permitido de discrepancias.En cuanto a las lecturas restantes, la secuencia de ADN N-mer que se extiende desde la marca de inicio y termina antes de la marca de parada se eliminó de la secuencia de lectura original y se procesó más (en lo sucesivo, "inserción").Después de la traducción del inserto, la parte posterior al primer codón de parada en el extremo 5' del cebador se elimina del inserto.Además, también se eliminaron los nucleótidos que conducían a codones incompletos en el extremo 3' del cebador.Para excluir las inserciones que contenían solo secuencias de fondo, también se eliminaron las inserciones traducidas que comenzaban con el patrón de aminoácidos "PAG".Los péptidos con una longitud postraduccional de menos de 3 aminoácidos se eliminaron de la biblioteca.Finalmente, elimine la redundancia en el conjunto de inserciones y determine la frecuencia de cada inserción única.Los resultados de este análisis incluyeron una lista de secuencias de nucleótidos (insertos) y sus frecuencias (de lectura) (Figuras complementarias 1c y 2).
Agrupe los insertos de ADN N-mer por similitud de secuencia: para eliminar errores de secuenciación específicos de 454/Roche (como problemas con la secuenciación de extensiones de homopolímero) y eliminar redundancias menos importantes, los insertos de secuencia de ADN N-mer previamente filtrados (insertos) se ordenan por similitud.inserciones (se permiten hasta 2 bases que no coinciden) usando un algoritmo iterativo definido de la siguiente manera: las inserciones se ordenan primero por su frecuencia (de mayor a menor), y si son iguales, por su ordenación secundaria por longitud (de mayor a menor)).Así, las inserciones más frecuentes y más largas definen el primer “grupo”.La frecuencia del grupo se establece en la frecuencia clave.Luego, cada inserción restante en la lista ordenada se intentó agregar al grupo mediante la alineación por parejas de Needleman-Wunsch.Si el número de discrepancias, inserciones o eliminaciones en una alineación no supera un umbral de 2, se agrega una inserción al grupo y la frecuencia general del grupo aumenta según la frecuencia con la que se agregó la inserción.Las inserciones añadidas a un grupo se marcan como usadas y se excluyen del procesamiento posterior.Si la secuencia de inserción no se puede agregar a un grupo ya existente, la secuencia de inserción se usa para crear un nuevo grupo con la frecuencia de inserción adecuada y se marca como usado.La iteración finaliza cuando cada secuencia de inserción se ha utilizado para formar un nuevo grupo o se puede incluir en un grupo ya existente.Después de todo, las inserciones agrupadas que consisten en nucleótidos finalmente se traducen en secuencias de péptidos (bibliotecas de péptidos).El resultado de este análisis es un conjunto de inserciones y sus frecuencias correspondientes que conforman el número de lecturas consecutivas (Figura 2 complementaria).
Generación de motivos: en base a una lista de péptidos únicos, se creó una biblioteca que contenía todos los patrones de aminoácidos (aa) posibles, como se muestra a continuación.Cada patrón posible de longitud 3 se extrajo del péptido y se añadió su patrón inverso junto con una biblioteca de motivos común que contenía todos los patrones (tripéptidos).Se secuenciaron bibliotecas de motivos altamente repetitivos y se eliminó la redundancia.Luego, para cada tripéptido en la biblioteca de motivos, verificamos su presencia en la biblioteca utilizando herramientas computacionales.En este caso, la frecuencia del péptido que contiene el tripéptido motivo encontrado se suma y se asigna al motivo en la biblioteca de motivos ("número de motivos").El resultado de la generación de motivos es una matriz bidimensional que contiene todas las apariciones de tripéptidos (motivos) y sus respectivos valores, que son el número de lecturas de secuenciación que dan como resultado el motivo correspondiente cuando las lecturas se filtran, agrupan y traducen.Métricas como se describe en detalle anteriormente.
Normalización del número de motivos y diagramas de dispersión correspondientes: el número de motivos para cada muestra se normalizó utilizando
donde ni es el número de lecturas que contienen el tema i.Por tanto, vi representa la frecuencia porcentual de lecturas (o péptidos) que contienen el motivo i en la muestra.Los valores de P para el número no normalizado de motivos se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher.En cuanto a los correlogramas del número de motivos, se calcularon las correlaciones de Spearman utilizando el número de motivos normalizado con R.
Para visualizar el contenido de aminoácidos en cada posición en la biblioteca de péptidos, se crearon los logogramas web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Primero, el contenido de aminoácidos en cada posición del péptido 12-mer se almacena en una matriz de 20x12.Luego, se genera un conjunto de 1000 péptidos que contienen el mismo contenido relativo de aminoácidos en cada posición en formato de secuencia fasta y se proporciona como entrada al web-logo 3, que genera una representación gráfica del contenido relativo de aminoácidos en cada posición.para una biblioteca de péptidos dada.Para visualizar conjuntos de datos multidimensionales, se crearon mapas de calor usando una herramienta desarrollada internamente en R (biosHeatmap, un paquete de R aún por lanzar).Los dendogramas presentados en los mapas de calor se calcularon utilizando el método de agrupación jerárquica de Ward con la métrica de distancia euclidiana.Para el análisis estadístico de los datos de puntuación del motivo, los valores de P para la puntuación no normalizada se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher.Los valores de p para otros conjuntos de datos se calcularon en R utilizando la prueba t de Student o ANOVA.
Los clones de fagos seleccionados y los fagos sin insertos se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola (2 x 1010 fagos/animal en 300 µl de PBS).Diez minutos antes de la perfusión y posterior fijación, a los mismos animales se les inyectaron por vía intravenosa 100 μl de lectina marcada con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutos después de la inyección del fago, se perfundió a las ratas a través del corazón con 50 ml de PBS seguido de 50 ml de PFA al 4%/PBS.Las muestras de cerebro se fijaron adicionalmente durante la noche en PFA/PBS al 4 % y se sumergieron en sacarosa al 30 % durante la noche a 4 °C.Las muestras se congelan instantáneamente en la mezcla OCT.El análisis inmunohistoquímico de muestras congeladas se realizó a temperatura ambiente en criosecciones de 30 µm bloqueadas con BSA al 1 % e incubadas con anticuerpos policlonales marcados con FITC contra el fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C.Incubar durante la noche.Finalmente, las secciones se lavaron 3 veces con PBS y se examinaron con un microscopio láser confocal (Leica TCS SP5).
Todos los péptidos con una pureza mínima del 98% fueron sintetizados por GenScript USA, biotinilados y liofilizados.La biotina se une a través de un espaciador de glicina triple adicional en el extremo N-terminal.Compruebe todos los péptidos mediante espectrometría de masas.
La estreptavidina (Sigma S0677) se mezcló con un exceso equimolar de 5 veces de péptido biotinilado, péptido inhibidor de BACE1 biotinilado o una combinación (proporción 3:1) de péptido inhibidor de BACE1 biotinilado y péptido inhibidor de BACE1 en DMSO al 5–10 %/incubado en PBS.1 hora a temperatura ambiente antes de la inyección.Se inyectaron péptidos conjugados con estreptavidina por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg en una de las venas de la cola de ratas con cavidad cerebral.
La concentración de complejos de estreptavidina-péptido se evaluó mediante ELISA.Se recubrieron placas de microvaloración Nunc Maxisorp (Sigma) durante la noche a 4ºC con 1,5 µg/ml de anticuerpo anti-estreptavidina de ratón (Thermo, MA1-20011).Después del bloqueo (tampón de bloqueo: NaCL 140 nM, EDTA 5 mM, NP40 al 0,05 %, gelatina al 0,25 %, BSA al 1 %) a temperatura ambiente durante 2 horas, lavar la placa con Tween-20 al 0,05 %/PBS (tampón de lavado) durante 3 segundos. 15).A continuación, la placa se incubó durante la noche a 4 °C con anticuerpo de detección (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239).Después de tres pasos de lavado, se detectó estreptavidina mediante incubación en solución de sustrato TMB (Roche) durante un máximo de 20 min.Después de detener el desarrollo de color con H2SO4 1M, mida la absorbancia a 450 nm.
La función del complejo inhibidor de estreptavidina-péptido-BACE1 se evaluó mediante Aβ(1-40) ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante (Wako, 294-64701).Brevemente, las muestras de LCR se diluyeron en diluyente estándar (1:23) y se incubaron durante la noche a 4 °C en placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo de captura BNT77.Después de cinco pasos de lavado, se añadió el anticuerpo BA27 conjugado con HRP y se incubó durante 2 horas a 4 °C, seguido de cinco pasos de lavado.Aβ(1–40) se detectó mediante incubación en solución de TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de detener el desarrollo del color con la solución de parada, mida la absorbancia a 450 nm.Las muestras de plasma se sometieron a extracción en fase sólida antes de Aβ(1–40) ELISA.Se añadió plasma a DEA al 0,2 % (Sigma) en placas de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de lavar sucesivamente las placas SPE (Oasis, 186000679) con agua y metanol al 100 %, se añadieron muestras de plasma a las placas SPE y se eliminó todo el líquido.Las muestras se lavaron (primero con metanol al 5 % y luego con metanol al 30 %) y se eluyeron con NH4OH al 2 %/metanol al 90 %.Después de secar el eluato a 55 °C durante 99 min a una corriente constante de N2, las muestras se redujeron en diluyentes estándar y se midió Aβ(1–40) como se describe anteriormente.
Cómo citar este artículo: Urich, E. et al.Entrega de carga al cerebro utilizando péptidos de tránsito identificados in vivo.la ciencia.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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