Algunos temas de resolución de problemas de LC nunca están desactualizados, ya que existen problemas en la práctica de LC, incluso a medida que la tecnología de los instrumentos mejora con el tiempo. Hay muchas formas en las que pueden surgir problemas en un sistema LC y terminar en una forma de pico deficiente. Cuando surgen problemas relacionados con la forma del pico, una breve lista de posibles causas de estos resultados ayuda a simplificar nuestra experiencia de resolución de problemas.
Ha sido divertido escribir esta columna "Solución de problemas de LC" y pensar en temas cada mes, porque algunos temas nunca pasan de moda. Si bien en el campo de la investigación en cromatografía ciertos temas o ideas se vuelven obsoletos a medida que son reemplazados por ideas más nuevas y mejores, en el campo de la resolución de problemas, desde que apareció el primer artículo de resolución de problemas en esta revista (la LC Journal en ese momento), ya que algunos temas siguen siendo relevantes) en 1983 (1). En los últimos años, he centrado varias secciones de Resolución de problemas de LC en las tendencias contemporáneas que afectan a la cromatografía líquida (LC) (por ejemplo, la comparación relativa de nuestra comprensión del efecto de la presión en la retención [2] Nuevos avances) Nuestra interpretación de los resultados de LC y cómo solucionar problemas con los instrumentos de LC modernos. En la entrega de este mes, continúo mi serie (3), que comenzó en diciembre de 2021, que se centró en algunos de los temas de "vida o muerte" de la resolución de problemas de LC: elementos que son excelentes para cualquier solucionador de problemas son esenciales, sin importar la edad del sistema que estamos usando. El tema central de esta serie es muy relevante para el famoso cuadro mural "Guía de solución de problemas de LC" (4) del LCGC, colgado en muchos laboratorios. Para la tercera parte de esta serie, elegí centrarme en problemas relacionados con la forma o las características de los picos. Increíblemente, el cuadro mural enumera 44 posibles causas diferentes de una forma de pico deficiente. No podemos considerar todos estos problemas en detalle en un solo artículo, por lo que en esta primera entrega sobre el tema, me centraré en algunos de los que veo con más frecuencia. Espero que los usuarios de LC, jóvenes y mayores, encuentren algunos consejos y recordatorios útiles sobre este importante tema.
Cada vez más, respondo a las preguntas de resolución de problemas con "todo es posible". Esta respuesta puede parecer fácil cuando se consideran observaciones que son difíciles de interpretar, pero a menudo la encuentro apropiada. Con tantas causas posibles de una forma de pico deficiente, es importante mantener la mente abierta al considerar cuál podría ser el problema y poder priorizar las causas potenciales para comenzar nuestros esfuerzos de resolución de problemas, centrándonos en las posibilidades más comunes; este punto es muy importante.
Un paso clave en cualquier ejercicio de resolución de problemas, aunque creo que se subestima, es reconocer que existe un problema que debe resolverse. Reconocer que existe un problema a menudo significa reconocer que lo que le sucede a la herramienta es diferente de nuestras expectativas, las cuales están moldeadas por la teoría, el conocimiento empírico y la experiencia (5). La "forma del pico" a la que se hace referencia aquí en realidad no solo se refiere a la forma del pico (simétrico, asimétrico, liso, esponjoso, borde delantero, cola, etc.), sino también a la anchura. Nuestras expectativas para la forma real del pico son simples. La teoría (6) respalda la expectativa de los libros de texto de que, en la mayoría de los casos, los picos cromatográficos deben ser simétricos y ajustarse a la forma de una distribución gaussiana, como se muestra en la Figura 1a. Lo que esperamos de las anchuras de los picos es un tema más complejo, y lo abordaremos en un próximo artículo. Las otras formas de pico en la Figura 1 muestran algunas de las otras posibilidades que podrían observarse; en otras palabras, algunas de las formas en que las cosas podrían salir mal. En el resto de esta entrega, dedicaremos Es hora de discutir algunos ejemplos específicos de situaciones que pueden llevar a estos tipos de formas.
A veces no se observan picos en absoluto en el cromatograma donde se espera que se eluyan. El diagrama de pared anterior indica que la ausencia de un pico (asumiendo que la muestra realmente contiene el analito objetivo en una concentración que debería hacer que la respuesta del detector sea suficiente para verlo por encima del ruido) generalmente está relacionada con algún problema del instrumento o condiciones incorrectas de la fase móvil (si es que se observan). picos, generalmente demasiado "débiles"). Se puede encontrar una lista corta de posibles problemas y soluciones en esta categoría en la Tabla I.
Como se mencionó anteriormente, la cuestión de cuánto ensanchamiento de pico debe tolerarse antes de prestar atención e intentar solucionarlo es un tema complejo que abordaré en un artículo futuro. Mi experiencia es que un ensanchamiento de pico significativo a menudo viene acompañado de un cambio significativo en la forma del pico, y la cola de pico es más común que el pre-pico o la división. Sin embargo, los picos nominalmente simétricos también se ensanchan, lo que puede deberse a algunas razones diferentes:
Cada uno de estos problemas se ha analizado en detalle en ediciones anteriores de Solución de problemas de LC, y los lectores interesados ​​pueden consultar estos artículos para obtener información sobre las causas y las posibles soluciones. Más información.
La cola de pico, el frente de pico y la división pueden ser causados ​​por fenómenos químicos o físicos, y la lista de posibles soluciones a estos problemas varía ampliamente, dependiendo de si estamos tratando con un problema químico o físico. A menudo, al comparar los diferentes picos en un cromatograma, puede encontrar pistas importantes sobre cuál es el culpable. Si todos los picos en un cromatograma presentan formas similares, lo más probable es que la causa no sea física. Si solo uno o unos pocos picos se ven afectados, pero el resto se ven bien, lo más probable es que la causa sea química.
Las causas químicas de la cola de pico son demasiado complejas para analizarlas brevemente aquí. El lector interesado puede consultar la edición reciente de "LC Troubleshooting" para obtener una explicación más detallada (10). Sin embargo, una solución sencilla es reducir la masa del analito inyectado y observar si mejora la forma del pico. De ser así, es un buen indicio de que el problema es una "sobrecarga de masa". En este caso, el método debe limitarse a inyectar pequeñas masas de analito o modificar las condiciones cromatográficas para obtener picos con buena forma incluso inyectando masas mayores.
También hay muchas razones físicas potenciales para la cola de pico. Los lectores interesados ​​en una discusión detallada de las posibilidades pueden consultar otro número reciente de "LC Troubleshooting" (11). Una de las causas físicas más comunes de la cola de pico es una mala conexión en un punto entre el inyector y el detector (12). Un ejemplo extremo se muestra en la Figura 1d, obtenida en mi laboratorio hace unas semanas. En este caso, construimos un sistema con una nueva válvula de inyección que no habíamos usado antes e instalamos un bucle de inyección de pequeño volumen con una férula que había sido moldeada sobre un capilar de acero inoxidable. Después de algunos experimentos iniciales de resolución de problemas, nos dimos cuenta de que la profundidad del puerto en el estator de la válvula de inyección era mucho mayor de lo acostumbrado, lo que resultaba en un gran volumen muerto en la parte inferior del puerto. Este problema se resuelve fácilmente reemplazando el bucle de inyección con otro tubo, podemos ajustar la férula a la posición adecuada para eliminar el volumen muerto en la parte inferior del puerto.
Los frentes de pico como los que se muestran en la Figura 1e también pueden deberse a problemas físicos o químicos. Una causa física común del borde de entrada es que el lecho de partículas de la columna no está bien empaquetado o que las partículas se han reorganizado con el tiempo. Al igual que con la cola de pico causada por este fenómeno físico, la mejor manera de solucionarlo es reemplazar la columna y continuar. Fundamentalmente, las formas de pico del borde de entrada con origen químico a menudo surgen de lo que llamamos condiciones de retención "no lineales". En condiciones ideales (lineales), la cantidad de analito retenida por la fase estacionaria (de ahí el factor de retención) está linealmente relacionada con la concentración del analito en la columna. Cromatográficamente, esto significa que a medida que aumenta la masa de analito inyectada en la columna, el pico se vuelve más alto, pero no más ancho. Esta relación se rompe cuando el comportamiento de retención es no lineal, y los picos no solo se vuelven más altos sino también más anchos a medida que se inyecta más masa. Además, las formas no lineales determinan la forma de los picos cromatográficos, lo que resulta en bordes de entrada o de salida. Al igual que con la sobrecarga de masa que provoca colas de pico (10), el avance de pico causado por retención no lineal también se puede diagnosticar reduciendo la masa de analito inyectado. Si la forma del pico mejora, se debe modificar el método para no exceder la calidad de inyección que causa el borde delantero, o se deben cambiar las condiciones cromatográficas para minimizar este comportamiento.
A veces observamos lo que parece ser un pico "dividido", como se muestra en la Figura 1f. El primer paso para resolver este problema es determinar si la forma del pico se debe a una coelución parcial (es decir, la presencia de dos compuestos distintos pero que eluyen cerca). Si en realidad hay dos analitos diferentes que eluyen juntos, entonces es una cuestión de mejorar su resolución (por ejemplo, aumentando la selectividad, la retención o el recuento de placas), y los picos "divididos" aparentes están relacionados con el rendimiento físico no tiene nada que ver con la columna en sí. A menudo, la pista más importante para esta decisión es si todos los picos en el cromatograma exhiben formas divididas, o solo uno o dos. Si es solo uno o dos, probablemente sea un problema de coelución; si todos los picos están divididos, probablemente sea un problema físico, muy probablemente relacionado con la columna en sí.
Los picos divididos relacionados con las propiedades físicas de la columna en sí se deben generalmente a fritas de entrada o salida parcialmente bloqueadas, o a la reorganización de partículas en la columna, lo que permite que la fase móvil fluya más rápido que la fase móvil en ciertas áreas de la formación del canal de la columna en otras regiones (11). La frita parcialmente obstruida a veces se puede limpiar invirtiendo el flujo a través de la columna; sin embargo, en mi experiencia, esta suele ser una solución a corto plazo en lugar de a largo plazo. Esto a menudo es fatal con las columnas modernas si las partículas se recombinan dentro de la columna. En este punto, es mejor reemplazar la columna y continuar.
El pico de la Figura 1g, también de un caso reciente en mi laboratorio, suele indicar que la señal es tan alta que ha alcanzado el límite superior del rango de respuesta. En los detectores de absorbancia óptica (UV-vis en este caso), cuando la concentración de analito es muy alta, este absorbe la mayor parte de la luz que pasa a través de la celda de flujo del detector, dejando muy poca luz sin detectar. En estas condiciones, la señal eléctrica del fotodetector se ve muy influenciada por diversas fuentes de ruido, como la luz parásita y la corriente oscura, lo que hace que la señal tenga un aspecto muy borroso e independiente de la concentración de analito. En este caso, el problema suele resolverse fácilmente reduciendo el volumen de inyección del analito, diluyendo la muestra o ambas cosas.
En la escuela de cromatografía, utilizamos la señal del detector (es decir, el eje y en el cromatograma) como un indicador de la concentración de analito en la muestra. Por lo tanto, parece extraño ver un cromatograma con una señal por debajo de cero, ya que la interpretación simple es que esto indica una concentración de analito negativa, lo que, por supuesto, no es físicamente posible. En mi experiencia, los picos negativos se observan con mayor frecuencia cuando se utilizan detectores de absorbancia óptica (por ejemplo, UV-vis).
En este caso, un pico negativo simplemente significa que las moléculas que eluyen de la columna absorben menos luz que la propia fase móvil inmediatamente antes y después del pico. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se utilizan longitudes de onda de detección relativamente bajas (<230 nm) y aditivos de fase móvil que absorben la mayor parte de la luz en estas longitudes de onda. Dichos aditivos pueden ser componentes del disolvente de la fase móvil, como el metanol, o componentes tampón, como el acetato o el formato. En realidad, se pueden utilizar picos negativos para preparar una curva de calibración y obtener información cuantitativa precisa, por lo que no hay una razón fundamental para evitarlos per se (este método a veces se denomina "detección UV indirecta") (13). Sin embargo, si realmente queremos evitar los picos negativos por completo, en el caso de la detección de absorbancia, la mejor solución es utilizar una longitud de onda de detección diferente para que el analito absorba más que la fase móvil, o cambiar la composición de la fase móvil para que absorban menos luz que los analitos.
También pueden aparecer picos negativos cuando se utiliza la detección del índice de refracción (IR) cuando el índice de refracción de otros componentes además del analito en la muestra, como la matriz del solvente, es diferente del índice de refracción de la fase móvil. Esto también sucede con la detección UV-vis, pero este efecto tiende a atenuarse en relación con la detección del IR. En ambos casos, los picos negativos se pueden minimizar haciendo coincidir más estrechamente la composición de la matriz de la muestra con la de la fase móvil.
En la tercera parte sobre el tema básico de la resolución de problemas de LC, analicé situaciones en las que la forma de pico observada difiere de la forma de pico esperada o normal. La resolución eficaz de tales problemas comienza con el conocimiento de las formas de pico esperadas (basadas en la teoría o experiencia previa con métodos existentes), por lo que las desviaciones de estas expectativas son obvias. Los problemas de forma de pico tienen muchas causas potenciales diferentes (demasiado ancho, cola, borde de entrada, etc.). En esta entrega, analizo en detalle algunas de las razones que veo con más frecuencia. Conocer estos detalles proporciona un buen lugar para comenzar la resolución de problemas, pero no captura todas las posibilidades. Los lectores interesados ​​en una lista más detallada de causas y soluciones pueden consultar el gráfico de pared "Guía de resolución de problemas de LC" de LCGC.
(4) Cuadro mural “Guía de solución de problemas de LC” de LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Análisis de datos y procesamiento de señales en cromatografía (Elsevier, Nueva York, NY, 1998), págs. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF y Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.