Algunos temas de solución de problemas de LC nunca están desactualizados, ya que existen problemas en la práctica de LC, incluso cuando la tecnología de los instrumentos mejora con el tiempo. Hay muchas formas en las que pueden surgir problemas en un sistema LC y terminar en una forma de pico deficiente. Cuando surgen problemas relacionados con la forma de pico, una breve lista de posibles causas de estos resultados ayuda a simplificar nuestra experiencia de solución de problemas.
Ha sido divertido escribir esta columna de "Resolución de problemas de LC" y pensar en temas cada mes, porque algunos temas nunca pasan de moda. Mientras que en el campo de la investigación cromatográfica, ciertos temas o ideas se vuelven obsoletos a medida que son reemplazados por nuevas y mejores ideas, en el campo de la resolución de problemas, desde que apareció el primer artículo de resolución de problemas en esta revista (la Revista LC en ese momento) ya que algunos temas siguen siendo relevantes) en 1983 (1). En los últimos años, me he centrado en varios LC Secciones de solución de problemas sobre tendencias contemporáneas que afectan a la cromatografía líquida (LC) (por ejemplo, la comparación relativa de nuestra comprensión del efecto de la presión en la retención [2] Nuevos avances) Nuestra interpretación de los resultados de LC y cómo solucionar problemas con instrumentos LC modernos. que estamos utilizando. El tema central de esta serie es muy relevante para el famoso gráfico de pared "Guía de solución de problemas de LC" (4) de LCGC que se encuentra en muchos laboratorios. Para la tercera parte de esta serie, opté por centrarme en los problemas relacionados con la forma o las características de los picos. Espero que los usuarios de LC jóvenes y mayores encuentren algunos consejos útiles y recordatorios sobre este importante tema.
Me encuentro cada vez más respondiendo preguntas de solución de problemas con "cualquier cosa es posible". Esta respuesta puede parecer fácil cuando se consideran observaciones que son difíciles de interpretar, pero a menudo la encuentro apropiada. Con muchas causas posibles de forma de pico deficiente, es importante mantener la mente abierta al considerar cuál podría ser el problema y poder priorizar las posibles causas para comenzar nuestros esfuerzos de solución de problemas, centrándonos en las posibilidades más comunes, este punto es muy importante. Posible.
Un paso clave en cualquier ejercicio de resolución de problemas, pero que creo que está subestimado, es reconocer que hay un problema que debe resolverse. Reconocer que hay un problema a menudo significa reconocer que lo que le sucede a la herramienta es diferente de nuestras expectativas, que están determinadas por la teoría, el conocimiento empírico y la experiencia (5). son simples. La teoría (6) apoya bien la expectativa de los libros de texto de que, en la mayoría de los casos, los picos cromatográficos deben ser simétricos y ajustarse a la forma de una distribución gaussiana, como se muestra en la Figura 1a. Lo que esperamos de los anchos de los picos es un tema más complejo, y discutiremos este tema en un artículo futuro. Las otras formas de los picos en la Figura 1 muestran algunas de las otras posibilidades que podrían observarse; ing algunos ejemplos específicos de situaciones que pueden conducir a estos tipos de forma.
A veces, los picos no se observan en absoluto en el cromatograma donde se espera que se eluyan. El gráfico mural anterior indica que la ausencia de un pico (suponiendo que la muestra realmente contiene el analito objetivo en una concentración que debería hacer que la respuesta del detector sea suficiente para verlo por encima del ruido) suele estar relacionada con algún problema del instrumento o condiciones incorrectas de la fase móvil (si se observa).picos, generalmente demasiado "débiles"). En la Tabla I se puede encontrar una breve lista de posibles problemas y soluciones en esta categoría.
Como se mencionó anteriormente, la cuestión de cuánto ensanchamiento de pico debe tolerarse antes de prestar atención y tratar de arreglarlo es un tema complejo que discutiré en un artículo futuro. Mi experiencia es que un ensanchamiento de pico significativo a menudo va acompañado de un cambio significativo en la forma del pico, y la cola de pico es más común que antes del pico o la división. Sin embargo, los picos nominalmente simétricos también se ensanchan, lo que puede deberse a algunas razones diferentes:
Cada uno de estos problemas se ha tratado en detalle en números anteriores de Solución de problemas de LC, y los lectores interesados ​​en estos temas pueden consultar estos artículos anteriores para obtener información sobre las causas principales y las posibles soluciones a estos problemas.Más detalles.
La cola de picos, el frente de picos y la división pueden ser causados ​​por fenómenos químicos o físicos, y la lista de posibles soluciones a estos problemas varía ampliamente, dependiendo de si se trata de un problema químico o físico. A menudo, al comparar los diferentes picos en un cromatograma, puede encontrar pistas importantes sobre cuál es el culpable. Si todos los picos en un cromatograma muestran formas similares, lo más probable es que la causa no sea física.
Las causas químicas de la formación de colas en los picos son demasiado complejas para discutirlas brevemente aquí. Se remite al lector interesado a la edición reciente de "LC Troubleshooting" para obtener una discusión más detallada (10). Sin embargo, una cosa fácil de intentar es reducir la masa del analito inyectado y ver si mejora la forma del pico. Si es así, esta es una buena pista de que el problema es una "sobrecarga de masa". Pueden obtenerse formas de pico incluso con grandes masas inyectadas.
También hay muchas posibles razones físicas para la cola máxima. Los lectores interesados ​​en una discusión detallada de las posibilidades pueden consultar otra edición reciente de "LC Troubleshooting" (11). Una de las causas físicas más comunes de la cola máxima es una conexión deficiente en un punto entre el inyector y el detector (12). En la Figura 1d, obtenida en mi laboratorio hace unas semanas, se muestra un ejemplo extremo. regla que había sido moldeada en un capilar de acero inoxidable. Después de algunos experimentos iniciales de solución de problemas, nos dimos cuenta de que la profundidad del puerto en el estator de la válvula de inyección era mucho más profunda de lo que estábamos acostumbrados, lo que resultó en un gran volumen muerto en la parte inferior del puerto.
Los frentes de pico como los que se muestran en la Figura 1e también pueden ser causados ​​por problemas físicos o químicos. Una causa física común del borde de ataque es que el lecho de partículas de la columna no está bien empaquetado o que las partículas se han reorganizado con el tiempo. Al igual que con las colas de pico causadas por este fenómeno físico, la mejor manera de solucionarlo es reemplazar la columna y continuar. la fase estacionaria (por lo tanto, el factor de retención) se relaciona linealmente con la concentración del analito en la columna. Cromatográficamente, esto significa que a medida que aumenta la masa del analito inyectado en la columna, el pico se vuelve más alto, pero no más ancho. Esta relación se rompe cuando el comportamiento de retención no es lineal, y los picos no solo se vuelven más altos sino también más anchos a medida que se inyecta más masa. (10), el adelanto de pico causado por la retención no lineal también se puede diagnosticar mediante la reducción de la masa del analito inyectado. Si la forma del pico mejora, se debe modificar el método para no exceder la calidad de la inyección que causa el adelanto, o se deben cambiar las condiciones cromatográficas para minimizar este comportamiento.
A veces observamos lo que parece ser un pico "dividido", como se muestra en la Figura 1f. El primer paso para resolver este problema es determinar si la forma del pico se debe a una coelución parcial (es decir, la presencia de dos compuestos distintos pero que eluyen muy de cerca). la columna misma. A menudo, la pista más importante para esta decisión es si todos los picos en el cromatograma muestran formas divididas, o solo uno o dos. Si es solo uno o dos, es probable que sea un problema de coelución;si todos los picos están divididos, es probable que sea un problema físico, probablemente relacionado con la columna misma.
Los picos divididos relacionados con las propiedades físicas de la columna en sí generalmente se deben a fritas de entrada o salida parcialmente bloqueadas, o a la reorganización de partículas en la columna, lo que permite que la fase móvil fluya más rápido que la fase móvil en ciertas áreas de la formación del canal de la columna en otras regiones (11). La frita parcialmente obstruida a veces se puede limpiar invirtiendo el flujo a través de la columna;sin embargo, en mi experiencia, esta suele ser una solución a corto plazo en lugar de a largo plazo. Esto suele ser fatal con las columnas modernas si las partículas se recombinan dentro de la columna. En este punto, es mejor reemplazar la columna y continuar.
El pico en la Figura 1g, también de un caso reciente en mi propio laboratorio, generalmente indica que la señal es tan alta que ha alcanzado el extremo superior del rango de respuesta. Para los detectores de absorbancia óptica (UV-vis en este caso), cuando la concentración del analito es muy alta, el analito absorbe la mayor parte de la luz que pasa a través de la celda de flujo del detector, dejando muy poca luz para detectar. En estas condiciones, la señal eléctrica del fotodetector está fuertemente influenciada por varias fuentes de ruido, como la luz parásita y la "corriente oscura". haciendo que la señal tenga un aspecto muy "borroso" e independiente de la concentración del analito.Cuando esto sucede, el problema a menudo se puede resolver fácilmente reduciendo el volumen de inyección del analito, reduciendo el volumen de inyección, diluyendo la muestra o ambos.
En la escuela de cromatografía, usamos la señal del detector (es decir, el eje Y en el cromatograma) como indicador de la concentración del analito en la muestra. Por lo tanto, parece extraño ver un cromatograma con una señal por debajo de cero, ya que la interpretación simple es que esto indica una concentración de analito negativa, lo que, por supuesto, no es físicamente posible. En mi experiencia, los picos negativos se observan con mayor frecuencia cuando se usan detectores de absorbancia óptica (por ejemplo, UV-vis).
En este caso, un pico negativo simplemente significa que las moléculas que eluyen de la columna absorben menos luz que la propia fase móvil inmediatamente antes y después del pico. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se utilizan longitudes de onda de detección relativamente bajas (<230 nm) y aditivos de fase móvil que absorben la mayor parte de la luz en estas longitudes de onda. se (este método a veces se denomina "detección UV indirecta") (13). Sin embargo, si realmente queremos evitar los picos negativos por completo, en el caso de la detección de absorbancia, la mejor solución es utilizar una longitud de onda de detección diferente para que el analito absorba más que la fase móvil, o cambiar la composición de la fase móvil para que absorba menos luz que los analitos.
Los picos negativos también pueden aparecer cuando se usa la detección del índice de refracción (IR) cuando el índice de refracción de los componentes que no son el analito en la muestra, como la matriz del solvente, es diferente del índice de refracción de la fase móvil. Esto también sucede con la detección UV-vis, pero este efecto tiende a atenuarse en relación con la detección RI. En ambos casos, los picos negativos se pueden minimizar haciendo coincidir más la composición de la matriz de la muestra con la de la fase móvil.
En la tercera parte, sobre el tema básico de la solución de problemas de LC, analicé situaciones en las que la forma del pico observada difiere de la forma del pico esperada o normal. La solución efectiva de problemas de este tipo comienza con el conocimiento de las formas de los picos esperadas (basadas en la teoría o en la experiencia previa con los métodos existentes), por lo que las desviaciones de estas expectativas son obvias. disparando, pero no captura todas las posibilidades. Los lectores interesados ​​en una lista más detallada de causas y soluciones pueden consultar el gráfico de pared de la “Guía de solución de problemas de LC” de LCGC.
(4) Gráfico de pared de la "Guía de resolución de problemas de LC" de LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Análisis de datos y procesamiento de señales en cromatografía (Elsevier, Nueva York, NY, 1998), págs. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF y Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.