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Los organoides neuronales autoensamblables representan una plataforma prometedora in vitro para modelar el desarrollo y la enfermedad en humanos. Sin embargo, los organoides carecen de la conectividad existente in vivo, lo que limita la maduración e impide la integración con otros circuitos que controlan la conducta. En este estudio, demostramos que los organoides corticales derivados de células madre humanas trasplantados a la corteza somatosensorial de ratas desnudas neonatales desarrollan tipos celulares maduros que se integran en circuitos sensoriales y motivacionales. La resonancia magnética reveló el crecimiento de organoides postrasplante en varias líneas de células madre y animales, mientras que el análisis de núcleo único reveló la progresión de la corticogénesis y la aparición de un programa de transcripción dependiente de la actividad. De hecho, las neuronas corticales trasplantadas presentan propiedades morfológicas, sinápticas y de membrana interna más complejas que sus contrapartes in vitro, lo que permite la detección de defectos neuronales en pacientes con síndrome de Timothy. El rastreo anatómico y funcional ha demostrado que los organoides trasplantados reciben entradas talamocorticales y corticocorticales, y los registros in vivo de la actividad neuronal sugieren que estas entradas pueden generar respuestas sensoriales en células humanas. Finalmente, los organoides corticales extienden axones por todo el cerebro de rata, y su activación optogenética induce la búsqueda de recompensa. Por lo tanto, las neuronas corticales humanas trasplantadas maduran y participan en los circuitos del huésped que controlan el comportamiento. Esperamos que este enfoque facilite la detección de fenotipos a nivel de hebra en células derivadas de pacientes que no pueden detectarse por otros medios.
El cerebro humano en desarrollo es un notable proceso de autoorganización en el que las células proliferan, se diferencian, migran y se conectan para formar circuitos neuronales funcionales que se refinan aún más a través de la experiencia sensorial. Un problema clave para comprender el desarrollo del cerebro humano, especialmente en el contexto de la enfermedad, es la falta de acceso al tejido cerebral. Los orgánulos autoorganizados, incluidos los organoides de la corteza humana (hCO; también conocidos como esfera de la corteza humana), pueden generar 2,3,4,5,6. Sin embargo, varias limitaciones limitan su aplicación más amplia para comprender el desarrollo y el funcionamiento de los circuitos neuronales. En particular, no está claro si la maduración del hCO está limitada por la ausencia de ciertas entradas microambientales y sensoriales presentes in vivo. Además, debido a que los hCO no están integrados en circuitos que puedan generar resultados conductuales, su utilidad en el modelado de trastornos neuropsiquiátricos genéticamente complejos y conductuales es actualmente limitada.
El trasplante de hCO en un cerebro vivo intacto puede superar estas limitaciones. Estudios previos han demostrado que las neuronas humanas trasplantadas en la corteza de roedores pueden sobrevivir, proyectarse y comunicarse con células de roedores7,8,9,10,11,12. Sin embargo, estos experimentos suelen realizarse en animales adultos, lo que puede limitar la integración sináptica y axonal. En este estudio, describimos un paradigma de trasplante en el que trasplantamos hCO 3D derivado de células hiPS en la corteza somatosensorial primaria (S1) de ratas inmunodeficientes en una etapa temprana de desarrollo plástico. Las neuronas hCO (t-hCO) trasplantadas experimentan una maduración sustancial, reciben entradas talamocorticales y corticocorticales que provocan respuestas sensoriales y extienden proyecciones axónicas hacia el cerebro de la rata para impulsar la conducta de búsqueda de recompensa. La maduración prolongada de t-hCO ha revelado defectos neuronales en pacientes con síndrome de Timothy (ST), un trastorno genético grave causado por mutaciones en el canal de calcio CaV1.2 de tipo L sensible al voltaje (codificado por CACNA1C).
Para estudiar neuronas corticales humanas en circuitos in vivo, trasplantamos estereotácticamente hCO 3D intacto en S1 de ratas atímicas en etapa posnatal temprana (días 3-7 posnatales) (Fig. 1a y datos ampliados de las Fig. 1a-c). En este punto, las proyecciones axónicas tálamo-corticales y corticocorticales aún no han completado su inervación en S1 (ref. 13). Por lo tanto, este enfoque está diseñado para maximizar la integración de t-hCO y minimizar el impacto en los circuitos endógenos. Para visualizar la ubicación de t-hCO en animales vivos, realizamos reconstrucciones cerebrales de ratas mediante resonancia magnética ponderada en T2 entre 2 y 3 meses después del trasplante (Fig. 1b y datos ampliados, Fig. 1d). Los niveles de t-hCO se observaron fácilmente y las mediciones de volumen de t-hCO fueron similares a las calculadas a partir de cortes fijos (Figura 1d,e de datos extendidos; P > 0,05). Los niveles de t-hCO se observaron fácilmente y las mediciones de volumen de t-hCO fueron similares a las calculadas a partir de cortes fijos (Figura 1d,e de datos extendidos; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные) данные, рис 1d, e; 0,05). Se observaron fácilmente t-hCO y las mediciones volumétricas de t-hCO fueron similares a las calculadas para secciones fijas (datos ampliados, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные) данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Se observó fácilmente t-hCO y las mediciones volumétricas de t-hCO fueron similares a las calculadas para secciones fijas (datos ampliados, Fig. 1d, e; P > 0,05).Determinamos la t-hCO en el 81 % de los animales trasplantados aproximadamente 2 meses después del trasplante (n = 72 animales; hCO de 10 líneas celulares hiPS; líneas celulares hiPS en la Tabla suplementaria 1). De estos, el 87 % se localizaron en la corteza cerebral (Fig. 1c). Al realizar exploraciones de resonancia magnética seriadas en múltiples puntos de tiempo en la misma rata trasplantada, encontramos un aumento de nueve veces en el volumen de t-hCO en 3 meses (Fig. 1d y datos ampliados, Fig. 1f). Los animales trasplantados tuvieron una alta tasa de supervivencia (74 %) a los 12 meses después del trasplante (datos ampliados, Fig. 1g y Tabla suplementaria 2), y no se encontraron alteraciones motoras o de memoria manifiestas, gliosis o electroencefalograma (EEG). Datos Fig. 1g y tabla suplementaria 2). 1h–m y 3e).
a, Esquema del diseño experimental. La hCO derivada de células hiPS se trasplantó en S1 de ratas desnudas recién nacidas en los días 30-60 de la diferenciación. b, Imágenes de resonancia magnética coronal y horizontal ponderadas en T2 que muestran t-hCO en S1 2 meses después del trasplante. Barra de escala, 2 mm. c, Cuantificación de las tasas de éxito del injerto mostradas para cada línea celular hiPS (n = 108, los números dentro de las barras indican la cantidad de t-hCO por línea celular hIPS) y ubicación cortical o subcortical (n = 88). d, Imagen de resonancia magnética de una arteria coronaria (izquierda; barra de escala, 3 mm) y reconstrucción volumétrica 3D correspondiente (barra de escala, 3 mm) que muestra un aumento en t-hCO durante 3 meses. e, Revisión de los patrones de t-hCO en la corteza cerebral de la rata. Barra de escala, 1 mm. f, Imágenes inmunocitoquímicas representativas de t-hCO que se muestran de izquierda a derecha (durante la diferenciación): PPP1R17 (4 meses de antigüedad), NeuN (8 meses de antigüedad), SOX9 y GFAP (8 meses de antigüedad), PDGFRα; (8 meses), MAP2 (8 meses) e IBA1 (8 meses). Barra de escala, 20 µm. La coexpresión de HNA indica células de origen humano. g, snRNA-seq: Imágenes de reducción de dimensionalidad de proyección y colector unificado (UMAP) de todos los núcleos de t-hCO de alta calidad después de la integración de Seurat (n = 3 muestras de t-hCO, n = 2 líneas celulares hiPS). Astrocitos, células de la línea de astrocitos; cyc prog, progenitores circulantes; GluN DL, neuronas glutamatérgicas profundas; GluN DL/SP, neuronas glutamatérgicas profundas y sublamelares; GluN UL, neuronas glutamatérgicas de la capa superior; oligodendrocitos, oligodendrocitos; OPC, células progenitoras de oligodendrocitos; RELN, neuronas reelina. h, análisis de enriquecimiento de términos de Gene Ontology (GO) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresado en al menos el 10 % de los núcleos) en neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con neuronas glutamatérgicas hCO. h, análisis de enriquecimiento de términos de Gene Ontology (GO) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresado en al menos el 10 % de los núcleos) en neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con neuronas glutamatérgicas hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронами hCO. h, análisis de enriquecimiento de términos de Gene Ontology (GO) para genes con activación significativa (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresión en al menos el 10 % de los núcleos) en neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con neuronas glutamatérgicas hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 ， 变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скоректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) en Glutamatérgicos neuronales t-hCO по сравнению с glutamatérgicos neuronales hCO Análisis ontológico (GO) de terminales de análisis. h, los genes se regularon positivamente de manera significativa (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresado en al menos el 10 % de los núcleos) en las neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con las neuronas glutamatérgicas hCO Análisis ontológico (GO) del término de enriquecimiento.La línea punteada indica un valor de aq de 0,05. i, Imágenes UMAP de tipos celulares GluN en t-hCO mediante transferencia de marcaje de un conjunto de datos de referencia de 22 snRNA-seq de corteza motora adulta. CT: células corticotalámicas; ET: células extracerebrales; IT: células telencefálicas internas; NP: proyección cercana.
A continuación, evaluamos la citoarquitectura y la composición celular global de t-hCO. La tinción con anticuerpos de células endoteliales de rata reveló vascularización con t-hCO, mientras que la tinción con IBA1 reveló la presencia de microglía de rata en todo el injerto (Fig. 1f y datos ampliados, Fig. 3c,d). La inmunotinción reveló células positivas al antígeno nuclear humano (HNA) que coexpresaban PPP1R17 (progenitores corticales), NeuN (neuronas), SOX9 y GFAP (células derivadas de la glía) o PDGFRα (progenitores de oligodendrocitos) (Figura 1f). Para estudiar la composición celular de t-hCO con resolución de célula única, realizamos secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) después de aproximadamente 8 meses de diferenciación. La filtración masiva y la extracción de núcleos de rata generaron 21 500 mapas mononucleares humanos de alta calidad (Fig. 1g y datos ampliados, Fig. 4a,b). Los patrones de expresión de marcadores típicos de tipo celular identificaron grupos de las principales clases de células corticales, incluyendo neuronas glutamatérgicas profundas y superficiales, progenitores circulantes, oligodendrocitos y linaje astrocítico (Fig. 1g, datos ampliados, Fig. 4c, y Tabla Suplementaria 3). La inmunotinción para SATB2 y CTIP2 mostró que, a pesar de la presencia de subtipos corticales, la t-hCO2 no mostró una estratificación anatómica clara (datos ampliados, Fig. 3a). La hCO snRNA-seq emparejada en estadio produjo clases celulares muy similares, con algunas excepciones, como la ausencia de oligodendrocitos y la presencia de neuronas GABAérgicas, lo que podría reflejar las condiciones in vitro favorables previamente descritas para las células progenitoras laterales15 (datos ampliados, Fig. 4f-i y Tabla Suplementaria 4). El análisis de expresión génica diferencial reveló diferencias significativas en las neuronas glutamatérgicas entre t-hCO y hCO (Tabla Suplementaria 5), ​​incluyendo la activación de conjuntos de genes asociados con la maduración neuronal, como la señalización sináptica, la localización dendrítica y la actividad de los canales dependientes de voltaje (Figura 1h y Tabla Suplementaria 5). Tabla 6). En consecuencia, las neuronas glutamatérgicas corticales t-hCO mostraron una maduración transcripcional acelerada.
Para dilucidar si estos cambios transcripcionales en t-hCO estaban relacionados con diferencias morfológicas entre hCO in vitro y t-hCO in vivo, reconstruimos hCO y hCO llenos de biocitina emparejados por etapa en secciones agudas después de 7-8 meses de diferenciación. neuronas hCO (Fig. 2a). Las neuronas t-hCO fueron significativamente más grandes, tenían 1,5 veces el diámetro del soma, el doble de dendritas y un aumento general de seis veces en la longitud dendrítica total en comparación con hCO in vitro (Fig. 2b). Además, observamos una densidad significativamente mayor de espinas dendríticas en neuronas t-hCO que en neuronas hCO (Fig. 2c). Esto sugiere que las neuronas t-hCO experimentan una elongación y ramificación dendríticas extensas, que, en combinación con la proliferación celular continua, puede contribuir al crecimiento intensivo de t-hCO después del trasplante (Fig. 1d y Datos Extendidos Fig. 1f). Esto nos impulsó a investigar las propiedades electrofisiológicas. La capacitancia de la membrana fue ocho veces mayor (datos ampliados, Fig. 8d), el potencial de membrana en estado de reposo fue más hiperpolarizado (aproximadamente 20 mV) y la inyección de corriente indujo una mayor tasa de excitación máxima en neuronas t-hCO que en neuronas hCO. in vitro (Fig. 2d), e), lo cual es consistente con las características morfológicas más grandes y complejas de t-hCO. Además, la frecuencia de eventos de corriente postsináptica excitatoria espontánea (EPSC) fue significativamente mayor en neuronas t-hCO (Fig. 2f), lo que sugiere que la mayor densidad de espinas dendríticas observada en neuronas t-hCO se asoció con excitabilidad funcional. sinapsis sexual. Confirmamos el carácter inmaduro de las neuronas hCO in vitro registrando neuronas glutamatérgicas marcadas (datos ampliados, Fig. 6a-c).
a, reconstrucción 3D de neuronas hCO y t-hCO llenas de biocitina después de 8 meses de diferenciación. b, Cuantificación de características morfológicas (n = 8 neuronas hCO, n = 6 neuronas t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 y ***P < 0,0001). b, Cuantificación de características morfológicas (n = 8 neuronas hCO, n = 6 neuronas t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 y ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, cuantificación de las características morfológicas (n=8 neuronas hCO, n=6 neuronas t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 y ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, cuantificación de las características morfológicas (n=8 neuronas hCO, n=6 neuronas t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 y ***P<0,0001).c, Reconstrucción 3D de las ramas dendríticas de hCO y t-hCO tras 8 meses de diferenciación. Los asteriscos rojos indican las posibles espinas dendríticas. Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas (n = 8 neuronas de hCO, n = 6 neuronas de t-hCO; **P = 0,0092). d, Cuantificación del potencial de membrana en reposo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). d, Cuantificación del potencial de membrana en reposo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, cuantificación del potencial de membrana en reposo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, cuantificación del potencial de membrana en reposo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). e, Disparos de potenciales de acción repetitivos en hCO y t-hCO inducidos por inyecciones de corriente crecientes y cuantificación de la tasa máxima de disparo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). e, Disparos de potenciales de acción repetitivos en hCO y t-hCO inducidos por inyecciones de corriente crecientes y cuantificación de la tasa máxima de disparo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO y t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reactivación del potencial de acción en hCO y t-hCO inducida por el aumento de corriente y cuantificación de la tasa máxima de activación (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25 个 hco神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO y t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка maximalino скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, disparo repetitivo de potenciales de acción hCO y t-hCO inducidos por un mayor suministro de corriente y cuantificación de la tasa máxima de disparo (n = 25 neuronas hCO, n = 16 neuronas t-hCO; *** P < 0,0001). f, EPSC espontáneas (sEPSC) en neuronas hCO y t-hCO a los 8 meses de diferenciación y cuantificación de la frecuencia de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC espontáneas (sEPSC) en neuronas hCO y t-hCO a los 8 meses de diferenciación y cuantificación de la frecuencia de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC espontáneo (sEPSC) en hCO y t-hCO neutros con 8 meses de diferencias y combinaciones de corrientes sinápticas событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001) . f, EPSC espontáneas (sEPSC) en neuronas hCO y t-hCO a los 8 meses de diferenciación y cuantificación de las tasas de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, EPSC espontáneo (sEPSC) en hCO y t-hCO neutros con 8 meses de diferencias y combinaciones de corrientes sinápticas событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001). f, EPSC espontáneas (sEPSC) en neuronas hCO y t-hCO a los 8 meses de diferenciación y cuantificación de las tasas de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; *** P < 0,0001).Para bf, hCO y t-hCO en la línea 1208-2 se tomaron del mismo lote de diferenciación mantenido en paralelo. g, análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (prueba exacta de Fisher unilateral) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresados ​​en al menos el 10 % de los núcleos) en neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con neuronas glutamatérgicas hCO con conjuntos de genes dependientes de la actividad de respuesta temprana (ERG) y respuesta tardía (LRG) identificados a partir de un estudio in vivo con ratones16 y LRG específicos de humanos de neuronas in vitro17. g, análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (prueba exacta de Fisher unilateral) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresados ​​en al menos el 10 % de los núcleos) en neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con neuronas glutamatérgicas hCO con conjuntos de genes dependientes de la actividad de respuesta temprana (ERG) y respuesta tardía (LRG) identificados a partir de un estudio in vivo con ratones16 y LRG específicos de humanos de neuronas in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с glutamatérgicos нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, análisis del enriquecimiento del conjunto de genes (prueba exacta de Fisher de una cola) de genes con activación significativa (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, expresión en al menos el 10 % de los núcleos) en neuronas glutamatérgicas t-hCO en comparación con conjuntos de neuronas glutamatérgicas hCO de genes dependientes de la actividad temprana (ERG) y tardía (LRG) identificados en ratones in vivo16 y LRG específicos de humanos de neuronas in vitro17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG. g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0.05 ，倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, neuronas glutamatorias t-hCO que se activan rápidamente con neuronas glutamatorias hCO (escorrectivas) P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) y позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. Las neuronas glutamatérgicas g, t-hCO se regularon positivamente de manera significativa en comparación con las neuronas glutamatérgicas hCO (P ajustada < 0,05, cambio de pliegue > 2, al menos 10 % Análisis de enriquecimiento de genes de respuesta temprana (ERG) y respuesta tardía (prueba exacta de Fisher de una cola) Genes dependientes de la actividad de respuesta (LRG) identificados en ratones in vivo16 y neuronas in vitro.17 LRG específicos humanos.La línea punteada indica un valor de p corregido por Bonferroni de 0,05. h, la expresión del gen GluN (pseudopaquete y escalamiento de cada gen) aumentó significativamente en las réplicas de snRNA-seq de los genes LRG en neuronas glutamatérgicas t-hCO. i, inmunotinción que muestra la expresión de SCG2 en neuronas t-hCO (arriba) y hCO (abajo). Las flechas blancas señalan las células SCG2+. Barra de escala: 25 µm. Los datos se expresan como media ± desviación estándar.
Basándose en el aumento de la actividad de t-hCO observado en cortes ex vivo, la snRNA-seq reveló una regulación positiva dependiente de la actividad de las transcripciones génicas en t-hCO en comparación con hCO in vitro. Las neuronas glutamatérgicas t-hCO expresaron mayores niveles de genes que regulan la actividad de respuesta tardía (Fig. 2g,h), que se encontraron en estudios previos en neuronas de ratón y humano16,17. Por ejemplo, BDNF18, SCG2 y OSTN, un gen regulador de la actividad específico de primates, mostraron una mayor expresión en neuronas t-hCO en comparación con neuronas hCO (Fig. 2g-i). Por lo tanto, las neuronas t-hCO exhibieron características de maduración mejoradas en comparación con las neuronas hCO mediante análisis transcripcionales, morfológicos y funcionales.
Para evaluar más a fondo la asociación de la maduración de t-hCO con el desarrollo del cerebro humano, realizamos comparaciones transcriptómicas de tipos de células corticales fetales y adultas19,20 y adultas21,22 así como datos extensos sobre la expresión génica cortical23 durante el desarrollo (datos ampliados, Fig. 5). ). con trabajos previos24, el estado de maduración del transcriptoma global de hCO y t-hCO a los 7-8 meses de diferenciación es ampliamente consistente con el tiempo de desarrollo in vivo y es más equivalente a la vida fetal tardía (Datos ampliados Fig. 5a). En particular, observamos una mayor madurez del transcriptoma en t-hCO en comparación con hCO de la misma edad, así como una activación del transcriptoma asociada con la sinaptogénesis, la astrogénesis y la mielinización (datos ampliados, Fig. 5b-d). A nivel celular, encontramos evidencia de un subtipo de corteza más delgada en t-hCO, con grupos de neuronas glutamatérgicas que se superponen con los subtipos de neuronas L2/3, L5 y L6 adultas (Figura 1i). Por el contrario, el solapamiento de grupos entre neuronas glutamatérgicas t-hCO y neuronas corticales fetales fue más limitado en la mitad del embarazo (datos ampliados, Figura 5e-j). Para determinar si las neuronas t-hCO son funcionalmente similares a las neuronas neocorticales postnatales humanas, realizamos registros electrofisiológicos y reconstrucciones anatómicas de neuronas piramidales L2/3 humanas en secciones nítidas de la corteza postnatal humana (datos ampliados, Figura 7a). Las propiedades electrofisiológicas de las neuronas piramidales L2/3 fueron similares a las de las neuronas piramidales t-hCO (datos ampliados, Figura 7e). Morfológicamente, las neuronas L2/3 de muestras humanas postnatales eran más similares a t-hCO que a hCO, aunque las células L2/3 eran más largas, contenían más ramas en general y tenían una mayor densidad de espinas (Fig. 3g y datos ampliados, Fig. 7b-). G).
a, trasplante de hCO producido por líneas celulares de control y TS hiPS en ratas neonatales. b, reconstrucción 3D de neuronas t-hCO llenas de biocitina después de 8 meses de diferenciación. c, cuantificación de la longitud dendrítica media (n = 19 neuronas de control, n = 21 neuronas TS; **P = 0,0041). d, ramas dendríticas reconstruidas en 3D del control y de las neuronas TS con t-hCO a los 8 meses de diferenciación, y cuantificación de la densidad de espinas dendríticas (n = 16 neuronas de control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001). d, ramas dendríticas reconstruidas en 3D del control y de las neuronas TS con t-hCO a los 8 meses de diferenciación, y cuantificación de la densidad de espinas dendríticas (n = 16 neuronas de control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дференцировки и количественная оценка плотности dendrita шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrucción 3D de ramas dendríticas de neuronas control y TS t-hCO a los 8 meses de diferenciación y cuantificación de la densidad de espinas dendríticas (n = 16 neuronas control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дендренцировки and количественная оценка плотности dendrita шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrucción 3D de ramas dendríticas de control y TS t-hCO a los 8 meses de diferenciación y cuantificación de la densidad de espinas dendríticas (n = 16 neuronas de control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001).Los asteriscos rojos indican las supuestas espinas dendríticas. e, EPSC espontáneos en neuronas control y neuronas TS t-hCO tras 8 meses de diferenciación. f, gráfico de frecuencia acumulada y cuantificación de la frecuencia y amplitud de los eventos sinápticos (n = 32 neuronas control, n = 26 neuronas TS; **P = 0,0076 y P = 0,8102). g, análisis de Scholl de neuronas TS y control en hCO y t-hCO. Las líneas discontinuas muestran neuronas piramidales postnatales L2/3 humanas para comparación (n = 24 neuronas control t-hCO, n = 21 neuronas TS t-hCO, n = 8 neuronas control hCO y n = 7 neuronas TS hCO). Los datos se expresan como media ± desviación estándar.
La capacidad de t-hCO para replicar las características morfológicas y funcionales de las neuronas de la corteza humana a un alto nivel nos impulsó a explorar si t-hCO podría usarse para detectar fenotipos de enfermedades. Nos centramos en el síndrome de Turner (ST), un trastorno grave del neurodesarrollo causado por mutaciones de ganancia de función en el gen que codifica CaV1.2, que inicia la transcripción génica dependiente de la actividad en las neuronas. Obtuvimos hCO de tres pacientes con ST que portaban la sustitución más común (p.G406R) y tres controles (Fig. 3a). Después del trasplante, observamos que la morfología dendrítica estaba alterada en las neuronas con ST en comparación con los controles (Fig. 3b y datos ampliados, Fig. 8a,b), con un aumento del doble en el número de dendritas primarias y un aumento general en la media y una disminución general en la longitud dendrítica (Fig. 3c y datos ampliados, Fig. 8c). Esto se asoció con una mayor densidad de espinas y una mayor frecuencia de EPSC espontáneas en el TS en comparación con las neuronas control (Fig. 3d-f y datos ampliados, Fig. 8g). Un análisis posterior reveló patrones de ramificación dendrítica anormal en el TS t-hCO en comparación con los controles, pero no en el TS hCO in vitro en una etapa de diferenciación similar (Fig. 3g). Esto concuerda con nuestros informes previos de contracción dendrítica dependiente de la actividad en el TS y destaca la capacidad de esta plataforma de trasplante para detectar fenotipos de la enfermedad in vivo.
Nos preguntamos entonces hasta qué punto las células t-hCO están funcionalmente integradas en S1 de rata. S1 en roedores recibe fuertes entradas sinápticas de los núcleos basal ventral ipsilateral y talámico posterior, así como de las cortezas motora y somatosensorial secundaria ipsilateral, y S1 contralateral (Fig. 4a). Para restaurar el patrón de inervación, infectamos hCO con virus de la rabia-dG-GFP/AAV-G y trasplantamos hCO en ratas S1 3 días después. Observamos una densa expresión de GFP en neuronas de S1 ipsilateral y ganglios basales ventrales 7-14 días después del trasplante (Fig. 4b, c). Además, la tinción de anticuerpos del marcador talámico netrina G1 reveló la presencia de terminaciones talámicas en t-hCO (Fig. 4d, e). Para evaluar si estas proyecciones aferentes podían generar respuestas sinápticas en células t-hCO, realizamos registros celulares completos de células humanas en secciones nítidas de la capa talamocortical. La estimulación eléctrica de S1 de rata, cápsula interna, sustancia blanca y fibras cercanas a t-hCO, o la activación optogenética de terminaciones talámicas que expresan opsina en t-hCO, indujo EPSC de latencia corta en neuronas t-hCO expuestas al antagonista del receptor AMPA, NBQX (Fig. 4f, g y datos ampliados, Fig. 9a-g). Estos datos demuestran que t-hCO está anatómicamente integrado en el cerebro de rata y puede ser activado por el tejido huésped de rata.
a, Diagrama esquemático de un experimento de rastreo de la rabia. b, Expresión de GFP y STEM121 específica de humanos entre t-hCO y la corteza cerebral de rata (panel superior). También se muestra la expresión de GFP en el núcleo basal ventral ipsilateral (VB) de rata (abajo a la izquierda) y S1 ipsilateral (abajo a la derecha). Barra de escala, 50 µm. Los cuadrados rojos representan las áreas del cerebro donde se tomaron las imágenes. c, Cuantificación de células que expresan GFP (n = 4 ratas). d, e — Terminales talámicas de netrina G1+ en t-hCO. d muestra una sección coronal que contiene los núcleos de t-hCO y VB. Barra de escala, 2 mm. e muestra la expresión de netrina G1 y STEM121 en neuronas t-hCO (izquierda) y VB (derecha). Barra de escala, 50 µm. La línea punteada naranja indica el límite de t-hCO. f, g, trazas de corriente de neuronas t-hCO tras estimulación eléctrica en rata S1 (f) o cápsula interna (g), con (morado) o sin (negro) NBQX (izquierda). Amplitudes de EPSC con y sin NBQX (n = 6 neuronas S1, *P = 0,0119; y n = 6 neuronas de la cápsula interna, **P = 0,0022) (centro). Porcentaje de neuronas t-hCO que muestran EPSC en respuesta a la estimulación eléctrica de rata S1 (f) o cápsula interna (g) (derecha). aCSF, líquido cefalorraquídeo artificial. h, diagrama esquemático del experimento de imágenes 2P (izquierda). Expresión de GCaMP6s en t-hCO (centro). Barra de escala, 100 µm. Lapso de tiempo de fluorescencia de GCaMP6s (derecha). i, puntuación Z de fluorescencia de actividad espontánea. j, ilustración esquemática de la estimulación del bigote. k, trayectorias de fluorescencia de 2P con puntuación z en un ensayo, alineadas con la desviación de los bigotes en el tiempo cero (línea discontinua) en las células de ejemplo. l, respuestas de puntuación z promediadas por la población de todas las células alineadas con la desviación de los bigotes en el tiempo cero (línea discontinua) (rojo) o marcas de tiempo generadas aleatoriamente (gris). m. Diagrama esquemático del experimento de marcado óptico. n, curvas de voltaje sin procesar de una célula de t-hCO3 de ejemplo durante la estimulación con láser azul o la desviación de los bigotes. Las flechas rojas indican los primeros picos causados ​​por la luz (arriba) o causados ​​por la desviación de los bigotes (abajo). El sombreado gris indica los períodos de desviación de los bigotes. o, formas de onda de luz pico y respuestas de desviación de los bigotes. p, picos de un solo intento, alineados con la desviación de los bigotes en las células del ejemplo. 0 indica la desviación de los bigotes (línea discontinua). q, tasa de activación de la puntuación z promediada por la población para todas las células fotosensibles, alineada con la desviación de los bigotes en el tiempo cero (línea discontinua) (rojo) o con marcas de tiempo generadas aleatoriamente (gris). r, proporción de unidades fotosensibles moduladas significativamente por la desviación de los bigotes (n = 3 ratas) (izquierda). Latencia máxima de la puntuación z (n = 3 ratas; n = 5 [verde claro], n = 4 [verde oscuro] y n = 4 [cian] unidades de modulación de la desviación de los bigotes por rata) (derecha). Los datos se expresan como media ± desviación estándar.
Luego nos preguntamos si el t-hCO podría ser activado por estímulos sensoriales in vivo. Trasplantamos hCO que expresa los indicadores de calcio genéticamente codificados GCaMP6 en ratas S1. Después de 150 días, realizamos fotometría de fibra o imágenes de calcio de dos fotones (Fig. 4h y datos expandidos, Fig. 10a). Observamos que las células t-hCO exhibieron actividad rítmica sincronizada (Figura 4i, Datos expandidos, Figura 10b y Video suplementario 1). Para caracterizar la actividad máxima de t-hCO, realizamos registros electrofisiológicos extracelulares en ratas trasplantadas anestesiadas (datos expandidos, Fig. 10c-f). Hemos generado coordenadas estereotáxicas a partir de imágenes de MRI; por lo tanto, estas unidades registradas representan neuronas humanas putativas, aunque la electrofisiología por sí sola no permite determinar una especie de origen. Observamos ráfagas sincronizadas de actividad (datos expandidos, Fig. 10d). Las ráfagas duraron aproximadamente 460 ms y estuvieron separadas por periodos de silencio de aproximadamente 2 s (datos ampliados, Fig. 10d, e). Las unidades individuales dispararon un promedio de aproximadamente tres rondas por ráfaga, lo que representa aproximadamente el 73 % de las unidades registradas por ráfaga. Las actividades de las unidades individuales estuvieron altamente correlacionadas, y estas correlaciones fueron mayores que las de las unidades identificadas en animales no vacunados registrados bajo las mismas condiciones (datos ampliados, Fig. 10f). Para caracterizar mejor las respuestas de pico de las neuronas derivadas de humanos identificadas, realizamos experimentos de marcado de luz en ratas anestesiadas trasplantadas con hCO que expresan el canal catiónico sensible a la luz rodopsina 2 (hChR2), a través del cual las neuronas t-hCO reconocen con latencia corta (menos de 10 ms) en respuesta a estímulos de luz azul (Fig. 4m–o). Las neuronas t-hCO exhibieron ráfagas de actividad espontánea a frecuencias similares a las observadas en imágenes de calcio, así como en registros electrofisiológicos realizados en t-hCO en ausencia de marcaje luminoso (datos ampliados, Fig. 10c-g). No se observó actividad espontánea en las etapas correspondientes de hCO registradas in vitro. Para evaluar si el t-hCO podía activarse mediante estímulos sensoriales, desviamos brevemente los bigotes de rata lejos del t-hCO (Fig. 4j,m y datos ampliados, Fig. 10h,k). Según estudios previos8,10, un subconjunto de células t-hCO mostró un aumento de la actividad en respuesta a la deflexión de los bigotes, lo cual no se observó al comparar los datos con marcas de tiempo aleatorias (Fig. 4k-q y datos ampliados, Fig. 10h-q). De hecho, aproximadamente el 54 % de las unidades individuales optomarcadas mostraron una tasa de excitación significativamente mayor tras la estimulación de los bigotes, alcanzando un máximo de aproximadamente 650 ms (Fig. 4r). En conjunto, estos datos sugieren que el t-hCO recibe entradas funcionales apropiadas y puede ser activado por estímulos ambientales.
Luego investigamos si t-hCO podría activar circuitos en ratas para controlar el comportamiento. Primero investigamos si los axones de las neuronas t-hCO se proyectan en los tejidos circundantes de la rata. Infectamos hCO con un lentivirus que codifica hChR2 fusionado a EYFP (hChR2-EYFP). Después de 110 días, observamos la expresión de EYFP en regiones corticales ipsilaterales, incluyendo las cortezas auditiva, motora y somatosensorial, así como en regiones subcorticales, incluyendo el cuerpo estriado, el hipocampo y el tálamo (Fig. 5a). Para evaluar si estas proyecciones eferentes podrían obtener respuestas sinápticas en células de rata, activamos ópticamente células t-hCO que expresan hChR2-EYFP mediante el registro de células de la corteza cerebral de rata en secciones agudas del cerebro. La activación de los axones de t-hCO con luz azul indujo EPSC de latencia corta en neuronas de la corteza piramidal de rata, las cuales fueron bloqueadas por NBQX (Figs. 5b-g). Además, estas respuestas podrían ser bloqueadas por tetrodotoxina (TTX) y restauradas por 4-aminopiridina (4-AP), lo que sugiere que fueron causadas por conexiones monosinápticas (Fig. 5e).
a, Diagrama esquemático del seguimiento axonal (izquierda). Expresión de EYFP con t-hCO₃ (derecha). Barra de escala, 100 µm. A1, corteza auditiva, ACC, corteza cingulada anterior, d. cuerpo estriado, cuerpo estriado dorsal, HPC, hipocampo; diafragma, tabique lateral, mPFC, corteza prefrontal medial, piri, corteza piriforme, v. cuerpo estriado, cuerpo estriado ventral, VPM, núcleo ventropostomedial del tálamo, ATV, región tegmental ventral. Los cuadrados rojos representan las áreas del cerebro donde se tomaron las imágenes. b, Diagrama esquemático del experimento de estimulación. c, d, Ejemplos de la respuesta de la fotocorriente inducida por luz azul (arriba) y el voltaje (abajo) en células humanas (c) EYFP+ t-hCO₃ o de rata (d) EYFP-. e, f, Rastros actuales de neuronas de rata después de la estimulación con luz azul de los axones de t-hCO con TTX y 4-AR (verde), TTX (gris) o aCSF (negro) (e), con (violeta) o sin (negro) ) ) NBQX (e). g, latencia de las respuestas inducidas por luz azul en células de rata (n = 16 células); las barras horizontales indican la latencia promedio (7,13 ms) (izquierda). Amplitud de los EPSC evocados por luz registrados con o sin NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (medio). Amplitud de los EPSC evocados por luz registrados con o sin NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (medio). Ampliación de la EPSC, registrada con o sin NBQX (n = 7 unidades; ***P <0,0001) (en el centro). Amplitud de los EPSC inducidos por luz registrados con o sin NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (centro).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Ampliación de la EPSC, registrada con o sin NBQX (n = 7 unidades; ***P <0,0001) (en el centro). Amplitud de los EPSC inducidos por luz registrados con o sin NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (centro).Porcentaje de células de rata que muestran EPSC que responden a la luz azul (derecha). h, Diagrama esquemático de una tarea conductual. d0, día 0. i. Rendimiento de animales ejemplares en el día 1 (izquierda) o el día 15 (derecha) de entrenamiento. Número medio de lamidas realizadas el día 1 (izquierda) o el día 15 (centro derecha) (n = 150 ensayos con luz azul, n = 150 ensayos con luz roja; ***P < 0,0001). Número medio de lamidas realizadas el día 1 (izquierda) o el día 15 (centro derecha) (n = 150 ensayos con luz azul, n = 150 ensayos con luz roja; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P<0,0001). Número medio de lamidas realizadas el día 1 (izquierda) o el día 15 (centro derecha) (n = 150 ensayos con luz azul, n = 150 ensayos con luz roja; ***P < 0,0001).Capítulo 1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。Capítulo 1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P<0,0001). Número medio de lamidas realizadas el día 1 (izquierda) o el día 15 (centro derecha) (n = 150 ensayos con luz azul, n = 150 ensayos con luz roja; ***P < 0,0001).Lamidos acumulados en ensayos con luz roja y azul el día 1 (centro izquierda) o el día 15 (derecha). NS, no significativo. j,k: Características conductuales de todos los animales trasplantados con t-hCO2 que expresa hChR2-EYFP (j) o fluoróforo control (k) el día 1 o el día 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ratas, ** P = 0,0049; control: n = 9, P = 0,1497). l, Evolución de la puntuación de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolución de la puntuación de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolución de la puntuación de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolución de las puntuaciones de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expresión de FOS en respuesta a la activación optogenética de t-hCO en S1. Se muestran imágenes de la expresión de FOS (izquierda) y cuantificación (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001) (derecha). Se muestran imágenes de la expresión de FOS (izquierda) y cuantificación (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001) (derecha). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) and количественного определения (n = 3 por grupo; * P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001) (справа). Se muestran imágenes de la expresión de FOS (izquierda) y cuantificación (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001) (derecha).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）的图像.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）的图像. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) and количественного определения (n = 3 por grupo; * P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001) (справа). Se muestran imágenes de la expresión de FOS (izquierda) y cuantificación (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001) (derecha).Barra de escala, 100 µm. Los datos se expresan como media ± error estándar de la ABL, amígdala basolateral, MDT, núcleo talámico dorsomedial, PAG y sustancia gris periacueductal.
Finalmente, nos preguntamos si t-hCO podría modular el comportamiento de las ratas. Para probar esto, trasplantamos hCO que expresa hChR2-EYFP en S1, y 90 días después, implantamos fibras ópticas en t-hCO para el suministro de luz. Luego entrenamos a las ratas con un paradigma de condicionamiento operante modificado (Fig. 5h). Colocamos a los animales en una cámara de prueba de comportamiento y aplicamos aleatoriamente estímulos de láser azul (473 nm) y rojo (635 nm) de 5 segundos. Los animales recibieron una recompensa de agua si lamían durante la estimulación con luz azul, pero no lamían durante la estimulación con luz roja. En el primer día de entrenamiento, los animales no mostraron diferencia en el lamido cuando se les estimuló con luz azul o roja. Sin embargo, en el día 15, los animales trasplantados con hCO que expresa hChR2-EYFP mostraron un lamido más activo cuando se les estimuló con luz azul en comparación con la estimulación con luz roja. Estos cambios en el comportamiento de lamido no se observaron en animales de control trasplantados con hCO que expresaban el fluoróforo de control (tasa de éxito de aprendizaje: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 y Video complementario 2). Estos datos sugieren que las células t-hCO pueden activar neuronas de rata para estimular el comportamiento de búsqueda de recompensa. Para descubrir qué circuitos neuronales de t-hCO de rata podrían estar involucrados en estos cambios de comportamiento, activamos optogenéticamente t-hCO en animales entrenados y recolectamos tejidos 90 minutos después. La inmunohistoquímica reveló la expresión de la proteína FOS dependiente de la actividad en varias regiones cerebrales involucradas en el comportamiento motivado, incluyendo la corteza prefrontal medial, el tálamo medial y la materia gris periacueductal, que se expresó tanto en animales de control no estimulados como en animales. arroz. 5m). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que t-hCO puede modular la actividad neuronal de la rata para impulsar el comportamiento.
Los organoides neuronales representan un sistema prometedor para estudiar el desarrollo y las enfermedades humanas in vitro, pero están limitados por la falta de conexiones entre los circuitos que existen in vivo. Hemos desarrollado una plataforma novedosa en la que trasplantamos hCO en S1 de ratas inmunodeprimidas en etapas postnatales tempranas para estudiar el desarrollo y la función de las células humanas in vivo. Hemos demostrado que la t-hCO desarrolla tipos celulares maduros no observados in vitro28 y que la t-hCO está integrada anatómica y funcionalmente en el cerebro de los roedores. La integración de la t-hCO en los circuitos neuronales de los roedores nos permitió establecer un vínculo entre la actividad celular humana y el comportamiento animal estudiado, demostrando que las neuronas t-hCO pueden modular la actividad neuronal de las ratas para impulsar respuestas conductuales.
La plataforma que describimos presenta varias ventajas con respecto a investigaciones previas sobre el trasplante de células humanas en cerebros de roedores. En primer lugar, trasplantamos hCO en la corteza en desarrollo de ratas en las primeras etapas posnatales, lo que podría facilitar la integración anatómica y funcional. En segundo lugar, la monitorización por resonancia magnética con t-hCO nos permitió estudiar la posición y el crecimiento del injerto en animales vivos, lo que nos permitió realizar estudios multianimales a largo plazo y establecer la fiabilidad de varias líneas celulares hiPS. Por último, trasplantamos organoides intactos, en lugar de suspensiones de células individuales aisladas, que son menos destructivas para las células humanas y pueden promover la integración y la generación de neuronas de la corteza humana en cerebros de rata.
Reconocemos que a pesar de los avances en esta plataforma, las restricciones temporales, espaciales y entre especies impiden la formación de circuitos neuronales humanos con alta fidelidad, incluso después del trasplante en una etapa temprana del desarrollo. Por ejemplo, no está claro si la actividad espontánea observada en t-hCO representa un fenotipo de desarrollo similar a la actividad rítmica observada durante el desarrollo cortical, o si se debe a la ausencia de tipos de células supresoras presentes en t-hCO. De manera similar, no está claro en qué medida la ausencia de laminación en t-hCO afecta la conectividad de la cadena30. El trabajo futuro se centrará en la integración de otros tipos de células como la microglía humana, las células endoteliales humanas y proporciones variables de interneuronas GABAérgicas como se muestra utilizando el ensamblaje 6 in vitro, así como en la comprensión de cómo la integración y el procesamiento neuronal pueden ocurrir en t-hCO alterado. niveles transcripcionales, sinápticos y conductuales en células obtenidas de pacientes.
En general, esta plataforma in vivo representa un recurso potente que puede complementar el desarrollo in vitro del cerebro humano y la investigación de enfermedades. Prevemos que esta plataforma nos permitirá descubrir nuevos fenotipos a nivel de cadena en células derivadas de pacientes, que de otro modo serían difíciles de obtener, y probar nuevas estrategias terapéuticas.
Generamos hCO2.5 a partir de células HiPS como se describió previamente. Para iniciar la producción de hCO2 a partir de células hiPS cultivadas en capas alimentadoras, se extrajeron colonias intactas de células hiPS de placas de cultivo con dispasa (0,35 mg/mL) y se transfirieron a cultivos plásticos de adhesión ultrabaja que contenían placas con medio de cultivo para células hiPS (Corning), suplementado con dos inhibidores de SMAD: dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) y SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris), y el inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Durante los primeros 5 días, el medio de cultivo para células hiPS se cambió diariamente y se añadieron dorsomorfina y SB-431542. En el sexto día en suspensión, los esferoides neurales se transfirieron a un medio neural que contenía neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sin vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina y estreptomicina (1:100, Life Technologies) y suplementado con el factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hasta el día 24. Desde el día 25 hasta el día 42, el medio se suplementaron con factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) y neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) con cambios de medio cada dos días. En el sexto día en suspensión, los esferoides neurales se transfirieron a un medio neural que contenía neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sin vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina y estreptomicina (1:100, Life Technologies) y suplementado con el factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hasta el día 24. Desde el día 25 hasta el día 42, el medio se suplementaron con factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) y neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) con cambios de medio cada dos días.Al sexto día en suspensión, los esferoides neurales fueron transferidos a un medio neural que contenía Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sin vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) para 24-го дня. y estreptomicina (1:100, Life Technologies) y suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) hasta el día 24.Desde el día 25 al 42, se agregó al medio factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) y neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), cambiando el medio cada dos días.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27 补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a 的 b-27补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina-estreptomicina neta (1:100, Life Technologies) con un factor epidérmico combinado (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) y фактора роста fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; El día 6, las suspensiones de neuroesferas se cambiaron a un suplemento que contenía neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sin vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), estreptomicina neutralizada con penicilina (1:100, Life Technologies) suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) до 24-го дня. Sistemas de I+D) hasta el día 24.Del día 25 al 42, se añadieron al medio de cultivo factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) y factor neurotrófico 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) cada dos días. El medio se cambió una vez.A partir del día 43, se mantuvo hCO en medio neurobasal-A sin suplementar (NM; 1088022, Thermo Fisher) con cambios de medio cada 4-6 días. Para obtener hCO de células hiPS cultivadas sin alimentación, estas se incubaron con Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) a 37 °C durante 7 minutos, se disociaron en células individuales y se sembraron en placas AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) a una densidad de 3 × 10⁻¹ células individuales por pocillo en medio Essential 8 suplementado con el inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Después de 24 horas, el medio de los pocillos se pipeteó verticalmente hacia arriba y hacia abajo en un medio que contenía medio Essential 6 (A1516401, Life Technologies) suplementado con dorsomorfina (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) y SB-431542 (10 μM; 1614, Tocrida). Del día 2 al 6, el medio Essential 6 se reemplazó diariamente con dorsomorfina y el suplemento SB-431542. A partir del sexto día, las suspensiones de neuroesferas se transfirieron al medio neurobasal y se mantuvieron como se describió anteriormente.
Todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal aprobadas por el Comité Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford (APLAC). Se compraron ratas RNU (rnu/+) eutímicas preñadas (Charles River Laboratories) o se alojaron. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con comida y agua ad libitum. Las crías de rata desnuda (FOXN1–/–) de tres a siete días de edad se identificaron por el crecimiento de bigotes inmaduros antes del sacrificio. Los cachorros (machos y hembras) se anestesiaron con isoflurano al 2-3% y se colocaron en un marco estereotáxico. Se realizó una trepanación del cráneo con un diámetro de aproximadamente 2-3 mm por encima de S1, manteniendo la integridad de la duramadre. Luego, use una aguja de 30 G (aproximadamente 0,3 mm) justo afuera de la craneotomía para perforar la duramadre. Luego aplique HCO a una fina lámina de parafilm de 3×3 cm y retire el exceso de medio. Usando una jeringa Hamilton conectada a una aguja de 23 G, 45°, extraiga suavemente hCO2 en el extremo más distal de la aguja. Luego instale la jeringa en la bomba de jeringa conectada al dispositivo estereotáxico. Luego coloque la punta de la aguja sobre un orificio de punción previamente hecho de 0,3 mm de ancho en la duramadre (z = 0 mm) y estreche la jeringa 1-2 mm (z = aproximadamente -1,5 mm) hasta que la aguja esté entre la duramadre A. Se forma un sello hermético. Luego eleve la jeringa al centro de la superficie cortical en z = -0,5 mm e inyecte hCO2 a una velocidad de 1-2 µl por minuto. Después de completar la inyección de hCO2, la aguja se retrae a una velocidad de 0,2-0,5 mm por minuto, la piel se sutura y el cachorro se coloca inmediatamente sobre una almohadilla térmica caliente hasta su recuperación completa. Algunos animales fueron trasplantados bilateralmente.
Todos los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con las directrices de cuidado animal aprobadas por APLAC de la Universidad de Stanford. Las ratas (más de 60 días después del trasplante) fueron inducidas con isoflurano al 5% y anestesiadas con isoflurano al 1-3% durante la adquisición de imágenes. Para la visualización, se utilizó un escáner de pozo horizontal con blindaje activo de 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) con un controlador de gradiente de International Electric Company (IECO), un inserto de gradiente blindado con un diámetro interno de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) utilizando AVANCE. III, capacidades de RF multibobina de ocho canales y multinúcleo, y la plataforma Paravision 6.0.1. El registro se realizó utilizando una bobina de RF volumétrica desacoplada activamente con un diámetro interno de 86 mm y una bobina de RF crioenfriada de cuatro canales solo para recepción. Turbo-RARE 2D axial (tiempo de repetición = 2500 ms, tiempo de eco = 33 ms, 2 promedios) con 16 capturas de corte, grosor de corte 0,6–0,8 mm, conteniendo 256 × 256 muestras. Las señales fueron recibidas usando una bobina de RF volumétrica de transceptor de cuadratura con un diámetro interno de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Finalmente, utilice las funciones integradas de estimación de superficie de Imaris (BitPlane) para renderizado 3D y análisis de volumen. Un trasplante exitoso fue definido como aquel en el cual se formaron áreas de señal de MRI continua ponderada en T2 en el hemisferio trasplantado. El rechazo del injerto fue definido como un injerto que no produjo áreas de señal de MRI continua ponderada en T2 en el hemisferio trasplantado. La t-hCO subcortical fue excluida del análisis posterior.
Para expresar GCaMP6s de forma estable en hCO3 para la obtención de imágenes de calcio con dos fotones, se infectaron células hiPS con pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, seguido de la selección de antibióticos. Brevemente, las células se disociaron con EDTA y se suspendieron en 1 ml de medio Essential 8 a una densidad aproximada de 300.000 células en presencia de polibreno (5 μg/ml) y 15 μl de virus. Posteriormente, las células se incubaron en suspensión durante 60 minutos y se sembraron a una densidad de 50.000 células por pocillo. Tras la confluencia, las células se trataron con 5-10 μg ml-1 de puromicina durante 5-10 días o hasta la aparición de colonias estables. La infección aguda con hCO3 se realizó como se describió previamente con algunas modificaciones. Brevemente, transfiera el hCO2 del día 30-45 a tubos de microcentrífuga Eppendorf de 1,5 ml que contengan 100 µl de medio nervioso. Luego, se retiran aproximadamente 90 µl del medio, se añaden de 3 a 6 µl de lentivirus de alto título (de 0,5 x 108 a 1,2 x 109) al tubo y el hCO2 se transfiere a la incubadora durante 30 minutos. Luego, agregue de 90 a 100 µl de medio a cada tubo y regrese los tubos a la incubadora durante la noche. Al día siguiente, transfiera el hCO2 a medio nervioso fresco en placas de baja adhesión. Después de 7 días, el hCO2 se transfirió a placas de fondo de vidrio de 24 pocillos para la visualización y evaluación de la calidad de la infección. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE y pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE fueron generados por VectorBuilder. El lentivirus se utiliza en la mayoría de los experimentos debido a su integración en el genoma del huésped, lo que permite la expresión del gen reportero en líneas celulares infectadas. Para el seguimiento de la rabia, entre los días 30 y 45, se coinfectó hCO con rabies-ΔG-eGFP y AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plásmido n.° 67528, Addgene), se lavó a fondo durante 3 días y se trasplantó a ratas en S1, manteniéndolas in vivo durante 7-14 días.
Para la inmunocitoquímica, los animales fueron anestesiados y perfundidos transcardialmente con PBS seguido de 4% de paraformaldehído (PFA en PBS; Electron Microscopy Sciences). Los cerebros fueron fijados en 4% de PFA durante 2 horas o durante la noche a 4°C, criopreservados en 30% de sacarosa en PBS durante 48-72 horas e incluidos en 1:1, 30% de sacarosa:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) y se realizaron cortes coronales a 30 µm utilizando un criostato (Leica). Para la inmunohistoquímica de cortes gruesos, los animales fueron perfundidos con PBS, y el cerebro fue disecado y seccionado coronalmente a 300–400 µm utilizando un vibratomo (Leica) y las secciones se fijaron con 4% de PFA durante 30 minutos. Luego, las criosecciones o secciones gruesas se lavaron con PBS, se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente (10% de suero de burro normal (NDS) y 0,3% de Triton X-100 diluido en PBS) y se bloquearon con solución de bloqueo a 4 °C. – Incubación Las criosecciones se incubaron durante la noche y las secciones gruesas se incubaron durante 5 días. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-NeuN (ratón, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conejo, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratón, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conejo, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conejo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conejo, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ratón, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (conejo, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratón, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratón, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conejo, 1:400; ABN904, Millipore) y anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-NeuN (ratón, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conejo, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratón, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conejo, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conejo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conejo, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ratón, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (conejo, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratón, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratón, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conejo, 1:400; ABN904, Millipore) y anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Utilice el anterior anterior: anti-NeuN (más, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (más, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), anti- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) y анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-NeuN (ratón, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conejo, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratón, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conejo, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conejo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conejo, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ratón, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (conejo, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratón, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratón, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conejo, 1:400; ABN904, Millipore) y anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratón, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conejo, 1:400; ABN904, Millipore) y anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam).Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-NeuN (ratón, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conejo, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pollo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratón, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conejo, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conejo, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conejo, 1:200; HPA047819, anticuerpo Atlas), anti-RECA-1 (ratón, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (conejo), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) y анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratón, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratón, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conejo, 1:400; ABN904, Millipore) y anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).Las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente (secciones congeladas) o durante la noche a 4 °C (secciones gruesas). Se utilizó el anticuerpo secundario Alexa Fluor (Life Technologies) diluido 1:1000 en solución de bloqueo. Después del lavado con PBS, los núcleos se visualizaron con un Hoechst 33258 (Life Technologies). Finalmente, los portaobjetos se colocaron en un microscopio con cubreobjetos (Fisher Scientific) utilizando un Aquamount (Polysciences) y se analizaron en un microscopio de fluorescencia Keyence (analizador BZ-X) o un microscopio confocal Leica TCS SP8 (Las-X) en la imagen. Las imágenes se procesaron utilizando el programa ImageJ (Fiji). Para cuantificar la proporción de neuronas humanas en t-hCO y la corteza de rata, se tomaron imágenes rectangulares de 387,5 μm de ancho en el centro del t-hCO, en o cerca del borde de la corteza de rata. Los márgenes del injerto se determinaron evaluando los cambios en la transparencia del tejido, los núcleos HNA+ y/o la presencia de autofluorescencia tisular. En cada imagen, el número total de células NeuN+ y HNA+ se dividió entre el número total de células NeuN+ en la misma área. Para garantizar que solo se cuenten las células con núcleos en el plano de la imagen, solo se incluyen en el cálculo las células que también son Hoechst+. Se promediaron dos imágenes separadas por al menos 1 mm para reducir el error estadístico.
Una semana antes de la toma de muestras, se colocaron los animales trasplantados con hCO₃ (aproximadamente 8 meses de diferenciación) en una habitación oscura, con los bigotes recortados para minimizar la estimulación sensorial. El aislamiento de los núcleos se realizó como se describió previamente, con algunas modificaciones. Brevemente, el t-hCO₃ y el hCO₃ se destruyeron mediante lisis celular mecánica con detergente y un triturador de tejidos de vidrio de 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Los núcleos crudos se filtraron con un filtro de 40 µm y se centrifugaron a 320 g durante 10 minutos a 4 °C antes de aplicar un gradiente de densidad de sacarosa. Tras la centrifugación (320 g durante 20 min a 4 °C), las muestras se resuspendieron en BSA/PBS al 0,04 % con 0,2 unidades de inhibidor de ARNasa µl-1 (40 µl-1, AM2682, Ambion) y se filtraron a través de un filtro de flujo de 40 µm. Los núcleos disociados se resuspendieron en PBS con BSA al 0,02 % y se cargaron en un chip Chromium Single Cell 3' (recuperación estimada de 8000 células por carril). Las bibliotecas de snRNA-seq se prepararon con el kit Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead v3 (10x Genomics). Las bibliotecas de snRNA-seq se prepararon con el kit Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead v3 (10x Genomics). Las bibliotecas snRNA-seq se combinan con el kit de perlas de gel, biblioteca y GEM de 3′ de una sola célula de cromo v3 (10x Genomics). Las bibliotecas snRNA-seq se prepararon utilizando Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. Biblioteca de snRNA-seq con kit de perlas de gel, biblioteca y GEM de una sola célula de cromo 3′ v3 (10x Genomics). La biblioteca snRNA-seq se preparó utilizando Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Admera Health reunió y secuenció bibliotecas de diferentes muestras en NovaSeq S4 (Illumina).
Los niveles de expresión génica de cada código de barras nuclear putativo se cuantificaron utilizando el paquete de análisis CellRanger de 10x Genomics (versión 6.1.2). Específicamente, las lecturas se compararon con una combinación de genomas de referencia humanos (GRCh38, Ensemble, versión 98) y de rata (Rnor_6.0, Ensemble, versión 100), creados con el comando mkref y utilizando la función count con el comando –include-introns=TRUE para incluir en la cuantificación las lecturas asignadas a regiones intrónicas. En las muestras de t-hCO3, los núcleos humanos se identificaron según el requisito conservador de que al menos el 95 % de todas las lecturas asignadas coincidieran con el genoma humano. Todos los análisis posteriores se realizaron en una matriz de códigos de barras filtrada generada por el CellRanger utilizando el paquete R (versión 4.1.2) Seurat (versión 4.1.1)32.
Para garantizar que solo se incluyan núcleos de alta calidad en el análisis posterior, se implementó un proceso de filtrado iterativo para cada muestra. Primero, se identifican y eliminan los núcleos de baja calidad con menos de 1000 genes únicos y más del 20 % del total de mitocondrias. Posteriormente, la matriz de número de genes sin procesar se normalizó mediante regresión binomial negativa regularizada utilizando la función sctransform(vst.flavor=”v2″), que también identificó los 3000 genes más variables con parámetros predeterminados. Se realizó una reducción de dimensión en los genes con mayor variabilidad mediante Análisis de Componentes Principales (ACP) con parámetros predeterminados y una dimensión del conjunto de datos de 30 (la dimensión 30 se seleccionó con base en la inspección visual de las zonas de rodilla y se utilizó para todas las muestras y análisis de conjuntos). Posteriormente, se realizaron varias rondas de agrupamiento iterativo (resolución = 1) para clasificar los genes según un recuento genético anormalmente bajo (mediana por debajo del percentil 10) y un recuento genético mitocondrial anormalmente alto (mediana por encima del percentil 95) para identificar y eliminar células putativas de baja calidad. Se identificaron agrupaciones y/o una alta proporción de gemelos sospechosos con el paquete DoubletFinder33 (puntuación media de DoubletFinder por encima del percentil 95). Muestras de t-hCO₂ (n=3) y muestras de hCO₂. (n=3) se integraron por separado mediante la función IntegrateData con los parámetros anteriores. Posteriormente, se realizó otra ronda de filtrado cualitativo del conjunto de datos integrados, como se describió anteriormente.
Tras eliminar los kernels de baja calidad, el conjunto de datos integrado se agrupó (resolución = 0,5) y se integró para la visualización de UMAP34. Los genes marcadores de cada clúster se determinaron mediante la función FindMarkers, con parámetros predeterminados calculados a partir de datos de expresión génica normalizada. Identificamos y clasificamos las principales clases celulares combinando conjuntos de datos de referencia corticales fetales y adultos con expresión de genes marcadores 19,20,21,35 y anotación. En particular, los precursores circulantes se identificaron mediante la expresión de MKI67 y TOP2A. Los clústeres progenitores se definieron por la ausencia de transcripciones mitóticas, un alto solapamiento con los clústeres progenitores gliales multipotentes descritos en la corteza fetal en metafase tardía, y la expresión de EGFR y OLIG1. Utilizamos el término astrocito para abarcar varios estados de diferenciación astrocítica, desde la glía radial tardía hasta la maduración de los astrocitos. Los grupos de astrocitos expresan altos niveles de SLC1A3 y AQP4 y se ha demostrado que se mapean con subtipos de glía radial fetal y/o astrocitos adultos. Las OPC expresan PDGFRA y SOX10, mientras que los oligodendrocitos expresan marcadores de mielinización (MOG y MYRF). Las neuronas glutamatérgicas se identificaron por la presencia de transcripciones neuronales (SYT1 y SNAP25), la ausencia de marcadores GABAérgicos (GAD2) y la expresión de NEUROD6, SLC17A7, BCL11B o SATB2. Las neuronas GluN se dividieron en subclases superiores (expresión de SATB2 y pérdida de BCL11B) y profundas (expresión de BCL11B). Las neuronas de la subplaca (SP) putativa expresan marcadores SP18 conocidos, como ST18 y SORCS1, además de marcadores GluN profundos. Las células similares al plexo coroideo se identificaron mediante la expresión de TTR, y las células similares a las meníngeas expresaron genes asociados a fibroblastos y mapearon células piales/vasculares del conjunto de datos de referencia.
Se realizó un análisis diferencial de la expresión génica entre las subclases de t-hCO y hCO mediante un nuevo método de pseudolotes reproducido en muestras implementadas con el paquete Libra R (versión 1.0.0). Específicamente, se realizaron pruebas de log-verosimilitud edgeR (versión 3.36.0, paquete R) para grupos sumando el número de genes en células para una clase celular dada para cada replicación de la muestra. Para la visualización del mapa de calor, se calcularon valores normalizados por millón (CPM) utilizando edgeR (función cpm()) y se escalaron (para lograr una media = 0, desviación estándar = 1). Se realizó un análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) de los genes GluN de t-hCO significativamente regulados al alza (valor P corregido por Benjamin-Hochberg inferior a 0,05 expresado en al menos el 10 % de las células GluN de t-hCO y un incremento en el cambio de al menos dos veces). realizado con ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Utilizamos la aplicación ToppFun con parámetros predeterminados y reportamos valores P corregidos por Benjamini-Hochberg calculados a partir de pruebas hipergeométricas anotadas por GO.
Para hacer coincidir nuestros clústeres de snRNA-seq con los clústeres de células anotadas de estudios de referencia de RNA-seq primario de una sola célula o snRNA-seq de adultos19,20,21,22, aplicamos un enfoque de integración de conjuntos de datos pareados. Utilizamos el flujo de trabajo de normalización SCTransform (v2) en Seurat para integrar y comparar las superposiciones de clústeres entre conjuntos de datos (utilizando los mismos parámetros que anteriormente). Los conjuntos de datos individuales se subdividieron aleatoriamente hasta 500 células o núcleos por clúster original para lograr eficiencia computacional. Utilizando un enfoque similar al descrito anteriormente, la superposición de clústeres se definió como la proporción de células o núcleos en cada clúster agrupado que se superponían con la etiqueta del clúster de referencia. Para clasificar mejor los GluN, utilizamos el flujo de trabajo TransferData de Seurat para datos de subconjuntos de GluN para asignar etiquetas de conjuntos de datos de referencia a nuestras células GluN.
Para evaluar el estado de maduración del transcriptoma global de las muestras de t-hCO y hCO, comparamos nuestras muestras pseudobulk con BrainSpan/psychENCODE23, que consiste en una gran secuencia de ARN que abarca el desarrollo del cerebro humano. Realizamos PCA en una matriz combinada de expresión génica normalizada por patrones de muestras corticales 10 semanas después de la concepción y posteriormente, en 5567 genes (junto con nuestros datos) que se identificaron previamente como activos en muestras corticales de BrainSpan (definidos como más del 50% en la varianza del desarrollo explicada por la edad utilizando un modelo cúbico)38. Además, derivamos genes asociados con las principales firmas del transcriptoma del neurodesarrollo utilizando factorización matricial no negativa como se describió previamente. Los pesos de la muestra calculados utilizando el procedimiento de factorización matricial no negativa se grafican en las Figs. 5b con datos expandidos para cada una de las cinco firmas descritas por Zhu et al.38. Nuevamente, los marcadores transcripcionales dependientes de la actividad se derivaron de estudios publicados previamente. En particular, ERG y LRG mostraron una sobreexpresión significativa en neuronas glutamatérgicas identificadas mediante la recopilación de secuenciación de ARNsn de la corteza visual de ratón tras la estimulación visual (Tabla Suplementaria 3, Hrvatin et al.16). Las LRG enriquecidas con genes humanos se obtuvieron a partir de cultivos de cerebro fetal humano activado con KCl y se recolectaron 6 horas después de la estimulación. Los genes filtrados mostraron una sobreexpresión significativa en humanos, pero no en roedores (Tabla Suplementaria 4). El análisis del enriquecimiento de estos conjuntos de genes se realizó mediante la prueba exacta de Fisher de una vía.
Se anestesiaron ratas con isoflurano, se extrajeron los cerebros y se colocaron en una solución de sacarosa fría (aproximadamente a 4 °C) oxigenada (95 % de O₂ y 5 % de CO₂) para obtener secciones que contuvieran: 234 mM de sacarosa, 11 mM de glucosa, 26 mM de NaHCO₃, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH₂PO₃, 10 mM de MgSO₃ y 0,5 mM de CaCl₂ (aproximadamente 310 mOsm). Se realizaron secciones coronales de cerebro de rata (300–400 µm) con t-hCO₃ utilizando un vibratomo Leica VT1200, como se describió previamente39. Las secciones se transfirieron a una cámara de corte con oxigenación continua a temperatura ambiente que contenía LCR preparado con: glucosa 10 mM, NaHCO₃ 26 mM, KCl 2,5 mM, NaHPO₃ 1,25 mM, MgSO₃ 1 mM, CaCl₂ 2 mM y NaCl 126 mM (298 mOsm), al menos 45 minutos antes del registro. Las secciones se registraron en una cámara sumergida donde se perfundieron continuamente con LCR (vial con 95 % de O₂ y 5 % de CO₂). Todos los datos se registraron a temperatura ambiente. Las neuronas de t-hCO se terminaron con una pipeta de vidrio de borosilicato llena con una solución que contenía 127 mM de gluconato de potasio, 8 mM de NaCl, 4 mM de ATP de magnesio, 0,3 mM de GTP de sodio, 10 mM de HEPES y 0,6 mM de EGTA, pH 7,2, solución interna ajustada con KOH (290 mOsm). Para su recuperación, se añadió biocitina (0,2 %) a la solución de registro.
Los datos se adquirieron con un amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) y un digitalizador Digidata 1550B (Molecular Devices), se filtraron con un filtro paso bajo a 2 kHz, se digitalizaron a 20 kHz y se analizaron con Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro 2021b, OriginLab) y funciones personalizadas de MATLAB (Mathworks). El potencial de unión se calculó con JPCalc y las entradas se ajustaron al valor calculado de -14 mV. La Operación IV consiste en una serie de pasos de corriente de 10 a 25 pA, de -250 a 750 pA.
El tálamo, la sustancia blanca y las aferencias S1 se estimularon eléctricamente en cortes talamocorticales durante el registro de fijación de parche de neuronas hCO, como se describió previamente. Brevemente, el cerebro se colocó sobre una mesa de impresión 3D inclinada 10° y la parte frontal del cerebro se seccionó a 35°. Posteriormente, el cerebro se pegó a la superficie de corte y se seccionó, preservando los axones talamocorticales salientes. Se montaron electrodos bipolares de tungsteno (0,5 MΩ) en un segundo micromanipulador y se colocaron estratégicamente para estimular cuatro regiones por célula (cápsula interna, sustancia blanca, S1 y hCO). Registre las respuestas sinápticas tras una estimulación fásica de 300 µA a 0,03–0,1 Hz.
Las neuronas hCO que expresaban hChR2 se activaron a 480 nm y se aplicaron pulsos de luz generados por un LED (Prizmatix) a través de un objetivo ×40 (0,9 NA; Olympus) para registrar la expresión de hChR2 cerca de las células. El diámetro del campo iluminado es de aproximadamente 0,5 mm y la potencia total es de 10-20 mW. La anchura del pulso se ajustó a 10 ms, que corresponde al pulso administrado durante el experimento de aprendizaje conductual. Se utilizaron varias frecuencias de estimulación, de 1 a 20 Hz, pero solo el primer pulso de la serie se utilizó para la cuantificación. Los intervalos entre trenes suelen ser superiores a 30 s para minimizar el efecto sobre las vías inhibidoras o facilitadoras sinápticas. Para comprobar si la respuesta de hChR2 era monosináptica, aplicamos TTX (1 μM) al baño hasta que desapareció la reacción EPSC y, a continuación, aplicamos 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM). Normalmente, la respuesta se obtiene en pocos minutos, con un retraso ligeramente mayor entre la activación del LED y la generación del EPSC. Se utilizó NBQX (10 μM) para comprobar si la respuesta está impulsada por los receptores AMPA.
Se crearon secciones nítidas de hCO como se describió previamente. Brevemente, las secciones de hCO se embebieron en agarosa al 4% y se transfirieron a células que contenían 126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH₂PO₄, 1 mM de MgSO₄, 2 mM de CaCl₂, 26 mM de NaHCO₃ y 10 mM de d-(+)-glucosa. Las secciones se cortaron a 200–300 µm a temperatura ambiente utilizando un vibrador Leica VT1200 y se almacenaron en LRA a temperatura ambiente. A continuación, se realizó un registro de células completas en secciones de hCO bajo un microscopio directo SliceScope (Scientifica). Las secciones se perfundieron con LCR activo (95% de O₂ y 5% de CO₂) y las señales celulares se registraron a temperatura ambiente. Las neuronas hCO se aplicaron con una pipeta de vidrio de borosilicato llena de una solución con 127 mM de gluconato de potasio, 8 mM de NaCl, 4 mM de ATP de magnesio, 0,3 mM de GTP de sodio, 10 mM de HEPES y 0,6 mM de EGTA, con un pH interno de 7,2, ajustado con KOH (osmolaridad 290). Para la recuperación, añadir 0,2 % de biocitina a la solución interna.
Los datos se adquirieron con Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) mediante un amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) y un digitalizador Digidata 1550B (Molecular Devices), se filtraron con un filtro paso bajo a 2 kHz, se digitalizaron a 20 kHz y se analizaron con Clampfit (versión 10.6 para análisis, Molecular Devices) y funciones personalizadas de MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). El potencial de unión se calculó con JPCalc y las entradas se ajustaron al potencial de unión calculado de -14 mV. La Operación IV consiste en una serie de pasos de corriente de 5 a 10 pA, desde -50 hasta 250 pA.
Para la reconstrucción morfológica de las neuronas pinzadas, se añadió biocitina al 0,2 % (Sigma-Aldrich) a la solución interna. Las células se cebaron durante al menos 15 minutos después de la manipulación. A continuación, se extrajo lentamente la pipeta durante 1 o 2 minutos hasta que la membrana registrada quedó completamente sellada. Tras el procedimiento de fisiología de las secciones, estas se fijaron durante la noche a 4 °C en PFA al 4 %, se lavaron con PBS X3 y se diluyeron 1:1000 con DyLight 549 o DyLight 405 conjugado con estreptavidina (Vector Labs). Las células con biocitina (2 %; Sigma-Aldrich) se marcaron durante el registro de fijación de parche a temperatura ambiente durante 2 horas. Las secciones se montaron en portaobjetos con un Aquamount (Thermo Scientific) y se visualizaron al día siguiente en un microscopio confocal Leica TCS SP8 con un objetivo de inmersión en aceite con una apertura numérica de ×40 1,3, aumento de ×0,9-1,0, xy. La frecuencia de muestreo es de aproximadamente 7 píxeles por micra. Se obtuvieron pilas Z en serie a intervalos de 1 µm, y se realizaron mosaicos de pilas Z y un cosido automático basado en Leica para cubrir todo el árbol dendrítico de cada neurona. Posteriormente, se realizó un seguimiento semimanual de las neuronas mediante la interfaz neuTube 40 y se generaron archivos SWC. Los archivos se subieron al complemento SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versión 2.1.0; NIH).
Se obtuvo tejido cortical humano con consentimiento informado de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Stanford. Se obtuvieron dos muestras de tejido humano posparto (de 3 y 18 años) mediante resección de la corteza frontal (giro frontal medio) como parte de una cirugía para la epilepsia refractaria. Después de la resección, se cosechó el tejido en NMDG-aCSF helado que contenía: 92 mM de NMDG, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH₂PO₄, 30 mM de NaHCO₃, 20 mM de HEPES, 25 mM de glucosa, 2 mM de tiourea, 5 mM de ascorbato de sodio, 3 mM de piruvato de sodio, 0,5 mM de CaCl₂·4H₂O y 10 mM de MgSO₄·7H₂O. Se tituló a pH 7,3-7,4 con ácido clorhídrico concentrado. Los tejidos fueron entregados al laboratorio dentro de los 30 minutos y se tomaron secciones coronales de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.
Todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal aprobadas por APLAC de la Universidad de Stanford. Las ratas (más de 140 días después del trasplante) fueron inducidas con anestesia de isoflurano al 5% y anestesiadas con isoflurano al 1-3% intraoperatoriamente. Los animales se colocaron en un marco estereotáxico (Kopf) y se inyectó buprenorfina de liberación sostenida (SR) por vía subcutánea. El cráneo se expone, se limpia y se insertan de 3 a 5 tornillos óseos. Para dirigir t-hCO, generamos coordenadas estereotáxicas a partir de imágenes de MRI. Se perforó un orificio de trépano en el sitio de interés y las fibras (400 µm de diámetro, NA 0.48, Doric) se bajaron 100 µm por debajo de la superficie de hCO y se aseguraron al cráneo con cemento dental curable por UV (Relyx).
Los registros fotométricos de fibra se realizaron como se describió previamente42. Para registrar la actividad espontánea, las ratas se colocaron en una jaula limpia y un cable de conexión de fibra óptica de 400 µm de diámetro (Doric) conectado a un sistema de adquisición de datos fotométricos de fibra óptica se conectó al cable de fibra óptica implantado. Durante los 10 minutos de registro de la actividad motora, los animales tuvieron libertad para explorar la jaula. Para registrar la actividad evocada, las ratas (más de 140 días después del trasplante) se anestesiaron con isoflurano al 5% para la inducción y con isoflurano al 1-3% para el mantenimiento. Coloque al animal en un marco estereotáctico (Kopf) y los bigotes en el lado opuesto del t-hCO se recortan a aproximadamente 2 cm y se pasan a través de una malla conectada a un actuador piezoeléctrico (PI). Un cable de conexión de fibra óptica de 400 µm (Doric) se conectó a la fibra implantada y al sistema de adquisición de datos. Los bigotes del lado opuesto del t-hCO se desviaron 50 veces (2 mm a 20 Hz, 2 s por presentación) en momentos aleatorios mediante un motor piezoeléctrico durante un periodo de grabación de 20 minutos. Utilice el paquete de soporte de Arduino MATLAB para controlar el tiempo de deflexión con código MATLAB personalizado. Los eventos se sincronizan con el software de adquisición de datos mediante pulsos de lógica transistor-transistor (TTL).
Las ratas (más de 140 días después del trasplante) fueron inducidas con anestesia con isoflurano al 5% y anestesiadas con isoflurano al 1-3% durante la operación. Los animales fueron colocados en un marco estereotáxico (Kopf) y se les inyectó buprenorfina SR y dexametasona por vía subcutánea. El cráneo se expuso, se limpió y se insertaron de 3 a 5 tornillos óseos. Para determinar la t-hCO2, generamos coordenadas estereotáxicas a partir de imágenes de resonancia magnética. Se realizó una craneotomía circular (aproximadamente 1 cm de diámetro) con un taladro de alta velocidad directamente sobre la hCO2 trasplantada. Una vez que el hueso esté lo más delgado posible, pero antes de perforarlo por completo, utilice pinzas para extraer el disco pélvico intacto restante para revelar la t-hCO2 subyacente. La craneotomía se rellenó con solución salina estéril y se fijaron al cráneo un cubreobjetos y un alfiler especial para la cabeza con cemento dental curado con luz ultravioleta (Relyx).
Se obtuvieron imágenes de dos fotones con un microscopio multifotónico Bruker y un objetivo Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Las imágenes de GCaMP6 se ​​obtuvieron a 920 nm con un aumento de 1,4x en el plano z y un promedio de 8x de 7,5 fps. Las ratas fueron inducidas con isoflurano al 5% y mantenidas con isoflurano al 1-3%. Se colocaron las ratas en un cabezal a medida y se posicionaron bajo la lente. Se obtuvo un registro de fondo de 3 minutos de la actividad motora. Durante 20 minutos de registro, se administraron aleatoriamente 50 inhalaciones (cada una de 100 ms de duración) a la almohadilla de bigotes opuesta a t-hCO3 utilizando un picospricer. Utilice el paquete de soporte de Arduino MATLAB para controlar el tiempo de ráfaga con código MATLAB personalizado. Sincronice los eventos con el software de adquisición de datos (PrairieView 5.5) mediante pulsos TTL. Para el análisis, las imágenes se corrigieron para el movimiento xy mediante corrección afín en el programa MoCo, lanzado en Fiyi. Se extrajeron trazas fluorescentes de células individuales mediante CNMF-E43. Se extrajo la fluorescencia de cada región de interés, se convirtió en curvas dF/F y, posteriormente, en puntuaciones z.
Las ratas (más de 140 días después del trasplante) fueron inducidas con anestesia con isoflurano al 5% y anestesiadas con isoflurano al 1-3% intraoperatoriamente. Los animales fueron colocados en un marco estereotáxico (Kopf) y se les inyectó buprenorfina SR y dexametasona por vía subcutánea. Los bigotes en el lado opuesto del t-hCO se cortaron a aproximadamente 2 cm y se enhebraron a través de una malla conectada a un actuador piezoeléctrico. El cráneo se expuso y se limpió. Se fijó un tornillo de acero inoxidable al cráneo. Para apuntar al t-hCO, generamos coordenadas estereotáxicas a partir de imágenes de MRI. Realice una craneotomía circular (aproximadamente 1 cm de diámetro) con un taladro de alta velocidad justo por encima del t-hCO. Una vez que el hueso esté lo más delgado posible, pero antes de perforar a través de todo el hueso, use pinzas para extraer el disco pélvico intacto restante para revelar el t-hCO subyacente. Se registraron células individuales utilizando sondas de silicio de alta densidad de 32 o 64 canales (Cambridge Neurotech), conectadas a tierra mediante tornillos y preamplificadas con amplificadores RHD (Intan). Utilice el manipulador para bajar los electrodos hasta la zona objetivo a través de la craneotomía, que se llena con solución salina estéril. La recopilación de datos se realizó a una frecuencia de 30 kHz utilizando el sistema de adquisición de datos Open Ephys. El registro solo continuó cuando se detectó actividad rítmica espontánea altamente correlacionada en más de 10 canales, lo que sugiere que los electrodos estaban ubicados en el injerto (según datos de imágenes de calcio de dos fotones). Se obtuvo un registro de fondo de 10 minutos de la actividad motora. Los bigotes del lado opuesto de t-hCO se desviaron 50 veces (2 mm a 20 Hz, 2 s por presentación) en momentos aleatorios mediante un controlador piezoeléctrico durante un período de registro de 20 minutos. Utilizando el paquete de soporte de MATLAB para Arduino (MATLAB 2019b), controle el tiempo de deflexión con código MATLAB personalizado. Utilice pulsos TTL para sincronizar eventos con el software de adquisición de datos.
Para los experimentos de marcado óptico, se conectó un cable de conexión óptica de 200 µm (Doric) a un láser de 473 nm (Omicron) a una fibra óptica de 200 µm colocada sobre la craneotomía. Inmediatamente antes, se ajustó la potencia del puente a 20 mW. Con el manipulador, se bajaron los electrodos hasta la zona objetivo a través de la craneotomía, que se llenó con solución salina estéril. Al inicio del registro, se emitieron diez pulsos de luz de 473 nm (frecuencia de 2 Hz, duración del pulso de 10 ms). Las células fotosensibles se definieron como aquellas que mostraron una respuesta de pico dentro de los 10 ms de luz en el 70 % o más de los ensayos.