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La corrosión microbiana (MIC) es un problema grave en muchas industrias, ya que puede causar enormes pérdidas económicas. El acero inoxidable súper dúplex 2707 (2707 HDSS) se ha utilizado en entornos marinos debido a su excelente resistencia química. Sin embargo, su resistencia a la MIC no se ha demostrado experimentalmente. En este estudio, se investigó el comportamiento de la MIC del 2707 HDSS causado por la bacteria aerobia marina Pseudomonas aeruginosa. El análisis electroquímico mostró que, en presencia de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa en medio 2216E, hubo un cambio positivo en el potencial de corrosión y un aumento en la densidad de corriente de corrosión. El análisis de espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS) mostró una disminución en el contenido de Cr en la superficie de la muestra debajo de la biopelícula. El análisis de imágenes de las picaduras mostró que la biopelícula de P. aeruginosa produjo una profundidad máxima de picaduras de 0,69 μm durante 14 días de incubación. Aunque esto es pequeño, indica que 2707 El HDSS no es totalmente inmune a la MIC de las biopelículas de P. aeruginosa.
Los aceros inoxidables dúplex (DSS) se utilizan ampliamente en diversas industrias por su combinación ideal de excelentes propiedades mecánicas y resistencia a la corrosión1,2. Sin embargo, aún se producen picaduras localizadas que afectan la integridad de este acero3,4. El DSS no es resistente a la corrosión microbiana (MIC)5,6. A pesar de la amplia gama de aplicaciones del DSS, todavía hay entornos en los que la resistencia a la corrosión del DSS no es suficiente para un uso a largo plazo. Esto significa que se requieren materiales más caros con mayor resistencia a la corrosión. Jeon et al7 encontraron que incluso los aceros inoxidables súper dúplex (SDSS) tienen algunas limitaciones en términos de resistencia a la corrosión. Por lo tanto, en algunas aplicaciones se requieren aceros inoxidables súper dúplex (HDSS) con mayor resistencia a la corrosión. Esto condujo al desarrollo de HDSS altamente aleados.
La resistencia a la corrosión del DSS depende de la relación entre las fases alfa y gamma, y ​​de las regiones 8, 9 y 10 empobrecidas en Cr, Mo y W adyacentes a la segunda fase. El HDSS contiene un alto contenido de Cr, Mo y N11, por lo que presenta una excelente resistencia a la corrosión y un Número Equivalente de Resistencia a las Picaduras (PREN) de alto valor (45-50), determinado por el % en peso de Cr + 3,3 (% en peso de Mo + 0,5 % en peso de W) + 16 % en peso de N12. Su excelente resistencia a la corrosión se basa en una composición equilibrada que contiene aproximadamente un 50 % de fases de ferrita (α) y un 50 % de austenita (γ). El HDSS presenta mejores propiedades mecánicas y una mayor resistencia que el DSS13 convencional. Propiedades de corrosión por cloruro. La resistencia a la corrosión mejorada amplía el uso del HDSS en entornos con cloruros más corrosivos, como los entornos marinos.
Las MIC son un problema importante en muchas industrias, como las de petróleo y gas y servicios de agua14. La MIC representa el 20% de todos los daños por corrosión15. La MIC es corrosión bioelectroquímica que se puede observar en muchos entornos. Las biopelículas que se forman en las superficies metálicas alteran las condiciones electroquímicas, lo que afecta el proceso de corrosión. Se cree ampliamente que la corrosión por MIC es causada por biopelículas. Los microorganismos electrogénicos corroen los metales para obtener energía sustentable para sobrevivir17. Estudios recientes de MIC han demostrado que la EET (transferencia de electrones extracelular) es el factor limitante de la velocidad en la MIC inducida por microorganismos electrogénicos. Zhang et al. 18 demostraron que los mediadores electrónicos aceleran la transferencia de electrones entre las células de Desulfovibrio sessificans y el acero inoxidable 304, lo que lleva a un ataque de MIC más severo. Enning et al. 19 y Venzlaff et al. 20 demostraron que las biopelículas de bacterias reductoras de sulfato (SRB) corrosivas pueden absorber directamente electrones de sustratos metálicos, lo que resulta en una corrosión por picaduras severa.
Se sabe que el DSS es susceptible a la MIC en ambientes que contienen SRB, bacterias reductoras de hierro (IRB), etc. 21. Estas bacterias causan picaduras localizadas en las superficies del DSS debajo de las biopelículas22,23. A diferencia del DSS, la MIC del HDSS24 es poco conocida.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa móvil con forma de bastón que está ampliamente distribuida en la naturaleza25. Pseudomonas aeruginosa también es un grupo microbiano importante en el entorno marino, que causa MIC en el acero. Pseudomonas está estrechamente involucrada en los procesos de corrosión y es reconocida como un colonizador pionero durante la formación de biopelículas. Mahat et al. 28 y Yuan et al. 29 demostraron que Pseudomonas aeruginosa tiene una tendencia a aumentar la tasa de corrosión del acero dulce y las aleaciones en entornos acuosos.
El objetivo principal de este trabajo fue investigar las propiedades MIC de 2707 HDSS causadas por la bacteria aerobia marina Pseudomonas aeruginosa utilizando métodos electroquímicos, técnicas analíticas de superficie y análisis de productos de corrosión. Se realizaron estudios electroquímicos que incluyeron potencial de circuito abierto (OCP), resistencia de polarización lineal (LPR), espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) y polarización dinámica potencial para estudiar el comportamiento MIC de 2707 HDSS. Se realizó un análisis de espectrómetro de energía dispersiva (EDS) para encontrar elementos químicos en la superficie corroída. Además, se utilizó el análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para determinar la estabilidad de la pasivación de la película de óxido bajo la influencia de un entorno marino que contiene Pseudomonas aeruginosa. La profundidad del hoyo se midió bajo un microscopio confocal de escaneo láser (CLSM).
La Tabla 1 enumera la composición química de 2707 HDSS. La Tabla 2 muestra que 2707 HDSS tiene excelentes propiedades mecánicas con un límite elástico de 650 MPa. La Figura 1 muestra la microestructura óptica de 2707 HDSS tratado térmicamente en solución. Se pueden ver bandas alargadas de fases de austenita y ferrita sin fases secundarias en la microestructura que contiene aproximadamente 50% de fases de austenita y 50% de ferrita.
La figura 2a muestra el potencial de circuito abierto (Eocp) versus los datos del tiempo de exposición para 2707 HDSS en medio abiótico 2216E y caldo P. aeruginosa durante 14 días a 37 °C. Muestra que el cambio más grande y significativo en Eocp ocurre dentro de las primeras 24 horas. Los valores de Eocp en ambos casos alcanzaron un máximo de -145 mV (vs. SCE) alrededor de las 16 h y luego cayeron bruscamente, alcanzando -477 mV (vs. SCE) y -236 mV (vs. SCE) para la muestra abiótica y P, respectivamente). Cupones de Pseudomonas aeruginosa, respectivamente. Después de 24 horas, el valor de Eocp de 2707 HDSS para P. aeruginosa fue relativamente estable a -228 mV (vs. SCE), mientras que el valor correspondiente para las muestras no biológicas fue de aproximadamente -442 mV (vs. SCE). El Eocp en presencia de P. aeruginosa fue bastante bajo.
Prueba electroquímica de 2707 muestras de HDSS en medio abiótico y caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp en función del tiempo de exposición, (b) curvas de polarización en el día 14, (c) Rp en función del tiempo de exposición y (d) icorr en función del tiempo de exposición.
En la Tabla 3 se listan los valores de los parámetros de corrosión electroquímica de 2707 muestras de HDSS expuestas a un medio abiótico y a un medio inoculado con Pseudomonas aeruginosa durante 14 días. Las tangentes de las curvas anódica y catódica se extrapolaron para llegar a las intersecciones que arrojaron la densidad de corriente de corrosión (icorr), el potencial de corrosión (Ecorr) y las pendientes de Tafel (βα y βc) de acuerdo con los métodos estándar30,31.
Como se muestra en la Figura 2b, el desplazamiento ascendente de la curva de P. aeruginosa resultó en un aumento en Ecorr en comparación con la curva abiótica. El valor de icorr, que es proporcional a la tasa de corrosión, aumentó a 0,328 μA cm-2 en la muestra de Pseudomonas aeruginosa, cuatro veces el de la muestra no biológica (0,087 μA cm-2).
LPR es un método electroquímico no destructivo clásico para el análisis rápido de corrosión. También se utilizó para estudiar MIC32. La Figura 2c muestra la resistencia a la polarización (Rp) en función del tiempo de exposición. Un valor de Rp más alto significa menos corrosión. Dentro de las primeras 24 horas, la Rp de 2707 HDSS alcanzó un valor máximo de 1955 kΩ cm2 para muestras abióticas y 1429 kΩ cm2 para muestras de Pseudomonas aeruginosa. La Figura 2c también muestra que el valor de Rp disminuyó rápidamente después de un día y luego permaneció relativamente sin cambios durante los siguientes 13 días. El valor de Rp de la muestra de Pseudomonas aeruginosa es de aproximadamente 40 kΩ cm2, que es mucho menor que el valor de 450 kΩ cm2 de la muestra no biológica.
El valor de icorr es proporcional a la tasa de corrosión uniforme. Su valor se puede calcular a partir de la siguiente ecuación de Stern-Geary,
Siguiendo a Zou et al. 33, se asumió que un valor típico de la pendiente de Tafel B en este trabajo fue de 26 mV/dec. La Figura 2d muestra que el icorr de la muestra no biológica 2707 se mantuvo relativamente estable, mientras que la muestra de P. aeruginosa fluctuó mucho después de las primeras 24 horas. Los valores de icorr de las muestras de P. aeruginosa fueron un orden de magnitud más alto que los controles no biológicos. Esta tendencia es consistente con los resultados de resistencia a la polarización.
La EIS es otra técnica no destructiva utilizada para caracterizar las reacciones electroquímicas en interfaces corroídas. Espectros de impedancia y valores de capacitancia calculados de muestras expuestas a medios abióticos y solución de Pseudomonas aeruginosa, resistencia Rb de película pasiva/biopelícula formada en la superficie de la muestra, resistencia de transferencia de carga Rct, capacitancia eléctrica de doble capa Cdl (EDL) y parámetros del elemento de fase constante (CPE) QCPE. Estos parámetros se analizaron más a fondo ajustando los datos utilizando un modelo de circuito equivalente (EEC).
La Figura 3 muestra los diagramas de Nyquist (a y b) y de Bode (a' y b') típicos de 2707 muestras de HDSS en medio abiótico y caldo de P. aeruginosa para diferentes tiempos de incubación. El diámetro del anillo de Nyquist disminuye en presencia de Pseudomonas aeruginosa. El diagrama de Bode (Fig. 3b') muestra un aumento en la magnitud de la impedancia total. Los máximos de fase pueden proporcionar información sobre la constante de tiempo de relajación. La Figura 4 muestra las estructuras físicas basadas en monocapa (a) y bicapa (b) y sus correspondientes EEC. Se introduce el CPE en el modelo EEC. Su admitancia e impedancia se expresan de la siguiente manera:
Dos modelos físicos y circuitos equivalentes correspondientes para ajustar el espectro de impedancia de la muestra HDSS 2707:
donde Y0 es la magnitud del CPE, j es el número imaginario o (-1)1/2, ω es la frecuencia angular y n es el índice de potencia del CPE menor que la unidad35. La inversa de la resistencia de transferencia de carga (es decir, 1/Rct) corresponde a la tasa de corrosión. Un Rct más pequeño significa una tasa de corrosión más rápida27. Después de 14 días de incubación, el Rct de las muestras de Pseudomonas aeruginosa alcanzó 32 kΩ cm2, mucho más pequeño que los 489 kΩ cm2 de las muestras no biológicas (Tabla 4).
Las imágenes CLSM y SEM en la Figura 5 muestran claramente que la cobertura de biopelícula en la superficie de la muestra de HDSS 2707 después de 7 días es densa. Sin embargo, después de 14 días, la cobertura de biopelícula era escasa y aparecieron algunas células muertas. La Tabla 5 muestra el espesor de la biopelícula en muestras de HDSS 2707 después de la exposición a P. aeruginosa durante 7 y 14 días. El espesor máximo de la biopelícula cambió de 23,4 μm después de 7 días a 18,9 μm después de 14 días. El espesor promedio de la biopelícula también confirmó esta tendencia. Disminuyó de 22,2 ± 0,7 μm después de 7 días a 17,8 ± 1,0 μm después de 14 días.
(a) Imagen CLSM 3-D después de 7 días, (b) Imagen CLSM 3-D después de 14 días, (c) Imagen SEM después de 7 días y (d) Imagen SEM después de 14 días.
La EDS reveló elementos químicos en biopelículas y productos de corrosión en muestras expuestas a P. aeruginosa durante 14 días. La Figura 6 muestra que el contenido de C, N, O y P en biopelículas y productos de corrosión es mucho mayor que en metales desnudos, porque estos elementos están asociados con biopelículas y sus metabolitos. Los microbios solo necesitan trazas de cromo y hierro. Los altos niveles de Cr y Fe en la biopelícula y los productos de corrosión en la superficie de las muestras indican que la matriz metálica ha perdido elementos debido a la corrosión.
Después de 14 días, se observaron picaduras con y sin P. aeruginosa en el medio 2216E. Antes de la incubación, la superficie de la muestra era lisa y libre de defectos (Fig. 7a). Después de la incubación y la eliminación de la biopelícula y los productos de corrosión, las picaduras más profundas en la superficie de las muestras se examinaron bajo CLSM, como se muestra en la Figura 7b y c. No se encontraron picaduras obvias en la superficie de las muestras de control no biológicas (profundidad máxima de picadura 0,02 μm). La profundidad máxima de picadura causada por Pseudomonas aeruginosa fue de 0,52 μm después de 7 días y de 0,69 μm después de 14 días, con base en la profundidad máxima promedio de picadura de 3 muestras (se seleccionaron 10 valores máximos de profundidad de picadura para cada muestra) alcanzó 0,42 ± 0,12 μm y 0,52 ± 0,15 μm, respectivamente (Tabla 5). Estas picaduras Los valores de profundidad son pequeños pero importantes.
(a) Antes de la exposición, (b) 14 días en medio abiótico y (c) 14 días en caldo de Pseudomonas aeruginosa.
La Figura 8 muestra los espectros XPS de diferentes superficies de muestra, y las composiciones químicas analizadas para cada superficie se resumen en la Tabla 6. En la Tabla 6, los porcentajes atómicos de Fe y Cr en presencia de P. aeruginosa (muestras A y B) fueron mucho menores que los de las muestras de control no biológicas (muestras C y D). Para la muestra de P. aeruginosa, la curva espectral de nivel central de Cr 2p se ajustó a cuatro componentes de pico con valores de energía de enlace (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 y 586,8 eV, que pueden atribuirse a Cr, Cr2O3, CrO3 y Cr(OH)3, respectivamente (Fig. 9a y b). Para las muestras no biológicas, el espectro de nivel central de Cr 2p contiene dos picos principales para Cr (573,80 eV para BE) y Cr2O3 (575,90 eV para BE) en la Fig. 9c y d, respectivamente. La diferencia más llamativa entre las muestras abióticas y de P. aeruginosa fue la presencia de Cr6+ y una fracción relativa más alta de Cr(OH)3 (BE de 586,8 eV) debajo de la biopelícula.
Los espectros XPS amplios de la superficie de la muestra HDSS 2707 en los dos medios son de 7 días y 14 días, respectivamente.
(a) 7 días de exposición a P. aeruginosa, (b) 14 días de exposición a P. aeruginosa, (c) 7 días en medio abiótico y (d) 14 días en medio abiótico.
El HDSS exhibe altos niveles de resistencia a la corrosión en la mayoría de los entornos. Kim et al. 2 informaron que el HDSS UNS S32707 se definió como un DSS altamente aleado con un PREN de más de 45. El valor PREN de la muestra de HDSS 2707 en este trabajo fue 49. Esto se debe a su alto contenido de cromo y altos niveles de molibdeno y Ni, que son beneficiosos en entornos ácidos y con alto contenido de cloruro. Además, una composición bien equilibrada y una microestructura libre de defectos son útiles para la estabilidad estructural y la resistencia a la corrosión. Sin embargo, a pesar de su excelente resistencia química, los datos experimentales en este trabajo sugieren que el HDSS 2707 no es completamente inmune a la MIC de las biopelículas de P. aeruginosa.
Los resultados electroquímicos mostraron que la tasa de corrosión de 2707 HDSS en caldo de P. aeruginosa aumentó significativamente después de 14 días en comparación con el medio no biológico. En la Figura 2a, se observó una reducción en Eocp tanto en el medio abiótico como en el caldo de P. aeruginosa durante las primeras 24 horas. Posteriormente, la biopelícula ha terminado de cubrir la superficie de la muestra y el Eocp se vuelve relativamente estable36. Sin embargo, el nivel de Eocp biológico fue mucho mayor que el de Eocp no biológico. Hay razones para creer que esta diferencia se debe a la formación de biopelículas de P. aeruginosa. En la Fig. 2d, en presencia de P. aeruginosa, el valor de icorr de 2707 HDSS alcanzó 0,627 μA cm-2, que fue un orden de magnitud mayor que el del control abiótico (0,063 μA cm-2), lo cual fue consistente con el valor de Rct medido por EIS. Durante los primeros días, Los valores de impedancia en el caldo de P. aeruginosa aumentaron debido a la unión de células de P. aeruginosa y la formación de biopelículas. Sin embargo, cuando la biopelícula cubre completamente la superficie de la muestra, la impedancia disminuye. La capa protectora es atacada primero debido a la formación de biopelículas y metabolitos de biopelícula. Por lo tanto, la resistencia a la corrosión disminuyó con el tiempo y la unión de P. aeruginosa provocó corrosión localizada. Las tendencias en los medios abióticos fueron diferentes. La resistencia a la corrosión del control no biológico fue mucho mayor que el valor correspondiente de las muestras expuestas al caldo de P. aeruginosa. Además, para las muestras abióticas, el valor Rct de 2707 HDSS alcanzó 489 kΩ cm2 el día 14, que fue 15 veces el valor Rct (32 kΩ cm2) en presencia de P. aeruginosa. Por lo tanto, 2707 HDSS tiene una excelente resistencia a la corrosión en un entorno estéril, pero no es resistente al ataque MIC por P. biopelículas de Aeruginosa.
Estos resultados también se pueden observar en las curvas de polarización de la Fig. 2b. La ramificación anódica se atribuyó a la formación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y a las reacciones de oxidación del metal. Al mismo tiempo, la reacción catódica es la reducción del oxígeno. La presencia de P. aeruginosa aumentó en gran medida la densidad de corriente de corrosión, aproximadamente un orden de magnitud mayor que el control abiótico. Esto indica que la biopelícula de P. aeruginosa aumenta la corrosión localizada de 2707 HDSS. Yuan et al29 encontraron que la densidad de corriente de corrosión de la aleación 70/30 Cu-Ni aumentó bajo el desafío de la biopelícula de P. aeruginosa. Esto puede deberse a la biocatálisis de la reducción de oxígeno por las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Esta observación también puede explicar la MIC de 2707 HDSS en este trabajo. Las biopelículas aeróbicas también pueden tener menos oxígeno debajo de ellas. Por lo tanto, la falta de repasivación de la superficie del metal por oxígeno puede ser un factor que contribuya a la MIC en este trabajar.
Dickinson et al. 38 sugirieron que las tasas de reacciones químicas y electroquímicas pueden verse afectadas directamente por la actividad metabólica de las bacterias sésiles en la superficie de la muestra y la naturaleza de los productos de corrosión. Como se muestra en la Figura 5 y la Tabla 5, tanto el número de células como el espesor de la biopelícula disminuyeron después de 14 días. Esto se puede explicar razonablemente porque después de 14 días, la mayoría de las células sésiles en la superficie de 2707 HDSS murieron debido al agotamiento de nutrientes en el medio 2216E o la liberación de iones metálicos tóxicos de la matriz de 2707 HDSS. Esta es una limitación de los experimentos por lotes.
En este trabajo, la biopelícula de P. aeruginosa promovió el agotamiento local de Cr y Fe debajo de la biopelícula en la superficie de 2707 HDSS (Fig. 6). En la Tabla 6, la reducción de Fe y Cr en la muestra D en comparación con la muestra C, lo que indica que el Fe y el Cr disueltos causados ​​por la biopelícula de P. aeruginosa persistieron más allá de los primeros 7 días. El medio 2216E se utiliza para simular entornos marinos. Contiene 17700 ppm de Cl-, que es comparable al encontrado en agua de mar natural. La presencia de 17700 ppm de Cl- fue la razón principal de la reducción de Cr en las muestras abióticas de 7 y 14 días analizadas por XPS. En comparación con las muestras de P. aeruginosa, la disolución de Cr en muestras abióticas fue mucho menor debido a la fuerte resistencia al Cl− de 2707 HDSS en entornos abióticos. La Figura 9 muestra la presencia de Cr6+ en la película de pasivación. Puede ser implicado en la eliminación de Cr de las superficies de acero por las biopelículas de P. aeruginosa, como sugirieron Chen y Clayton.
Debido al crecimiento bacteriano, los valores de pH del medio antes y después del cultivo fueron 7,4 y 8,2, respectivamente. Por lo tanto, por debajo de la biopelícula de P. aeruginosa, es poco probable que la corrosión por ácido orgánico sea un factor que contribuya a este trabajo debido al pH relativamente alto en el medio a granel. El pH del medio de control no biológico no cambió significativamente (de un 7,4 inicial a un 7,5 final) durante el período de prueba de 14 días. El aumento del pH en el medio de inoculación después de la incubación se debió a la actividad metabólica de P. aeruginosa y se encontró que tenía el mismo efecto sobre el pH en ausencia de tiras de prueba.
Como se muestra en la Figura 7, la profundidad máxima de picadura causada por la biopelícula de P. aeruginosa fue de 0,69 μm, que fue mucho más grande que la del medio abiótico (0,02 μm). Esto es consistente con los datos electroquímicos descritos anteriormente. La profundidad de picadura de 0,69 μm es más de diez veces menor que el valor de 9,5 μm informado para el 2205 DSS en las mismas condiciones. Estos datos demuestran que el 2707 HDSS exhibe una mejor resistencia a MIC en comparación con el 2205 DSS. Esto no debería sorprender, ya que el 2707 HDSS tiene un mayor contenido de cromo, lo que proporciona una pasivación más duradera, debido a la estructura de fase equilibrada sin precipitados secundarios dañinos, lo que dificulta que P. aeruginosa se despasive y los puntos de inicio se eclipsen.
En conclusión, se encontraron picaduras MIC en la superficie de 2707 HDSS en caldo de P. aeruginosa en comparación con picaduras insignificantes en medios abióticos. Este trabajo muestra que 2707 HDSS tiene mejor resistencia MIC que 2205 DSS, pero no es completamente inmune a MIC debido a la biopelícula de P. aeruginosa. Estos hallazgos ayudan en la selección de aceros inoxidables adecuados y la vida útil estimada para el entorno marino.
El cupón para 2707 HDSS es proporcionado por la Escuela de Metalurgia de la Universidad del Noreste (NEU) en Shenyang, China. La composición elemental de 2707 HDSS se muestra en la Tabla 1, que fue analizada por el Departamento de Análisis y Pruebas de Materiales de NEU. Todas las muestras se trataron en solución a 1180 °C durante 1 hora. Antes de la prueba de corrosión, 2707 HDSS en forma de moneda con un área de superficie superior expuesta de 1 cm2 se pulió a grano 2000 con papel de carburo de silicio y se pulió aún más con una suspensión de polvo de Al2O3 de 0,05 μm. Los lados y el fondo están protegidos por pintura inerte. Después del secado, las muestras se enjuagaron con agua desionizada estéril y se esterilizaron con etanol al 75% (v/v) durante 0,5 h. Luego se secaron al aire bajo luz ultravioleta (UV) durante 0,5 horas antes de su uso.
La cepa Pseudomonas aeruginosa marina MCCC 1A00099 se adquirió en el Centro de Recolección de Cultivos Marinos de Xiamen (MCCC), China. La Pseudomonas aeruginosa se cultivó aeróbicamente a 37 °C en matraces de 250 ml y celdas de vidrio electroquímicas de 500 ml utilizando el medio líquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). Medio (g/L): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl₂, 3,24 Na₂SO₃, 1,8 CaCl₂, 0,55 KCl, 0,16 Na₂CO₃, 0,08 KBr, 0,034 SrCl₂, 0,08 SrBr₂, 0,022 H₃BO₃, 0,004 NaSiO₃, 0,016 NH₃, 0,016 NH₃, 0,016 NaH2PO4, 5,0 peptona, 1,0 extracto de levadura y 0,1 citrato férrico. Autoclave a 121°C durante 20 minutos antes de la inoculación. Contar las células sésiles y planctónicas utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio óptico con un aumento de 400X. La concentración celular inicial de Pseudomonas aeruginosa planctónica inmediatamente después de la inoculación fue de aproximadamente 106 células/ml.
Las pruebas electroquímicas se realizaron en una celda de vidrio clásica de tres electrodos con un volumen medio de 500 ml. Una lámina de platino y un electrodo de calomelanos saturado (SCE) se conectaron al reactor mediante capilares de Luggin llenos de puentes salinos, que sirvieron como contraelectrodos y electrodos de referencia, respectivamente. Para fabricar los electrodos de trabajo, se fijó un alambre de cobre recubierto de caucho a cada muestra y se cubrió con epoxi, dejando aproximadamente 1 cm² de superficie expuesta de un solo lado para el electrodo de trabajo. Durante las mediciones electroquímicas, las muestras se colocaron en medio 2216E y se mantuvieron a una temperatura de incubación constante (37 °C) en un baño de agua. Los datos de OCP, LPR, EIS y polarización dinámica potencial se midieron utilizando un potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EE. UU.). Las pruebas de LPR se registraron a una velocidad de barrido de 0,125 mV s-1 en el rango de -5 y 5 mV con Eocp y una frecuencia de muestreo de 1 Hz. EIS fue Se realizó con una onda sinusoidal en el rango de frecuencia de 0,01 a 10 000 Hz utilizando un voltaje aplicado de 5 mV en estado estable Eocp. Antes del barrido de potencial, los electrodos estaban en modo de circuito abierto hasta que se alcanzó un valor de potencial de corrosión libre estable. Luego, se ejecutaron curvas de polarización de -0,2 a 1,5 V frente a Eocp a una velocidad de barrido de 0,166 mV/s. Cada prueba se repitió 3 veces con y sin P. aeruginosa.
Las muestras para análisis metalográfico se pulieron mecánicamente con papel de SiC húmedo de grano 2000 y luego se pulieron aún más con una suspensión de polvo de Al2O3 de 0,05 μm para observación óptica. El análisis metalográfico se realizó utilizando un microscopio óptico. Las muestras se grabaron con una solución de hidróxido de potasio al 10 % en peso 43.
Después de la incubación, las muestras se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) y luego se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % (v/v) durante 10 horas para fijar las biopelículas. Posteriormente, se deshidrató con una serie graduada (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % v/v) de etanol antes del secado al aire. Finalmente, la superficie de la muestra se pulveriza con una película de oro para proporcionar conductividad para la observación SEM. Las imágenes SEM se enfocaron en los puntos con las células de P. aeruginosa más sésiles en la superficie de cada espécimen. Realice un análisis EDS para encontrar elementos químicos. Se utilizó un microscopio láser de barrido confocal Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Alemania) para medir la profundidad de las picaduras. Para observar las picaduras de corrosión debajo de la biopelícula, La pieza de prueba se limpió primero de acuerdo con la Norma Nacional China (CNS) GB/T4334.4-2000 para eliminar los productos de corrosión y la biopelícula de la superficie de la pieza de prueba.
El análisis por espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS, sistema de análisis de superficie ESCALAB250, Thermo VG, EE. UU.) se realizó utilizando una fuente de rayos X monocromática (línea Kα de aluminio a 1500 eV de energía y 150 W de potencia) en un amplio rango de energía de enlace de 0 en condiciones estándar –1350 eV. Los espectros de alta resolución se registraron utilizando una energía de paso de 50 eV y un tamaño de paso de 0,2 eV.
Las muestras incubadas se retiraron y se enjuagaron suavemente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) durante 15 s45. Para observar la viabilidad bacteriana de las biopelículas en las muestras, las biopelículas se tiñeron utilizando el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Eugene, OR, EE. UU.). El kit tiene dos tintes fluorescentes, un tinte verde fluorescente SYTO-9 y un tinte rojo fluorescente de yoduro de propidio (PI). Bajo CLSM, los puntos con verde y rojo fluorescente representan células vivas y muertas, respectivamente. Para la tinción, se incubó una mezcla de 1 ml que contenía 3 μl de SYTO-9 y 3 μl de solución de PI durante 20 minutos a temperatura ambiente (23 °C) en la oscuridad. Posteriormente, las muestras teñidas se observaron a dos longitudes de onda (488 nm para células vivas y 559 nm para células muertas) utilizando una máquina Nikon CLSM (C2 Plus, Nikon, Japón). El espesor de la biopelícula fue medido en modo de escaneo 3D.
Cómo citar este artículo: Li, H. et al.Corrosión microbiana del acero inoxidable súper dúplex 2707 por biopelícula marina de Pseudomonas aeruginosa.science.Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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