Gracias por visitar Nature.com.La versión del navegador que está utilizando tiene compatibilidad limitada con CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador actualizado (o deshabilite el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, representaremos el sitio sin estilos ni JavaScript.
La biopsia líquida (LB) es un concepto que está ganando popularidad rápidamente en el campo biomédico.El concepto se basa principalmente en la detección de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA), que se liberan principalmente como pequeños fragmentos después de la muerte celular en varios tejidos.Una pequeña proporción de estos fragmentos se originan a partir de tejidos u organismos extraños.En el trabajo actual, hemos aplicado este concepto a los mejillones, una especie centinela conocida por su alta capacidad de filtración de agua de mar.Utilizamos la capacidad de los mejillones para actuar como filtros naturales para capturar fragmentos de ADN ambiental de una variedad de fuentes para proporcionar información sobre la biodiversidad de los ecosistemas costeros marinos.Nuestros resultados muestran que la hemolinfa del mejillón contiene fragmentos de ADN que varían mucho en tamaño, de 1 a 5 kb.La secuenciación de escopeta mostró que una gran cantidad de fragmentos de ADN son de origen microbiano extraño.Entre ellos, encontramos fragmentos de ADN de bacterias, arqueas y virus, incluidos virus que se sabe que infectan una variedad de huéspedes que se encuentran comúnmente en los ecosistemas marinos costeros.En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB aplicado a los mejillones representa una rica pero aún inexplorada fuente de conocimiento sobre la diversidad microbiana en los ecosistemas costeros marinos.
El impacto del cambio climático (CC) en la biodiversidad de los ecosistemas marinos es un área de investigación en rápido crecimiento.El calentamiento global no solo provoca importantes tensiones fisiológicas, sino que también empuja los límites evolutivos de la estabilidad térmica de los organismos marinos, afectando el hábitat de una serie de especies, incitándolas a buscar condiciones más favorables [1, 2].Además de afectar la biodiversidad de los metazoos, CC altera el delicado equilibrio de las interacciones entre el huésped y los microbios.Esta disbacteriosis microbiana representa una grave amenaza para los ecosistemas marinos, ya que hace que los organismos marinos sean más susceptibles a los patógenos infecciosos [3, 4].Se cree que los SS juegan un papel importante en las muertes masivas, lo cual es un problema grave para la gestión de los ecosistemas marinos globales [5, 6].Este es un tema importante dados los impactos económicos, ecológicos y nutricionales de muchas especies marinas.Esto es especialmente cierto para los bivalvos que viven en las regiones polares, donde los efectos de la CK son más inmediatos y graves [6, 7].De hecho, bivalvos como Mytilus spp.son ampliamente utilizados para monitorear los efectos del CC en los ecosistemas marinos.No es sorprendente que se haya desarrollado una cantidad relativamente grande de biomarcadores para monitorear su salud, a menudo utilizando un enfoque de dos niveles que involucra biomarcadores funcionales basados ​​en la actividad enzimática o funciones celulares como la viabilidad celular y la actividad fagocítica [8].Estos métodos también incluyen la medición de la concentración de indicadores de presión específicos que se acumulan en los tejidos blandos después de la absorción de grandes cantidades de agua de mar.Sin embargo, la alta capacidad de filtración y el sistema circulatorio semiabierto de los bivalvos brindan la oportunidad de desarrollar nuevos biomarcadores de hemolinfa utilizando el concepto de biopsia líquida (LB), un enfoque simple y mínimamente invasivo para el manejo de pacientes.muestras de sangre [9, 10].Aunque se pueden encontrar varios tipos de moléculas circulantes en LB humano, este concepto se basa principalmente en el análisis de secuenciación de ADN de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA) en plasma.De hecho, la presencia de ADN circulante en el plasma humano se conoce desde mediados del siglo XX [11], pero solo en los últimos años el advenimiento de los métodos de secuenciación de alto rendimiento ha llevado al diagnóstico clínico basado en ccfDNA.La presencia de estos fragmentos de ADN circulantes se debe en parte a la liberación pasiva de ADN genómico (nuclear y mitocondrial) después de la muerte celular. En individuos sanos, la concentración de ccfDNA es normalmente baja (<10 ng/mL), pero puede aumentar de 5 a 10 veces en pacientes que padecen diversas patologías o están sometidos a estrés, lo que resulta en daño tisular. En individuos sanos, la concentración de ccfDNA es normalmente baja (<10 ng/mL), pero puede aumentar de 5 a 10 veces en pacientes que padecen diversas patologías o están sometidos a estrés, lo que resulta en daño tisular. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 ра з у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению т каней. En personas sanas, la concentración de cccDNA normalmente es baja (<10 ng/mL), pero puede aumentar de 5 a 10 veces en pacientes con diversas patologías o bajo estrés que conduce a daño tisular.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 р аз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Las concentraciones de ccfDNA suelen ser bajas (<10 ng/ml) en individuos sanos, pero pueden aumentar de 5 a 10 veces en pacientes con diversas patologías o estrés, lo que resulta en daño tisular.El tamaño de los fragmentos de ccfDNA varía ampliamente, pero generalmente oscila entre 150 y 200 pb.[12].El análisis de ccfDNA autoderivado, es decir, ccfDNA de células huésped normales o transformadas, se puede utilizar para detectar cambios genéticos y epigenéticos presentes en el genoma nuclear y/o mitocondrial, lo que ayuda a los médicos a seleccionar terapias específicas dirigidas a moléculas [13] .Sin embargo, ccfDNA se puede obtener de fuentes externas como ccfDNA de células fetales durante el embarazo o de órganos trasplantados [14,15,16,17].ccfDNA también es una importante fuente de información para detectar la presencia de ácidos nucleicos de un agente infeccioso (extraño), lo que permite la detección no invasiva de infecciones generalizadas no identificadas por hemocultivos, evitando la biopsia invasiva del tejido infectado [18].De hecho, estudios recientes han demostrado que la sangre humana contiene una rica fuente de información que puede usarse para identificar patógenos virales y bacterianos, y que aproximadamente el 1% del ccfDNA que se encuentra en el plasma humano es de origen extraño [19].Estos estudios demuestran que la biodiversidad del microbioma circulante de un organismo se puede evaluar mediante el análisis ccfDNA.Sin embargo, hasta hace poco tiempo, este concepto se utilizaba exclusivamente en humanos y, en menor medida, en otros vertebrados [20, 21].
En el presente artículo, usamos el potencial LB para analizar el ccfDNA de Aulacomya atra, una especie del sur que se encuentra comúnmente en las islas subantárticas Kerguelen, un grupo de islas sobre una gran meseta que se formó hace 35 millones de años.erupción volcánica.Utilizando un sistema experimental in vitro, descubrimos que los fragmentos de ADN en el agua de mar son absorbidos rápidamente por los mejillones y entran en el compartimento de la hemolinfa.La secuenciación de escopeta ha demostrado que el ccfDNA de la hemolinfa del mejillón contiene fragmentos de ADN de origen propio y no propio, incluidas bacterias simbióticas y fragmentos de ADN de biomas típicos de ecosistemas costeros marinos volcánicos fríos.Hemolinfa ccfDNA también contiene secuencias virales derivadas de virus con diferentes rangos de huéspedes.También encontramos fragmentos de ADN de animales multicelulares como peces óseos, anémonas de mar, algas e insectos.En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto LB se puede aplicar con éxito a los invertebrados marinos para generar un rico repertorio genómico en los ecosistemas marinos.
Se recolectaron adultos (55-70 mm de largo) Mytilus platensis (M. platensis) y Aulacomya atra (A. atra) de las costas rocosas intermareales de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Islas Kerguelen en diciembre de 2018. Se obtuvieron otros mejillones azules (Mytilus spp.) adultos de un proveedor comercial (PEI Mussel King Inc., Isla del Príncipe Eduardo, Canadá) y se colocaron en un tanque aireado con temperatura controlada (4 °C) que contenía 10–20 L de salmuera artificial al 32‰.(sal marina artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, EE. UU.).Para cada experimento, se midieron la longitud y el peso de las conchas individuales.
Un protocolo de acceso abierto gratuito para este programa está disponible en línea (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Brevemente, la hemolinfa LB se recolectó de los músculos abductores como se describe [22].La hemolinfa se clarificó por centrifugación a 1200xg durante 3 minutos, el sobrenadante se congeló (-20°C) hasta su uso.Para el aislamiento y la purificación de cfDNA, las muestras (1,5-2,0 ml) se descongelaron y procesaron utilizando el kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) según las instrucciones del fabricante.ccfDNA se almacenó a -80 ° C hasta su posterior análisis.En algunos experimentos, ccfDNA se aisló y purificó utilizando el QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadá).El ADN purificado se cuantificó utilizando un ensayo PicoGreen estándar.La distribución de fragmentos del ccfDNA aislado se analizó mediante electroforesis capilar usando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) usando un kit de ADN de alta sensibilidad.El ensayo se realizó utilizando 1 µl de la muestra ccfDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la secuenciación de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparó bibliotecas de escopeta utilizando el kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75.Se utilizó un adaptador estándar (BioO).Los archivos de datos sin procesar están disponibles en el Archivo de lectura de secuencias de NCBI (SRR8924808 y SRR8924809).La calidad de lectura básica se evaluó mediante FastQC [23].Trimmomatic [24] se ha utilizado para adaptadores de recorte y lecturas de baja calidad.Las lecturas de escopeta con extremos emparejados se fusionaron con FLASH en lecturas individuales más largas con una superposición mínima de 20 pb para evitar desajustes [25]. Las lecturas fusionadas se anotaron con BLASTN utilizando una base de datos de taxonomía NCBI de bivalvos (valor e < 1e-3 y 90 % de homología), y el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad se realizó mediante DUST [26]. Las lecturas fusionadas se anotaron con BLASTN utilizando una base de datos de taxonomía NCBI de bivalvos (valor e < 1e-3 y 90 % de homología), y el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad se realizó mediante DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии д вустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 y 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Las lecturas agrupadas se anotaron con BLASTN utilizando la base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e-3 y 90 % de homología) y el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad se realizó mediante DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 polvo [26] 进行掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данн ых двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 y 90% гомологии), а маскирование последовательностей ни зкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Las lecturas agrupadas se anotaron con BLASTN utilizando la base de datos taxonómica de bivalvos del NCBI (valor e <1e-3 y 90 % de homología), y el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad se realizó mediante DUST [26].Las lecturas se dividieron en dos grupos: relacionadas con secuencias bivalvas (aquí denominadas autolecturas) y no relacionadas (no autolecturas).Se ensamblaron dos grupos por separado usando MEGAHIT para generar contigs [27].Mientras tanto, la distribución taxonómica de las lecturas de microbiomas alienígenas se clasificó utilizando Kraken2 [28] y se representó gráficamente mediante un gráfico circular Krona en Galaxy [29, 30].Se determinó que los kmers óptimos eran kmers-59 a partir de nuestros experimentos preliminares. Luego, los autocontigs se identificaron mediante la alineación con BLASTN (base de datos NCBI de bivalvos, valor e < 1e-10 y 60% de homología) para una anotación final. Luego, los autocontigs se identificaron mediante la alineación con BLASTN (base de datos NCBI de bivalvos, valor e < 1e-10 y 60% de homología) para una anotación final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоствления с BLASTN (база данных двустворча тых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. A continuación, se identificaron los autocontigs comparándolos con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor de e <1e-10 y 60 % de homología) para la anotación final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). A continuación, se identificaron los autocontigs para la anotación final comparándolos con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e <1e-10 y 60 % de homología). Paralelamente, los contigs de grupos no propios se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología). Paralelamente, los contigs de grupos no propios se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 y гомология 60%). Paralelamente, los contigs de grupos extraños se anotaron con BLASTN (base de datos NT NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база ndанных nt NCBI, значение e <1e-10 y гомология 60%). Paralelamente, los contigs del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos NCBI de proteínas nr y RefSeq (valor e < 1e-10 y 60% de homología). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos NCBI de proteínas nr y RefSeq (valor e < 1e-10 y 60% de homología). BLASTX tác. BI (значение e <1e-10 y гомология 60%). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 y 60% de homología).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI ( значение e <1e-10 y гомология 60%). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq NCBI (valor e <1e-10 y 60% de homología).Los grupos BLASTN y BLASTX de no autocontigs representan los contigs finales (consulte el archivo complementario).
Los cebadores utilizados para la PCR se enumeran en la Tabla S1.Se usó ADN polimerasa Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) para amplificar los genes diana ccfDNA.Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización a 95°C durante 3 minutos, 95°C durante 1 minuto, temperatura de hibridación establecida durante 1 minuto, elongación a 72°C durante 1 minuto, 35 ciclos y finalmente 72°C en 10 minutos..Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa (1,5 %) que contenían SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Mejillones (Mytilus spp.) fueron aclimatados en 500 ml de agua de mar oxigenada (32 PSU) durante 24 horas a 4°C.Se añadió al vial ADN de plásmido que contenía un inserto que codificaba la secuencia de ADNc de galectina-7 humana (número de acceso L07769 de NCBI) a una concentración final de 190 μg/μl.Los mejillones incubados en las mismas condiciones sin adición de ADN fueron el control.El tercer tanque de control contenía ADN sin mejillones.Para monitorear la calidad del ADN en el agua de mar, se tomaron muestras de agua de mar (20 μl; tres repeticiones) de cada tanque en el momento indicado.Para la trazabilidad del ADN plasmídico, se recolectaron mejillones LB en los tiempos indicados y se analizaron mediante qPCR y ddPCR.Debido al alto contenido de sal del agua de mar, las alícuotas se diluyeron en agua de calidad para PCR (1:10) antes de todos los ensayos de PCR.
La PCR digital de gotas (ddPCR) se realizó utilizando el protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadá).Utilice el perfil de temperatura para determinar la temperatura óptima (Tabla S1).Las gotas se generaron usando un generador de gotas QX200 (BioRad).La ddPCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 95 °C durante 5 min, 50 ciclos de 95 °C durante 30 s y una temperatura de hibridación determinada durante 1 min y 72 °C durante 30 s, 4 °C durante 5 min y 90 °C durante 5 minutos.El número de gotas y las reacciones positivas (número de copias/µl) se midieron usando un lector de gotas QX200 (BioRad).Se rechazaron las muestras con menos de 10.000 gotas.El control de patrón no se realizó cada vez que se ejecutó ddPCR.
La qPCR se realizó con Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) y cebadores específicos LGALS7.Todas las PCR cuantitativas se realizaron en 20 µl utilizando el kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).qPCR se inició con una incubación de 15 min a 95 °C seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 10 segundos y a 60 °C durante 60 segundos con una recopilación de datos.Las curvas de fusión se generaron mediante mediciones sucesivas a 95 °C durante 5 s, 65 °C durante 60 s y 97 °C al final de la qPCR.Cada qPCR se realizó por triplicado, excepto para las muestras de control.
Dado que los mejillones son conocidos por su alta tasa de filtración, primero investigamos si podían filtrar y retener fragmentos de ADN presentes en el agua de mar.También nos interesó saber si estos fragmentos se acumulan en su sistema linfático semiabierto.Resolvimos este problema experimentalmente al rastrear el destino de los fragmentos de ADN soluble agregados a los tanques de mejillón azul.Para facilitar el seguimiento de los fragmentos de ADN, utilizamos ADN plásmido extraño (no propio) que contiene el gen de la galectina-7 humana.ddPCR rastrea fragmentos de ADN de plásmido en agua de mar y mejillones.Nuestros resultados muestran que si la cantidad de fragmentos de ADN en el agua de mar permaneció relativamente constante a lo largo del tiempo (hasta 7 días) en ausencia de mejillones, entonces, en presencia de mejillones, este nivel desapareció casi por completo en 8 horas (Fig. 1a,b).Los fragmentos de ADN exógeno se detectaron fácilmente en 15 minutos en líquido intravalvular y hemolinfa (Fig. 1c).Estos fragmentos aún podrían detectarse hasta 4 horas después de la exposición.Esta actividad de filtración con respecto a los fragmentos de ADN es comparable a la actividad de filtración de bacterias y algas [31].Estos resultados sugieren que los mejillones pueden filtrar y acumular ADN extraño en sus compartimentos de fluidos.
Concentraciones relativas de ADN plasmídico en agua de mar en presencia (A) o ausencia (B) de mejillones, medidas por ddPCR.En A, los resultados se expresan como porcentajes, con los bordes de las casillas representando los percentiles 75 y 25.La curva logarítmica ajustada se muestra en rojo y el área sombreada en gris representa el intervalo de confianza del 95 %.En B, la línea roja representa la media y la línea azul representa el intervalo de confianza del 95 % para la concentración.C Acumulación de ADN plasmídico en la hemolinfa y líquido valvular de mejillones en diferentes momentos después de la adición del ADN plasmídico.Los resultados se presentan como copias absolutas detectadas/mL (±SE).
A continuación, investigamos el origen del ccfDNA en mejillones recolectados en lechos de mejillones en las Islas Kerguelen, un grupo remoto de islas con influencia antropogénica limitada.Para este propósito, se aisló cccDNA de hemolinfas de mejillón y se purificó mediante métodos comúnmente utilizados para purificar cccDNA humano [32, 33].Descubrimos que las concentraciones promedio de ccfDNA de hemolinfa en mejillones están en el rango bajo de microgramos por ml de hemolinfa (consulte la Tabla S2, Información complementaria).Este rango de concentraciones es mucho mayor que en personas sanas (bajos nanogramos por mililitro), pero en casos raros, en pacientes con cáncer, el nivel de ccfDNA puede alcanzar varios microgramos por mililitro [34, 35].Un análisis de la distribución de tamaño del ccfDNA de hemolinfa mostró que estos fragmentos varían mucho en tamaño, desde 1000 pb hasta 1000 pb.hasta 5000 pb (Fig. 2).Se obtuvieron resultados similares utilizando el QIAamp Investigator Kit basado en sílice, un método comúnmente utilizado en la ciencia forense para aislar y purificar rápidamente el ADN genómico a partir de muestras de ADN de baja concentración, incluido el ccfDNA [36].
Electroforegrama ccfDNA representativo de hemolinfa de mejillón.Extraído con el kit NucleoSnap Plasma (arriba) y el kit QIAamp DNA Investigator.B Gráfica de violín que muestra la distribución de las concentraciones de ccfDNA de hemolinfa (± SE) en mejillones.Las líneas negras y rojas representan la mediana y el primer y tercer cuartil, respectivamente.
Aproximadamente el 1 % del ccfDNA en humanos y primates tiene una fuente externa [21, 37].Dado el sistema circulatorio semiabierto de los bivalvos, el agua de mar rica en microbios y la distribución de tamaños del ccfDNA del mejillón, planteamos la hipótesis de que el ccfDNA de la hemolinfa del mejillón puede contener un grupo rico y diverso de ADN microbiano.Para probar esta hipótesis, secuenciamos hemolinfa ccfDNA de Aulacomya atra muestras recolectadas de las islas Kerguelen, lo que arrojó más de 10 millones de lecturas, el 97,6% de las cuales pasaron el control de calidad.Luego, las lecturas se clasificaron según fuentes propias y no propias utilizando las bases de datos de bivalvos BLASTN y NCBI (Fig. S1, Información complementaria).
En los seres humanos, tanto el ADN nuclear como el mitocondrial pueden liberarse en el torrente sanguíneo [38].Sin embargo, en el presente estudio no fue posible describir en detalle el ADN genómico nuclear de los mejillones, dado que el genoma de A. atra no ha sido secuenciado ni descrito.Sin embargo, pudimos identificar una serie de fragmentos de ccfDNA de nuestro propio origen utilizando la biblioteca de bivalvos (Fig. S2, Información complementaria).También confirmamos la presencia de fragmentos de ADN de nuestro propio origen mediante amplificación por PCR dirigida de aquellos genes de A. atra que fueron secuenciados (fig. 3).Del mismo modo, dado que el genoma mitocondrial de A. atra está disponible en bases de datos públicas, se puede encontrar evidencia de la presencia de fragmentos de ccfDNA mitocondrial en la hemolinfa de A. atra.La presencia de fragmentos de ADN mitocondrial se confirmó mediante amplificación por PCR (fig. 3).
Varios genes mitocondriales estaban presentes en la hemolinfa de A. atra (puntos rojos, número de inventario: SRX5705969) y M. platensis (puntos azules, número de inventario: SRX5705968) amplificados por PCR.Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificación del sobrenadante de hemolinfa de A. atra Almacenado en papel FTA.Use un punzón de 3 mm para agregar directamente al tubo de PCR que contiene la mezcla de PCR.
Dado el abundante contenido microbiano en el agua de mar, inicialmente nos centramos en la caracterización de las secuencias de ADN microbiano en la hemolinfa.Para ello, utilizamos dos estrategias diferentes.La primera estrategia utilizó Kraken2, un programa de clasificación de secuencias basado en algoritmos que puede identificar secuencias microbianas con una precisión comparable a BLAST y otras herramientas [28].Se determinó que más de 6719 lecturas eran de origen bacteriano, mientras que 124 y 64 eran de arqueas y virus, respectivamente (Fig. 4).Los fragmentos de ADN bacteriano más abundantes fueron Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) y Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Esta distribución es consistente con estudios previos del microbioma del mejillón azul marino [39, 40].Las gammaproteobacterias fueron la clase principal de Proteobacterias (44%), incluidas muchas Vibrionales (Fig. 4b).El método ddPCR confirmó la presencia de fragmentos de ADN de Vibrio en el ccfDNA de hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41].Para obtener más información sobre el origen bacteriano de ccfDNA, se tomó un enfoque adicional (Fig. S2, Información complementaria). En este caso, las lecturas que se superpusieron se ensamblaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como de origen propio (bivalvos) o no propio utilizando BLASTN y un valor e de 1e-3 y un límite con > 90 % de homología. En este caso, las lecturas que se superpusieron se ensamblaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como de origen propio (bivalvos) o no propio utilizando BLASTN y un valor e de 1e-3 y un límite con > 90 % de homología. Ver todas las opciones disponibles фицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием B LASTN y значения e 1e-3 y отсечения с гомологией> 90%. En este caso, las lecturas superpuestas se recolectaron como lecturas emparejadas y se clasificaron como nativas (bivalvas) o no originales usando BLASTN y un valor e de 1e-3 y corte con > 90 % de homología.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% Ver todas las opciones disponibles ваны как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. En este caso, las lecturas superpuestas se recopilaron como lecturas emparejadas y se clasificaron como propias (bivalvos) o no originales utilizando los valores e BLASTN y 1e-3 y un umbral de homología >90 %.Dado que el genoma de A. atra aún no se ha secuenciado, utilizamos la estrategia de ensamblaje de novo del ensamblador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Se han identificado un total de 147.188 contigs como dependientes (bivalvos) de origen.Estos contigs luego se explotaron con valores e de 1e-10 usando BLASTN y BLASTX.Esta estrategia nos permitió identificar 482 fragmentos no bivalvos presentes en A. atra ccfDNA.Más de la mitad (57%) de estos fragmentos de ADN se obtuvieron de bacterias, principalmente de simbiontes branquiales, incluidos los simbiontes sulfotróficos, y de simbiontes branquiales Solemya velum (Fig. 5).
Abundancia relativa a nivel de tipo.B Diversidad microbiana de dos filos principales (Firmicutes y Proteobacteria).Amplificación representativa de ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmentos del gen 16S rRNA (azul) en tres atra hemolinfas.
Se analizaron un total de 482 contigs recolectados.Perfil general de la distribución taxonómica de las anotaciones metagenómicas de contig (procariotas y eucariotas).B Distribución detallada de fragmentos de ADN bacteriano identificados por BLASTN y BLASTX.
El análisis de Kraken2 también mostró que el ccfDNA del mejillón contenía fragmentos de ADN de arqueas, incluidos fragmentos de ADN de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) y Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).La presencia de fragmentos de ADN derivados de Euryarchaeota y Crenarchaeota, encontrados previamente en la comunidad microbiana de los mejillones de California, no debería sorprender [42].Aunque Euryarchaeota a menudo se asocia con condiciones extremas, ahora se reconoce que tanto Euryarchaeota como Crenarcheota se encuentran entre los procariotas más comunes en el entorno criogénico marino [43, 44].La presencia de microorganismos metanogénicos en mejillones no es sorprendente, dados los informes recientes de fugas extensas de metano en el fondo de la meseta de Kerguelen [45] y la posible producción microbiana de metano observada en la costa de las islas Kerguelen [46].
Nuestra atención luego se centró en las lecturas de los virus de ADN.Hasta donde sabemos, este es el primer estudio fuera del objetivo del contenido de virus de los mejillones.Como era de esperar, encontramos fragmentos de ADN de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b).Sin embargo, el ADN viral más común proviene de un filo de nucleocitovirus, también conocido como virus de ADN grande citoplasmático nuclear (NCLDV), que tiene el genoma más grande de todos los virus.Dentro de este filo, la mayoría de las secuencias de ADN pertenecen a las familias Mimimidoviridae (58%) y Poxviridae (21%), cuyos huéspedes naturales incluyen vertebrados y artrópodos, mientras que una pequeña proporción de estas secuencias de ADN pertenecen a algas virológicas conocidas.Infecta algas eucariotas marinas.Las secuencias también se obtuvieron del virus Pandora, el virus gigante con el tamaño de genoma más grande de todos los géneros virales conocidos.Curiosamente, el rango de huéspedes que se sabe que están infectados con el virus, según lo determinado por la secuenciación de hemolinfa ccfDNA, fue relativamente grande (Figura S3, Información complementaria).Incluye virus que infectan insectos como Baculoviridae e Iridoviridae, así como virus que infectan amebas, algas y vertebrados.También encontramos secuencias que coinciden con el genoma de Pithovirus sibericum.Los pitovirus (también conocidos como "virus zombis") se aislaron por primera vez del permafrost de 30 000 años de antigüedad en Siberia [47].Por lo tanto, nuestros resultados son consistentes con informes anteriores que muestran que no todas las especies modernas de estos virus están extintas [48] y que estos virus pueden estar presentes en ecosistemas marinos subárticos remotos.
Finalmente, probamos para ver si podíamos encontrar fragmentos de ADN de otros animales multicelulares.BLASTN y BLASTX identificaron un total de 482 contigs extraños con bibliotecas nt, nr y RefSeq (genómica y de proteínas).Nuestros resultados muestran que entre los fragmentos extraños de ccfDNA de animales multicelulares predomina el ADN de huesos óseos (Fig. 5).También se han encontrado fragmentos de ADN de insectos y otras especies.No se ha identificado una parte relativamente grande de los fragmentos de ADN, posiblemente debido a la subrepresentación de un gran número de especies marinas en las bases de datos genómicas en comparación con las especies terrestres [49].
En el presente artículo, aplicamos el concepto LB a los mejillones, argumentando que la secuenciación de disparos de ccfDNA de hemolinfa puede proporcionar información sobre la composición de los ecosistemas costeros marinos.En particular, encontramos que 1) la hemolinfa del mejillón contiene concentraciones relativamente altas (niveles de microgramos) de fragmentos de ADN circulantes relativamente grandes (~ 1-5 kb);2) estos fragmentos de ADN son independientes y no independientes 3) Entre las fuentes extrañas de estos fragmentos de ADN, encontramos ADN bacteriano, arqueal y viral, así como ADN de otros animales multicelulares;4) La acumulación de estos fragmentos extraños de ccfDNA en la hemolinfa ocurre rápidamente y contribuye a la actividad de filtración interna de los mejillones.En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB, que hasta ahora se ha aplicado principalmente en el campo de la biomedicina, codifica una fuente de conocimiento rica pero inexplorada que puede utilizarse para comprender mejor la interacción entre las especies centinela y su entorno.
Además de los primates, se ha informado el aislamiento de ccfDNA en mamíferos, incluidos ratones, perros, gatos y caballos [50, 51, 52].Sin embargo, hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero en informar la detección y secuenciación de ccfDNA en especies marinas con un sistema de circulación abierto.Esta característica anatómica y la capacidad de filtrado de los mejillones pueden, al menos en parte, explicar las diferentes características de tamaño de los fragmentos de ADN circulantes en comparación con otras especies.En los seres humanos, la mayoría de los fragmentos de ADN que circulan en la sangre son pequeños fragmentos que varían en tamaño entre 150 y 200 pb.con un pico máximo de 167 pb [34, 53].Una porción pequeña pero significativa de los fragmentos de ADN tiene un tamaño de entre 300 y 500 pb, y alrededor del 5% tiene más de 900 pb.[54].El motivo de esta distribución de tamaño es que la principal fuente de ccfDNA en el plasma se produce como resultado de la muerte celular, ya sea por muerte celular o por necrosis de las células hematopoyéticas circulantes en individuos sanos o por apoptosis de células tumorales en pacientes con cáncer (conocido como ADN tumoral circulante)., ADNc).La distribución del tamaño del ccfDNA de la hemolinfa que encontramos en los mejillones osciló entre 1000 y 5000 pb, lo que sugiere que el ccfDNA del mejillón tiene un origen diferente.Esta es una hipótesis lógica, ya que los mejillones tienen un sistema vascular semiabierto y viven en ambientes acuáticos marinos que contienen altas concentraciones de ADN genómico microbiano.De hecho, nuestros experimentos de laboratorio utilizando ADN exógeno han demostrado que los mejillones acumulan fragmentos de ADN en el agua de mar, al menos después de unas pocas horas se degradan después de la absorción celular y/o se liberan y/o se almacenan en varias organizaciones.Dada la rareza de las células (tanto procariotas como eucariotas), el uso de compartimentos intravalvulares reducirá la cantidad de ccfDNA tanto de fuentes propias como de fuentes externas.Teniendo en cuenta la importancia de la inmunidad innata de los bivalvos y la gran cantidad de fagocitos circulantes, planteamos la hipótesis de que incluso el ccfDNA extraño se enriquece en fagocitos circulantes que acumulan ADN extraño al ingerir microorganismos y/o restos celulares.En conjunto, nuestros resultados muestran que la hemolinfa bivalva ccfDNA es un depósito único de información molecular y refuerza su condición de especie centinela.
Nuestros datos indican que la secuenciación y el análisis de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa derivados de bacterias pueden proporcionar información clave sobre la flora bacteriana huésped y las bacterias presentes en el ecosistema marino circundante.Las técnicas de secuenciación por disparo han revelado secuencias de la bacteria comensal A. atra gill que se habrían pasado por alto si se hubieran utilizado métodos de identificación de ARNr 16S convencionales, debido en parte a un sesgo de la biblioteca de referencia.De hecho, nuestro uso de los datos de LB recopilados de M. platensis en la misma capa de mejillones en Kerguelen mostró que la composición de los simbiontes bacterianos asociados a las branquias era la misma para ambas especies de mejillones (Fig. S4, Información complementaria).Esta similitud de dos mejillones genéticamente diferentes puede reflejar la composición de las comunidades bacterianas en los depósitos fríos, sulfurosos y volcánicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58].Se han descrito bien niveles más altos de microorganismos reductores de azufre al recolectar mejillones de áreas costeras bioturbadas [59], como la costa de Port-au-France.Otra posibilidad es que la flora comensal del mejillón se vea afectada por la transmisión horizontal [60, 61].Se necesita más investigación para determinar la correlación entre el ambiente marino, la superficie del fondo marino y la composición de bacterias simbióticas en los mejillones.Estos estudios están actualmente en curso.
La longitud y la concentración de ccfDNA de hemolinfa, su facilidad de purificación y su alta calidad para permitir una secuenciación rápida son algunas de las muchas ventajas de usar ccfDNA de mejillón para evaluar la biodiversidad en los ecosistemas costeros marinos.Este enfoque es especialmente efectivo para caracterizar comunidades virales (viromas) en un ecosistema dado [62, 63].A diferencia de las bacterias, las arqueas y los eucariotas, los genomas virales no contienen genes conservados filogenéticamente, como las secuencias 16S.Nuestros resultados indican que las biopsias líquidas de especies indicadoras como los mejillones se pueden utilizar para identificar un número relativamente grande de fragmentos del virus ccfDNA que se sabe que infectan a los huéspedes que normalmente habitan en los ecosistemas marinos costeros.Esto incluye virus que se sabe que infectan protozoos, artrópodos, insectos, plantas y virus bacterianos (p. ej., bacteriófagos).Se encontró una distribución similar cuando examinamos el viroma ccfDNA de hemolinfa de mejillones azules (M. platensis) recolectados en la misma capa de mejillones en Kerguelen (Tabla S2, Información complementaria).La secuenciación de escopeta de ccfDNA es de hecho un nuevo enfoque que gana impulso en el estudio del viroma de humanos u otras especies [21, 37, 64].Este enfoque es particularmente útil para estudiar virus de ADN de doble cadena, ya que no se conserva ningún gen único entre todos los virus de ADN de doble cadena, lo que representa la clase de virus más amplia y diversa en Baltimore [65].Aunque la mayoría de estos virus permanecen sin clasificar y pueden incluir virus de una parte completamente desconocida del mundo viral [66], encontramos que los viromas y los rangos de huéspedes de los mejillones A. atra y M. platensis se encuentran entre las dos especies.de manera similar (ver figura S3, información adicional).Esta similitud no es sorprendente, ya que puede reflejar una falta de selectividad en la captación de ADN presente en el medio ambiente.Actualmente se necesitan estudios futuros que utilicen ARN purificado para caracterizar el viroma de ARN.
En nuestro estudio, usamos una tubería muy rigurosa adaptada del trabajo de Kowarski y colegas [37], quienes usaron una eliminación de dos pasos de lecturas agrupadas y contigs antes y después del ensamblaje de ccfDNA nativo, lo que resultó en una alta proporción de lecturas no asignadas.Por lo tanto, no podemos descartar que algunas de estas lecturas no mapeadas aún puedan tener su propio origen, principalmente porque no tenemos un genoma de referencia para esta especie de mejillón.También usamos esta canalización porque nos preocupaban las quimeras entre lecturas propias y no propias y las longitudes de lectura generadas por Illumina MiSeq PE75.Otra razón para la mayoría de las lecturas no registradas es que gran parte de los microbios marinos, especialmente en áreas remotas como Kerguelen, no se han anotado.Usamos Illumina MiSeq PE75, asumiendo longitudes de fragmentos de ccfDNA similares a las de ccfDNA humano.Para estudios futuros, dados nuestros resultados que muestran que el ccfDNA de hemolinfa tiene lecturas más largas que los humanos o los mamíferos, recomendamos usar una plataforma de secuenciación más adecuada para fragmentos de ccfDNA más largos.Esta práctica hará que sea mucho más fácil identificar más indicaciones para un análisis más profundo.Obtener la secuencia completa del genoma nuclear de A. atra actualmente no disponible también facilitaría en gran medida la discriminación de ccfDNA de fuentes propias y ajenas.Dado que nuestra investigación se ha centrado en la posibilidad de aplicar el concepto de biopsia líquida a los mejillones, esperamos que a medida que este concepto se utilice en futuras investigaciones, se desarrollarán nuevas herramientas y líneas de producción para aumentar el potencial de este método para estudiar la diversidad microbiana de los mejillones.ecosistema marino.
Como biomarcador clínico no invasivo, los niveles elevados de ccfDNA en plasma humano están asociados con diversas enfermedades, daño tisular y condiciones de estrés [67,68,69].Este aumento está asociado a la liberación de fragmentos de ADN de origen propio tras el daño tisular.Abordamos este problema utilizando el estrés por calor agudo, en el que los mejillones se expusieron brevemente a una temperatura de 30 °C.Realizamos este análisis en tres tipos diferentes de mejillones en tres experimentos independientes.Sin embargo, no encontramos ningún cambio en los niveles de ccfDNA después del estrés por calor agudo (consulte la Figura S5, información adicional).Este descubrimiento puede explicar, al menos en parte, el hecho de que los mejillones tengan un sistema circulatorio semiabierto y acumulen grandes cantidades de ADN extraño debido a su alta actividad de filtración.Por otro lado, los mejillones, como muchos invertebrados, pueden ser más resistentes al daño tisular inducido por el estrés, lo que limita la liberación de ccfDNA en su hemolinfa [70, 71].
Hasta la fecha, el análisis de ADN de la biodiversidad en los ecosistemas acuáticos se ha centrado principalmente en la codificación de metabarras del ADN ambiental (eDNA).Sin embargo, este método suele estar limitado en el análisis de la biodiversidad cuando se utilizan cebadores.El uso de la secuenciación instantánea evita las limitaciones de la PCR y la selección sesgada de conjuntos de cebadores.Por lo tanto, en cierto sentido, nuestro método está más cerca del método de secuenciación de eDNA Shotgun de alto rendimiento utilizado recientemente, que puede secuenciar directamente el ADN fragmentado y analizar casi todos los organismos [72, 73].Sin embargo, hay una serie de problemas fundamentales que distinguen a LB de los métodos estándar de eDNA.Por supuesto, la principal diferencia entre eDNA y LB es el uso de filtros naturales.Se ha informado sobre el uso de especies marinas como esponjas y bivalvos (Dresseina spp.) como filtro natural para estudiar eDNA [74, 75].Sin embargo, el estudio de Dreissena utilizó biopsias de tejido de las que se extrajo el ADN.El análisis de ccfDNA de LB no requiere biopsia de tejido, equipo especializado y a veces costoso y logística asociada con eDNA o biopsia de tejido.De hecho, recientemente informamos que ccfDNA de LB se puede almacenar y analizar con el soporte de FTA sin mantener una cadena de frío, lo cual es un gran desafío para la investigación en áreas remotas [76].La extracción de ccfDNA a partir de biopsias líquidas también es sencilla y proporciona ADN de alta calidad para secuenciación rápida y análisis de PCR.Esta es una gran ventaja dadas algunas de las limitaciones técnicas asociadas con el análisis de eDNA [77].La simplicidad y el bajo costo del método de muestreo también es particularmente adecuado para programas de monitoreo a largo plazo.Además de su alta capacidad de filtración, otra característica bien conocida de los bivalvos es la composición química de mucopolisacáridos de su moco, que promueve la absorción de virus [78, 79].Esto convierte a los bivalvos en un filtro natural ideal para caracterizar la biodiversidad y el impacto del cambio climático en un ecosistema acuático determinado.Aunque la presencia de fragmentos de ADN derivados del huésped puede verse como una limitación del método en comparación con el eDNA, el costo asociado con tener un ccfDNA nativo en comparación con el eDNA es comprensible al mismo tiempo por la gran cantidad de información disponible para estudios de salud.anfitrión compensado.Esto incluye la presencia de secuencias virales integradas en el genoma del huésped huésped.Esto es especialmente importante para los mejillones, dada la presencia de retrovirus leucémicos transmitidos horizontalmente en bivalvos [80, 81].Otra ventaja de LB sobre eDNA es que explota la actividad fagocítica de las células sanguíneas circulantes en la hemolinfa, que engulle a los microorganismos (y sus genomas).La fagocitosis es la función principal de las células sanguíneas en los bivalvos [82].Finalmente, el método aprovecha la alta capacidad de filtración de los mejillones (promedio de 1,5 l/h de agua de mar) y la circulación de dos días, que aumentan la mezcla de diferentes capas de agua de mar, lo que permite la captura de eDNA heterólogo.[83, 84].Por lo tanto, el análisis ccfDNA de mejillones es una vía interesante dados los impactos nutricionales, económicos y ambientales de los mejillones.Similar al análisis de LB recolectado de humanos, este método también abre la posibilidad de medir cambios genéticos y epigenéticos en el ADN del huésped en respuesta a sustancias exógenas.Por ejemplo, se pueden contemplar tecnologías de secuenciación de tercera generación para realizar análisis de metilación de todo el genoma en ccfDNA nativo mediante secuenciación de nanoporos.Este proceso debería verse facilitado por el hecho de que la longitud de los fragmentos de ccfDNA del mejillón es idealmente compatible con las plataformas de secuenciación de lectura larga que permiten el análisis de la metilación del ADN en todo el genoma a partir de una sola ejecución de secuenciación sin necesidad de transformaciones químicas.85,86] Esta es una posibilidad interesante, ya que se ha demostrado que los patrones de metilación del ADN reflejan una respuesta al estrés ambiental y persisten durante muchas generaciones.Por lo tanto, puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos subyacentes que gobiernan la respuesta después de la exposición al cambio climático o a los contaminantes [87].Sin embargo, el uso de LB no está exento de limitaciones.No hace falta decir que esto requiere la presencia de especies indicadoras en el ecosistema.Como se mencionó anteriormente, el uso de LB para evaluar la biodiversidad de un ecosistema determinado también requiere una tubería bioinformática rigurosa que tenga en cuenta la presencia de fragmentos de ADN de la fuente.Otro problema importante es la disponibilidad de genomas de referencia para especies marinas.Se espera que iniciativas como el Proyecto de Genomas de Mamíferos Marinos y el proyecto Fish10k recientemente establecido [88] faciliten dicho análisis en el futuro.La aplicación del concepto LB a los organismos marinos que se alimentan por filtración también es compatible con los últimos avances en tecnología de secuenciación, lo que lo hace muy adecuado para el desarrollo de biomarcadores de múltiples ohmios para proporcionar información importante sobre la salud de los hábitats marinos en respuesta al estrés ambiental.
Los datos de secuenciación del genoma se han depositado en el archivo de lectura de secuencias de NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 bajo Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacto del cambio climático en la vida marina y los ecosistemas.Cole Biología.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Considere los impactos combinados del cambio climático y otros factores de estrés locales en el medio ambiente marino.entorno científico general.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Ciencia del primero de marzo.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. La reducción de la tolerancia al calor en condiciones de estrés por calor repetitivo explica la alta mortalidad estival de los mejillones azules.Informe científico 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Cambios recientes en la frecuencia, las causas y el alcance de las muertes de animales.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Múltiples patógenos no específicos de especie pueden haber causado la mortalidad masiva de Pinna nobilis.Vida.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Impacto potencial del cambio climático en las enfermedades zoonóticas del Ártico.Int J Circumpolar salud.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Mejillones azules (Mytilus edulis spp.) como organismos señal en el monitoreo de la contaminación costera: una revisión.Mar Medio Ambiente Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integración de la biopsia líquida en el tratamiento del cáncer.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maduración de biopsia líquida: permite que circule el ADN tumoral.Nat Rev Cáncer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ácidos nucleicos en plasma humano.Actas de asambleas de las filiales de Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nuevo papel para el ADN libre de células como marcador molecular para el tratamiento del cáncer.Cuantificación del análisis biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS La biopsia líquida ingresa a la clínica: problemas de implementación y desafíos futuros.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW y otros.El ADN fetal está presente en el plasma y el suero materno.Lanceta.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Estudio del curso del embarazo y sus complicaciones utilizando ARN extracelular circulante en la sangre de mujeres durante el embarazo.dopediatría.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsia líquida: el ADN libre de células del donante se utiliza para detectar lesiones alogénicas en un injerto renal.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaciones en diagnóstico prenatal: secuenciación del genoma del plasma materno.Ana MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arévalo S, Stryke D, et al.Detección rápida de patógenos con secuenciación metagenómica de próxima generación de fluidos corporales infectados.Medicina Nacional.2021;27:115-24.