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La biopsia líquida (LB) es un concepto que está ganando rápidamente popularidad en el campo biomédico. Se basa principalmente en la detección de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA), que se liberan principalmente como pequeños fragmentos tras la muerte celular en diversos tejidos. Una pequeña proporción de estos fragmentos proviene de tejidos u organismos extraños. En este trabajo, hemos aplicado este concepto a los mejillones, una especie centinela conocida por su alta capacidad de filtración de agua de mar. Aprovechamos la capacidad de los mejillones para actuar como filtros naturales y capturar fragmentos de ADN ambiental de diversas fuentes, lo que proporciona información sobre la biodiversidad de los ecosistemas marinos costeros. Nuestros resultados muestran que la hemolinfa de los mejillones contiene fragmentos de ADN con un tamaño muy variable, de 1 a 5 kb. La secuenciación shotgun mostró que un gran número de fragmentos de ADN son de origen microbiano extraño. Entre ellos, encontramos fragmentos de ADN de bacterias, arqueas y virus, incluyendo virus que infectan a diversos hospedadores comunes en los ecosistemas marinos costeros. En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB aplicado a los mejillones representa una fuente rica pero aún inexplorada de conocimiento sobre la diversidad microbiana en los ecosistemas costeros marinos.
El impacto del cambio climático (CC) en la biodiversidad de los ecosistemas marinos es un área de investigación en rápido crecimiento. El calentamiento global no solo causa importantes tensiones fisiológicas, sino que también amplía los límites evolutivos de la estabilidad térmica de los organismos marinos, afectando el hábitat de varias especies y obligándolas a buscar condiciones más favorables [1, 2]. Además de afectar la biodiversidad de los metazoos, el CC altera el delicado equilibrio de las interacciones entre el huésped y el microbio. Esta disbacteriosis microbiana representa una grave amenaza para los ecosistemas marinos, ya que aumenta la susceptibilidad de los organismos marinos a patógenos infecciosos [3, 4]. Se cree que la SS desempeña un papel importante en las muertes masivas, lo cual constituye un grave problema para la gestión de los ecosistemas marinos globales [5, 6]. Este es un problema importante dados los impactos económicos, ecológicos y nutricionales de muchas especies marinas. Esto es especialmente cierto para los bivalvos que viven en las regiones polares, donde los efectos de la CK son más inmediatos y graves [6, 7]. De hecho, bivalvos como Mytilus spp. Se utilizan ampliamente para monitorear los efectos del CC en los ecosistemas marinos. No es sorprendente que se haya desarrollado una cantidad relativamente grande de biomarcadores para monitorear su salud, a menudo utilizando un enfoque de dos niveles que involucra biomarcadores funcionales basados ​​en la actividad enzimática o funciones celulares como la viabilidad celular y la actividad fagocítica [8]. Estos métodos también incluyen la medición de la concentración de indicadores de presión específicos que se acumulan en los tejidos blandos después de la absorción de grandes cantidades de agua de mar. Sin embargo, la alta capacidad de filtración y el sistema circulatorio semiabierto de los bivalvos brindan la oportunidad de desarrollar nuevos biomarcadores de hemolinfa utilizando el concepto de biopsia líquida (LB), un enfoque simple y mínimamente invasivo para el manejo de pacientes. Muestras de sangre [9, 10]. Si bien se pueden encontrar varios tipos de moléculas circulantes en la LB humana, este concepto se basa principalmente en el análisis de secuenciación de ADN de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA) en plasma. De hecho, la presencia de ADN circulante en el plasma humano se conoce desde mediados del siglo XX [11], pero solo en los últimos años la aparición de métodos de secuenciación de alto rendimiento ha permitido el diagnóstico clínico basado en ccfDNA. La presencia de estos fragmentos de ADN circulante se debe en parte a la liberación pasiva de ADN genómico (nuclear y mitocondrial) tras la muerte celular. En individuos sanos, la concentración de ccfDNA normalmente es baja (<10 ng/mL) pero puede aumentar de 5 a 10 veces en pacientes que padecen diversas patologías o están sometidos a estrés, lo que produce daño tisular. En individuos sanos, la concentración de ccfDNA normalmente es baja (<10 ng/mL) pero puede aumentar de 5 a 10 veces en pacientes que padecen diversas patologías o están sometidos a estrés, lo que produce daño tisular. Para una mayor concentración de líquido en la norma mínima (<10 ng/ml), no se puede colocar entre 5 y 10 veces más rápidamente. patología o подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. En personas sanas, la concentración de cccDNA normalmente es baja (<10 ng/mL), pero puede aumentar de 5 a 10 veces en pacientes con diversas patologías o bajo estrés que conduce a daño tisular.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но moгут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Las concentraciones de ccfDNA suelen ser bajas (<10 ng/ml) en individuos sanos, pero pueden aumentar de 5 a 10 veces en pacientes con diversas patologías o estrés, lo que resulta en daño tisular.El tamaño de los fragmentos de ccfDNA varía ampliamente, pero usualmente oscila entre 150 y 200 pb. [12]. El análisis de ccfDNA autoderivado, es decir, ccfDNA de células huésped normales o transformadas, se puede utilizar para detectar cambios genéticos y epigenéticos presentes en el genoma nuclear y/o mitocondrial, ayudando así a los médicos a seleccionar terapias moleculares específicas [13]. Sin embargo, el ccfDNA se puede obtener de fuentes extrañas como el ccfDNA de células fetales durante el embarazo o de órganos trasplantados [14,15,16,17]. El ccfDNA también es una fuente importante de información para detectar la presencia de ácidos nucleicos de un agente infeccioso (extraño), lo que permite la detección no invasiva de infecciones generalizadas no identificadas por hemocultivos, evitando la biopsia invasiva de tejido infectado [18]. Estudios recientes han demostrado que la sangre humana contiene una rica fuente de información que permite identificar patógenos virales y bacterianos, y que aproximadamente el 1 % del ccfDNA presente en el plasma humano es de origen foráneo [19]. Estos estudios demuestran que la biodiversidad del microbioma circulante de un organismo puede evaluarse mediante el análisis de ccfDNA. Sin embargo, hasta hace poco, este concepto se utilizaba exclusivamente en humanos y, en menor medida, en otros vertebrados [20, 21].
En el presente trabajo, utilizamos el potencial LB para analizar el ccfDNA de Aulacomya atra, una especie austral que se encuentra comúnmente en las Islas Kerguelén subantárticas, un grupo de islas sobre una gran meseta que se formó hace 35 millones de años. erupción volcánica. Utilizando un sistema experimental in vitro, descubrimos que los fragmentos de ADN en agua de mar son rápidamente absorbidos por los mejillones y entran en el compartimento de la hemolinfa. La secuenciación shotgun ha demostrado que el ccfDNA de la hemolinfa del mejillón contiene fragmentos de ADN de origen propio y ajeno, incluyendo bacterias simbióticas y fragmentos de ADN de biomas típicos de ecosistemas costeros marinos volcánicos fríos. El ccfDNA de la hemolinfa también contiene secuencias virales derivadas de virus con diferentes rangos de hospedadores. También encontramos fragmentos de ADN de animales multicelulares como peces óseos, anémonas de mar, algas e insectos. En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto LB puede aplicarse con éxito a los invertebrados marinos para generar un rico repertorio genómico en los ecosistemas marinos.
Se recolectaron mejillones azules adultos (Mytilus spp.) de 55 a 70 mm de largo (M. platensis) y Aulacomya atra (A. atra) en las costas rocosas intermareales de Puerto Francia (049°21.235 S, 070°13.490 E), Islas Kerguelén, en diciembre de 2018. Otros mejillones azules adultos (Mytilus spp.) se obtuvieron de un proveedor comercial (PEI Mussel King Inc., Isla del Príncipe Eduardo, Canadá) y se colocaron en un tanque aireado con temperatura controlada (4 °C) que contenía 10 a 20 L de salmuera artificial al 32‰ (sal marina artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, EE. UU.). En cada experimento, se midieron la longitud y el peso de las conchas individuales.
Un protocolo de acceso abierto y gratuito para este programa está disponible en línea (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Brevemente, se recolectó hemolinfa de LB de los músculos abductores como se describe [22]. La hemolinfa se clarificó mediante centrifugación a 1200 × g durante 3 minutos, y el sobrenadante se congeló (-20 °C) hasta su uso. Para el aislamiento y la purificación del ADNcf, se descongelaron muestras (1,5-2,0 ml) y se procesaron utilizando el kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) según las instrucciones del fabricante. El ADNccf se almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis. En algunos experimentos, el ADNccf se aisló y purificó utilizando el kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadá). El ADN purificado se cuantificó utilizando un ensayo estándar PicoGreen. La distribución de fragmentos del ccfDNA aislado se analizó mediante electroforesis capilar con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) y un kit de ADN de alta sensibilidad. El ensayo se realizó con 1 µl de la muestra de ccfDNA, según las instrucciones del fabricante.
Para la secuenciación de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparó bibliotecas shotgun con el kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75. Se utilizó un adaptador estándar (BioO). Los archivos de datos sin procesar están disponibles en el Archivo de Lecturas de Secuencias del NCBI (SRR8924808 y SRR8924809). La calidad básica de la lectura se evaluó mediante FastQC [23]. Trimmomatic [24] se ha utilizado para recortar adaptadores y lecturas de baja calidad. Las lecturas shotgun con extremos pareados se fusionaron mediante FLASH en lecturas individuales más largas con un solapamiento mínimo de 20 pb para evitar desajustes [25]. Las lecturas fusionadas se anotaron con BLASTN usando una base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e−3 y homología del 90 %), y el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad se realizó usando DUST [26]. Las lecturas fusionadas se anotaron con BLASTN usando una base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e−3 y homología del 90 %), y el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad se realizó usando DUST [26]. La configuración obligatoria se realiza mediante anotación con BLASTN utilizando bases de datos de la industria NCBI. (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), una mascarilla que no se puede utilizar con polvo [26]. Las lecturas agrupadas se anotaron con BLASTN utilizando la base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e-3 y homología del 90 %) y se realizó un enmascaramiento de secuencia de baja complejidad utilizando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 polvo [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽La configuración obligatoria es la annotirovania con el uso de BLASTN con la aplicación de bases de datos de software NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Las lecturas agrupadas se anotaron con BLASTN utilizando la base de datos taxonómica de bivalvos del NCBI (valor e <1e-3 y homología del 90 %), y se realizó un enmascaramiento de secuencia de baja complejidad utilizando DUST [26].Las lecturas se dividieron en dos grupos: relacionadas con secuencias de bivalvos (en este caso, autolecturas) y no relacionadas (no autolecturas). Se ensamblaron dos grupos por separado mediante MEGAHIT para generar contigs [27]. Mientras tanto, la distribución taxonómica de las lecturas del microbioma exógeno se clasificó mediante Kraken2 [28] y se representó gráficamente mediante un gráfico circular de Krona en Galaxy [29, 30]. A partir de nuestros experimentos preliminares, se determinó que el kmers óptimo era kmers-59. Luego se identificaron los contigs propios mediante alineación con BLASTN (base de datos NCBI de bivalvos, valor e < 1e−10 y homología del 60%) para una anotación final. Luego se identificaron los contigs propios mediante alineación con BLASTN (base de datos NCBI de bivalvos, valor e < 1e−10 y homología del 60%) para una anotación final. Затем собственные контиги были идентицированы путем сопоставления с BLASTN (baza данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Luego se identificaron los autocontigs mediante comparación con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e <1e-10 y 60 % de homología) para la anotación final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (baza данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Luego se identificaron los autocontigs para la anotación final mediante comparación con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e <1e-10 y 60 % de homología). Paralelamente, los contig del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e−10 y homología del 60%). Paralelamente, los contig del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e−10 y homología del 60%). Paralelamente, los grupos de grupos completos cuentan con comentarios adicionales con BLASTN (basa de nt NCBI, clasificación y <1e-10 y homología 60%). Paralelamente, los contig del grupo extraño se anotaron con BLASTN (base de datos NT NCBI, valor e <1e-10 y homología del 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Paralelamente, no es compatible con el grupo integrado, sino que incluye comentarios de BLASTN (basado en NCBI, artículos y <1e-10) y geología 60%). Paralelamente, los contig del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e-10 y homología del 60%). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq de NCBI (valor e < 1e−10 y homología del 60%). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq de NCBI (valor e < 1e−10 y homología del 60%). BLASTX se utiliza para proporcionar conexiones no deseadas con la configuración de RefSeq NCBI (aplicaciones y <1e-10) гомология 60%). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 y 60% de homología).还使用nr 和RefSeq 同源性）。还使用nr 和RefSeq 同源性）。 BLASTX está disponible para todas las conexiones no especificadas con RefSeq NCBI (configuración y <1e-10 y homologación) 60%). BLASTX también se realizó en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq NCBI (valor e <1e-10 y 60% de homología).Los grupos BLASTN y BLASTX de contigs no propios representan los contigs finales (ver archivo complementario).
Los cebadores utilizados para la PCR se listan en la Tabla S1. Se utilizó la ADN polimerasa Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) para amplificar los genes diana de ccfDNA. Se emplearon las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos, 95 °C durante 1 minuto, temperatura de hibridación establecida durante 1 minuto, elongación a 72 °C durante 1 minuto, 35 ciclos y, finalmente, 72 °C en 10 minutos. Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa (1,5 %) con tinción de gel de ADN segura SYBRTM (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Mejillones (Mytilus spp.) se aclimataron en 500 ml de agua de mar oxigenada (32 PSU) durante 24 horas a 4 °C. Se añadió al vial ADN plasmídico que contenía un inserto que codificaba la secuencia de ADNc de la galectina-7 humana (número de acceso L07769 del NCBI) a una concentración final de 190 μg/μl. Los mejillones incubados en las mismas condiciones sin adición de ADN fueron el control. El tercer tanque de control contenía ADN sin mejillones. Para monitorear la calidad del ADN en agua de mar, se tomaron muestras de agua de mar (20 μl; tres repeticiones) de cada tanque a la hora indicada. Para la trazabilidad del ADN plasmídico, los mejillones LB se cosecharon a las horas indicadas y se analizaron mediante qPCR y ddPCR. Debido al alto contenido en sal del agua de mar, se diluyeron alícuotas en agua de calidad para PCR (1:10) antes de todos los ensayos de PCR.
La PCR digital de gotas (ddPCR) se realizó con el protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadá). La temperatura óptima se determinó mediante el perfil de temperatura (Tabla S1). Las gotas se generaron con un generador de gotas QX200 (BioRad). La ddPCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 95 °C durante 5 min, 50 ciclos de 95 °C durante 30 s y una temperatura de hibridación dada durante 1 min, 72 °C durante 30 s, 4 °C durante 5 min y 90 °C en 5 minutos. El número de gotas y reacciones positivas (número de copias/µl) se midió con un lector de gotas QX200 (BioRad). Las muestras con menos de 10 000 gotas se rechazaron. No se realizó un control de patrón en cada ejecución de la ddPCR.
La qPCR se realizó con Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) y cebadores específicos para LGALS7. Todas las PCR cuantitativas se realizaron en 20 µl con el kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). La qPCR se inició con una incubación de 15 min a 95 °C, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 10 segundos y a 60 °C durante 60 segundos, con una sola toma de datos. Las curvas de fusión se generaron mediante mediciones sucesivas a 95 °C durante 5 s, 65 °C durante 60 s y 97 °C al final de la qPCR. Cada qPCR se realizó por triplicado, excepto las muestras control.
Dado que los mejillones son conocidos por su alta tasa de filtración, investigamos primero si podían filtrar y retener fragmentos de ADN presentes en el agua de mar. También nos interesaba si estos fragmentos se acumulaban en su sistema linfático semiabierto. Resolvimos este problema experimentalmente rastreando el destino de los fragmentos de ADN solubles añadidos a los tanques de mejillón azul. Para facilitar el rastreo de los fragmentos de ADN, utilizamos ADN plasmídico foráneo (no propio) que contiene el gen humano de la galectina-7. La ddPCR rastrea fragmentos de ADN plasmídico en agua de mar y mejillones. Nuestros resultados muestran que si la cantidad de fragmentos de ADN en el agua de mar se mantuvo relativamente constante a lo largo del tiempo (hasta 7 días) en ausencia de mejillones, entonces, en presencia de mejillones, este nivel desapareció casi por completo en 8 horas (Fig. 1a,b). Los fragmentos de ADN exógeno se detectaron fácilmente en 15 minutos en el líquido intravalvular y la hemolinfa (Fig. 1c). Estos fragmentos pudieron detectarse hasta 4 horas después de la exposición. Esta actividad de filtrado de fragmentos de ADN es comparable a la de bacterias y algas [31]. Estos resultados sugieren que los mejillones pueden filtrar y acumular ADN extraño en sus compartimentos fluidos.
Concentraciones relativas de ADN plasmídico en agua de mar en presencia (A) o ausencia (B) de mejillones, medidas mediante ddPCR. En A, los resultados se expresan como porcentajes, con los bordes de las cajas representando los percentiles 75 y 25. La curva logarítmica ajustada se muestra en rojo, y el área sombreada en gris representa el intervalo de confianza del 95%. En B, la línea roja representa la media y la línea azul representa el intervalo de confianza del 95% para la concentración. C: Acumulación de ADN plasmídico en la hemolinfa y el líquido valvular de mejillones en diferentes momentos tras la adición de ADN plasmídico. Los resultados se presentan como copias absolutas detectadas/ml (±SE).
A continuación, investigamos el origen del ccfDNA en mejillones recolectados en bancos de mejillones de las Islas Kerguelen, un grupo remoto de islas con poca influencia antropogénica. Para ello, se aisló y purificó cccDNA de hemolinfas de mejillón mediante métodos comúnmente utilizados para purificar cccDNA humano [32, 33]. Descubrimos que las concentraciones promedio de ccfDNA en la hemolinfa de mejillones se encuentran en el rango bajo de microgramos por ml de hemolinfa (véase la Tabla S2, Información complementaria). Este rango de concentraciones es mucho mayor que en personas sanas (bajos nanogramos por mililitro), pero en casos excepcionales, en pacientes con cáncer, el nivel de ccfDNA puede alcanzar varios microgramos por mililitro [34, 35]. Un análisis de la distribución del tamaño del ccfDNA de la hemolinfa mostró que estos fragmentos varían considerablemente en tamaño, desde 1000 pb hasta 5000 pb (Fig. 2). Se obtuvieron resultados similares utilizando el kit de investigación QIAamp basado en sílice, un método comúnmente usado en la ciencia forense para aislar y purificar rápidamente ADN genómico de muestras de ADN de baja concentración, incluido el ccfDNA [36].
Electroforegrama representativo de ccfDNA de hemolinfa de mejillón. Extraído con el kit NucleoSnap Plasma (arriba) y el kit QIAamp DNA Investigator. B. Gráfico de violín que muestra la distribución de las concentraciones de ccfDNA de hemolinfa (±EE) en mejillones. Las líneas negras y rojas representan la mediana y el primer y tercer cuartil, respectivamente.
Aproximadamente el 1% del ADNccf en humanos y primates proviene de una fuente externa [21, 37]. Dado el sistema circulatorio semiabierto de los bivalvos, la riqueza microbiana del agua marina y la distribución del tamaño del ADNccf del mejillón, planteamos la hipótesis de que el ADNccf de la hemolinfa del mejillón podría contener una reserva rica y diversa de ADN microbiano. Para comprobar esta hipótesis, secuenciamos el ADNccf de la hemolinfa de muestras de Aulacomya atra recolectadas en las Islas Kerguelen, obteniendo más de 10 millones de lecturas, de las cuales el 97,6% superó el control de calidad. Las lecturas se clasificaron según su origen propio y ajeno, utilizando las bases de datos de bivalvos BLASTN y NCBI (Fig. S1, Información adicional).
En humanos, tanto el ADN nuclear como el mitocondrial pueden liberarse en el torrente sanguíneo [38]. Sin embargo, en el presente estudio, no fue posible describir en detalle el ADN genómico nuclear de los mejillones, dado que el genoma de A. atra no ha sido secuenciado ni descrito. No obstante, pudimos identificar varios fragmentos de ccfDNA de nuestro propio origen utilizando la biblioteca de bivalvos (Fig. S2, Información suplementaria). También confirmamos la presencia de fragmentos de ADN de nuestro propio origen mediante la amplificación por PCR dirigida de los genes de A. atra que fueron secuenciados (Fig. 3). De manera similar, dado que el genoma mitocondrial de A. atra está disponible en bases de datos públicas, se puede encontrar evidencia de la presencia de fragmentos de ccfDNA mitocondrial en la hemolinfa de A. atra. La presencia de fragmentos de ADN mitocondrial se confirmó mediante amplificación por PCR (Fig. 3).
Se observaron varios genes mitocondriales en la hemolinfa de A. atra (puntos rojos – número de stock: SRX5705969) y M. platensis (puntos azules – número de stock: SRX5705968) amplificados por PCR. Figura adaptada de Breton et al., 2011 B. Amplificación del sobrenadante de hemolinfa de A. atra. Almacenado en papel FTA. Utilice un punzón de 3 mm para añadir directamente al tubo de PCR que contiene la mezcla.
Dado el abundante contenido microbiano en el agua de mar, inicialmente nos centramos en la caracterización de secuencias de ADN microbiano en la hemolinfa. Para ello, utilizamos dos estrategias diferentes. La primera estrategia utilizó Kraken2, un programa de clasificación de secuencias basado en algoritmos que puede identificar secuencias microbianas con una precisión comparable a BLAST y otras herramientas [28]. Se determinó que más de 6719 lecturas eran de origen bacteriano, mientras que 124 y 64 eran de arqueas y virus, respectivamente (Fig. 4). Los fragmentos de ADN bacteriano más abundantes fueron Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) y Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Esta distribución es consistente con estudios previos del microbioma del mejillón azul marino [39, 40]. Gammaproteobacteria fue la clase principal de Proteobacteria (44%), incluyendo muchos Vibrionales (Fig. 4b). El método ddPCR confirmó la presencia de fragmentos de ADN de Vibrio en el ccfDNA de la hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41]. Para obtener más información sobre el origen bacteriano del ccfDNA, se adoptó un enfoque adicional (Fig. S2, Información adicional). En este caso, las lecturas que se superponían se ensamblaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como de origen propio (bivalvos) o no propio utilizando BLASTN y un valor e de 1e−3 y un punto de corte con >90 % de homología. En este caso, las lecturas que se superponían se ensamblaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como de origen propio (bivalvos) o no propio utilizando BLASTN y un valor e de 1e−3 y un punto de corte con >90 % de homología. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по по происхождению с использованием BLASTN and значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. En este caso, las lecturas superpuestas se recopilaron como lecturas de pares terminales y se clasificaron como nativas (bivalvas) o no originales utilizando BLASTN y un valor e de 1e-3 y un punto de corte con >90 % de homología.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. En este caso, las lecturas superpuestas se recopilaron como lecturas de pares terminales y se clasificaron como propias (bivalvos) o no originales utilizando valores e BLASTN y 1e-3 y un umbral de homología >90%.Dado que el genoma de A. atra aún no se ha secuenciado, utilizamos la estrategia de ensamblaje de novo del ensamblador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Se identificaron 147.188 contigs como dependientes (bivalvos) de origen. Estos contigs se explotaron con valores e de 1e-10 mediante BLASTN y BLASTX. Esta estrategia nos permitió identificar 482 fragmentos no bivalvos presentes en el ccfDNA de A. atra. Más de la mitad (57%) de estos fragmentos de ADN se obtuvieron de bacterias, principalmente de simbiontes branquiales, incluyendo simbiontes sulfotróficos, y de simbiontes branquiales como Solemya velum (Fig. 5).
Abundancia relativa a nivel de tipo. B. Diversidad microbiana de dos filos principales (Firmicutes y Proteobacteria). Amplificación representativa de ddPCR. C. Vibrio spp. A. Fragmentos del gen ARNr 16S (azul) en tres hemolinfas atra.
Se analizaron un total de 482 contigs recolectados. Perfil general de la distribución taxonómica de las anotaciones metagenómicas de contigs (procariotas y eucariotas). B Distribución detallada de los fragmentos de ADN bacteriano identificados mediante BLASTN y BLASTX.
El análisis de Kraken2 también mostró que el ccfDNA de mejillón contenía fragmentos de ADN arqueológico, incluyendo fragmentos de ADN de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) y Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). La presencia de fragmentos de ADN derivados de Euryarchaeota y Crenarchaeota, previamente encontrados en la comunidad microbiana de mejillones californianos, no debería sorprender [42]. Aunque Euryarchaeota se asocia a menudo con condiciones extremas, ahora se reconoce que tanto Euryarchaeota como Crenarcheota se encuentran entre los procariotas más comunes en el ambiente criogénico marino [43, 44]. La presencia de microorganismos metanogénicos en mejillones no es sorprendente, dados los informes recientes de extensas fugas de metano de las filtraciones del fondo en la meseta de Kerguelen [45] y la posible producción microbiana de metano observada frente a la costa de las Islas Kerguelen [46].
Nuestra atención se centró entonces en las lecturas de virus de ADN. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio fuera del objetivo del contenido viral de mejillones. Como se esperaba, encontramos fragmentos de ADN de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b). Sin embargo, el ADN viral más común proviene de un filo de nucleocitovirus, también conocido como el virus nuclear citoplasmático de ADN grande (NCLDV), que tiene el genoma más grande de todos los virus. Dentro de este filo, la mayoría de las secuencias de ADN pertenecen a las familias Mimimidoviridae (58%) y Poxviridae (21%), cuyos huéspedes naturales incluyen vertebrados y artrópodos, mientras que una pequeña proporción de estas secuencias de ADN pertenecen a algas virológicas conocidas. Infecta algas eucariotas marinas. Las secuencias también se obtuvieron del virus Pandora, el virus gigante con el tamaño de genoma más grande de todos los géneros virales conocidos. Curiosamente, el rango de hospedadores infectados por el virus, determinado mediante secuenciación de ccfDNA de hemolinfa, fue relativamente amplio (Figura S3, Información Suplementaria). Incluye virus que infectan insectos como Baculoviridae e Iridoviridae, así como virus que infectan amebas, algas y vertebrados. También encontramos secuencias que coinciden con el genoma de Pithovirus sibericum. Los pitovirus (también conocidos como "virus zombi") se aislaron por primera vez en permafrost de 30.000 años de antigüedad en Siberia [47]. Por lo tanto, nuestros resultados coinciden con informes previos que muestran que no todas las especies modernas de estos virus están extintas [48] y que podrían estar presentes en ecosistemas marinos subárticos remotos.
Finalmente, probamos la posibilidad de encontrar fragmentos de ADN de otros animales multicelulares. Se identificaron un total de 482 contigs foráneos mediante BLASTN y BLASTX con bibliotecas nt, nr y RefSeq (genómicas y proteicas). Nuestros resultados muestran que, entre los fragmentos foráneos de ccfDNA de animales multicelulares, predomina el ADN de huesos (Fig. 5). También se encontraron fragmentos de ADN de insectos y otras especies. Una parte relativamente grande de los fragmentos de ADN no se ha identificado, posiblemente debido a la escasa representación de un gran número de especies marinas en las bases de datos genómicas, en comparación con las especies terrestres [49].
En el presente artículo, aplicamos el concepto LB a los mejillones, argumentando que la secuenciación de ccfDNA de hemolinfa puede proporcionar información sobre la composición de los ecosistemas costeros marinos. En particular, encontramos que 1) la hemolinfa del mejillón contiene concentraciones relativamente altas (niveles de microgramos) de fragmentos de ADN circulantes relativamente grandes (~1-5 kb); 2) estos fragmentos de ADN son independientes y no independientes 3) Entre las fuentes foráneas de estos fragmentos de ADN, encontramos ADN bacteriano, arqueológico y viral, así como ADN de otros animales multicelulares; 4) La acumulación de estos fragmentos de ccfDNA foráneos en la hemolinfa ocurre rápidamente y contribuye a la actividad de filtrado interno de los mejillones. En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB, que hasta ahora se ha aplicado principalmente en el campo de la biomedicina, codifica una fuente rica pero inexplorada de conocimiento que se puede utilizar para comprender mejor la interacción entre las especies centinela y su entorno.
Además de en primates, se ha reportado el aislamiento de ccfDNA en mamíferos, incluyendo ratones, perros, gatos y caballos [50, 51, 52]. Sin embargo, hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero en reportar la detección y secuenciación de ccfDNA en especies marinas con un sistema circulatorio abierto. Esta característica anatómica y la capacidad de filtrado de los mejillones podrían, al menos en parte, explicar las diferentes características de tamaño de los fragmentos de ADN circulantes en comparación con otras especies. En humanos, la mayoría de los fragmentos de ADN que circulan en la sangre son pequeños fragmentos que varían en tamaño de 150 a 200 pb, con un pico máximo de 167 pb [34, 53]. Una pequeña pero significativa porción de fragmentos de ADN tiene un tamaño de entre 300 y 500 pb, y aproximadamente el 5% tiene más de 900 pb [54]. La razón para esta distribución de tamaño es que la principal fuente de ccfDNA en plasma ocurre como resultado de la muerte celular, ya sea por muerte celular o por necrosis de células hematopoyéticas circulantes en individuos sanos o por apoptosis de células tumorales en pacientes con cáncer (conocido como ADN tumoral circulante). , ctDNA). La distribución de tamaño de ccfDNA de hemolinfa que encontramos en mejillones varió de 1000 a 5000 pb, lo que sugiere que el ccfDNA de mejillón tiene un origen diferente. Esta es una hipótesis lógica, ya que los mejillones tienen un sistema vascular semiabierto y viven en ambientes acuáticos marinos que contienen altas concentraciones de ADN genómico microbiano. De hecho, nuestros experimentos de laboratorio usando ADN exógeno han demostrado que los mejillones acumulan fragmentos de ADN en agua de mar, al menos después de unas horas se degradan después de la captación celular y/o se liberan y/o almacenan en varias organizaciones. Dada la rareza de las células (tanto procariotas como eucariotas), el uso de compartimentos intravalvulares reducirá la cantidad de ccfDNA, tanto de fuentes propias como ajenas. Considerando la importancia de la inmunidad innata de los bivalvos y la gran cantidad de fagocitos circulantes, planteamos la hipótesis de que incluso el ccfDNA ajeno se enriquece en los fagocitos circulantes que acumulan ADN ajeno tras la ingestión de microorganismos o restos celulares. En conjunto, nuestros resultados demuestran que el ccfDNA de la hemolinfa bivalva constituye un depósito único de información molecular y refuerza su estatus como especie centinela.
Nuestros datos indican que la secuenciación y el análisis de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa derivados de bacterias pueden proporcionar información clave sobre la flora bacteriana del hospedador y las bacterias presentes en el ecosistema marino circundante. Las técnicas de secuenciación rápida han revelado secuencias de las branquias de la bacteria comensal A. atra que se habrían pasado por alto si se hubieran utilizado métodos convencionales de identificación de ARNr 16S, debido en parte a un sesgo de la biblioteca de referencia. De hecho, nuestro uso de datos de LB recopilados de M. platensis en la misma capa de mejillones en Kerguelen mostró que la composición de los simbiontes bacterianos asociados a las branquias era la misma para ambas especies de mejillones (Fig. S4, Información Suplementaria). Esta similitud entre dos mejillones genéticamente diferentes puede reflejar la composición de las comunidades bacterianas en los depósitos fríos, sulfurosos y volcánicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Se han descrito niveles elevados de microorganismos reductores de azufre durante la recolección de mejillones en zonas costeras bioturbadas [59], como la costa de Puerto Francia. Otra posibilidad es que la flora comensal de los mejillones se vea afectada por la transmisión horizontal [60, 61]. Se necesita más investigación para determinar la correlación entre el entorno marino, la superficie del fondo marino y la composición de bacterias simbióticas en los mejillones. Estos estudios están actualmente en curso.
La longitud y concentración del ccfDNA de hemolinfa, su facilidad de purificación y su alta calidad, que permite una rápida secuenciación shotgun, son algunas de las numerosas ventajas de utilizar el ccfDNA de mejillón para evaluar la biodiversidad en ecosistemas marinos costeros. Este enfoque es especialmente eficaz para caracterizar las comunidades virales (viromas) en un ecosistema determinado [62, 63]. A diferencia de las bacterias, las arqueas y los eucariotas, los genomas virales no contienen genes conservados filogenéticamente, como las secuencias 16S. Nuestros resultados indican que las biopsias líquidas de especies indicadoras, como los mejillones, pueden utilizarse para identificar un número relativamente elevado de fragmentos de virus ccfDNA que se sabe que infectan a los huéspedes que suelen habitar en ecosistemas marinos costeros. Esto incluye virus que se sabe que infectan a protozoos, artrópodos, insectos, plantas y virus bacterianos (p. ej., bacteriófagos). Se encontró una distribución similar al examinar el viroma del ccfDNA de la hemolinfa de mejillones azules (M. platensis) recolectados en la misma capa de mejillones en Kerguelen (Tabla S2, Información adicional). La secuenciación shotgun del ccfDNA es, de hecho, un nuevo enfoque que está cobrando impulso en el estudio del viroma de humanos u otras especies [21, 37, 64]. Este enfoque es particularmente útil para estudiar virus de ADN bicatenario, ya que ningún gen se conserva entre todos los virus de ADN bicatenario, lo que representa la clase de virus más diversa y amplia en Baltimore [65]. Aunque la mayoría de estos virus permanecen sin clasificar y pueden incluir virus de una parte completamente desconocida del mundo viral [66], encontramos que los viromas y los rangos de hospedadores de los mejillones A. atra y M. platensis se encuentran entre las dos especies. (véase la figura S3, información adicional). Esta similitud no es sorprendente, ya que puede reflejar una falta de selectividad en la captación del ADN presente en el ambiente. Actualmente se necesitan estudios futuros que utilicen ARN purificado para caracterizar el viroma del ARN.
En nuestro estudio, utilizamos un proceso de secuenciación muy riguroso adaptado del trabajo de Kowarski y colegas [37], quienes emplearon una deleción en dos pasos de lecturas agrupadas y contigs antes y después del ensamblaje del ccfDNA nativo, lo que resultó en una alta proporción de lecturas sin mapear. Por lo tanto, no podemos descartar que algunas de estas lecturas sin mapear aún puedan tener su propio origen, principalmente porque no disponemos de un genoma de referencia para esta especie de mejillón. También utilizamos este proceso de secuenciación porque nos preocupaban las quimeras entre lecturas propias y ajenas, y las longitudes de lectura generadas por Illumina MiSeq PE75. Otra razón para la mayoría de las lecturas sin mapear es que gran parte de los microbios marinos, especialmente en áreas remotas como Kerguelen, no han sido anotados. Utilizamos Illumina MiSeq PE75, asumiendo longitudes de fragmentos de ccfDNA similares a las de ccfDNA humano. Para futuros estudios, dado que nuestros resultados muestran que el ccfDNA de la hemolinfa presenta lecturas más largas que en humanos y/o mamíferos, recomendamos utilizar una plataforma de secuenciación más adecuada para fragmentos de ccfDNA más largos. Esta práctica facilitará considerablemente la identificación de más indicios para un análisis más profundo. La obtención de la secuencia completa del genoma nuclear de A. atra, actualmente no disponible, también facilitaría enormemente la discriminación del ccfDNA de fuentes propias y ajenas. Dado que nuestra investigación se ha centrado en la posibilidad de aplicar el concepto de biopsia líquida a los mejillones, esperamos que, a medida que este concepto se utilice en futuras investigaciones, se desarrollen nuevas herramientas y metodologías para aumentar el potencial de este método en el estudio de la diversidad microbiana de los mejillones y el ecosistema marino.
Como biomarcador clínico no invasivo, los niveles plasmáticos elevados de ccfDNA en humanos se asocian con diversas enfermedades, daño tisular y condiciones de estrés [67,68,69]. Este aumento se asocia con la liberación de fragmentos de ADN de origen propio tras el daño tisular. Abordamos este problema mediante estrés térmico agudo, en el que los mejillones se expusieron brevemente a una temperatura de 30 °C. Realizamos este análisis en tres tipos diferentes de mejillones en tres experimentos independientes. Sin embargo, no observamos ningún cambio en los niveles de ccfDNA tras el estrés térmico agudo (véase la Figura S5, información adicional). Este descubrimiento podría explicar, al menos en parte, el hecho de que los mejillones tienen un sistema circulatorio semiabierto y acumulan grandes cantidades de ADN extraño debido a su alta actividad de filtrado. Por otro lado, los mejillones, al igual que muchos invertebrados, pueden ser más resistentes al daño tisular inducido por estrés, lo que limita la liberación de ccfDNA en su hemolinfa [70, 71].
Hasta la fecha, el análisis de ADN de la biodiversidad en ecosistemas acuáticos se ha centrado principalmente en la metacodificación de barras del ADN ambiental (eDNA). Sin embargo, este método suele ser limitado en el análisis de la biodiversidad cuando se utilizan cebadores. El uso de la secuenciación shotgun evita las limitaciones de la PCR y la selección sesgada de conjuntos de cebadores. Por lo tanto, en cierto sentido, nuestro método se acerca más al método de secuenciación shotgun de eDNA de alto rendimiento utilizado recientemente, que puede secuenciar directamente ADN fragmentado y analizar casi todos los organismos [72, 73]. Sin embargo, hay una serie de cuestiones fundamentales que distinguen a LB de los métodos estándar de eDNA. Por supuesto, la principal diferencia entre eDNA y LB es el uso de huéspedes de filtro naturales. Se ha descrito el uso de especies marinas como esponjas y bivalvos (Dresseina spp.) como filtro natural para estudiar eDNA [74, 75]. Sin embargo, el estudio de Dreissena utilizó biopsias de tejido de las que se extrajo ADN. El análisis de ccfDNA de LB no requiere biopsia de tejido, ni el equipo especializado y a veces costoso, ni la logística asociada con el eDNA o la biopsia de tejido. De hecho, recientemente informamos que el ccfDNA de LB puede almacenarse y analizarse con soporte de FTA sin necesidad de mantener una cadena de frío, lo cual supone un gran reto para la investigación en zonas remotas [76]. La extracción de ccfDNA de biopsias líquidas también es sencilla y proporciona ADN de alta calidad para la secuenciación shotgun y el análisis por PCR. Esto supone una gran ventaja, dadas algunas de las limitaciones técnicas asociadas con el análisis de eDNA [77]. La simplicidad y el bajo coste del método de muestreo también lo hacen especialmente adecuado para programas de seguimiento a largo plazo. Además de su alta capacidad de filtrado, otra característica bien conocida de los bivalvos es la composición química de mucopolisacáridos de su moco, que favorece la absorción de virus [78, 79]. Esto convierte a los bivalvos en un filtro natural ideal para caracterizar la biodiversidad y el impacto del cambio climático en un ecosistema acuático determinado. Aunque la presencia de fragmentos de ADN derivados del hospedador puede considerarse una limitación del método en comparación con el eDNA, el coste asociado a la obtención de un ccfDNA nativo en comparación con el eDNA es comprensible dada la gran cantidad de información disponible para estudios de salud. hospedador desplazado. Esto incluye la presencia de secuencias virales integradas en el genoma del hospedador. Esto es especialmente importante en el caso de los mejillones, dada la presencia de retrovirus leucémicos de transmisión horizontal en bivalvos [80, 81]. Otra ventaja del LB sobre el eDNA es que aprovecha la actividad fagocítica de las células sanguíneas circulantes en la hemolinfa, que engulle a los microorganismos (y sus genomas). La fagocitosis es la principal función de las células sanguíneas en los bivalvos [82]. Por último, el método aprovecha la alta capacidad de filtración de los mejillones (un promedio de 1,5 l/h de agua de mar) y la circulación de dos días, que incrementa la mezcla de diferentes capas de agua de mar, lo que permite la captura de eDNA heterólogo [83, 84]. Por lo tanto, el análisis del ccfDNA de mejillón es una vía interesante dados los impactos nutricionales, económicos y ambientales de los mejillones. Similar al análisis de LB recolectado de humanos, este método también abre la posibilidad de medir cambios genéticos y epigenéticos en el ADN del huésped en respuesta a sustancias exógenas. Por ejemplo, se pueden prever tecnologías de secuenciación de tercera generación para realizar análisis de metilación de todo el genoma en ccfDNA nativo mediante secuenciación de nanoporos. Este proceso debería verse facilitado por el hecho de que la longitud de los fragmentos de ccfDNA de mejillón es idealmente compatible con plataformas de secuenciación de lectura larga que permiten el análisis de metilación de ADN de todo el genoma a partir de una sola secuenciación sin la necesidad de transformaciones químicas. [85,86] Esta es una posibilidad interesante, ya que se ha demostrado que los patrones de metilación del ADN reflejan una respuesta al estrés ambiental y persisten durante muchas generaciones. Por lo tanto, puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos subyacentes que rigen la respuesta después de la exposición al cambio climático o a contaminantes [87]. Sin embargo, el uso del LB no está exento de limitaciones. Obviamente, esto requiere la presencia de especies indicadoras en el ecosistema. Como se mencionó anteriormente, el uso de LB para evaluar la biodiversidad de un ecosistema dado también requiere un riguroso proceso bioinformático que considere la presencia de fragmentos de ADN de la fuente. Otro problema importante es la disponibilidad de genomas de referencia para especies marinas. Se espera que iniciativas como el Proyecto de Genomas de Mamíferos Marinos y el recientemente establecido proyecto Fish10k [88] faciliten dicho análisis en el futuro. La aplicación del concepto de LB a organismos marinos filtradores también es compatible con los últimos avances en tecnología de secuenciación, lo que la hace ideal para el desarrollo de biomarcadores multiohm que proporcionen información importante sobre la salud de los hábitats marinos en respuesta al estrés ambiental.
Los datos de secuenciación del genoma se han depositado en el Archivo de lectura de secuencias del NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 bajo Bioproyectos SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ: Impacto del cambio climático en la vida marina y los ecosistemas. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpandou V, Bevilacqua S, et al. Considerar los impactos combinados del cambio climático y otros factores de estrés locales en el medio marino. Entorno científico general. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Ciencia del primero de marzo. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. La reducción de la tolerancia al calor en condiciones de estrés térmico repetitivo explica la alta mortalidad estival del mejillón común. Informe científico 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Cambios recientes en la frecuencia, causas y magnitud de las muertes de animales. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Múltiples patógenos no específicos de especie pueden haber causado una mortalidad masiva de Pinna nobilis. Vida. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Impacto potencial del cambio climático en las enfermedades zoonóticas del Ártico. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mejillones azules (Mytilus edulis spp.) como organismos señalizadores en el monitoreo de la contaminación costera: una revisión. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integración de la biopsia líquida en el tratamiento del cáncer. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maduración de la biopsia líquida: Permite la circulación del ADN tumoral. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ácidos nucleicos en plasma humano. Actas de reuniones de las filiales de Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nuevo papel para el ADN libre como marcador molecular para el tratamiento del cáncer. Cuantificación del análisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. La biopsia líquida llega a la práctica clínica: problemas de implementación y desafíos futuros. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW y otros. El ADN fetal está presente en el plasma y el suero maternos. The Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Estudio del curso del embarazo y sus complicaciones mediante el uso de ARN extracelular circulante en la sangre de mujeres durante el embarazo. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsia líquida: el ADN libre de células del donante se utiliza para detectar lesiones alogénicas en un injerto renal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaciones en diagnóstico prenatal: secuenciación del genoma plasmático materno. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Detección rápida de patógenos mediante secuenciación metagenómica de última generación de fluidos corporales infectados. Nat Medicine. 2021;27:115-24.