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El sangrado incontrolado es una de las principales causas de muerte.Lograr una hemostasia rápida asegura la supervivencia del sujeto como primeros auxilios durante combates, accidentes de tránsito y operaciones de reducción de muertes.El andamio compuesto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS) derivado de una composición formadora de película hemostática simple (HFFC) como una fase continua puede desencadenar y mejorar la hemostasia.El desarrollo del NFRCS se basa en el diseño del ala de la libélula.La estructura del ala de la libélula consta de alas transversales y longitudinales, y las membranas de las alas están conectadas entre sí para mantener la integridad de la microestructura.HFFC recubre uniformemente la superficie de la fibra con una película de espesor nanométrico y conecta el espesor de algodón distribuido aleatoriamente (Ct) (fase dispersa) para formar una estructura nanoporosa.La combinación de fases continuas y dispersas reduce diez veces el costo del producto en comparación con los productos disponibles comercialmente.NFRCS modificado (tampones o muñequeras) se puede utilizar en una variedad de aplicaciones biomédicas.Los estudios in vivo han concluido que el Cp NFRCS desarrollado desencadena y mejora el proceso de coagulación en el sitio de aplicación.NFRCS puede modular el microambiente y actuar a nivel celular debido a su estructura nanoporosa, lo que resulta en una mejor cicatrización de heridas en el modelo de herida por escisión.
El sangrado incontrolado durante el combate, el intraoperatorio y las situaciones de emergencia puede suponer una grave amenaza para la vida de los heridos1.Estas condiciones conducen además a un aumento general de la resistencia vascular periférica, lo que lleva a un shock hemorrágico.Las medidas apropiadas para controlar el sangrado durante y después de la cirugía se consideran potencialmente mortales2,3.El daño a los grandes vasos provoca una pérdida masiva de sangre, lo que resulta en una tasa de mortalidad ≤ 50 % en combate y 31 % durante la cirugía1.La pérdida masiva de sangre conduce a una disminución del volumen corporal, lo que reduce el gasto cardíaco.Un aumento en la resistencia vascular periférica total y un deterioro progresivo de la microcirculación conducen a la hipoxia en los órganos de soporte vital.Puede ocurrir shock hemorrágico si la condición continúa sin una intervención efectiva1,4,5.Otras complicaciones incluyen la progresión de la hipotermia y la acidosis metabólica, así como un trastorno de la coagulación que impide el proceso de coagulación.El shock hemorrágico severo se asocia con un mayor riesgo de muerte6,7,8.En el shock de grado III (progresivo), la transfusión de sangre es esencial para la supervivencia del paciente durante la morbilidad y la mortalidad intraoperatoria y posoperatoria.Para superar todas las situaciones que amenazan la vida mencionadas anteriormente, hemos desarrollado un andamio compuesto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS) que utiliza una concentración mínima de polímero (0,5 %) mediante una combinación de polímeros hemostáticos solubles en agua.
Con el uso de refuerzo de fibra, se pueden desarrollar productos rentables.Las fibras dispuestas al azar se asemejan a la estructura del ala de una libélula, equilibradas por las rayas horizontales y verticales de las alas.Las venas transversal y longitudinal del ala se comunican con la membrana del ala (Fig. 1).NFRCS consiste en Ct reforzado como un sistema de andamiaje con mejor resistencia física y mecánica (Figura 1).Debido a la asequibilidad y la artesanía, los cirujanos prefieren usar calibres de hilo de algodón (Ct) durante las operaciones y los apósitos. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluido > 90 % de celulosa cristalina (imparte en la mejora de la actividad hemostática), la Ct se utilizó como un sistema esquelético de NFRCS9,10. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluido > 90 % de celulosa cristalina (imparte en la mejora de la actividad hemostática), la Ct se utilizó como un sistema esquelético de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристалллической цел люлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной систем ы NFRCS9,10. Por lo tanto, debido a sus múltiples beneficios, incluido >90 % de celulosa cristalina (implicada en el aumento de la actividad hemostática), se utilizó Ct como el sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Por lo tanto, dados sus muchos beneficios, incluido más del 90 % de celulosa cristalina (ayuda a mejorar la actividad hemostática), la Ct se utilizó como andamio para NFRCS9,10.Ct se recubrió superficialmente (se observó la formación de una película nanogruesa) y se interconectó con una composición formadora de película hemostática (HFFC).HFFC actúa como un matrigel, manteniendo juntos Ct colocados aleatoriamente.El diseño desarrollado transmite tensión dentro de la fase dispersa (fibras de refuerzo).Es difícil obtener estructuras nanoporosas con buena resistencia mecánica utilizando concentraciones mínimas de polímero.Además, no es fácil personalizar diferentes moldes para diferentes aplicaciones biomédicas.
La figura muestra un diagrama del diseño NFRCS basado en la estructura del ala de la libélula (A).Esta imagen muestra una analogía comparativa de la estructura del ala de una libélula (las venas transversales y longitudinales del ala están interconectadas) y una microfotografía transversal de Cp NFRCS (B).Representación esquemática de NFRCS.
Los NFRC se desarrollaron utilizando HFFC como una fase continua para abordar las limitaciones anteriores.La HFFC está compuesta por varios polímeros hemostáticos formadores de película, incluido el quitosano (como principal polímero hemostático) con metilcelulosa (MC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC 50 cp) y alcohol polivinílico (PVA) (125 kDa) como polímero de soporte que promueve la formación de trombos.formación.La adición de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) mejoró la capacidad de absorción de humedad del NFRCS.Se añadió polietilenglicol 400 (PEG 400) para mejorar la reticulación de polímeros en mezclas de polímeros enlazados.Se aplicaron tres composiciones hemostáticas de HFFC diferentes (Cm HFFC, Ch HFFC y Cp HFFC), a saber, quitosano con MC (Cm), quitosano con HPMC (Ch) y quitosano con PVA (Cp), a Ct.Varios estudios de caracterización in vitro e in vivo han confirmado la actividad hemostática y cicatrizante de heridas de NFRCS.Los materiales compuestos ofrecidos por NFRCS se pueden usar para personalizar varias formas de andamios para satisfacer necesidades específicas.
Además, NFRCS se puede modificar como un vendaje o rollo para cubrir toda el área lesionada de las extremidades inferiores y otras partes del cuerpo.Específicamente para lesiones en extremidades de combate, el diseño NFRCS diseñado se puede cambiar a medio brazo o pierna completa (Figura complementaria S11).El NFRCS se puede convertir en una muñequera con pegamento de tejido, que se puede usar para detener el sangrado de lesiones graves en la muñeca por suicidio.Nuestro objetivo principal es desarrollar un NFRCS con la menor cantidad posible de polímeros que pueda entregarse a una gran población (por debajo del umbral de pobreza) y que pueda colocarse en un botiquín de primeros auxilios.De diseño simple, eficiente y económico, NFRCS beneficia a las comunidades locales y puede tener un impacto global.
El quitosano (peso molecular 80 kDa) y el amaranto se adquirieron de Merck, India.La hidroxipropilmetilcelulosa 50 Cp, el polietilenglicol 400 y la metilcelulosa se adquirieron de Loba Chemie Pvt.LLC, Bombay.Se adquirió alcohol polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90% hidrolizado) de National Chemicals, Gujarat.La polivinilpirrolidina K30 se adquirió de Molychem, Mumbai, los hisopos estériles se adquirieron de Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con agua Milli Q (sistema de purificación de agua Direct-Q3, Merck, India) como vehículo.
NFRCS se desarrolló utilizando un método de liofilización11,12.Todas las composiciones de HFFC (Tabla 1) se prepararon utilizando un agitador mecánico.Preparar una solución de quitosano al 0,5% utilizando ácido acético al 1% en agua mediante agitación continua a 800 rpm en un agitador mecánico.Se añadió el peso exacto del polímero cargado indicado en la Tabla 1 a la solución de quitosano y se agitó hasta que se obtuvo una solución de polímero transparente.Se añadieron PVP K30 y PEG 400 a la mezcla resultante en las cantidades indicadas en la Tabla 1, y se continuó agitando hasta que se obtuvo una solución de polímero transparente y viscosa.El baño de solución de polímero resultante se sonicó durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la mezcla de polímero.Como se muestra en la Figura complementaria S1 (b), Ct se distribuyó uniformemente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (molde) complementada con 5 ml de HFFC.
La placa de seis pocillos se sonicó durante 60 min para lograr una humectación y una distribución uniformes de HFFC en la red de Ct.A continuación, congele la placa de seis pocillos a -20 °C durante 8-12 horas.Las placas congeladas se liofilizaron durante 48 horas para obtener diversas formulaciones de NFRCS.El mismo procedimiento se utiliza para producir diferentes formas y estructuras, como tampones o tampones cilíndricos, o cualquier otra forma para diferentes aplicaciones.
El quitosano pesado con precisión (80 kDa) (3%) se disuelve en ácido acético al 1% utilizando un agitador magnético.A la solución resultante de quitosano se le añadió PEG 400 al 1% y se agitó durante 30 minutos.Verter la solución resultante en un recipiente cuadrado o rectangular y congelar a -80°C durante 12 horas.Las muestras congeladas se liofilizaron durante 48 horas para obtener Cs13 poroso.
El NFRCS desarrollado se sometió a experimentos utilizando espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japón) para confirmar la compatibilidad química del quitosano con otros polímeros14,15.Los espectros FTIR (ancho del rango espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas las muestras analizadas se obtuvieron realizando 32 escaneos.
La tasa de absorción en sangre (BAR) para todas las formulaciones se evaluó usando el método descrito por Chen et al.16 con ligeras modificaciones.Los NFRK desarrollados de todas las composiciones se secaron en un horno de vacío a 105°C durante la noche para eliminar el solvente residual.Se colocaron 30 mg de NFRCS (peso de la muestra inicial – W0) y 30 mg de Ct (control positivo) en placas separadas que contenían una premezcla de citrato de sodio al 3,8 %.A intervalos de tiempo predeterminados, es decir, 5, 10, 20, 30, 40 y 60 segundos, se retiraron los NFRCS y se limpiaron sus superficies de sangre no absorbida colocando las muestras en Ct durante 30 segundos.Se consideró el peso final de sangre absorbida por NFRCS 16 (W1) en cada punto de tiempo.Calcula el porcentaje de BAR utilizando la siguiente fórmula:
El tiempo de coagulación de la sangre (BCT) se determinó según lo informado por Wang et al.17El tiempo necesario para que la sangre completa (sangre de rata premezclada con citrato de sodio al 3,8 %) se coagule en presencia de NFRCS se calculó como la BCT de la muestra de prueba.Los diversos componentes de NFRCS (30 mg) se colocaron en viales con tapón de rosca de 10 ml y se incubaron a 37°C.Se añadió sangre (0,5 ml) al vial y se añadieron 0,3 ml de CaCl _{2} 0,2 M para activar la coagulación de la sangre.Finalmente, invierta el vial cada 15 segundos (hasta 180°) hasta que se forme un coágulo firme.El BCT de la muestra se estima por el número de volteos de vails17,18.Con base en BCT, se seleccionaron dos composiciones óptimas de NFRCS Cm, Ch y Cp para estudios de caracterización adicionales.
El BCT de las composiciones Ch NFRCS y Cp NFRCS se determinó implementando el método descrito por Li et al.19Coloque 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs (control positivo) en placas Petri separadas (37 °C).La sangre que contenía citrato de sodio al 3,8 % se mezcló con CaCl2 0,2 ​​M en una proporción de volumen de 10:1 para iniciar el proceso de coagulación de la sangre.Se aplicaron 20 µl de mezcla de sangre de rata CaCl2 0,2 ​​M a la superficie de la muestra y se colocaron en una placa de Petri vacía.El control fue sangre vertida en placas de Petri vacías sin Ct.A intervalos fijos de 0, 3 y 5 minutos, detenga la coagulación agregando 10 ml de agua desionizada (DI) a la muestra que contiene el plato sin perturbar el coágulo.Los eritrocitos no coagulados (eritrocitos) sufren hemólisis en presencia de agua desionizada y liberan hemoglobina.La hemoglobina en diferentes puntos temporales (HA(t)) se midió a 540 nm (λmax hemoglobina) usando un espectrofotómetro UV-Vis.Se tomó como estándar de referencia la absorción absoluta de hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sangre en 10 ml de agua desionizada.La captación relativa de hemoglobina (RHA) de sangre coagulada se calculó a partir de la relación HA(t)/HA(0) utilizando el mismo lote de sangre.
Usando un analizador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EE. UU.), se determinaron las propiedades adhesivas de NFRK al tejido dañado.Presione un plato cilíndrico de fondo abierto contra el interior de la piel de cerdo (sin la capa de grasa).Se aplicaron muestras (Ch NFRCS y Cp NFRCS) a través de una cánula en moldes cilíndricos para crear adherencia a la piel del cerdo.Después de una incubación de 3 minutos a temperatura ambiente (TA) (25ºC), se registró la fuerza adhesiva NFRCS a una velocidad constante de 0,5 mm/seg.
La característica principal de los selladores quirúrgicos es aumentar la coagulación de la sangre y reducir la pérdida de sangre.La coagulación sin pérdidas en NFRCS se evaluó utilizando un método previamente publicado con ligeras modificaciones 19 .Haga un tubo de microcentrífuga (2 ml) (diámetro interior 10 mm) con un orificio de 8 × 5 mm2 en un lado del tubo de centrífuga (que representa una herida abierta).NFRCS se usa para cerrar la abertura y se usa cinta para sellar los bordes exteriores.Agregue 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al tubo de microcentrífuga que contiene la premezcla de citrato de sodio al 3,8 %.Después de 10 minutos, los tubos de microcentrífuga se retiraron de los platos y se determinó el aumento de la masa de los platos debido a la salida de sangre de la NFRK (n = 3).La pérdida de sangre Ch NFRCS y Cp NFRCS se compararon con Cs.
La integridad húmeda de NFRCS se determinó con base en el método descrito por Mishra y Chaudhary21 con modificaciones menores.Coloque el NFRCS en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de agua y agite durante 60 s sin formar una tapa.Inspección visual y priorización de muestras para la integridad física en base a la recolección.
La fuerza de unión de HFFC a Ct se estudió utilizando métodos publicados previamente con modificaciones menores.La integridad del revestimiento de la superficie se evaluó exponiendo NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) en presencia de agua milliQ (Ct).Los NFRCS Ch NFRCS y Cp NFRCS desarrollados se colocaron en un vaso de precipitados lleno de agua y se sonicaron durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 30 min, respectivamente.Después del secado, la diferencia porcentual entre el peso inicial y final del NFRCS se utilizó para calcular el porcentaje de pérdida de material (HFFC).BCT in vitro apoyó aún más la fuerza de unión o la pérdida de materiales superficiales.La eficiencia de la unión de HFFC a Ct proporciona coagulación sanguínea y un revestimiento elástico en la superficie de Ct22.
La homogeneidad del NFRCS desarrollado se determinó mediante la BCT de muestras (30 mg) tomadas de ubicaciones generales seleccionadas al azar del NFRCS.Siga el procedimiento BCT mencionado anteriormente para determinar el cumplimiento de NFRCS.La proximidad entre las cinco muestras garantiza una cobertura superficial uniforme y la deposición de HFFC en la malla Ct.
El área nominal de contacto con la sangre (NBCA) se determinó como se informó anteriormente con algunas modificaciones.Coagule la sangre sujetando 20 l de sangre entre las dos superficies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs.Después de 1 hora, se separaron las dos partes del stent y se midió manualmente el área del coágulo.Se consideró el valor promedio de tres repeticiones NBCA NFRCS19.
Se utilizó el análisis de sorción dinámica de vapor (DVS) para evaluar la eficacia de NFRCS para absorber agua del entorno externo o del sitio de la lesión responsable de iniciar la coagulación.El DVS evalúa o registra la absorción y pérdida de vapor en una muestra gravimétricamente utilizando una balanza ultrasensible con una resolución de masa de ±0,1 µg.Se genera una presión de vapor parcial (humedad relativa) mediante un controlador electrónico de flujo másico alrededor de la muestra mezclando gases portadores saturados y secos. Según las directrices de la Farmacopea Europea, según el porcentaje de absorción de humedad por las muestras, las muestras se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p− no higroscópico, 0,2–2 % p/p ligeramente higroscópico, 2–15 % moderadamente higroscópico y > 15 % muy higroscópico)23. Según las directrices de la Farmacopea Europea, según el porcentaje de absorción de humedad por las muestras, las muestras se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p− no higroscópico, 0,2–2 % p/p ligeramente higroscópico, 2–15 % moderadamente higroscópico y > 15 % muy higroscópico)23.De acuerdo con las recomendaciones de la Farmacopea Europea, según el porcentaje de absorción de humedad de las muestras, las muestras se dividieron en 4 categorías (0–0,012 % p/p: no higroscópico, 0,2–2 % p/p, ligeramente higroscópico, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico y > 15% muy higroscópico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w- 非吸湿性、0,2-2% w /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % p/p 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 % 非常吸湿）23。De acuerdo con las recomendaciones de la Farmacopea Europea, las muestras se dividen en 4 clases según el porcentaje de humedad absorbida por la muestra (0-0,012 % en peso – no higroscópico, 0,2-2 % en peso ligeramente higroscópico, 2-15 % en peso).%. % moderadamente higroscópico, > 15% muy higroscópico) 23.La eficiencia higroscópica de NFCS X NFCS y TsN NFCS se determinó en un analizador DVS TA TGA Q5000 SA.Durante este proceso, se obtuvieron el tiempo de ejecución, la humedad relativa (HR) y el peso de la muestra en tiempo real a 25 °C24.El contenido de humedad se calcula mediante un análisis de masa NFRCS preciso utilizando la siguiente ecuación:
MC es la humedad NFRCS.m1 – peso seco de los AINE.m2 es la masa NFRCS en tiempo real a una HR dada.
El área de superficie total se estimó mediante un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). El área de superficie total se estimó mediante un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азо том после опорожнения образцов при 25 °С en течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). El área de superficie total se estimó mediante un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr).25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидк им азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов 25°C (< 7 × 10-3 torr). El área de superficie total se estimó mediante experimentos de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras durante 10 horas a 25 °C (< 7 x 10-3 torr).El área de superficie total, el volumen de poro y el tamaño de poro NFRCS se determinaron con un Quantachrome de NOVA 1000e, Austria usando el software RS 232.
Prepare glóbulos rojos al 5 % (solución salina como diluyente) a partir de sangre completa.A continuación, transfiera una alícuota de HFFC (0,25 ml) a una placa de 96 pocillos y una masa de glóbulos rojos al 5 % (0,1 ml).Incubar la mezcla a 37°C durante 40 minutos.Una mezcla de glóbulos rojos y suero se consideró como control positivo y una mezcla de solución salina y glóbulos rojos como control negativo.La hemaglutinación se determinó según la escala de Stajitzky.Las escalas propuestas son las siguientes: + + + + agregados granulares densos;+ + + almohadillas inferiores lisas con bordes curvos;++ Almohadillas inferiores lisas con bordes rasgados;+ anillos rojos estrechos alrededor de los bordes de las almohadillas lisas;– (negativo) discreto botón rojo 12 en el centro del pozo inferior.
La hemocompatibilidad de NFRCS se estudió según el método de la Organización Internacional para la Estandarización (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.El método gravimétrico descrito por Singh et al.Se realizaron modificaciones menores para evaluar la formación de trombos en presencia o sobre la superficie de NFRCS.Se incubaron 500 mg de Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 24 horas a 37°C.Después de 24 horas, se eliminó el PBS y se trató NFRCS con 2 ml de sangre que contenía citrato de sodio al 3,8%.En la superficie del NFRCS, agregue 0,04 ml de CaCl2 0,1 M a las muestras incubadas.Después de 45 minutos, se agregaron 5 ml de agua destilada para detener la coagulación.La sangre coagulada en la superficie de NFRK se trató con una solución de formaldehído al 36-38%.Los coágulos fijados con formaldehído se secaron y pesaron.El porcentaje de trombosis se estimó calculando el peso del vaso sin sangre y muestra (control negativo) y del vaso con sangre (control positivo).
Como confirmación inicial, las muestras se visualizaron bajo un microscopio óptico para comprender la capacidad del recubrimiento de superficie HFFC, Ct interconectado y red de Ct para formar poros.Se recortaron secciones delgadas de Ch y Cp de NFRCS con una hoja de bisturí.La sección resultante se colocó en un portaobjetos de vidrio, se cubrió con un cubreobjetos y los bordes se fijaron con pegamento.Los portaobjetos preparados se observaron al microscopio óptico y se tomaron fotografías con diferentes aumentos.
La deposición de polímeros en las redes de Ct se visualizó mediante microscopía de fluorescencia basada en el método descrito por Rice et al.29. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se prepararon NFRCS (Ch & Cp) según el método mencionado anteriormente. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se prepararon NFRCS (Ch & Cp) según el método mencionado anteriormente.La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se obtuvo NFRCS (Ch y Cp) de acuerdo con el método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。La composición de HFFC utilizada en la formulación se mezcló con un tinte fluorescente (Amaranto) y recibió NFRCS (Ch y Cp), como se mencionó anteriormente.Se cortaron secciones delgadas de NFRK de las muestras obtenidas, se colocaron en portaobjetos de vidrio y se cubrieron con cubreobjetos.Observe los portaobjetos preparados bajo un microscopio fluorescente usando un filtro verde (310-380 nm).Las imágenes se tomaron con un aumento de 4x para comprender las relaciones de Ct y el exceso de depósito de polímero en la red de Ct.
La topografía superficial de NFRCS Ch y Cp se determinó utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) con un voladizo TESP ultranítido en modo tapping: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwán.La rugosidad de la superficie se determinó mediante la raíz cuadrada media (RMS) utilizando software (Scanning Probe Image Processor).Varias ubicaciones de NFRCS se renderizaron en imágenes 3D para verificar la uniformidad de la superficie.La desviación estándar de la puntuación para un área determinada se define como la rugosidad de la superficie.La ecuación RMS se utilizó para cuantificar la rugosidad de la superficie de NFRCS31.
Los estudios basados ​​en FESEM se realizaron utilizando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, para comprender la morfología de la superficie de Ch NFRCS y Cp NFRCS, que mostró mejor BCT que Cm NFRCS.El estudio FESEM se realizó según el método descrito por Zhao et al.32 con modificaciones menores.NFRCS 20 a 30 mg de Ch NFRCS y Cp NFRCS se premezclaron con 20 µl de citrato de sodio al 3,8% premezclado con sangre de rata.Se añadieron 20 μl de CaCl2 0,2 ​​M a las muestras tratadas con sangre para iniciar la coagulación y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.Además, se eliminó el exceso de eritrocitos de la superficie del NFRCS enjuagando con solución salina.
Las muestras posteriores se trataron con glutaraldehído al 0,1 % y luego se secaron en un horno de aire caliente a 37 °C para eliminar la humedad.Las muestras secas se recubrieron y analizaron 32 .Otras imágenes obtenidas durante el análisis fueron la formación de coágulos en la superficie de las fibras de algodón individuales, la deposición de polímeros entre Ct, la morfología (forma) de los eritrocitos, la integridad del coágulo y la morfología de los eritrocitos en presencia de NFRCS.Las áreas NFRCS no tratadas y las áreas NFRCS tratadas con Ch y Cp incubadas con sangre se escanearon en busca de iones elementales (sodio, potasio, nitrógeno, calcio, magnesio, zinc, cobre y selenio)33.Compare los porcentajes de iones elementales entre muestras tratadas y no tratadas para comprender la acumulación de iones elementales durante la formación de coágulos y la homogeneidad de los coágulos.
El espesor del recubrimiento superficial Cp HFFC sobre la superficie Ct se determinó utilizando FESEM.Las secciones transversales de Cp NFRCS se cortaron del armazón y se recubrieron por pulverización catódica.Las muestras de recubrimiento por pulverización catódica resultantes fueron observadas por FESEM y se midió el espesor del recubrimiento superficial 34 , 35 , 36 .
La micro-CT de rayos X proporciona imágenes no destructivas en 3D de alta resolución y le permite estudiar la disposición estructural interna de NFRK.Micro-CT utiliza un haz de rayos X que atraviesa la muestra para registrar el coeficiente de atenuación lineal local de los rayos X en la muestra, lo que ayuda a obtener información morfológica.La ubicación interna de Ct en Cp NFRCS y Cp NFRCS tratado con sangre se examinó mediante micro-CT para comprender la eficiencia de absorción y la coagulación de la sangre en presencia de NFRCS37,38,39.Las estructuras 3D de muestras Cp NFRCS tratadas con sangre y no tratadas se reconstruyeron utilizando micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Alemania).Usando el software VG STUDIO-MAX versión 2.2, se tomaron varias imágenes de rayos X desde diferentes ángulos (lo ideal sería una cobertura de 360°) para desarrollar imágenes 3D para NFRCS.Los datos de proyección recopilados se reconstruyeron en imágenes volumétricas 3D utilizando el correspondiente software 3D ScanIP Academic simple.
Además, para comprender la distribución del coágulo, se añadieron 20 µl de sangre citratada premezclada y 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al NFRCS para iniciar la coagulación de la sangre.Las muestras preparadas se dejan endurecer.La superficie NFRK se trató con glutaraldehído al 0,5 % y se secó en un horno de aire caliente a 30–40 °C durante 30 min.El coágulo de sangre formado en el NFRCS se escaneó, reconstruyó y se visualizó una imagen 3D del coágulo de sangre.
Los ensayos antibacterianos se realizaron en Cp NFRCS (mejor en comparación con Ch NFRCS) utilizando el método descrito anteriormente con modificaciones menores.La actividad antibacteriana de Cp NFRCS y Cp HFFC se determinó utilizando tres microorganismos de prueba diferentes [S.aureus (bacterias grampositivas), E.coli (bacterias gramnegativas) y Candida blanca (C.albicans)] que crecían en agar en placas de Petri en una incubadora.Inocule uniformemente 50 ml de la suspensión de cultivo bacteriano diluido a una concentración de 105-106 CFU ml-1 en el medio de agar.Vierta el medio en una placa de Petri y deje que se solidifique.Se hicieron pozos en la superficie de la placa de agar para llenar con HFFC (3 pozos para HFFC y 1 para control negativo).Agregue 200 l de HFFC a 3 pocillos y 200 l de PBS de pH 7,4 al cuarto pocillo.En el otro lado de la placa de Petri, coloque un disco NFRCS Cp de 12 mm en el agar solidificado y humedezca con PBS (pH 7,4).Las tabletas de ciprofloxacina, ampicilina y fluconazol se consideran estándares de referencia para Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans.Mida la zona de inhibición manualmente y tome una imagen digital de la zona de inhibición.
Después de la aprobación ética institucional, el estudio se llevó a cabo en el Kasturba Medical College of Education and Research en Manipal, Karnataka, en el sur de la India.El protocolo experimental in vitro TEG ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética Institucional de Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Los sujetos fueron reclutados de donantes de sangre voluntarios (de 18 a 55 años) del banco de sangre del hospital.Además, se obtuvo un formulario de consentimiento informado de los voluntarios para la recolección de muestras de sangre.Se utilizó TEG nativo (N-TEG) ​​​​para estudiar el efecto de la formulación Cp HFFC en sangre completa premezclada con citrato de sodio.N-TEG es ampliamente reconocido por su papel en la reanimación en el punto de atención, lo que crea problemas para los médicos debido al potencial de retraso clínicamente significativo en los resultados (pruebas de coagulación de rutina).El análisis de N-TEG se realizó utilizando sangre entera.Se obtuvo el consentimiento informado y la historia clínica detallada de todos los participantes.El estudio no incluyó participantes con complicaciones hemostáticas o trombóticas como embarazo/postparto o enfermedad hepática.Los sujetos que toman medicamentos que afectan la cascada de la coagulación también fueron excluidos del estudio.Se realizaron pruebas de laboratorio básicas (hemoglobina, tiempo de protrombina, tromboplastina activada y recuento de plaquetas) a todos los participantes de acuerdo con los procedimientos estándar.N-TEG determina la viscoelasticidad del coágulo sanguíneo, la estructura inicial del coágulo, la interacción de partículas, el fortalecimiento del coágulo y la lisis del coágulo.El análisis N-TEG proporciona datos gráficos y numéricos sobre los efectos colectivos de varios elementos celulares y plasma.El análisis N-TEG se realizó en dos volúmenes diferentes de Cp HFFC (10 µl y 50 µl).Como resultado, se añadió 1 ml de sangre completa con ácido cítrico a 10 μl de Cp HFFC.Añada 1 ml (Cp HFFC + sangre citratada), 340 µl de sangre mezclada a 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M que contenga TEG.A partir de entonces, las placas TEG se cargaron en TEG® 5000, US para medir R, K, ángulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % de las muestras de sangre en presencia de Cp HFFC41.
El protocolo de estudio in vivo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC), Escuela de Medicina Kasturba, Instituto de Educación Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Comité para el Control y Supervisión de la Experimentación Animal (CPCSEA).Todos los estudios NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) se realizaron en ratas Wistar hembra (con un peso de 200 a 250 g).Todos los animales fueron aclimatados a una temperatura de 24-26°C, los animales tuvieron libre acceso a alimento estándar y agua ad libitum.Todos los animales se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos, cada grupo constaba de tres animales.Todos los estudios se realizaron de acuerdo con Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Antes del estudio, los animales fueron anestesiados mediante administración intraperitoneal (ip) de una mezcla de 20-50 mg de ketamina (por 1 kg de peso corporal) y 2-10 mg de xilazina (por 1 kg de peso corporal).Luego del estudio se calculó el volumen de sangrado evaluando la diferencia entre el peso inicial y final de las muestras, se tomó como volumen de sangrado de la muestra el valor promedio obtenido de las tres pruebas.
El modelo de amputación de cola de rata se implementó para comprender el potencial de NFRCS para modular el sangrado en trauma, combate o accidente de tráfico (modelo de lesión).Cortar el 50% de la cola con una hoja de bisturí y colocar en el aire durante 15 s para garantizar un sangrado normal.Además, las muestras de prueba se colocaron en la cola de una rata aplicando presión (Ct, Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS).Se informaron sangrado y PCT para las muestras de prueba (n = 3)17,45.
La efectividad del control de presión NFRCS en combate se investigó en un modelo de la arteria femoral superficial.Se expone la arteria femoral, se punza con un trocar 24G y se sangra en 15 segundos.Después de que se observe un sangrado incontrolado, la muestra de prueba se coloca en el sitio de punción con presión aplicada.Inmediatamente después de la aplicación de la muestra de prueba, se registró el tiempo de coagulación y se observó la eficacia hemostática durante los siguientes 5 minutos.Se repitió el mismo procedimiento con Cs y Ct46.
Dowling et al.47 propusieron un modelo de lesión hepática para evaluar el potencial hemostático de los materiales hemostáticos en el contexto del sangrado intraoperatorio.Se registró BCT para muestras de Ct (control negativo), marco de Cs (control positivo), muestras de Ch NFRCS y muestras de Cp NFRCS.La vena cava suprahepática de la rata se expuso realizando una laparotomía mediana.Después de eso, la parte distal del lóbulo izquierdo se cortó con unas tijeras.Haga una incisión en el hígado con una hoja de bisturí y déjelo sangrar durante unos segundos.Se colocaron muestras de prueba de Ch NFRCS y Cp NFRCS pesadas con precisión sobre la superficie dañada sin ninguna presión positiva y se registró la BCT.El grupo de control (Ct) luego aplicó presión seguida de Cs 30 s47 sin romper la lesión.
Los ensayos de cicatrización de heridas in vivo se realizaron utilizando un modelo de herida por escisión para evaluar las propiedades de cicatrización de heridas de los NFRCS basados ​​en polímeros desarrollados.Los modelos de heridas por escisión se seleccionaron y realizaron de acuerdo con métodos previamente publicados con modificaciones menores19,32,48.Todos los animales fueron anestesiados como se describió anteriormente.Utilice un sacabocados de biopsia (12 mm) para hacer una incisión circular profunda en la piel de la espalda.Los sitios de herida preparados se vendaron con Cs (control positivo), Ct (reconociendo que las almohadillas de algodón interfieren con la cicatrización), Ch NFRCS y Cp NFRCS (grupo experimental) y un control negativo sin ningún tratamiento.En cada día del estudio, se midió el área de la herida en todas las ratas.Use una cámara digital para tomar una fotografía del área de la herida y coloque un vendaje nuevo.El porcentaje de cierre de la herida se midió mediante la siguiente fórmula:
Basándose en el porcentaje de cierre de la herida el día 12 del estudio, se extirpó la piel de rata del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) y se estudió mediante tinción H&E y tinción tricrómica de Masson. Basándose en el porcentaje de cierre de la herida el día 12 del estudio, se extirpó la piel de rata del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) y se estudió mediante tinción H&E y tinción tricrómica de Masson.Basándose en el porcentaje de cierre de la herida el día 12 del estudio, la piel de las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) se extirpó y se examinó mediante tinción con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson.Más hijo三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y grupos de control) se extirparon para tinción con hematoxilina-eosina y tinción con tricrómico de Masson en función del porcentaje de cierre de la herida el día 12 del estudio.El procedimiento de tinción implementado se llevó a cabo de acuerdo con los métodos descritos previamente49,50.Brevemente, después de la fijación en formalina al 10%, las muestras se deshidrataron usando una serie de alcoholes graduados.Utilice un micrótomo para obtener secciones finas (5 μm de espesor) del tejido extirpado.Secciones delgadas en serie de controles y Cp NFRCS se trataron con hematoxilina y eosina para estudiar los cambios histopatológicos.Se utilizó la tinción tricrómica de Masson para detectar la formación de fibrillas de colágeno.Los resultados obtenidos fueron estudiados a ciegas por patólogos.
La estabilidad de las muestras de Cp NFRCS se estudió a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60 % HR ± 5 %) durante 12 meses51.Cp NFRCS (decoloración de la superficie y crecimiento microbiano) se inspeccionó visualmente y se probó la resistencia al desgaste por pliegue y BCT de acuerdo con los métodos anteriores descritos en la sección de Materiales y Métodos.
La escalabilidad y reproducibilidad de Cp NFRCS se examinó preparando Cp NFRCS con un tamaño de 15 × 15 cm2.Además, se extirparon muestras de 30 mg (n = 5) de varias fracciones Cp NFRCS y se evaluó el BCT de las muestras estudiadas como se describe anteriormente en la sección Métodos.
Hemos intentado desarrollar varias formas y estructuras utilizando composiciones Cp NFRCS para diversas aplicaciones biomédicas.Dichas formas o configuraciones incluyen hisopos cónicos para hemorragias nasales, procedimientos dentales e hisopos cilíndricos para hemorragias vaginales.
Todos los conjuntos de datos se expresan como media ± desviación estándar y se analizaron mediante ANOVA utilizando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.), seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (*p<0,05).
Todos los procedimientos realizados en los estudios humanos se realizaron de acuerdo con las normas del Instituto y del Consejo Nacional de Investigación, así como la Declaración de Helsinki de 1964 y sus modificaciones posteriores, o normas éticas similares.Todos los participantes fueron informados sobre las características del estudio y su carácter voluntario.Los datos de los participantes permanecen confidenciales una vez recopilados.El protocolo experimental in vitro TEG ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética Institucional de Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Los voluntarios firmaron el consentimiento informado para recolectar muestras de sangre.
Todos los procedimientos realizados en estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Facultad de Medicina de Kastuba, Instituto de Educación Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Todos los experimentos con animales diseñados se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité para el Control y Supervisión de la Experimentación Animal (CPCSEA).Todos los autores siguen las pautas ARRIVE.
Los espectros FTIR de todos los NFRCS se analizaron y compararon con el espectro de quitosano que se muestra en la Figura 2A.Picos espectrales característicos de quitosano (registrados) a 3437 cm-1 (estiramiento OH y NH, superposición), 2945 y 2897 cm-1 (estiramiento CH), 1660 cm-1 (deformación NH2), 1589 cm-1 (flexión N–H), 1157 cm-1 (estiramiento puente O-), 1067 cm-1 (estiramiento C–O, hidroxilo secundario), 993 cm -1 (tramo CO, Bo-OH) 52.53.54.La Tabla complementaria S1 muestra los valores del espectro de absorción FTIR NFRCS para quitosano (reportero), quitosano puro, Cm, Ch y Cp.Los espectros FTIR de todos los NFRCS (Cm, Ch y Cp) mostraron las mismas bandas de absorción características que el quitosano puro sin cambios significativos (Fig. 2A).Los resultados de FTIR confirmaron la ausencia de interacciones químicas o físicas entre los polímeros utilizados para desarrollar el NFRCS, lo que indica que los polímeros utilizados son inertes.
Caracterización in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs.(A) representa los espectros FTIR combinados de las composiciones de quitosano y Cm NFRCS, Ch NFRCS y Cp NFRCS bajo compresión.(B) a) Tasa de captación de sangre completa de NFRCS Cm, Ch, Cp y Cg (n = 3);Las muestras de Ct mostraron un BAR más alto porque el hisopo de algodón tiene una mayor eficiencia de absorción;b) Sangre después de la absorción de sangre Ilustración de la muestra absorbida.Representación gráfica de la BCT de la muestra de prueba C (Cp NFRCS tuvo la mejor BCT (15 s, n = 3)). Los datos en C, D, E y G se mostraron como media ± SD, y las barras de error representan SD, ***p < 0,0001. Los datos en C, D, E y G se mostraron como media ± SD, y las barras de error representan SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Los datos en C, D, E y G se presentan como media ± desviación estándar y las barras de error representan la desviación estándar, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представл яют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± desviación estándar, las barras de error representan la desviación estándar, ***p<0,0001.