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La fertilidad de las aves depende de su capacidad para almacenar suficiente esperma viable durante un período prolongado de tiempo en los túbulos de almacenamiento de esperma (SST).El mecanismo exacto por el cual los espermatozoides entran, residen y salen de la SST sigue siendo controvertido.Los espermatozoides de las gallinas sharkasi mostraron una alta tendencia a la aglutinación, formando haces filamentosos móviles que contenían muchas células.Debido a la dificultad de observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides en una trompa de Falopio opaca, utilizamos un dispositivo de microfluidos con una sección transversal de microcanales similar a la de los espermatozoides para estudiar la aglutinación y la motilidad de los espermatozoides.Este estudio analiza cómo se forman los paquetes de espermatozoides, cómo se mueven y su posible papel en la extensión de la residencia de los espermatozoides en la SST.Investigamos la velocidad de los espermatozoides y el comportamiento reológico cuando se generó flujo de fluido dentro de un canal de microfluidos por presión hidrostática (velocidad de flujo = 33 µm/s).Los espermatozoides tienden a nadar contra la corriente (reología positiva) y la velocidad del haz de espermatozoides se reduce significativamente en comparación con los espermatozoides individuales.Se ha observado que los paquetes de esperma se mueven en espiral y aumentan en longitud y grosor a medida que se reclutan más espermatozoides individuales. Se observaron haces de esperma acercándose y adhiriéndose a las paredes laterales de los canales de microfluidos para evitar ser barridos con una velocidad de flujo de fluido > 33 µm/s. Se observaron haces de esperma acercándose y adhiriéndose a las paredes laterales de los canales de microfluidos para evitar ser barridos con una velocidad de flujo de fluido > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофл юидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Se ha observado que los haces de esperma se acercan y se adhieren a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados a caudales de fluido >33 µm/s.> 33 µm/s > 33 µm/s33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожи дкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/s. Se ha observado que los haces de esperma se acercan y se adhieren a las paredes laterales del canal de microfluidos para evitar ser arrastrados por el flujo de fluido a >33 µm/s.La microscopía electrónica de barrido y de transmisión reveló que los haces de esperma estaban sostenidos por abundante material denso.Los datos obtenidos demuestran la movilidad única de los espermatozoides de pollo Sharkazi, así como la capacidad de los espermatozoides para aglutinar y formar paquetes móviles, lo que contribuye a una mejor comprensión del almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en SMT.
Para lograr la fertilización en humanos y en la mayoría de los animales, los espermatozoides y los óvulos deben llegar al lugar de la fertilización en el momento adecuado.Por lo tanto, el apareamiento debe ocurrir antes o en el momento de la ovulación.Por otro lado, algunos mamíferos, como los perros, así como especies no mamíferas, como insectos, peces, reptiles y aves, almacenan esperma en sus órganos reproductores durante un período prolongado de tiempo hasta que sus óvulos están listos para la fertilización (fertilización asíncrona 1).Las aves son capaces de mantener la viabilidad de los espermatozoides capaces de fecundar los óvulos durante 2 a 10 semanas2.
Esta es una característica única que distingue a las aves de otros animales, ya que proporciona una alta probabilidad de fertilización después de una sola inseminación durante varias semanas sin apareamiento y ovulación simultáneos.El principal órgano de almacenamiento de esperma, llamado túbulo de almacenamiento de esperma (SST), se encuentra en los pliegues de la mucosa interna en la unión uterovaginal.Hasta la fecha, los mecanismos por los cuales los espermatozoides ingresan, residen y salen del banco de esperma no se comprenden completamente.Sobre la base de estudios previos, se han planteado muchas hipótesis, pero ninguna de ellas ha sido confirmada.
Forman4 planteó la hipótesis de que los espermatozoides mantienen su residencia en la cavidad de la SST a través de un movimiento oscilatorio continuo en contra de la dirección del flujo de fluido a través de los canales de proteínas ubicados en las células epiteliales de la SST (reología).El ATP se agota debido a la constante actividad flagelar necesaria para mantener los espermatozoides en la luz del SST y la motilidad finalmente disminuye hasta que los espermatozoides son sacados del banco de espermatozoides por el flujo de fluidos y comienzan un nuevo viaje por la trompa de Falopio ascendente para fertilizar los espermatozoides.Huevo (Forman4).Este modelo de almacenamiento de esperma está respaldado por la detección por inmunocitoquímica de las acuaporinas 2, 3 y 9 presentes en las células epiteliales de SST.Hasta la fecha, faltan estudios sobre la reología del semen de pollo y su papel en el almacenamiento de SST, la selección de espermatozoides vaginales y la competencia de espermatozoides.En las gallinas, los espermatozoides entran en la vagina después del apareamiento natural, pero más del 80 % de los espermatozoides son expulsados ​​de la vagina poco después del apareamiento.Esto sugiere que la vagina es el sitio principal para la selección de esperma en las aves.Además, se ha informado que menos del 1% de los espermatozoides fertilizados en la vagina terminan en SST2.En la inseminación artificial de pollitos en la vagina, el número de espermatozoides que llegan a SST tiende a aumentar 24 horas después de la inseminación.Hasta el momento, el mecanismo de selección de espermatozoides durante este proceso no está claro y la motilidad de los espermatozoides puede desempeñar un papel importante en la captación de espermatozoides SST.Debido a las paredes gruesas y opacas de las trompas de Falopio, es difícil monitorear directamente la motilidad de los espermatozoides en las trompas de Falopio de las aves.Por lo tanto, carecemos de conocimientos básicos sobre cómo los espermatozoides hacen la transición a SST después de la fertilización.
La reología ha sido reconocida recientemente como un factor importante que controla el transporte de esperma en los genitales de los mamíferos.Sobre la base de la capacidad de los espermatozoides móviles para migrar a contracorriente, Zaferani et al8 utilizaron un sistema de microfluidos corra para aislar pasivamente los espermatozoides móviles de las muestras de semen en corrales.Este tipo de clasificación de semen es esencial para el tratamiento médico de la infertilidad y la investigación clínica, y se prefiere a los métodos tradicionales que requieren mucho tiempo y trabajo y pueden comprometer la morfología y la integridad estructural de los espermatozoides.Sin embargo, hasta la fecha, no se han realizado estudios sobre el efecto de las secreciones de los órganos genitales de los pollos sobre la motilidad de los espermatozoides.
Independientemente del mecanismo que mantiene el esperma almacenado en la SST, muchos investigadores han observado que los espermatozoides residentes se aglutinan cabeza a cabeza en la SST de pollos 9, 10, codornices 2 y pavos 11 para formar paquetes de esperma aglutinado.Los autores sugieren que existe un vínculo entre esta aglutinación y el almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en la SST.
Tingari y Lake12 informaron una fuerte asociación entre los espermatozoides en la glándula receptora de esperma del pollo y cuestionaron si los espermatozoides aviares se aglutinan de la misma manera que los espermatozoides de mamíferos.Creen que las conexiones profundas entre los espermatozoides en los conductos deferentes pueden deberse al estrés causado por la presencia de una gran cantidad de espermatozoides en un espacio pequeño.
Al evaluar el comportamiento de los espermatozoides en portaobjetos de vidrio frescos, se pueden observar signos transitorios de aglutinación, especialmente en los bordes de las gotitas de semen.Sin embargo, la aglutinación a menudo se vio perturbada por la acción de rotación asociada con el movimiento continuo, lo que explica la naturaleza transitoria de este fenómeno.Los investigadores también notaron que cuando se añadía el diluyente al semen, aparecían agregados de células alargadas "en forma de hilo".
Los primeros intentos de imitar a un espermatozoide se hicieron quitando un alambre delgado de una gota colgante, lo que resultó en una vesícula alargada parecida a un espermatozoide que sobresalía de la gota de semen.Los espermatozoides inmediatamente se alinearon en forma paralela dentro de la vesícula, pero la unidad entera desapareció rápidamente debido a la limitación 3D.Por lo tanto, para estudiar la aglutinación de espermatozoides, es necesario observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides directamente en túbulos de almacenamiento de esperma aislados, lo cual es difícil de lograr.Por lo tanto, es necesario desarrollar un instrumento que imite a los espermatozoides para apoyar los estudios de motilidad y comportamiento de aglutinación de los espermatozoides.Brillard et al13 informaron que la longitud promedio de los túbulos de almacenamiento de esperma en pollitos adultos es de 400 a 600 µm, pero algunas SST pueden tener una longitud de hasta 2000 µm.Mero y Ogasawara14 dividieron las glándulas seminíferas en túbulos de almacenamiento de esperma agrandados y no agrandados, ambos de la misma longitud (~500 µm) y ancho del cuello (~38 µm), pero el diámetro medio de la luz de los túbulos fue de 56,6 y 56,6 µm.., respectivamente 11,2 μm, respectivamente.En el estudio actual, utilizamos un dispositivo de microfluidos con un tamaño de canal de 200 μm × 20 μm (ancho × alto), cuya sección transversal es algo similar a la de la SST amplificada.Además, examinamos la motilidad de los espermatozoides y el comportamiento de aglutinación en el fluido que fluye, lo que es consistente con la hipótesis de Foreman de que el fluido producido por las células epiteliales de SST mantiene a los espermatozoides en la luz en una dirección contracorriente (reológica).
El objetivo de este estudio fue superar los problemas de observar la motilidad de los espermatozoides en la trompa de Falopio y evitar las dificultades de estudiar la reología y el comportamiento de los espermatozoides en un entorno dinámico.Se utilizó un dispositivo de microfluidos que crea presión hidrostática para simular la motilidad de los espermatozoides en los genitales de un pollo.
Cuando se cargó una gota de una muestra de esperma diluida (1:40) en el dispositivo de microcanal, se pudieron identificar dos tipos de motilidad de esperma (esperma aislado y esperma unido).Además, los espermatozoides tendían a nadar contra corriente (reología positiva; video 1, 2). Aunque los paquetes de espermatozoides tenían una velocidad más baja que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Aunque los paquetes de espermatozoides tenían una velocidad más baja que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,00 1); 2). Aunque los haces de espermatozoides tenían una velocidad menor que la de los espermatozoides individuales (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2).(p < 0,001)分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001; 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уве личивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; tabla 2). Aunque la velocidad de los haces de espermatozoides fue menor que la de los espermatozoides individuales (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides con reología positiva (p < 0,001; Tabla 2).La reología positiva para espermatozoides individuales y mechones se estima en aproximadamente 53 % y 85 %, respectivamente.
Se ha observado que los espermatozoides de los pollos sharkasi inmediatamente después de la eyaculación forman paquetes lineales, que consisten en docenas de individuos.Estos mechones aumentan de longitud y grosor con el tiempo y pueden permanecer in vitro durante varias horas antes de disiparse (video 3).Estos haces filamentosos tienen forma de espermatozoides de equidna que se forman al final del epidídimo.Se ha encontrado que el semen de gallina Sharkashi tiene una alta tendencia a aglutinarse y formar un paquete reticulado en menos de un minuto después de la recolección.Estos rayos son dinámicos y pueden adherirse a cualquier pared cercana u objeto estático.Aunque los haces de esperma reducen la velocidad de los espermatozoides, está claro que macroscópicamente aumentan su linealidad.La longitud de los paquetes varía según la cantidad de espermatozoides recolectados en los paquetes.Se aislaron dos partes del haz: la parte inicial, que incluía la cabeza libre de los espermatozoides aglutinados, y la parte terminal, que incluía la cola y todo el extremo distal de los espermatozoides.Mediante una cámara de alta velocidad (950 fps) se observaron cabezas libres de espermatozoides aglutinados en la parte inicial del haz, responsables del movimiento del haz debido a su movimiento oscilatorio, arrastrando los restantes al interior del haz con un movimiento helicoidal (Video 4).Sin embargo, en mechones largos, se ha observado que algunas cabezas de espermatozoides libres se adhieren al cuerpo y la porción terminal del mechón actúa como paletas para ayudar a impulsar el mechón.
Mientras que en un flujo lento de fluido, los paquetes de esperma se mueven paralelos entre sí, sin embargo, comienzan a superponerse y se adhieren a todo lo que está quieto, para no ser arrastrados por el flujo de corriente a medida que aumenta la velocidad del flujo.Los paquetes se forman cuando un puñado de espermatozoides se acercan entre sí, comienzan a moverse en sincronía y se envuelven entre sí, y luego se adhieren a una sustancia pegajosa.Las figuras 1 y 2 muestran cómo los espermatozoides se acercan entre sí, formando una unión a medida que las colas se enrollan entre sí.
Los investigadores aplicaron presión hidrostática para crear un flujo de fluido en un microcanal para estudiar la reología de los espermatozoides.Se utilizó un microcanal con un tamaño de 200 μm × 20 μm (ancho × alto) y una longitud de 3,6 μm.Utilice microcanales entre contenedores con jeringas colocadas en los extremos.Se utilizó colorante alimentario para hacer más visibles los canales.
Ate los cables de interconexión y los accesorios a la pared.El video fue tomado con un microscopio de contraste de fase.Con cada imagen, se presentan microscopía de contraste de fase e imágenes de mapeo.(A) La conexión entre dos corrientes resiste el flujo debido al movimiento helicoidal (flecha roja).(B) La conexión entre el haz de tubos y la pared del canal (flechas rojas), al mismo tiempo que están conectados a otros dos haces (flechas amarillas).(C) Los paquetes de esperma en el canal de microfluidos comienzan a conectarse entre sí (flechas rojas), formando una malla de paquetes de esperma.(D) Formación de una red de haces de esperma.
Cuando se cargó una gota de esperma diluido en el dispositivo de microfluidos y se creó un flujo, se observó que el haz de esperma se movía en contra de la dirección del flujo.Los haces encajan perfectamente contra las paredes de los microcanales, y las cabezas libres en la parte inicial de los haces encajan perfectamente contra ellos (video 5).También se adhieren a cualquier partícula estacionaria en su camino, como escombros, para resistir ser arrastrados por la corriente.Con el tiempo, estos mechones se convierten en filamentos largos que atrapan a otros espermatozoides individuales y mechones más cortos (Video 6).A medida que el flujo comienza a disminuir, largas filas de espermatozoides comienzan a formar una red de filas de espermatozoides (Video 7; Figura 2).
A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos en espiral de los hilos se incrementan como un intento de atrapar muchos espermatozoides individuales formando paquetes que resisten mejor la fuerza de deriva del flujo. A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos en espiral de los hilos se incrementan como un intento de atrapar muchos espermatozoides individuales formando paquetes que resisten mejor la fuerza de deriva del flujo. спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они п ытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше против остоят дрейфующей силе потока. A velocidades de flujo altas (V > 33 µm/s), los movimientos helicoidales de las hebras aumentan a medida que intentan atrapar muchos espermatozoides individuales formando haces que pueden resistir mejor la fuerza de deriva del flujo.在高流速(V > 33 µm/s)地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s)地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 спиральное движение нитей увеличивается в попытке захват ить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться сила м дрейфа потока. A velocidades de flujo elevadas (V > 33 µm/s), el movimiento helicoidal de los filamentos aumenta en un intento de capturar muchos espermatozoides individuales formando haces para resistir mejor las fuerzas de deriva del flujo.También intentaron unir microcanales a las paredes laterales.
Los paquetes de esperma se identificaron como grupos de cabezas de esperma y colas rizadas mediante microscopía óptica (LM).Los haces de esperma con varios agregados también se han identificado como cabezas retorcidas y agregados flagelares, múltiples colas de esperma fusionadas, cabezas de esperma unidas a una cola y cabezas de esperma con núcleos doblados como múltiples núcleos fusionados.microscopía electrónica de transmisión (TEM).La microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró que los paquetes de espermatozoides eran agregados revestidos de cabezas de espermatozoides y los agregados de espermatozoides mostraban una red unida de colas envueltas.
La morfología y la ultraestructura de los espermatozoides, la formación de haces de espermatozoides se estudiaron mediante microscopía óptica (media sección), microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), los frotis de esperma se tiñeron con naranja de acridina y se examinaron mediante microscopía de epifluorescencia.
La tinción del frotis de esperma con naranja de acridina (Fig. 3B) mostró que las cabezas de los espermatozoides estaban pegadas y cubiertas con material secretor, lo que condujo a la formación de grandes mechones (Fig. 3D).Los paquetes de esperma consistían en agregados de esperma con una red de colas adheridas (Fig. 4A-C).Los paquetes de esperma están compuestos por las colas de muchos espermatozoides pegados (Fig. 4D).Los secretos (Fig. 4E, F) cubrían las cabezas de los paquetes de espermatozoides.
Formación del haz de espermatozoides Usando microscopía de contraste de fase y frotis de esperma teñidos con naranja de acridina, mostró que las cabezas de los espermatozoides se pegan entre sí.(A) La formación temprana del penacho de espermatozoides comienza con un espermatozoide (círculo blanco) y tres espermatozoides (círculo amarillo), con la espiral comenzando en la cola y terminando en la cabeza.(B) Microfotografía de un frotis de espermatozoides teñido con naranja de acridina que muestra cabezas de espermatozoides adherentes (flechas).La descarga cubre la(s) cabeza(s).Aumento × 1000. (C) Desarrollo de un gran haz transportado por flujo en un canal de microfluidos (usando una cámara de alta velocidad a 950 fps).(D) Micrografía de un frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra grandes mechones (flechas).Ampliación: ×200.
Micrografía electrónica de barrido de un haz de esperma y un frotis de esperma teñido con naranja de acridina.(A, B, D, E) son micrografías electrónicas de barrido digital en color de espermatozoides, y C y F son micrografías de frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina que muestran la unión de múltiples espermatozoides que envuelven la red caudal.(AC) Los agregados de esperma se muestran como una red de colas unidas (flechas).(D) Adhesión de varios espermatozoides (con sustancia adhesiva, contorno rosa, flecha) envolviendo la cola.(E y F) Agregados de cabezas espermáticas (punteros) cubiertos con material adhesivo (punteros).Los espermatozoides formaron haces con varias estructuras en forma de vórtice (F).(C) ×400 y (F) ×200 aumentos.
Usando microscopía electrónica de transmisión, encontramos que los paquetes de esperma tenían colas unidas (Fig. 6A, C), cabezas unidas a las colas (Fig. 6B) o cabezas unidas a las colas (Fig. 6D).Las cabezas de los espermatozoides en el haz son curvas, presentando en la sección dos regiones nucleares (Fig. 6D).En el haz de la incisión, los espermatozoides tenían una cabeza torcida con dos regiones nucleares y múltiples regiones flagelares (Fig. 5A).
Micrografía electrónica digital en color que muestra las colas de conexión en el haz de espermatozoides y el material aglutinante que conecta las cabezas de los espermatozoides.(A) Cola adherida de un gran número de espermatozoides.Observe cómo se ve la cola en las proyecciones vertical (flecha) y horizontal (flecha).(B) La cabeza (flecha) del espermatozoide está conectada a la cola (flecha).(C) Se adjuntan varias colas de espermatozoides (flechas).(D) El material de aglutinación (AS, azul) conecta cuatro cabezas de esperma (púrpura).
Se usó microscopía electrónica de barrido para detectar cabezas de esperma en paquetes de esperma cubiertos con secreciones o membranas (Figura 6B), lo que indica que los paquetes de esperma estaban anclados por material extracelular.El material aglutinado se concentró en la cabeza del espermatozoide (conjunto similar a una cabeza de medusa; Fig. 5B) y se expandió distalmente, dando una apariencia amarilla brillante bajo microscopía de fluorescencia cuando se tiñó con naranja de acridina (Fig. 6C).Esta sustancia es claramente visible bajo un microscopio de barrido y se considera un aglutinante.Las secciones semidelgadas (Fig. 5C) y los frotis de esperma teñidos con naranja de acridina mostraron haces de esperma que contenían cabezas densamente empaquetadas y colas rizadas (Fig. 5D).
Varias fotomicrografías que muestran la agregación de cabezas de espermatozoides y colas plegadas utilizando varios métodos.(A) Micrografía electrónica de transmisión de color digital transversal de un haz de esperma que muestra una cabeza de esperma enrollada con un núcleo de dos partes (azul) y varias partes flagelares (verde).(B) Micrografía electrónica de barrido digital en color que muestra un grupo de cabezas de esperma parecidas a medusas (flechas) que parecen estar cubiertas.(C) Sección semidelgada que muestra cabezas de esperma agregadas (flechas) y colas rizadas (flechas).(D) Micrografía de un frotis de espermatozoides teñido con naranja de acridina que muestra agregados de cabezas de espermatozoides (flechas) y colas adherentes rizadas (flechas).Tenga en cuenta que una sustancia pegajosa (S) cubre la cabeza del espermatozoide.(D) × 1000 aumentos.
Usando microscopía electrónica de transmisión (Fig. 7A), también se observó que las cabezas de los espermatozoides estaban torcidas y los núcleos tenían forma de espiral, como lo confirmaron los frotis de esperma teñidos con naranja de acridina y examinados usando microscopía de fluorescencia (Fig. 7B).
(A) Micrografía electrónica de transmisión de color digital y (B) Frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra cabezas enrolladas y unión de cabezas y colas de espermatozoides (flechas).(B) aumento × 1000.
Un hallazgo interesante es que el esperma de Sharkazi se agrega para formar haces filamentosos móviles.Las propiedades de estos haces nos permiten comprender su posible papel en la absorción y almacenamiento de espermatozoides en la SST.
Después del apareamiento, los espermatozoides ingresan a la vagina y se someten a un intenso proceso de selección, lo que da como resultado que solo un número limitado de espermatozoides ingresen al SST15,16.Hasta la fecha, los mecanismos por los cuales los espermatozoides entran y salen de la SST no están claros.En las aves de corral, los espermatozoides se almacenan en el SST durante un período prolongado de 2 a 10 semanas, según la especie6.Sigue existiendo controversia sobre la condición del semen durante el almacenamiento en el SST.¿Están en movimiento o en reposo?En otras palabras, ¿cómo los espermatozoides mantienen su posición en la SST durante tanto tiempo?
Forman4 sugirió que la residencia y la eyección de SST podrían explicarse en términos de motilidad de los espermatozoides.Los autores plantean la hipótesis de que los espermatozoides mantienen su posición nadando contra el flujo de fluido creado por el epitelio de la SST y que los espermatozoides son expulsados ​​de la SST cuando su velocidad cae por debajo del punto en el que comienzan a retroceder debido a la falta de energía.Zaniboni5 confirmó la presencia de acuaporinas 2, 3 y 9 en la porción apical de las células epiteliales de SST, lo que puede apoyar indirectamente el modelo de almacenamiento de esperma de Foreman.En el estudio actual, encontramos que casi la mitad de los espermatozoides de Sharkashi muestran una reología positiva en el fluido que fluye, y que los paquetes de espermatozoides aglutinados aumentan la cantidad de espermatozoides que muestran una reología positiva, aunque la aglutinación los ralentiza.No se comprende completamente cómo los espermatozoides viajan por la trompa de Falopio del ave hasta el sitio de la fertilización.En los mamíferos, el líquido folicular atrae a los espermatozoides.Sin embargo, se cree que los quimioatrayentes dirigen a los espermatozoides para que se acerquen a largas distancias7.Por lo tanto, otros mecanismos son responsables del transporte de espermatozoides.Se ha informado que la capacidad de los espermatozoides para orientarse y fluir contra el líquido de las trompas de Falopio liberado después del apareamiento es un factor importante en la selección de espermatozoides en ratones.Parker 17 sugirió que los espermatozoides cruzan los oviductos nadando contra la corriente ciliar en aves y reptiles.Aunque no se ha demostrado experimentalmente en aves, Adolphi18 fue el primero en encontrar que el esperma aviar da resultados positivos cuando se crea una fina capa de líquido entre un cubreobjetos y un portaobjetos con una tira de papel de filtro.Reología.Hino y Yanagimachi [19] colocaron un complejo de ovario, trompas y útero de ratón en un anillo de perfusión e inyectaron 1 µl de tinta en el istmo para visualizar el flujo de líquido en las trompas de Falopio.Notaron un movimiento muy activo de contracción y relajación en la trompa de Falopio, en el que todas las bolas de tinta se movían constantemente hacia la ampolla de la trompa de Falopio.Los autores enfatizan la importancia del flujo de líquido tubárico desde la parte inferior a la parte superior de las trompas de Falopio para la elevación y fertilización de los espermatozoides.Brillard20 informó que en pollos y pavos, los espermatozoides migran por movimiento activo desde la entrada vaginal, donde se almacenan, hasta la unión útero-vaginal, donde se almacenan.Sin embargo, este movimiento no es necesario entre la unión uterovaginal y el infundíbulo porque los espermatozoides son transportados por desplazamiento pasivo.Conociendo estas recomendaciones anteriores y los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede suponer que la capacidad de los espermatozoides para moverse aguas arriba (reología) es una de las propiedades en las que se basa el proceso de selección.Esto determina el paso de los espermatozoides a través de la vagina y su entrada en el CCT para su almacenamiento.Como sugirió Forman4, esto también puede facilitar el proceso de que los espermatozoides ingresen a la SST y su hábitat durante un período de tiempo y luego salgan cuando su velocidad comienza a disminuir.
Por otro lado, Matsuzaki y Sasanami 21 sugirieron que los espermatozoides aviares experimentan cambios de motilidad desde la latencia a la motilidad en los tractos reproductivos masculino y femenino.Se ha propuesto la inhibición de la motilidad de los espermatozoides residentes en la SST para explicar el largo tiempo de almacenamiento de los espermatozoides y luego el rejuvenecimiento después de dejar la SST.En condiciones hipóxicas, Matsuzaki et al.1 informó una alta producción y liberación de lactato en la SST, lo que puede conducir a la inhibición de la motilidad de los espermatozoides residentes.En este caso, la importancia de la reología espermática se refleja en la selección y absorción de los espermatozoides, y no en su almacenamiento.
El patrón de aglutinación de espermatozoides se considera una explicación plausible para el largo período de almacenamiento de espermatozoides en el SST, ya que este es un patrón común de retención de espermatozoides en las aves de corral2,22,23.Bakst et al.2 observaron que la mayoría de los espermatozoides se adhirieron entre sí, formando agregados fasciculares, y rara vez se encontraron espermatozoides únicos en la codorniz CCM.Por otro lado, Wen et al.24 observaron más espermatozoides dispersos y menos mechones de espermatozoides en la luz del SST en pollos.Con base en estas observaciones, se puede suponer que la propensión a la aglutinación de espermatozoides difiere entre aves y entre espermatozoides en el mismo eyaculado.Además, Van Krey et al.9 sugirieron que la disociación aleatoria de los espermatozoides aglutinados es responsable de la penetración gradual de los espermatozoides en la luz de la trompa de Falopio.Según esta hipótesis, los espermatozoides con menor capacidad de aglutinación deberían ser expulsados ​​primero de la SST.En este contexto, la capacidad de aglutinación de los espermatozoides puede ser un factor que influya en el resultado de la competencia espermática en las aves sucias.Además, cuanto más tiempo se disocia el esperma aglutinado, más tiempo se mantiene la fertilidad.
Aunque la agregación de espermatozoides y la agregación en haces se han observado en varios estudios2,22,24, no se han descrito en detalle debido a la complejidad de su observación cinemática dentro de la SST.Se han realizado varios intentos para estudiar la aglutinación de esperma in vitro.Se observó una agregación extensa pero transitoria cuando se retiró el alambre delgado de la gota de semilla que colgaba.Esto lleva al hecho de que una burbuja alargada sobresale de la gota, imitando la glándula seminal.Debido a las limitaciones 3D y los cortos tiempos de secado por goteo, todo el bloque se deterioró rápidamente9.En el estudio actual, utilizando pollos Sharkashi y chips de microfluidos, pudimos describir cómo se forman estos mechones y cómo se mueven.Los paquetes de esperma se formaron inmediatamente después de la recolección del semen y se encontró que se movían en espiral, mostrando una reología positiva cuando estaban presentes en el flujo.Además, cuando se observa macroscópicamente, se ha observado que los paquetes de espermatozoides aumentan la linealidad de la motilidad en comparación con los espermatozoides aislados.Esto sugiere que la aglutinación de espermatozoides puede ocurrir antes de la penetración de SST y que la producción de espermatozoides no se limita a un área pequeña debido al estrés como se sugirió anteriormente (Tingari y Lake12).Durante la formación del penacho, los espermatozoides nadan en sincronía hasta formar una unión, luego sus colas se enrollan entre sí y la cabeza del espermatozoide permanece libre, pero la cola y la parte distal del espermatozoide se pegan entre sí con una sustancia pegajosa.Por tanto, la cabeza libre del ligamento es la responsable del movimiento, arrastrando al resto del ligamento.La microscopía electrónica de barrido de los haces de esperma mostró cabezas de esperma unidas cubiertas con una gran cantidad de material pegajoso, lo que sugiere que las cabezas de esperma estaban unidas en haces de reposo, lo que puede haber ocurrido después de llegar al sitio de almacenamiento (SST).
Cuando un frotis de esperma se tiñe con naranja de acridina, el material adhesivo extracelular alrededor de los espermatozoides se puede ver bajo un microscopio fluorescente.Esta sustancia permite que los paquetes de esperma se adhieran y se adhieran a cualquier superficie o partícula circundante para que no se desplacen con el flujo circundante.Por lo tanto, nuestras observaciones muestran el papel de la adhesión de los espermatozoides en forma de haces móviles.Su capacidad para nadar contra la corriente y adherirse a las superficies cercanas permite que los espermatozoides permanezcan más tiempo en el SST.
Rothschild25 utilizó una cámara de hemocitometría para estudiar la distribución flotante del semen bovino en una gota de suspensión, tomando microfotografías a través de una cámara con eje óptico tanto vertical como horizontal del microscopio.Los resultados mostraron que los espermatozoides fueron atraídos hacia la superficie de la cámara.Los autores sugieren que puede haber interacciones hidrodinámicas entre el esperma y la superficie.Teniendo esto en cuenta, junto con la capacidad del semen de los pollitos Sharkashi para formar mechones pegajosos, puede aumentar la probabilidad de que el semen se adhiera a la pared del SST y se almacene durante largos períodos de tiempo.
Bccetti y Afzeliu26 informaron que el glucocáliz espermático es necesario para el reconocimiento y la aglutinación de los gametos.Forman10 observó que la hidrólisis de los enlaces α-glucosídicos en los recubrimientos de glicoproteína-glucolípido al tratar el semen aviar con neuraminidasa resultó en una reducción de la fertilidad sin afectar la motilidad de los espermatozoides.Los autores sugieren que el efecto de la neuraminidasa en el glucocáliz altera el secuestro de esperma en la unión útero-vaginal, lo que reduce la fertilidad.Sus observaciones no pueden ignorar la posibilidad de que el tratamiento con neuraminidasa pueda reducir el reconocimiento de espermatozoides y ovocitos.Forman y Engel10 encontraron que la fertilidad se reducía cuando las gallinas eran inseminadas por vía intravaginal con semen tratado con neuraminidasa.Sin embargo, la FIV con esperma tratado con neuraminidasa no afectó la fertilidad en comparación con los pollos de control.Los autores concluyeron que los cambios en el revestimiento de glicoproteínas y glicolípidos alrededor de la membrana del esperma redujeron la capacidad de los espermatozoides para fertilizar al afectar el secuestro de espermatozoides en la unión útero-vaginal, lo que a su vez aumentó la pérdida de espermatozoides debido a la velocidad de la unión útero-vaginal, pero no afecta el reconocimiento de espermatozoides y óvulos.
En pavos Bakst y Bauchan 11 encontraron pequeñas vesículas y fragmentos de membrana en el lumen de la SST y observaron que algunos de estos gránulos se habían fusionado con la membrana espermática.Los autores sugieren que estas relaciones pueden contribuir al almacenamiento a largo plazo de espermatozoides en SST.Sin embargo, los investigadores no especificaron la fuente de estas partículas, si son secretadas por las células epiteliales de CCT, producidas y secretadas por el sistema reproductivo masculino, o producidas por el propio esperma.Además, estas partículas son responsables de la aglutinación.Grützner et al27 informaron que las células epiteliales del epidídimo producen y secretan una proteína específica que se requiere para la formación de tractos seminales de un solo poro.Los autores también informan que la dispersión de estos haces depende de la interacción de las proteínas del epidídimo.Nixon et al28 encontraron que los anexos secretan una proteína, la osteonectina ácida rica en cisteína;SPARC participa en la formación de mechones de esperma en equidnas y ornitorrincos de pico corto.La dispersión de estos haces está asociada con la pérdida de esta proteína.
En el estudio actual, el análisis ultraestructural con microscopía electrónica mostró que los espermatozoides se adhirieron a una gran cantidad de material denso.Se cree que estas sustancias son responsables de la aglutinación que se condensa entre y alrededor de las cabezas adherentes, pero en concentraciones más bajas en la región de la cola.Suponemos que esta sustancia aglutinante se excreta del sistema reproductor masculino (epidídimo o conducto deferente) junto con el semen, ya que a menudo observamos que el semen se separa de la linfa y el plasma seminal durante la eyaculación.Se ha informado que a medida que los espermatozoides aviares pasan a través del epidídimo y los conductos deferentes, experimentan cambios relacionados con la maduración que respaldan su capacidad para unirse a proteínas y adquirir glicoproteínas asociadas al lema plasmático.La persistencia de estas proteínas en las membranas espermáticas residentes en la SST sugiere que estas proteínas pueden influir en la adquisición de la estabilidad de la membrana espermática 30 y determinar su fertilidad 31 .Ahammad et al32 informaron que los espermatozoides obtenidos de varias partes del sistema reproductivo masculino (desde los testículos hasta el conducto deferente distal) mostraron un aumento progresivo en la viabilidad en condiciones de almacenamiento líquido, independientemente de la temperatura de almacenamiento, y la viabilidad en los pollos también aumenta en las trompas de Falopio después de la inseminación artificial.
Los mechones de esperma de pollo Sharkashi tienen características y funciones diferentes a las de otras especies, como equidnas, ornitorrincos, ratones de campo, ratas ciervos y conejillos de Indias.En los pollos sharkasi, la formación de paquetes de espermatozoides redujo su velocidad de natación en comparación con los espermatozoides individuales.Sin embargo, estos paquetes aumentaron el porcentaje de espermatozoides reológicamente positivos y aumentaron la capacidad de los espermatozoides para estabilizarse en un entorno dinámico.Por lo tanto, nuestros resultados confirman la sugerencia anterior de que la aglutinación de espermatozoides en SST está asociada con el almacenamiento de espermatozoides a largo plazo.También planteamos la hipótesis de que la propensión de los espermatozoides a formar mechones puede controlar la tasa de pérdida de espermatozoides en SST, lo que puede alterar el resultado de la competencia de espermatozoides.De acuerdo con esta suposición, los espermatozoides con baja capacidad de aglutinación liberan SST primero, mientras que los espermatozoides con alta capacidad de aglutinación producen la mayor parte de la descendencia.La formación de paquetes de espermatozoides de un solo poro es beneficiosa y afecta la relación padre-hijo, pero utiliza un mecanismo diferente.En equidnas y ornitorrincos, los espermatozoides están dispuestos paralelos entre sí para aumentar la velocidad de avance del haz.Los paquetes de equidnas se mueven unas tres veces más rápido que los espermatozoides individuales.Se cree que la formación de esos mechones de esperma en los equidnas es una adaptación evolutiva para mantener el dominio, ya que las hembras son promiscuas y suelen aparearse con varios machos.Por tanto, los espermatozoides de diferentes eyaculados compiten ferozmente por la fecundación del óvulo.
Los espermatozoides aglutinados de pollos sharkasi son fáciles de visualizar mediante microscopía de contraste de fase, lo que se considera ventajoso porque permite estudiar fácilmente el comportamiento de los espermatozoides in vitro.El mecanismo por el cual la formación de mechones de espermatozoides promueve la reproducción en los pollos sharkasi también es diferente del observado en algunos mamíferos placentarios que representan un comportamiento cooperativo de los espermatozoides, como los ratones de madera, donde algunos espermatozoides alcanzan los óvulos, ayudando a otros individuos relacionados a alcanzarlos y dañarlos.para probarte a ti mismo.comportamiento altruista.Autofertilización 34. Otro ejemplo de comportamiento cooperativo en los espermatozoides se encontró en ratones ciervos, donde los espermatozoides pudieron identificar y combinarse con los espermatozoides más relacionados genéticamente y formar grupos cooperativos para aumentar su velocidad en comparación con los espermatozoides no relacionados35.
Los resultados obtenidos en este estudio no contradicen la teoría de Foman sobre el almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en SWS.Los investigadores informan que los espermatozoides continúan moviéndose en el flujo de células epiteliales que recubren la SST durante un período prolongado de tiempo y, después de un cierto período de tiempo, las reservas de energía de los espermatozoides se agotan, lo que resulta en una disminución de la velocidad, lo que permite la expulsión de sustancias de peso molecular pequeño.energía de los espermatozoides con el flujo de líquido de la luz del SST La cavidad de la trompa de Falopio.En el estudio actual, observamos que la mitad de los espermatozoides individuales mostraron la capacidad de nadar contra los fluidos que fluyen, y su adhesión en el paquete aumentó su capacidad para mostrar una reología positiva.Además, nuestros datos son consistentes con los de Matsuzaki et al.1, quien informó que el aumento de la secreción de lactato en SST puede inhibir la motilidad de los espermatozoides residentes.Sin embargo, nuestros resultados describen la formación de ligamentos móviles de esperma y su comportamiento reológico en presencia de un entorno dinámico dentro de un microcanal en un intento por dilucidar su comportamiento en SST.La investigación futura puede centrarse en determinar la composición química y el origen del agente aglutinante, lo que sin duda ayudará a los investigadores a desarrollar nuevas formas de almacenar semen líquido y aumentar la duración de la fertilidad.
En el estudio, se seleccionaron como donantes de esperma quince machos de tiburón con el cuello desnudo de 30 semanas de edad (homocigótico dominante; Na Na).Las aves fueron criadas en la Granja Avícola de Investigación de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Ashit, Gobernación de Ashit, Egipto.Las aves se alojaron en jaulas individuales (30 x 40 x 40 cm), se sometieron a un programa de luz (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) y se alimentaron con una dieta que contenía 160 g de proteína cruda, 2800 kcal de energía metabolizable, 35 g de calcio cada una.5 gramos de fósforo disponible por kilogramo de dieta.
Según datos 36, 37, se recolectó semen de machos mediante masaje abdominal.Se recogieron un total de 45 muestras de semen de 15 hombres durante 3 días.El semen (n = 15/día) se diluyó inmediatamente 1:1 (v:v) con diluyente de semen de aves de corral Belsville, que contiene difosfato de potasio (1,27 g), monohidrato de glutamato monosódico (0,867 g), fructosa (0,5 d) de sodio anhidro.acetato (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potasio monohidrato (0,064 g), monofosfato de potasio (0,065 g), cloruro de magnesio (0,034 g) y H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaridad 333 mOsm/kg38.Las muestras de semen diluido se examinaron primero con un microscopio óptico para garantizar la buena calidad del semen (humedad) y luego se almacenaron en un baño de agua a 37°C hasta su uso dentro de la media hora posterior a la recolección.
La cinemática y la reología de los espermatozoides se describen utilizando un sistema de dispositivos de microfluidos.Las muestras de semen se diluyeron aún más a 1:40 en Beltsville Avian Semen Diluent, se cargaron en un dispositivo de microfluidos (ver más abajo) y los parámetros cinéticos se determinaron utilizando un sistema de análisis de semen computarizado (CASA) desarrollado previamente para la caracterización de microfluidos.sobre la movilidad de los espermatozoides en medios líquidos (Departamento de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ingeniería, Universidad de Assiut, Egipto).El complemento se puede descargar en: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Se midieron la velocidad de curva (VCL, μm/s), la velocidad lineal (VSL, μm/s) y la velocidad de trayectoria promedio (VAP, μm/s).Los videos de los espermatozoides se tomaron utilizando un microscopio de contraste de fase invertido Optika XDS-3 (con objetivo de 40x) conectado a una cámara Tucson ISH1000 a 30 fps durante 3 s.Utilice el software CASA para estudiar al menos tres áreas y 500 trayectorias de esperma por muestra.El video grabado fue procesado utilizando un CASA casero.La definición de motilidad en el complemento CASA se basa en la velocidad de natación de los espermatozoides en comparación con la tasa de flujo, y no incluye otros parámetros como el movimiento de lado a lado, ya que se ha encontrado que es más confiable en el flujo de fluidos.El movimiento reológico se describe como el movimiento de los espermatozoides en contra de la dirección del flujo del fluido.Los espermatozoides con propiedades reológicas se dividieron por el número de espermatozoides móviles;los espermatozoides que estaban en reposo y los espermatozoides en movimiento convectivo fueron excluidos del conteo.
Todos los productos químicos utilizados se obtuvieron de Elgomhoria Pharmaceuticals (El Cairo, Egipto), a menos que se indique lo contrario.El dispositivo se fabricó según lo descrito por El-sherry et al.40 con algunas modificaciones.Los materiales utilizados para fabricar los microcanales incluyeron placas de vidrio (Howard Glass, Worcester, MA), resistencia negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol de diacetona (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) y poliacetona.-184, Dow Corning, Midland, Míchigan).Los microcanales se fabrican mediante litografía blanda.En primer lugar, se imprimió una mascarilla protectora transparente con el diseño de microcanales deseado en una impresora de alta resolución (Prismatic, El Cairo, Egipto y Pacific Arts and Design, Markham, ON).Los maestros se realizaron utilizando placas de vidrio como sustrato.Las placas se limpiaron en acetona, isopropanol y agua desionizada y luego se recubrieron con una capa de 20 µm de SU8-25 mediante recubrimiento por rotación (3000 rpm, 1 min).A continuación, las capas de SU-8 se secaron suavemente (65 °C, 2 min y 95 °C, 10 min) y se expusieron a la radiación UV durante 50 s.Hornear después de la exposición a 65°C y 95°C durante 1 min y 4 min para reticular las capas expuestas de SU-8, seguido de revelado en alcohol de diacetona durante 6,5 min.Hornee los waffles (200 °C durante 15 min) para solidificar aún más la capa SU-8.
El PDMS se preparó mezclando el monómero y el endurecedor en una proporción de peso de 10:1, luego se desgasificó en un desecador de vacío y se vertió en el marco principal del SU-8.El PDMS se curó en un horno (120 °C, 30 min), luego se cortaron los canales, se separaron del maestro y se perforaron para permitir que los tubos se unieran a la entrada y salida del microcanal.Finalmente, los microcanales PDMS se unieron permanentemente a portaobjetos de microscopio utilizando un procesador de corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL) como se describe en otra parte.El microcanal utilizado en este estudio mide 200 μm × 20 μm (ancho × alto) y 3,6 cm de largo.
El flujo de fluido inducido por la presión hidrostática dentro del microcanal se logra manteniendo el nivel de fluido en el depósito de entrada por encima de la diferencia de altura Δh39 en el depósito de salida (Fig. 1).
donde f es el coeficiente de fricción, definido como f = C/Re para flujo laminar en un canal rectangular, donde C es una constante que depende de la relación de aspecto del canal, L es la longitud del microcanal, Vav es la velocidad promedio dentro del microcanal, Dh es el diámetro hidráulico del canal, g – aceleración de la gravedad.Usando esta ecuación, la velocidad promedio del canal se puede calcular usando la siguiente ecuación: