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La fertilidad de las aves depende de su capacidad para almacenar suficientes espermatozoides viables durante un período prolongado en los túbulos de almacenamiento de esperma (TSE). El mecanismo exacto por el cual los espermatozoides entran, residen y salen de los TSE sigue siendo controvertido. Los espermatozoides de las gallinas sharkasi mostraron una alta tendencia a la aglutinación, formando haces filamentosos móviles que contienen muchas células. Debido a la dificultad de observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides en una trompa de Falopio opaca, utilizamos un dispositivo microfluídico con una sección transversal de microcanal similar a la de los espermatozoides para estudiar la aglutinación y la motilidad de los espermatozoides. Este estudio analiza cómo se forman los haces de espermatozoides, cómo se mueven y su posible papel en la extensión de la residencia de los espermatozoides en los TSE. Investigamos la velocidad y el comportamiento reológico de los espermatozoides cuando se generó un flujo de fluido dentro de un canal microfluídico mediante presión hidrostática (tasa de flujo = 33 µm/s). Los espermatozoides tienden a nadar contracorriente (reología positiva) y la velocidad del haz espermático se reduce significativamente en comparación con los espermatozoides individuales. Se ha observado que los haces espermáticos se mueven en espiral y aumentan de longitud y grosor a medida que se reclutan más espermatozoides individuales. Se observó que los haces de espermatozoides se acercaban y se adherían a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados con una velocidad de flujo de fluido > 33 µm/s. Se observó que los haces de espermatozoides se acercaban y se adherían a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados con una velocidad de flujo de fluido > 33 µm/s. Было замечено, что пучки стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Se ha observado que los haces de espermatozoides se aproximan y se adhieren a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados a velocidades de flujo de fluido >33 µm/s.Temperatura de funcionamiento > 33 µm/s > 33 µm/s.33 µm/s 扫过。 Además, las bolsas de espermatozoides se colocan y se aplican a los canales microscópicos de los microbios. збежать Las temperaturas máximas son superiores a 33 mm/s. Se ha observado que los haces de espermatozoides se aproximan y se adhieren a las paredes laterales del canal microfluídico para evitar ser arrastrados por el flujo de fluido a >33 µm/s.La microscopía electrónica de barrido y transmisión reveló que los haces espermáticos estaban soportados por abundante material denso. Los datos obtenidos demuestran la movilidad única de los espermatozoides de pollo Sharkazi, así como su capacidad para aglutinarse y formar haces móviles, lo que contribuye a una mejor comprensión del almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en el SMT.
Para lograr la fecundación en humanos y la mayoría de los animales, los espermatozoides y los óvulos deben llegar al lugar de la fecundación en el momento oportuno. Por lo tanto, el apareamiento debe ocurrir antes o en el momento de la ovulación. Por otro lado, algunos mamíferos, como los perros, así como especies no mamíferas, como insectos, peces, reptiles y aves, almacenan espermatozoides en sus órganos reproductores durante un período prolongado hasta que sus óvulos están listos para la fecundación (fecundación asincrónica 1 ). Las aves pueden mantener la viabilidad de los espermatozoides capaces de fecundar óvulos durante 2 a 10 semanas 2 .
Esta es una característica única que distingue a las aves de otros animales, ya que proporciona una alta probabilidad de fecundación tras una sola inseminación durante varias semanas sin apareamiento y ovulación simultáneos. El principal órgano de almacenamiento de espermatozoides, llamado túbulo de almacenamiento espermático (TSE), se encuentra en los pliegues mucosos internos de la unión uterovaginal. Hasta la fecha, no se comprenden completamente los mecanismos por los que los espermatozoides entran, residen y salen del banco de espermatozoides. Con base en estudios previos, se han planteado numerosas hipótesis, pero ninguna ha sido confirmada.
Forman4 planteó la hipótesis de que los espermatozoides mantienen su residencia en la cavidad del SST a través de un movimiento oscilatorio continuo en contra de la dirección del flujo de fluido a través de canales de proteínas ubicados en las células epiteliales del SST (reología). El ATP se agota debido a la constante actividad flagelar necesaria para mantener el esperma en el lumen del SST y la motilidad finalmente disminuye hasta que el esperma es transportado fuera del banco de esperma por el flujo de fluido y comienza un nuevo viaje por la trompa de Falopio ascendente para fertilizar el esperma. Óvulo (Forman4). Este modelo de almacenamiento de esperma está respaldado por la detección por inmunocitoquímica de acuaporinas 2, 3 y 9 presentes en las células epiteliales del SST. Hasta la fecha, faltan estudios sobre la reología del semen de pollo y su papel en el almacenamiento del SST, la selección vaginal de espermatozoides y la competencia espermática. En los pollos, el esperma ingresa a la vagina después del apareamiento natural, pero más del 80% de los espermatozoides son expulsados ​​de la vagina poco después del apareamiento. Esto sugiere que la vagina es el sitio principal para la selección de espermatozoides en las aves. Además, se ha reportado que menos del 1% de los espermatozoides fecundados en la vagina terminan en SSTs². En la inseminación artificial de pollitos en la vagina, el número de espermatozoides que alcanzan SST tiende a aumentar 24 horas después de la inseminación. Hasta el momento, el mecanismo de selección de espermatozoides durante este proceso no está claro, y la motilidad espermática podría desempeñar un papel importante en la captación de espermatozoides en SST. Debido a las paredes gruesas y opacas de las trompas de Falopio, es difícil monitorear directamente la motilidad espermática en las trompas de Falopio de las aves. Por lo tanto, carecemos de un conocimiento básico sobre cómo los espermatozoides pasan a SST después de la fecundación.
Recientemente se ha reconocido que la reología es un factor importante que controla el transporte de espermatozoides en los genitales de los mamíferos. Basándose en la capacidad de los espermatozoides móviles para migrar a contracorriente, Zaferani et al.8 utilizaron un sistema microfluídico de corra para aislar pasivamente espermatozoides móviles de muestras de semen en corral. Este tipo de clasificación de semen es esencial para el tratamiento médico de la infertilidad y la investigación clínica, y se prefiere a los métodos tradicionales, que requieren mucho tiempo y mano de obra, y pueden comprometer la morfología y la integridad estructural de los espermatozoides. Sin embargo, hasta la fecha, no se han realizado estudios sobre el efecto de las secreciones de los órganos genitales de los pollos en la motilidad de los espermatozoides.
Independientemente del mecanismo que mantiene los espermatozoides almacenados en el SST, muchos investigadores han observado que los espermatozoides residentes se aglutinan cabeza con cabeza en el SST de los pollos 9 y 10, las codornices 2 y los pavos 11 para formar haces de espermatozoides aglutinados. Los autores sugieren que existe una relación entre esta aglutinación y el almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en el SST.
Tingari y Lake12 informaron de una fuerte asociación entre los espermatozoides en la glándula receptora de espermatozoides del pollo y cuestionaron si los espermatozoides aviares se aglutinan de la misma manera que los de los mamíferos. Creen que las profundas conexiones entre los espermatozoides en el conducto deferente podrían deberse al estrés causado por la presencia de una gran cantidad de espermatozoides en un espacio reducido.
Al evaluar el comportamiento de los espermatozoides en portaobjetos frescos, se observaron signos transitorios de aglutinación, especialmente en los bordes de las gotitas de semen. Sin embargo, la aglutinación se vio frecuentemente alterada por la rotación asociada al movimiento continuo, lo que explica la naturaleza transitoria de este fenómeno. Los investigadores también observaron que, al añadir el diluyente al semen, aparecieron agregados celulares alargados con forma de filamento.
Los primeros intentos de imitar un espermatozoide se realizaron retirando un alambre delgado de una gota colgante, lo que resultó en una vesícula alargada similar a un espermatozoide que sobresalía de la gota de semen. Los espermatozoides se alinearon inmediatamente de forma paralela dentro de la vesícula, pero toda la unidad desapareció rápidamente debido a la limitación 3D. Por lo tanto, para estudiar la aglutinación de los espermatozoides, es necesario observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides directamente en túbulos de almacenamiento de espermatozoides aislados, lo cual es difícil de lograr. Por lo tanto, es necesario desarrollar un instrumento que imite a los espermatozoides para respaldar los estudios de la motilidad y el comportamiento de aglutinación de los espermatozoides. Brillard et al13 informaron que la longitud promedio de los túbulos de almacenamiento de espermatozoides en pollos adultos es de 400 a 600 µm, pero algunos SST pueden alcanzar los 2000 µm. Mero y Ogasawara14 dividieron las glándulas seminíferas en túbulos de almacenamiento de espermatozoides agrandados y no agrandados, ambos de los cuales eran iguales en longitud (~500 µm) y ancho de cuello (~38 µm), pero el diámetro medio del lumen de los túbulos era de 56,6 y 56,6 µm. . , respectivamente 11,2 µm, respectivamente. En el estudio actual, utilizamos un dispositivo microfluídico con un tamaño de canal de 200 µm × 20 µm (ancho × alto), cuya sección transversal es algo cercana a la del SST amplificado. Además, examinamos la motilidad de los espermatozoides y el comportamiento de aglutinación en el fluido que fluye, lo cual es consistente con la hipótesis de Foreman de que el fluido producido por las células epiteliales del SST mantiene a los espermatozoides en el lumen en una dirección contracorriente (reológica).
El objetivo de este estudio fue superar los problemas que presenta la observación de la motilidad de los espermatozoides en las trompas de Falopio y evitar las dificultades que presenta el estudio de la reología y el comportamiento de los espermatozoides en un entorno dinámico. Se utilizó un dispositivo microfluídico que genera presión hidrostática para simular la motilidad de los espermatozoides en los genitales de un pollo.
Al introducir una gota de una muestra de esperma diluida (1:40) en el dispositivo de microcanales, se identificaron dos tipos de movilidad espermática (espermatozoides aislados y espermatozoides ligados). Además, los espermatozoides tendían a nadar contracorriente (reología positiva; vídeos 1 y 2). Aunque los haces de espermatozoides tenían una velocidad menor que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraron reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Aunque los haces de espermatozoides tenían una velocidad menor que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraron reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент espermatozoides, demostradores de reacciones adversas (p < 0,001; tabla 2). Aunque los haces de espermatozoides tuvieron una velocidad menor que la de los espermatozoides individuales (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraron reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент espermatozoides s положительной реоLOGией (p < 0,001; tabla 2). Aunque la velocidad de los haces espermáticos fue menor que la de los espermatozoides individuales (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides con reología positiva (p < 0,001; Tabla 2).Se estima que la reología positiva para los espermatozoides individuales y los penachos es de aproximadamente el 53% y el 85%, respectivamente.
Se ha observado que los espermatozoides de los pollos sharkasi, inmediatamente después de la eyaculación, forman haces lineales, compuestos por docenas de individuos. Estos mechones aumentan en longitud y grosor con el tiempo y pueden permanecer in vitro durante varias horas antes de disiparse (video 3). Estos haces filamentosos tienen la forma de los espermatozoides de equidna que se forman al final del epidídimo. Se ha descubierto que el semen de la gallina sharkasi tiene una alta tendencia a aglutinarse y formar un haz reticulado en menos de un minuto después de su recolección. Estos haces son dinámicos y capaces de adherirse a cualquier pared cercana u objeto estático. Si bien los haces de espermatozoides reducen la velocidad de los espermatozoides, es evidente que macroscópicamente aumentan su linealidad. La longitud de los haces varía según el número de espermatozoides recolectados. Se aislaron dos partes del haz: la parte inicial, que incluye la cabeza libre del espermatozoide aglutinado, y la parte terminal, que incluye la cola y todo el extremo distal del espermatozoide. Utilizando una cámara de alta velocidad (950 fps), se observaron cabezas libres de espermatozoides aglutinados en la parte inicial del haz, responsables del movimiento del haz gracias a su movimiento oscilatorio, arrastrando a los restantes hacia el haz con un movimiento helicoidal (Video 4). Sin embargo, en mechones largos, se ha observado que algunas cabezas libres de espermatozoides adheridas al cuerpo y la porción terminal del mechón actúan como álabes para impulsarlo.
Durante un flujo lento de fluido, los haces de espermatozoides se mueven paralelos. Sin embargo, comienzan a superponerse y a adherirse a todo lo que está quieto para evitar ser arrastrados por la corriente a medida que aumenta la velocidad. Los haces se forman cuando un puñado de espermatozoides se aproximan, comienzan a moverse sincronizados y se enroscan entre sí, adhiriéndose a una sustancia pegajosa. Las figuras 1 y 2 muestran cómo los espermatozoides se aproximan, formando una unión al enrollarse las colas.
Los investigadores aplicaron presión hidrostática para crear un flujo de fluido en un microcanal y estudiar la reología del esperma. Se utilizó un microcanal de 200 µm × 20 µm (ancho × alto) y 3,6 µm de longitud. Se utilizaron microcanales entre recipientes con jeringas en los extremos. Se utilizó colorante alimentario para hacer los canales más visibles.
Ate los cables de interconexión y los accesorios a la pared. El video se grabó con un microscopio de contraste de fases. Con cada imagen, se presentan imágenes de microscopía de contraste de fases y mapeo. (A) La conexión entre dos corrientes opone resistencia al flujo debido al movimiento helicoidal (flecha roja). (B) La conexión entre el haz tubular y la pared del canal (flechas rojas), al mismo tiempo que se conectan a otros dos haces (flechas amarillas). (C) Los haces espermáticos en el canal microfluídico comienzan a conectarse entre sí (flechas rojas), formando una malla de haces espermáticos. (D) Formación de una red de haces espermáticos.
Al cargar una gota de espermatozoides diluidos en el dispositivo microfluídico y generar un flujo, se observó que el haz de espermatozoides se movía en sentido contrario al flujo. Los haces se ajustaban perfectamente a las paredes de los microcanales, y las cabezas libres en la parte inicial de los haces se ajustaban a ellas (video 5). También se adherían a cualquier partícula estacionaria en su camino, como residuos, para resistir ser arrastrados por la corriente. Con el tiempo, estos penachos se convertían en largos filamentos que atrapaban otros espermatozoides individuales y penachos más cortos (video 6). A medida que el flujo disminuía, largas hileras de espermatozoides formaban una red de hileras de espermatozoides (video 7; figura 2).
A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos espirales de los hilos aumentan en un intento de atrapar muchos espermatozoides individuales formando haces que resistan mejor la fuerza de deriva del flujo. A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos espirales de los hilos aumentan en un intento de atrapar muchos espermatozoides individuales formando haces que resistan mejor la fuerza de deriva del flujo. Si la velocidad de la corriente es alta (V > 33 mm/s), la televisión en espiral no se utilizará durante la noche, después de haber encendido el dispositivo. отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. A altas velocidades de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos helicoidales de las hebras aumentan a medida que intentan atrapar muchos espermatozoides individuales formando haces que son más capaces de resistir la fuerza de deriva del flujo.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. A velocidades de flujo elevadas (V > 33 µm/s), el movimiento helicoidal de los filamentos aumenta en un intento de capturar muchos espermatozoides individuales formando haces para resistir mejor las fuerzas de deriva del flujo.También intentaron colocar microcanales en las paredes laterales.
Los haces espermáticos se identificaron como grupos de cabezas espermáticas y colas enroscadas mediante microscopía óptica (LM). También se han identificado haces espermáticos con diversos agregados como cabezas retorcidas y agregados flagelares, múltiples colas espermáticas fusionadas, cabezas espermáticas unidas a una cola y cabezas espermáticas con núcleos doblados como múltiples núcleos fusionados mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). La microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró que los haces espermáticos eran agregados envainados de cabezas espermáticas y que los agregados espermáticos presentaban una red adherida de colas envueltas.
Se estudiaron la morfología y ultraestructura de los espermatozoides, la formación de haces de espermatozoides mediante microscopía óptica (media sección), microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), los frotis de espermatozoides se tiñeron con naranja de acridina y se examinaron mediante microscopía de epifluorescencia.
La tinción del frotis espermático con naranja de acridina (Fig. 3B) mostró que las cabezas de los espermatozoides estaban adheridas y cubiertas de material secretor, lo que dio lugar a la formación de grandes penachos (Fig. 3D). Los haces espermáticos estaban formados por agregados espermáticos con una red de colas adheridas (Fig. 4A-C). Los haces espermáticos están compuestos por las colas de muchos espermatozoides adheridas (Fig. 4D). Las secreciones (Figs. 4E,F) cubrían las cabezas de los haces espermáticos.
Formación del haz de espermatozoides. Mediante microscopía de contraste de fases y frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina, se mostró que las cabezas de los espermatozoides se adhieren entre sí. (A) La formación temprana del penacho de espermatozoides comienza con un espermatozoide (círculo blanco) y tres espermatozoides (círculo amarillo), con la espiral comenzando en la cola y terminando en la cabeza. (B) Fotomicrografía de un frotis de espermatozoides teñido con naranja de acridina que muestra cabezas de espermatozoides adherentes (flechas). La descarga cubre la(s) cabeza(s). Aumento × 1000. (C) Desarrollo de un haz grande transportado por flujo en un canal de microfluidos (usando una cámara de alta velocidad a 950 fps). (D) Micrografía de un frotis de espermatozoides teñido con naranja de acridina que muestra grandes penachos (flechas). Aumento: ×200.
Micrografía electrónica de barrido de un haz de espermatozoides y un frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina. (A, B, D, E) son micrografías electrónicas de barrido digitales a color de espermatozoides, y C y F son micrografías de frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina que muestran la adhesión de múltiples espermatozoides envolviendo la membrana caudal. (AC) Los agregados de espermatozoides se muestran como una red de colas adheridas (flechas). (D) Adhesión de varios espermatozoides (con sustancia adhesiva, contorno rosa, flecha) envolviendo la cola. (E y F) Agregados de cabezas de espermatozoides (punteros) cubiertos con material adhesivo (punteros). Los espermatozoides formaron haces con varias estructuras similares a vórtices (F). (C) ×400 y (F) ×200 aumentos.
Mediante microscopía electrónica de transmisión, observamos que los haces espermáticos presentaban colas adheridas (Fig. 6A, C), cabezas adheridas a las colas (Fig. 6B) o cabezas adheridas a las colas (Fig. 6D). Las cabezas de los espermatozoides en el haz son curvas, presentando en la sección dos regiones nucleares (Fig. 6D). En el haz de incisión, los espermatozoides presentaban una cabeza retorcida con dos regiones nucleares y múltiples regiones flagelares (Fig. 5A).
Micrografía electrónica digital a color que muestra las colas de conexión del haz espermático y el material aglutinante que conecta las cabezas espermáticas. (A) Cola adherida de un gran número de espermatozoides. Observe el aspecto de la cola tanto en proyección vertical (flecha) como horizontal (flecha). (B) La cabeza (flecha) del espermatozoide está conectada a la cola (flecha). (C) Varias colas espermáticas (flechas) están adheridas. (D) El material aglutinante (AS, azul) conecta cuatro cabezas espermáticas (morado).
Se utilizó microscopía electrónica de barrido para detectar cabezas de espermatozoides en haces espermáticos cubiertos de secreciones o membranas (Figura 6B), lo que indica que los haces espermáticos estaban anclados por material extracelular. El material aglutinado se concentró en la cabeza del espermatozoide (conjunto similar a una cabeza de medusa; Fig. 5B) y se expandió distalmente, dando un aspecto amarillo brillante bajo microscopía de fluorescencia al teñirse con naranja de acridina (Fig. 6C). Esta sustancia es claramente visible al microscopio de barrido y se considera un aglutinante. Las secciones semifinas (Fig. 5C) y los frotis espermáticos teñidos con naranja de acridina mostraron haces espermáticos que contenían cabezas densamente empaquetadas y colas enrolladas (Fig. 5D).
Varias fotomicrografías que muestran la agregación de cabezas de espermatozoides y colas plegadas utilizando varios métodos. (A) Micrografía electrónica de transmisión digital a color de un haz de espermatozoides que muestra una cabeza de espermatozoide enrollada con un núcleo de dos partes (azul) y varias partes flagelares (verde). (B) Micrografía electrónica de barrido a color digital que muestra un grupo de cabezas de espermatozoides similares a medusas (flechas) que parecen estar cubiertas. (C) Sección semifina que muestra cabezas de espermatozoides agregadas (flechas) y colas enroscadas (flechas). (D) Micrografía de un frotis de espermatozoides teñido con naranja de acridina que muestra agregados de cabezas de espermatozoides (flechas) y colas adherentes enroscadas (flechas). Nótese que una sustancia pegajosa (S) cubre la cabeza del espermatozoide. (D) × 1000 aumentos.
Utilizando microscopía electrónica de transmisión (Fig. 7A), también se observó que las cabezas de los espermatozoides estaban retorcidas y los núcleos tenían forma espiral, como lo confirmaron los frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina y examinados mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 7B).
(A) Micrografía electrónica de transmisión digital en color y (B) Frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra cabezas enrolladas y la unión de las cabezas y colas de los espermatozoides (flechas). (B) Aumento de 1000 ×.
Un hallazgo interesante es que los espermatozoides de Sharkazi se agregan para formar haces filamentosos móviles. Las propiedades de estos haces nos permiten comprender su posible papel en la absorción y el almacenamiento de espermatozoides en la SST.
Tras el apareamiento, los espermatozoides entran en la vagina y se someten a un intenso proceso de selección, lo que resulta en que solo un número limitado de espermatozoides entren en el SST15,16. Hasta la fecha, no se han esclarecido los mecanismos por los que los espermatozoides entran y salen del SST. En las aves de corral, los espermatozoides se almacenan en el SST durante un periodo prolongado de 2 a 10 semanas, según la especie6. Existe controversia sobre el estado del semen durante su almacenamiento en el SST. ¿Están en movimiento o en reposo? En otras palabras, ¿cómo mantienen los espermatozoides su posición en el SST durante tanto tiempo?
Forman4 sugirió que la residencia y expulsión del SST podrían explicarse en términos de la motilidad espermática. Los autores plantean la hipótesis de que los espermatozoides mantienen su posición nadando contra el flujo de fluido creado por el epitelio del SST y que los espermatozoides son expulsados ​​del SST cuando su velocidad cae por debajo del punto en el que comienzan a moverse hacia atrás debido a la falta de energía. Zaniboni5 confirmó la presencia de acuaporinas 2, 3 y 9 en la porción apical de las células epiteliales del SST, lo que podría respaldar indirectamente el modelo de almacenamiento de espermatozoides de Foreman. En el estudio actual, encontramos que casi la mitad de los espermatozoides de Sharkashi muestran reología positiva en el fluido que fluye, y que los haces de espermatozoides aglutinados aumentan el número de espermatozoides que muestran reología positiva, aunque la aglutinación los ralentiza. Cómo los espermatozoides viajan a través de la trompa de Falopio del ave hasta el sitio de fertilización no se comprende completamente. En los mamíferos, el líquido folicular quimioatrae a los espermatozoides. Sin embargo, se cree que los quimioatrayentes dirigen a los espermatozoides para que se acerquen a largas distancias7. Por lo tanto, otros mecanismos son responsables del transporte de los espermatozoides. Se ha informado que la capacidad de los espermatozoides para orientarse y fluir contra el fluido de las trompas de Falopio liberado después del apareamiento es un factor importante para dirigirse a los espermatozoides en ratones. Parker 17 sugirió que los espermatozoides cruzan los oviductos nadando contra la corriente ciliar en aves y reptiles. Aunque no se ha demostrado experimentalmente en aves, Adolphi18 fue el primero en descubrir que el esperma aviar da resultados positivos cuando se crea una capa delgada de líquido entre un cubreobjetos y un portaobjetos con una tira de papel de filtro. Reología. Hino y Yanagimachi [19] colocaron un complejo ovario-tubárico-uterino de ratón en un anillo de perfusión e inyectaron 1 µl de tinta en el istmo para visualizar el flujo de fluido en las trompas de Falopio. Observaron un movimiento muy activo de contracción y relajación en la trompa de Falopio, en el cual todas las bolas de tinta se movían constantemente hacia la ampolla de la trompa. Los autores enfatizan la importancia del flujo de fluido tubárico desde las trompas de Falopio inferiores a las superiores para la elevación de los espermatozoides y la fertilización. Brillard20 reportó que en pollos y pavos, los espermatozoides migran por movimiento activo desde la entrada vaginal, donde se almacenan, hasta la unión útero-vaginal, donde se almacenan. Sin embargo, este movimiento no es necesario entre la unión útero-vaginal y el infundíbulo porque los espermatozoides son transportados por desplazamiento pasivo. Conociendo estas recomendaciones previas y los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede asumir que la capacidad de los espermatozoides para moverse aguas arriba (reología) es una de las propiedades en las que se basa el proceso de selección. Esto determina el paso de los espermatozoides a través de la vagina y su entrada al CCT para su almacenamiento. Como sugirió Forman4, esto también puede facilitar el proceso por el cual los espermatozoides entran a la SST y su hábitat por un período de tiempo y luego salen cuando su velocidad comienza a disminuir.
Por otro lado, Matsuzaki y Sasanami 21 sugirieron que los espermatozoides aviares experimentan cambios de motilidad desde la latencia hasta la movilidad en los tractos reproductivos masculino y femenino. Se ha propuesto que la inhibición de la motilidad de los espermatozoides residentes en el SST explica el largo tiempo de almacenamiento de los espermatozoides y su posterior rejuvenecimiento tras salir del SST. En condiciones de hipoxia, Matsuzaki et al. 1 informaron una alta producción y liberación de lactato en el SST, lo que puede conducir a la inhibición de la motilidad de los espermatozoides residentes. En este caso, la importancia de la reología espermática se refleja en la selección y absorción de los espermatozoides, y no en su almacenamiento.
El patrón de aglutinación de los espermatozoides se considera una explicación plausible del largo periodo de almacenamiento de los espermatozoides en el SST, ya que este es un patrón común de retención de espermatozoides en las aves de corral2,22,23. Bakst et al. 2 observaron que la mayoría de los espermatozoides se adherían entre sí, formando agregados fasciculares, y rara vez se encontraron espermatozoides individuales en el CCM de codorniz. Por otro lado, Wen et al. 24 observaron espermatozoides más dispersos y menos penachos de espermatozoides en el lumen del SST en pollos. Con base en estas observaciones, se puede asumir que la propensión a la aglutinación de los espermatozoides difiere entre las aves y entre los espermatozoides en el mismo eyaculado. Además, Van Krey et al. 9 sugirieron que la disociación aleatoria de los espermatozoides aglutinados es responsable de la penetración gradual de los espermatozoides en el lumen de la trompa de Falopio. Según esta hipótesis, los espermatozoides con menor capacidad de aglutinación deberían ser expulsados ​​primero del SST. En este contexto, la capacidad de los espermatozoides para aglutinarse puede ser un factor que influya en el resultado de la competencia espermática en aves sucias. Además, cuanto más tiempo se disocia el esperma aglutinado, más se mantiene la fertilidad.
Aunque la agregación de espermatozoides y su formación en haces se ha observado en varios estudios2,22,24, no se han descrito en detalle debido a la complejidad de su observación cinemática dentro del SST. Se han realizado varios intentos para estudiar la aglutinación de espermatozoides in vitro. Se observó una agregación extensa pero transitoria al retirar el alambre delgado de la gota de semilla colgante. Esto lleva al hecho de que una burbuja alargada sobresale de la gota, imitando la glándula seminal. Debido a las limitaciones 3D y los cortos tiempos de secado por goteo, todo el bloque se deterioró rápidamente9. En el estudio actual, utilizando pollos Sharkashi y chips de microfluidos, pudimos describir cómo se forman estos haces de espermatozoides y cómo se mueven. Los haces de espermatozoides se formaron inmediatamente después de la recolección de semen y se observó que se movían en espiral, mostrando una reología positiva cuando estaban presentes en el flujo. Además, al observarlos macroscópicamente, se ha observado que los haces de espermatozoides aumentan la linealidad de la motilidad en comparación con los espermatozoides aislados. Esto sugiere que la aglutinación de los espermatozoides puede ocurrir antes de la penetración del SST y que la producción de espermatozoides no se limita a un área pequeña debido al estrés como se sugirió previamente (Tingari y Lake12). Durante la formación del penacho, los espermatozoides nadan en sincronía hasta que forman una unión, luego sus colas se enrollan una alrededor de la otra y la cabeza del espermatozoide permanece libre, pero la cola y la parte distal del espermatozoide se adhieren con una sustancia pegajosa. Por lo tanto, la cabeza libre del ligamento es responsable del movimiento, arrastrando el resto del ligamento. La microscopía electrónica de barrido de los haces de espermatozoides mostró cabezas de espermatozoides adheridas cubiertas con una gran cantidad de material pegajoso, lo que sugiere que las cabezas de los espermatozoides estaban adheridas en haces de reposo, lo que puede haber ocurrido después de alcanzar el sitio de almacenamiento (SST).
Al teñir un frotis de esperma con naranja de acridina, se puede observar bajo un microscopio de fluorescencia el material adhesivo extracelular que rodea a los espermatozoides. Esta sustancia permite que los haces espermáticos se adhieran y se adhieran a cualquier superficie o partícula circundante, evitando que se desplacen con la corriente. Por lo tanto, nuestras observaciones demuestran la función de la adhesión de los espermatozoides en forma de haces móviles. Su capacidad para flotar contra la corriente y adherirse a las superficies cercanas permite que los espermatozoides permanezcan más tiempo en la superficie del mar (SST).
Rothschild25 utilizó una cámara de hemocitometría para estudiar la distribución flotante del semen bovino en una gota de suspensión, tomando fotomicrografías con una cámara con ejes ópticos verticales y horizontales. Los resultados mostraron que los espermatozoides fueron atraídos hacia la superficie de la cámara. Los autores sugieren que podrían existir interacciones hidrodinámicas entre los espermatozoides y la superficie. Considerando esto, junto con la capacidad del semen de pollo Sharkashi para formar mechones pegajosos, podría aumentar la probabilidad de que el semen se adhiera a la pared del SST y se almacene durante largos periodos.
Bccetti y Afzeliu26 informaron que el glicocáliz del esperma es necesario para el reconocimiento y la aglutinación de gametos. Forman10 observó que la hidrólisis de enlaces α-glucosídicos en recubrimientos de glicoproteína-glicolípido mediante el tratamiento de semen aviar con neuraminidasa resultó en una fertilidad reducida sin afectar la motilidad de los espermatozoides. Los autores sugieren que el efecto de la neuraminidasa en el glicocáliz altera el secuestro de espermatozoides en la unión útero-vaginal, reduciendo así la fertilidad. Sus observaciones no pueden ignorar la posibilidad de que el tratamiento con neuraminidasa pueda reducir el reconocimiento de espermatozoides y ovocitos. Forman y Engel10 encontraron que la fertilidad se redujo cuando las gallinas fueron inseminadas intravaginalmente con semen tratado con neuraminidasa. Sin embargo, la FIV con espermatozoides tratados con neuraminidasa no afectó la fertilidad en comparación con los pollos de control. Los autores concluyeron que los cambios en el recubrimiento de glicoproteína-glicolípido alrededor de la membrana del esperma redujeron la capacidad del esperma de fertilizar al perjudicar el secuestro de esperma en la unión útero-vaginal, lo que a su vez aumentó la pérdida de esperma debido a la velocidad de la unión útero-vaginal, pero no afecta el reconocimiento de esperma y óvulo.
En pavos, Bakst y Bauchan 11 encontraron pequeñas vesículas y fragmentos de membrana en el lumen del SST y observaron que algunos de estos gránulos se habían fusionado con la membrana del espermatozoide. Los autores sugieren que estas relaciones pueden contribuir al almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en el SST. Sin embargo, los investigadores no especificaron la fuente de estas partículas, si son secretadas por células epiteliales CCT, producidas y secretadas por el sistema reproductor masculino o producidas por el propio espermatozoide. Además, estas partículas son responsables de la aglutinación. Grützner et al27 informaron que las células epiteliales del epidídimo producen y secretan una proteína específica que se requiere para la formación de tractos seminales de poro único. Los autores también informan que la dispersión de estos haces depende de la interacción de las proteínas del epidídimo. Nixon et al28 encontraron que los anejos secretan una proteína, la osteonectina ácida rica en cisteína; SPARC participa en la formación de penachos de esperma en equidnas de hocico corto y ornitorrincos. La dispersión de estos haces se asocia con la pérdida de esta proteína.
En el estudio actual, el análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica mostró que los espermatozoides se adhirieron a una gran cantidad de material denso. Se cree que estas sustancias son responsables de la aglutinación que se condensa entre y alrededor de las cabezas adherentes, pero en concentraciones más bajas en la región de la cola. Asumimos que esta sustancia aglutinante se excreta del sistema reproductor masculino (epidídimo o conducto deferente) junto con el semen, ya que a menudo observamos que el semen se separa de la linfa y el plasma seminal durante la eyaculación. Se ha informado que a medida que los espermatozoides aviares pasan a través del epidídimo y el conducto deferente, experimentan cambios relacionados con la maduración que respaldan su capacidad para unirse a proteínas y adquirir glucoproteínas asociadas al lema plasmático. La persistencia de estas proteínas en las membranas de los espermatozoides residentes en el SST sugiere que estas proteínas pueden influir en la adquisición de la estabilidad de la membrana espermática 30 y determinar su fertilidad 31 . Ahammad et al32 informaron que los espermatozoides obtenidos de varias partes del sistema reproductor masculino (desde los testículos hasta el conducto deferente distal) mostraron un aumento progresivo en la viabilidad en condiciones de almacenamiento líquido, independientemente de la temperatura de almacenamiento, y la viabilidad en pollos también aumenta en las trompas de Falopio después de la inseminación artificial.
Los penachos de esperma de los pollos sharkashi presentan características y funciones diferentes a las de otras especies como equidnas, ornitorrincos, ratones de campo, ratas ciervo y cobayas. En los pollos sharkasi, la formación de haces de espermatozoides redujo su velocidad de nado en comparación con los espermatozoides individuales. Sin embargo, estos haces aumentaron el porcentaje de espermatozoides reológicamente positivos y su capacidad para estabilizarse en un entorno dinámico. Por lo tanto, nuestros resultados confirman la sugerencia previa de que la aglutinación de espermatozoides en SST está asociada con el almacenamiento espermático a largo plazo. También planteamos la hipótesis de que la propensión de los espermatozoides a formar penachos puede controlar la tasa de pérdida de espermatozoides en SST, lo que puede alterar el resultado de la competencia espermática. Según esta suposición, los espermatozoides con baja capacidad de aglutinación liberan primero SST, mientras que los espermatozoides con alta capacidad de aglutinación producen la mayor parte de la descendencia. La formación de haces de espermatozoides de poro único es beneficiosa y afecta la proporción padre-hijo, pero utiliza un mecanismo diferente. En equidnas y ornitorrincos, los espermatozoides se disponen paralelos para aumentar la velocidad de avance del haz. Los haces de equidnas se mueven aproximadamente tres veces más rápido que los espermatozoides individuales. Se cree que la formación de estos penachos de espermatozoides en los equidnas es una adaptación evolutiva para mantener la dominancia, ya que las hembras son promiscuas y suelen aparearse con varios machos. Por lo tanto, los espermatozoides de diferentes eyaculados compiten ferozmente por la fecundación del óvulo.
Los espermatozoides aglutinados de pollos sharkasi son fáciles de visualizar mediante microscopía de contraste de fases, lo cual se considera ventajoso porque permite estudiar fácilmente su comportamiento in vitro. El mecanismo por el cual la formación de penachos espermáticos promueve la reproducción en pollos sharkasi también difiere del observado en algunos mamíferos placentarios que representan un comportamiento espermático cooperativo, como los ratones de campo, donde algunos espermatozoides alcanzan los óvulos, ayudando a otros individuos emparentados a alcanzarlos y dañarlos. para demostrar su valía. Comportamiento altruista. Autofecundación 34. Otro ejemplo de comportamiento cooperativo en espermatozoides se encontró en ratones ciervo, donde los espermatozoides pudieron identificar y combinarse con los espermatozoides genéticamente más relacionados y formar grupos cooperativos para aumentar su velocidad en comparación con los espermatozoides no emparentados 35.
Los resultados obtenidos en este estudio no contradicen la teoría de Foman sobre el almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides en SWS. Los investigadores informan que los espermatozoides continúan moviéndose en el flujo de células epiteliales que recubren el SST durante un período prolongado de tiempo y, después de un cierto período de tiempo, las reservas de energía de los espermatozoides se agotan, lo que resulta en una disminución de la velocidad, lo que permite la expulsión de sustancias de bajo peso molecular. energía de los espermatozoides con el flujo de fluido desde el lumen del SST La cavidad de la trompa de Falopio. En el estudio actual, observamos que la mitad de los espermatozoides individuales mostraron la capacidad de nadar contra los fluidos que fluyen, y su adhesión en el haz aumentó su capacidad para mostrar una reología positiva. Además, nuestros datos son consistentes con los de Matsuzaki et al. 1 quienes informaron que el aumento de la secreción de lactato en SST puede inhibir la motilidad de los espermatozoides residentes. Sin embargo, nuestros resultados describen la formación de ligamentos móviles espermáticos y su comportamiento reológico en presencia de un entorno dinámico dentro de un microcanal, con el fin de dilucidar su comportamiento en la TSM. Investigaciones futuras podrían centrarse en determinar la composición química y el origen del agente aglutinante, lo que sin duda ayudará a los investigadores a desarrollar nuevas formas de almacenar semen líquido y prolongar la fertilidad.
Quince sharkasi machos de cuello desnudo de 30 semanas de edad (homocigotos dominantes; Na Na) fueron seleccionados como donantes de esperma en el estudio. Las aves se criaron en la Granja Avícola de Investigación de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Ashit, Gobernación de Ashit, Egipto. Las aves se alojaron en jaulas individuales (30 x 40 x 40 cm), se sometieron a un programa de iluminación (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) y se alimentaron con una dieta que contenía 160 g de proteína cruda, 2800 kcal de energía metabolizable y 35 g de calcio cada una. 5 gramos de fósforo disponible por kilogramo de dieta.
Según los datos 36 y 37, se recolectó semen de machos mediante masaje abdominal. Se recogieron 45 muestras de semen de 15 hombres durante 3 días. El semen (n = 15/día) se diluyó inmediatamente 1:1 (v:v) con diluyente de semen avícola Belsville, que contiene difosfato de potasio (1,27 g), glutamato monosódico monohidratado (0,867 g), fructosa (0,5 d), acetato de sodio anhidro (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potasio monohidratado (0,064 g), monofosfato de potasio (0,065 g), cloruro de magnesio (0,034 g) y H₂O (100 ml); pH = 7,5, osmolaridad: 333 mOsm/kg₃8. Las muestras de semen diluidas se examinaron primero bajo un microscopio óptico para garantizar la buena calidad del semen (humedad) y luego se almacenaron en un baño de agua a 37 °C hasta su uso dentro de media hora después de la recolección.
Se describe la cinemática y la reología de los espermatozoides mediante un sistema de dispositivos microfluídicos. Las muestras de semen se diluyeron a 1:40 en diluyente de semen aviar Beltsville, se cargaron en un dispositivo microfluídico (véase más adelante) y los parámetros cinéticos se determinaron mediante un sistema de análisis computarizado de semen (CASA), desarrollado previamente para la caracterización microfluídica. sobre la movilidad de los espermatozoides en medios líquidos (Departamento de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ingeniería, Universidad de Assiut, Egipto). El complemento puede descargarse en: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Se midieron la velocidad de curva (VCL, μm/s), la velocidad lineal (VSL, μm/s) y la velocidad de trayectoria promedio (VAP, μm/s). Los videos de espermatozoides se tomaron utilizando un microscopio de contraste de fase Optika XDS-3 invertido (con objetivo 40x) conectado a una cámara Tucson ISH1000 a 30 fps durante 3 s. Utilice el software CASA para estudiar al menos tres áreas y 500 trayectorias de espermatozoides por muestra. El video grabado se procesó utilizando un CASA casero. La definición de motilidad en el complemento CASA se basa en la velocidad de nado del espermatozoide en comparación con la velocidad de flujo y no incluye otros parámetros como el movimiento de lado a lado, ya que se ha encontrado que es más confiable en el flujo de fluidos. El movimiento reológico se describe como el movimiento de las células espermáticas contra la dirección del flujo de fluido. Los espermatozoides con propiedades reológicas se dividieron por el número de espermatozoides móviles; los espermatozoides que estaban en reposo y los espermatozoides en movimiento convectivo se excluyeron del recuento.
Todos los productos químicos utilizados se obtuvieron de Elgomhoria Pharmaceuticals (El Cairo, Egipto), a menos que se indique lo contrario. El dispositivo se fabricó según lo descrito por El-sherry et al. 40 con algunas modificaciones. Los materiales utilizados para fabricar los microcanales incluyeron placas de vidrio (Howard Glass, Worcester, MA), resina negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol diacetónico (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) y poliacetona-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Los microcanales se fabrican mediante litografía blanda. Primero, se imprimió una máscara facial protectora transparente con el diseño de microcanal deseado en una impresora de alta resolución (Prismatic, El Cairo, Egipto y Pacific Arts and Design, Markham, ON). Los másteres se fabricaron utilizando placas de vidrio como sustratos. Las placas se limpiaron con acetona, isopropanol y agua desionizada y luego se recubrieron con una capa de 20 µm de SU8-25 mediante recubrimiento por centrifugación (3000 rpm, 1 min). Las capas de SU-8 se secaron suavemente (65 °C, 2 min y 95 °C, 10 min) y se expusieron a radiación UV durante 50 s. Tras la exposición, se hornearon a 65 °C y 95 °C durante 1 min y 4 min para reticular las capas expuestas de SU-8, seguido de un revelado en alcohol diacetónico durante 6,5 min. Se hornearon los waffles a 200 °C durante 15 min para solidificar aún más la capa de SU-8.
El PDMS se preparó mezclando el monómero y el endurecedor en una proporción en peso de 10:1, se desgasificó en un desecador de vacío y se vertió sobre el marco principal del SU-8. El PDMS se curó en un horno (120 °C, 30 min), se cortaron los canales, se separaron del molde maestro y se perforaron para permitir la fijación de tubos en la entrada y la salida del microcanal. Finalmente, los microcanales de PDMS se fijaron permanentemente a portaobjetos de microscopio mediante un procesador de corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), como se describe en otro documento. El microcanal utilizado en este estudio mide 200 µm × 20 µm (ancho × alto) y tiene 3,6 cm de longitud.
El flujo de fluido inducido por la presión hidrostática dentro del microcanal se logra manteniendo el nivel de fluido en el depósito de entrada por encima de la diferencia de altura Δh39 en el depósito de salida (Fig. 1).
Donde f es el coeficiente de fricción, definido como f = C/Re para flujo laminar en un canal rectangular, donde C es una constante que depende de la relación de aspecto del canal, L es la longitud del microcanal, Vav es la velocidad media dentro del microcanal, Dh es el diámetro hidráulico del canal, g es la aceleración de la gravedad. Con esta ecuación, la velocidad media del canal se puede calcular mediante la siguiente ecuación: