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Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana libre de químicos basada en nanotecnología que utiliza nanoestructuras artificiales de agua (EWNS). Las EWNS tienen una alta carga superficial y son ricas en especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden interactuar con e inactivar una serie de microorganismos, incluyendo patógenos transmitidos por alimentos. Aquí se demuestra que sus propiedades durante la síntesis se pueden ajustar y optimizar para mejorar aún más su potencial antibacteriano. La plataforma de laboratorio EWNS fue diseñada para ajustar las propiedades de las EWNS modificando los parámetros de síntesis. La caracterización de las propiedades de las EWNS (carga, tamaño y contenido de ROS) se realizó utilizando métodos analíticos modernos. Además, microorganismos alimentarios como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum y Saccharomyces cerevisiae se inocularon en la superficie de tomates cherry orgánicos para evaluar su potencial de inactivación microbiana. Los resultados presentados aquí demuestran que las propiedades de EWNS pueden ajustarse con precisión durante la síntesis, lo que resulta en un aumento exponencial de la eficiencia de inactivación. En particular, la carga superficial se cuadruplicó y el contenido de ROS aumentó. La tasa de eliminación microbiana fue dependiente de la microbiota y osciló entre 1,0 y 3,8 log tras 45 minutos de exposición a una dosis de aerosol de 40.000 #/cm³ de EWNS.
La contaminación microbiana es la principal causa de enfermedades transmitidas por los alimentos causadas por la ingestión de patógenos o sus toxinas. Estas enfermedades son responsables de aproximadamente 76 millones de casos, 325.000 hospitalizaciones y 5.000 muertes cada año, tan solo en Estados Unidos.¹ Además, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) estima que el aumento del consumo de productos frescos es responsable del 48 % de todas las enfermedades transmitidas por los alimentos reportadas en el país.² El costo de las enfermedades y las muertes causadas por patógenos transmitidos por los alimentos en Estados Unidos es muy alto; los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) lo estiman en más de 15.600 millones de dólares estadounidenses al año.³
Actualmente, las intervenciones antimicrobianas químicas4, radiactivas5 y térmicas6 para garantizar la inocuidad alimentaria se implementan principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados en la cadena de producción (generalmente después de la cosecha o durante el envasado), en lugar de implementarse de forma continua, de modo que los productos frescos estén expuestos a la contaminación cruzada7. Las intervenciones antimicrobianas son necesarias para controlar mejor las enfermedades transmitidas por los alimentos y el deterioro de los alimentos, y tienen el potencial de aplicarse en todo el proceso de la granja a la mesa. Menor impacto y menor costo.
Recientemente se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana libre de químicos basada en nanotecnología para inactivar bacterias en superficies y en el aire utilizando nanoestructuras artificiales de agua (EWNS). Para la síntesis de EVNS, se utilizaron dos procesos paralelos: electrospray e ionización de agua (Fig. 1a). Se ha demostrado previamente que las EWNS tienen un conjunto único de propiedades físicas y biológicas8,9,10. Las EWNS tienen un promedio de 10 electrones por estructura y un tamaño nanométrico promedio de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Además, la resonancia de espín electrónico (ESR) mostró que las EWNS contienen una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente radicales hidroxilo (OH•) y superóxido (O2-) (Fig. 1c) 8 . Las EWNS permanecieron en el aire durante mucho tiempo y pudieron colisionar con microbios suspendidos en el aire y presentes en las superficies, liberando su carga útil de ROS y causando la inactivación microbiana (Fig. 1d). Estos estudios previos también demostraron que el EWNS puede interactuar con diversas bacterias gramnegativas y grampositivas de importancia para la salud pública, incluyendo micobacterias, e inactivarlas en superficies y en el aire8,9. La microscopía electrónica de transmisión mostró que la inactivación se debía a la ruptura de la membrana celular. Además, estudios de inhalación aguda han demostrado que dosis altas de EWNS no causan daño pulmonar ni inflamación8.
(a) La electropulverización se produce cuando se aplica un alto voltaje entre un capilar que contiene líquido y un contraelectrodo. (b) La aplicación de alto voltaje da como resultado dos fenómenos diferentes: (i) electropulverización de agua y (ii) generación de especies reactivas de oxígeno (iones) atrapadas en el EWNS. (c) La estructura única del EWNS. (d) Los EWNS son altamente móviles debido a su naturaleza a nanoescala y pueden interactuar con patógenos transportados por el aire.
Recientemente se ha demostrado la capacidad de la plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar microorganismos transmitidos por alimentos en la superficie de alimentos frescos. Además, se ha demostrado que la carga superficial de EWNS puede utilizarse en combinación con un campo eléctrico para una administración dirigida. Más importante aún, se observó un prometedor resultado inicial de una reducción de aproximadamente 1,4 log en la actividad del tomate orgánico contra diversos microorganismos alimentarios, como E. coli y Listeria, a los 90 minutos de exposición a EWNS a una concentración de aproximadamente 50 000 lb/cm³. Además, las pruebas preliminares de evaluación organoléptica no mostraron ningún efecto organoléptico en comparación con el tomate de control. Si bien estos resultados iniciales de inactivación prometen seguridad alimentaria incluso con dosis muy bajas de EWNS de 50 000 lb/cc, es evidente que un mayor potencial de inactivación sería más beneficioso para reducir aún más el riesgo de infección y deterioro.
En este trabajo, centraremos nuestra investigación en el desarrollo de una plataforma de generación de EWNS para ajustar los parámetros de síntesis y optimizar sus propiedades fisicoquímicas, con el fin de aumentar su potencial antibacteriano. En particular, la optimización se ha centrado en aumentar su carga superficial (para mejorar la administración dirigida) y el contenido de ROS (para mejorar la eficiencia de inactivación). Caracterización de las propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga y contenido de ROS) mediante métodos analíticos modernos y utilizando microorganismos alimentarios comunes como E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae y M. parafortuitum.
El EVNS se sintetizó mediante electropulverización e ionización simultáneas de agua de alta pureza (18 MΩ cm–1). El atomizador eléctrico 12 se utiliza habitualmente para atomizar líquidos, partículas de polímeros sintéticos y cerámicas 13 y fibras 14 de tamaño controlado.
Como se detalla en publicaciones anteriores 8, 9, 10, 11, en un experimento típico, se aplica un alto voltaje entre un capilar metálico y un contraelectrodo conectado a tierra. Durante este proceso, ocurren dos fenómenos diferentes: 1) electrospray y 2) ionización del agua. Un fuerte campo eléctrico entre los dos electrodos provoca la acumulación de cargas negativas en la superficie del agua condensada, lo que resulta en la formación de conos de Taylor. Como resultado, se forman gotas de agua altamente cargadas, que continúan rompiéndose en partículas más pequeñas, según la teoría de Rayleigh16. Al mismo tiempo, un fuerte campo eléctrico hace que algunas de las moléculas de agua se dividan y desprendan electrones (ionización), generando así una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS)17. Los paquetes de ROS18 generados simultáneamente se encapsularon en EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a muestra el sistema de generación de EWNS desarrollado y utilizado en la síntesis de EWNS en este estudio. El agua purificada, almacenada en una botella cerrada, se alimentó a través de un tubo de teflón (2 mm de diámetro interior) a una aguja de acero inoxidable de 30 G (capilar metálico). Como se muestra en la figura 2b, el flujo de agua se controla mediante la presión del aire dentro de la botella. La aguja está conectada a una consola de teflón que se puede ajustar manualmente a una cierta distancia del contraelectrodo. El contraelectrodo es un disco de aluminio pulido con un orificio central para el muestreo. Debajo del contraelectrodo se encuentra un embudo de muestreo de aluminio, conectado al resto del equipo experimental a través de un puerto de muestreo (figura 2b). Todos los componentes del muestreador están conectados a tierra para evitar la acumulación de carga que podría degradar el muestreo de partículas.
(a) Sistema de generación de nanoestructuras de agua diseñadas (EWNS). (b) Sección transversal del muestreador y la unidad de electrospray que muestra los parámetros más importantes. (c) Configuración experimental para la inactivación de bacterias.
El sistema de generación de EWNS descrito anteriormente permite modificar parámetros operativos clave para facilitar el ajuste preciso de sus propiedades. Ajuste el voltaje aplicado (V), la distancia entre la aguja y el contraelectrodo (L) y el caudal de agua (φ) a través del capilar para ajustar las características del EWNS. Los símbolos [V (kV), L (cm)] se utilizan para indicar diferentes combinaciones. Ajuste el caudal de agua para obtener un cono de Taylor estable con un valor determinado [V, L]. Para este estudio, la apertura del contraelectrodo (D) se fijó en 1,29 cm (0,5 pulgadas).
Debido a la geometría limitada y la asimetría, la intensidad del campo eléctrico no puede calcularse mediante principios básicos. En su lugar, se utilizó el software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 para calcularlo. El campo eléctrico no es uniforme, por lo que el valor del campo eléctrico en la punta del capilar se utilizó como valor de referencia para diversas configuraciones.
Durante el estudio, se evaluaron diversas combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación y estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de la producción de EWNS y reproducibilidad. Las diversas combinaciones se muestran en la Tabla Suplementaria S1.
La salida del sistema de generación de EWNS se conectó directamente a un analizador de partículas por movilidad de barrido (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) para medir la concentración de partículas y se utilizó con un electrómetro de aerosoles Faraday (TSI, modelo 3068B, Shoreview, EE. UU.) para medir los flujos de aerosol, como se describe en nuestra publicación anterior9. Tanto el SMPS como el electrómetro de aerosoles muestrearon a un caudal de 0,5 l/min (caudal total de muestra: 1 l/min). Las concentraciones de partículas y los flujos de aerosol se midieron durante 120 s. Repita la medición 30 veces. La carga total de aerosol se calcula a partir de las mediciones actuales, y la carga media de EWNS se estima a partir del número total de partículas de EWNS muestreadas. El coste medio de EWNS se puede calcular mediante la ecuación (1):
donde IEl es la corriente medida, NSMPS es la concentración numérica medida con el SMPS y φEl es el caudal al electrómetro.
Debido a que la humedad relativa (HR) afecta la carga superficial, la temperatura y la (HR) se mantuvieron constantes a 21 °C y 45 %, respectivamente, durante el experimento.
Se utilizó un microscopio de fuerza atómica (AFM), el Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, California) y una sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japón) para medir el tamaño y la vida útil de los EWNS. La velocidad de escaneo del AFM es de 1 Hz y el área de escaneo es de 5 µm × 5 µm con 256 líneas de escaneo. Todas las imágenes se sometieron a una alineación de primer orden mediante el software Asylum (máscara con un rango de 100 nm y un umbral de 100 µm).
Retire el embudo de muestreo y coloque la superficie de mica a una distancia de 2,0 cm del contraelectrodo durante un tiempo promedio de 120 s para evitar la coalescencia de partículas y la formación de gotitas irregulares. El EWNS se aplicó directamente a superficies de mica recién cortadas (Ted Pella, Redding, CA). Inmediatamente después de la pulverización catódica, la superficie de mica se visualizó mediante AFM. El ángulo de contacto superficial de la mica recién cortada sin modificar es cercano a 0°, por lo que el EWNS se propaga sobre la superficie de mica en forma de domo20. El diámetro (a) y la altura (h) de las gotitas que se difunden se midieron directamente a partir de la topografía del AFM y se utilizaron para calcular el volumen de difusión en domo EWNS mediante nuestro método previamente validado8. Suponiendo que el EVNS integrado tiene el mismo volumen, el diámetro equivalente se puede calcular a partir de la ecuación (2):
De acuerdo con nuestro método previamente desarrollado, se utilizó una trampa de espín de resonancia de espín electrónico (ESR) para detectar la presencia de intermediarios radicales de vida corta en EWNS. Los aerosoles se pasaron a través de una solución que contenía 235 mM DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregón). Todas las mediciones de EPR se realizaron utilizando un espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EE. UU.) y matrices de celdas planas. Se utilizó el software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EE. UU.) para recopilar y analizar los datos. La caracterización de ROS se realizó solo para un conjunto de condiciones de operación [-6,5 kV, 4,0 cm]. Las concentraciones de EWNS se midieron utilizando SMPS después de tener en cuenta la pérdida de EWNS en el impactador.
Los niveles de ozono se monitorearon utilizando un 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas las propiedades de EWNS, el valor de la medición es la media de las mediciones y el error de medición es la desviación estándar. Se realizó una prueba t para comparar el valor del atributo EWNS optimizado con el valor correspondiente del EWNS base.
La Figura 2c muestra un Sistema de Paso a Través de Precipitación Electrostática (EPES) previamente desarrollado y caracterizado, que puede utilizarse para dirigir EWNS11 a superficies. El EPES utiliza una carga de EWNS combinada con un campo eléctrico intenso para apuntar directamente a la superficie del objetivo. Los detalles del sistema EPES se presentan en una publicación reciente de Pyrgiotakis et al.11. El EPES consiste en una cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos que contiene dos placas metálicas paralelas de acero inoxidable (acero inoxidable 304, pulido a espejo) en el centro, separadas 15,24 cm. Las placas se conectaron a una fuente externa de alto voltaje (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY); la placa inferior siempre estuvo positiva y la placa superior siempre conectada a tierra (flotante). Las paredes de la cámara están cubiertas con papel de aluminio, conectado a tierra eléctricamente para evitar la pérdida de partículas. La cámara cuenta con una puerta de carga frontal sellada que permite colocar las superficies de prueba en soportes de plástico, separándolas de la placa metálica inferior para evitar interferencias de alto voltaje.
La eficiencia de deposición de EWNS en EPES se calculó de acuerdo con un protocolo desarrollado previamente detallado en la Figura Suplementaria S111.
Como cámara de control, el segundo flujo a través de la cámara cilíndrica se conecta en serie con el sistema EPES mediante un filtro HEPA intermedio para eliminar el EWNS. Como se muestra en la figura 2c, el aerosol EWNS se bombeó a través de dos cámaras conectadas en serie. El filtro entre la sala de control y el EPES elimina cualquier EWNS restante, lo que resulta en la misma temperatura (T), humedad relativa (HR) y niveles de ozono.
Se ha descubierto que importantes microorganismos transmitidos por los alimentos contaminan productos frescos, como Escherichia coli (ATCC #27325), un indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), un patógeno transmitido por los alimentos, Listeria innocua (ATCC #33090), una alternativa al patógeno Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), como alternativa a la levadura de descomposición, y Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686), como una bacteria viva más resistente, se adquirieron en ATCC (Manassas, Virginia).
Compra al azar cajas de tomates cherry orgánicos en tu mercado local y refrigéralos a 4 °C hasta su uso (hasta 3 días). Selecciona tomates de un tamaño, de aproximadamente 1,27 cm de diámetro, para experimentar.
Los protocolos de incubación, inoculación, exposición y recuento de colonias se detallaron en nuestras publicaciones anteriores y se explicaron en detalle en los Datos suplementarios 11. El rendimiento de EWNS se evaluó exponiendo tomates inoculados a 40 000 #/cm³ durante 45 minutos. Brevemente, en el tiempo t = 0 min, se utilizaron tres tomates para evaluar los microorganismos supervivientes. Tres tomates se colocaron en EPES y se expusieron a EWNS a 40 000 #/cc (tomates expuestos a EWNS) y otros tres se colocaron en la cámara de control (tomates control). Ninguno de los grupos de tomates se sometió a procesamiento adicional. Los tomates expuestos a EWNS y los controles se retiraron después de 45 minutos para evaluar el efecto de EWNS.
Cada experimento se realizó por triplicado. El análisis de datos se realizó según el protocolo descrito en los Datos Suplementarios.
Las muestras bacterianas de E. coli, Enterobacter y L. innocua, expuestas a EWNS (45 min, concentración de aerosol de EWNS: 40 000 #/cm³) y no expuestas, se sedimentaron para evaluar los mecanismos de inactivación. El precipitado se fijó durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) con un fijador de glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 1,25 % y ácido pícrico al 0,03 %. Tras el lavado, se fijaron con tetróxido de osmio (OsO₄) al 1 %/ferrocianuro de potasio (KFeCN₆) al 1,5 % durante 2 h, se lavaron 3 veces con agua y se incubaron en acetato de uranilo al 1 % durante 1 h, tras lo cual se lavaron dos veces con agua. Posteriormente, se deshidrataron durante 10 minutos con alcohol al 50 %, 70 %, 90 % y 100 %. Las muestras se colocaron en óxido de propileno durante una hora y se impregnaron con una mezcla 1:1 de óxido de propileno y TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). Se embebieron en TAAB Epon y se polimerizaron a 60 °C durante 48 horas. La resina granular curada se cortó y visualizó mediante TEM con un microscopio electrónico de transmisión convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japón), equipado con una cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, EE. UU.).
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para cada punto temporal, se realizaron lavados bacterianos por triplicado, lo que resultó en un total de nueve puntos de datos por punto, cuyo promedio se utilizó como concentración bacteriana para ese organismo en particular. La desviación estándar se utilizó como error de medición. Todos los puntos cuentan.
El logaritmo de la disminución de la concentración de bacterias en comparación con t = 0 min se calculó utilizando la siguiente fórmula:
donde C0 es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo 0 (es decir, después de que la superficie se haya secado pero antes de colocarse en la cámara) y Cn es la concentración de bacterias en la superficie después de n minutos de exposición.
Para tener en cuenta la degradación natural de las bacterias durante el período de exposición de 45 minutos, también se calculó la reducción logarítmica en comparación con el control a los 45 minutos de la siguiente manera:
Donde Cn es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo n y Cn-Control es la concentración de bacterias de control en el tiempo n. Los datos se presentan como una reducción logarítmica en comparación con el control (sin exposición a EWNS).
Durante el estudio, se evaluaron diversas combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación del cono de Taylor, estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de la producción de EWNS y reproducibilidad. Varias combinaciones se muestran en la Tabla Suplementaria S1. Se seleccionaron dos casos para un estudio completo que mostró propiedades estables y reproducibles (cono de Taylor, producción de EWNS y estabilidad en el tiempo). En la figura 3 se muestran los resultados sobre la carga, el tamaño y el contenido de ROS para dos casos. Los resultados también se resumen en la Tabla 1. Como referencia, la Figura 3 y la Tabla 1 incluyen las propiedades del EWNS no optimizado previamente sintetizado8, 9, 10, 11 (EWNS de línea base). Los cálculos de significancia estadística utilizando una prueba t de dos colas se republican en la Tabla Suplementaria S2. Además, los datos adicionales incluyen estudios sobre el efecto del diámetro del orificio de muestreo del contraelectrodo (D) y la distancia entre el electrodo de tierra y la punta de la aguja (L) (Figuras Suplementarias S2 y S3).
(a–c) Distribución del tamaño del AFM. (d–f) Característica de carga superficial. (g) Caracterización de ROS y ESR.
También es importante destacar que, en todas las condiciones mencionadas, las corrientes de ionización medidas se situaron en el rango de 2 a 6 µA y los voltajes en el rango de -3,8 a -6,5 kV, lo que resultó en un consumo de energía para este módulo de generación de EWNS de terminal único inferior a 50 mW. Si bien el EWNS se sintetizó a alta presión, los niveles de ozono fueron muy bajos, sin superar nunca las 60 ppb.
La Figura Suplementaria S4 muestra los campos eléctricos simulados para los escenarios de [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Los campos, según los escenarios de [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], se calculan como 2 × 10⁻¹ V/m y 4,7 × 10⁻¹ V/m, respectivamente. Esto es previsible, ya que la relación entre el voltaje y la distancia es mucho mayor en el segundo caso.
Las figuras 3a y 3b muestran el diámetro del EWNS medido con el AFM8. Los diámetros promedio de EWNS para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm] se calcularon en 27 nm y 19 nm, respectivamente. Las desviaciones estándar geométricas de las distribuciones para los casos [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm] son ​​de 1,41 y 1,45, respectivamente, lo que indica una distribución de tamaño estrecha. Tanto el tamaño medio como la desviación estándar geométrica son muy similares a los valores del EWNS de referencia, siendo de 25 nm y 1,41, respectivamente. La figura 3c muestra la distribución de tamaño del EWNS de referencia medido con el mismo método y en las mismas condiciones.
En las figuras 3d y e se muestran los resultados de la caracterización de la carga. Los datos corresponden al promedio de 30 mediciones simultáneas de concentración (#/cm³) y corriente (I). El análisis muestra que la carga promedio en el EWNS es de 22 ± 6 e₀ y 44 ± 6 e₀ para [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. En comparación con el EWNS de referencia (10 ± 2 e₀), su carga superficial es significativamente mayor, el doble que en el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] y cuatro veces mayor que en el escenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f muestra los datos básicos de pago del EWNS.
De los mapas de concentración del número de EWNS (Figuras Suplementarias S5 y S6), se observa que la escena [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta un número de partículas significativamente mayor que la escena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Cabe destacar también que las concentraciones del número de EWNS se monitorearon hasta por 4 horas (Figuras Suplementarias S5 y S6), donde la estabilidad de la generación de EWNS mostró los mismos niveles de concentración del número de partículas en ambos casos.
La Figura 3g muestra el espectro de EPR tras la sustracción del control (de fondo) para EWNS optimizado a [-6,5 kV, 4,0 cm]. El espectro de ROS también se compara con el EWNS de referencia en un artículo publicado previamente. El número calculado de EWNS que reaccionan con la trampa de espín es de 7,5 × 10⁻¹ EWNS/s, similar al EWNS de referencia8 publicado previamente. Los espectros de EPR indicaron claramente la presencia de dos tipos de ROS: el O₂ predominó y el OH₂ se presentó en menor cantidad. Además, una comparación directa de las intensidades de pico mostró que el EWNS optimizado presentó un contenido de ROS significativamente mayor que el EWNS de referencia.
La figura 4 muestra la eficiencia de deposición de EWNS en EPES. Los datos también se resumen en la Tabla I y se comparan con los datos originales de EWNS. En ambos casos de EUNS, la deposición fue cercana al 100% incluso a un voltaje bajo de 3,0 kV. Normalmente, 3,0 kV es suficiente para lograr una deposición del 100%, independientemente del cambio en la carga superficial. En las mismas condiciones, la eficiencia de deposición del EWNS de referencia fue de tan solo el 56% debido a la menor carga (un promedio de 10 electrones por EWNS).
La Figura 5 y la Tabla 2 resumen el grado de inactivación de los microorganismos inoculados en la superficie de tomates tras la exposición a aproximadamente 40.000 #/cm³ de EWNS durante 45 minutos en el escenario óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli y L. innocua inoculadas mostraron una reducción significativa de 3,8 log tras 45 minutos de exposición. En las mismas condiciones, S. enterica mostró una reducción logarítmica menor, de 2,2 log, mientras que S. cerevisiae y M. parafortuitum mostraron una reducción de 1,0 log.
Micrografías electrónicas (Figura 6) que muestran los cambios físicos inducidos por EWNS en células de E. coli, Salmonella enterica y L. innocua que conducen a la inactivación. Las bacterias control mostraron membranas celulares intactas, mientras que las bacterias expuestas presentaron membranas externas dañadas.
Las imágenes microscópicas electrónicas de bacterias de control y expuestas revelaron daño a la membrana.
Los datos sobre las propiedades fisicoquímicas del EWNS optimizado muestran colectivamente que las propiedades del EWNS (carga superficial y contenido de ROS) mejoraron significativamente en comparación con los datos de referencia del EWNS publicados previamente8,9,10,11. Por otro lado, su tamaño se mantuvo en el rango nanométrico, lo cual es muy similar a los resultados publicados previamente, lo que les permite permanecer en el aire durante un largo período de tiempo. La polidispersidad observada puede explicarse por cambios en la carga superficial, que determinan la magnitud del efecto Rayleigh, la aleatoriedad y la posible fusión del EWNS. Sin embargo, como detallan Nielsen et al.22, una carga superficial alta reduce la evaporación al aumentar efectivamente la energía/tensión superficial de la gota de agua. Esta teoría fue confirmada experimentalmente para microgotas22 y EWNS en nuestra publicación anterior8. La pérdida de tiempo extra también puede afectar el tamaño y contribuir a la distribución de tamaño observada.
Además, la carga por estructura es de aproximadamente 22–44 e-, dependiendo de las circunstancias, lo cual es significativamente mayor en comparación con el EWNS básico, que tiene una carga promedio de 10 ± 2 electrones por estructura. Sin embargo, cabe destacar que esta es la carga promedio del EWNS. Seto et al. han demostrado que la carga no es uniforme y sigue una distribución log-normal21. En comparación con nuestro trabajo previo, duplicar la carga superficial duplica la eficiencia de deposición en el sistema EPES hasta casi el 100 %11.