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Las partículas de sílice porosa se prepararon mediante un método sol-gel con algunas modificaciones para obtener partículas macroporosas. Estas partículas se derivatizaron mediante polimerización por transferencia de cadena de fragmentación por adición reversible (RAFT) con N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) y estireno para preparar la fase estacionaria de intercalación de N-fenilmaleimida de poliestireno (PMP). Separación en columna PMP evaluada de una mezcla de péptidos que consta de cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, rendimiento cromatográfico de leucina encefalina) y digestión con tripsina de albúmina sérica humana (HAS). /m². Al comparar el rendimiento de separación de la columna desarrollada con la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, se observó que el rendimiento de separación de la columna PMP fue superior al de la columna comercial en términos de eficiencia de separación y resolución.
En los últimos años, la industria biofarmacéutica se ha convertido en un mercado global en expansión con un aumento sustancial en la participación de mercado. Con el crecimiento explosivo de la industria biofarmacéutica1,2,3, el análisis de péptidos y proteínas es muy deseado. Además del péptido objetivo, se generan varias impurezas durante la síntesis de péptidos, lo que requiere purificación cromatográfica para obtener péptidos de la pureza deseada. El análisis y caracterización de proteínas en fluidos corporales, tejidos y células es una tarea extremadamente desafiante debido a la gran cantidad de posibles especies detectables en una sola muestra. Aunque la espectrometría de masas es una herramienta eficaz para la secuenciación de péptidos y proteínas, si dichas muestras se inyectan en el espectrómetro de masas en un solo paso, la separación no será ideal. Este problema se puede mitigar implementando separaciones por cromatografía líquida (LC) antes del análisis de MS, lo que reducirá la cantidad de analitos que ingresan al espectrómetro de masas en un momento dado4,5,6. pruebas y mejorar la sensibilidad de detección de MS. La cromatografía líquida (LC) ha avanzado significativamente durante la última década y se ha convertido en una técnica popular en el análisis proteómico7,8,9,10.
La cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC) se usa ampliamente para la purificación y separación de mezclas de péptidos utilizando sílice modificada con octadecil (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Sin embargo, las fases estacionarias de RP no brindan una separación satisfactoria de péptidos y proteínas debido a su estructura compleja y naturaleza anfifílica.14,15 Por lo tanto, se requieren fases estacionarias especialmente diseñadas para analizar péptidos y proteínas con mitad polar y no polar lazos para interactuar con estos analitos y retenerlos16. La cromatografía de modo mixto, que proporciona interacciones multimodales, puede ser una alternativa a la RP-LC para la separación de péptidos, proteínas y otras mezclas complejas. Se han preparado varias fases estacionarias de modo mixto y se han utilizado columnas empaquetadas con estas fases para separaciones de péptidos y proteínas17,18,19,20,21. Fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC /RPLC, intercalación polar/RPLC) son adecuados para separaciones de péptidos y proteínas debido a la presencia de grupos polares y no polares22,23,24,25,26,27,28. De manera similar, las fases estacionarias de intercalación polar con grupos polares unidos covalentemente muestran un buen poder de separación y selectividad única para analitos polares y no polares, ya que la separación depende de la interacción entre el analito y la fase estacionaria.Interacciones multimodales 29, 30, 31, 32. Recientemente, Zhang et al.30 preparó una fase estacionaria de poliamina terminada en dodecilo y separó con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estrógenos y otros analitos. Columnas Express RP-Amide, pero estas columnas se usan solo para el análisis de la amina 33.
En el presente estudio, se preparó y evaluó una fase estacionaria polar incrustada (poliestireno incrustado en N-fenilmaleimida) para la separación de péptidos y digestiones de tripsina de HSA. La fase estacionaria se preparó utilizando la siguiente estrategia. Las partículas de sílice porosa se prepararon de acuerdo con el procedimiento dado en nuestra publicación anterior con algunas modificaciones al protocolo de preparación. cond, se sintetizó un nuevo ligando, fenilmaleimida-metil vinilisocianato, y se usó para derivatizar partículas de sílice para preparar una fase estacionaria incrustada polar. La fase estacionaria resultante se empaquetó en una columna de acero inoxidable (100 × 1,8 mm de d.i.) usando el esquema de empaque optimizado. El empaque de la columna está asistido por vibración mecánica para garantizar que se forme un lecho homogéneo dentro de la columna. Evalúe la separación de la columna empaquetada de mezclas de péptidos que constan de cinco péptidos;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) y digerido de tripsina de albúmina sérica humana (HAS). Se observó que la mezcla de péptidos y el digerido de tripsina de HSA se separaban con buena resolución y eficiencia. El rendimiento de separación de la columna PMP se comparó con el de la columna Ascentis Express RP-amida. Ambos péptidos y se observó que las proteínas estaban bien resueltas y eran eficientes en la columna PMP, que fue más eficiente que la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, ortosilicato de trimetoxi (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albúmina de suero humano (HSA), cloruro de amonio, urea, hexano metildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloilo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoilo (BPO), acetonitrilo de grado HPLC (ACN), metanol, 2-propanol y acetona adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
Una mezcla de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) y 8 ml de ácido acético 0,01 N se agitó durante 10 minutos y luego se añadieron 24 ml de TMOS en condiciones de hielo. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C durante 6 horas y luego a 120 °C durante 8 horas en un autoclave de acero inoxidable. la masa se molió uniformemente en un horno y se calcinó a 550°C durante 12 horas. Se prepararon y caracterizaron tres lotes para examinar la reproducibilidad en tamaño de partícula, tamaño de poro y área superficial.
Mediante la modificación de la superficie de las partículas de sílice con el ligando presintetizado fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) seguido de la polimerización radial con estireno, se preparó un compuesto que contenía un grupo polar.Fase estacionaria para áridos y cadenas de poliestireno. A continuación se describe el proceso de preparación.
Se disolvieron N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de metilvinilo (100 mg) en tolueno seco y se añadieron 0,1 ml de 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) al matraz de reacción para preparar el copolímero de fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMCP). La mezcla se calentó a 60 °C durante 3 horas, se filtró y se secó en una estufa a 40 °C durante 3 horas.
Las partículas de sílice secas (2 g) se dispersaron en tolueno seco (100 ml), se agitaron y sonicaron en un matraz de fondo redondo de 500 ml durante 10 min. Se disolvió PMCP (10 mg) en tolueno y se añadió gota a gota al matraz de reacción a través de un embudo de goteo. (100 g) se disolvieron en tolueno (200 ml) y se añadió 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) en presencia de 100 µl de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. La mezcla se agitó a 50 °C durante 8 horas, se filtró y se secó a 50 °C durante 3 horas.
Se dispersaron en tolueno y se purgaron con nitrógeno estireno (1 ml), peróxido de benzoílo BPO (0,5 ml) y partículas de sílice adheridas a TEMPO-PMCP (1,5 g). La polimerización del estireno se llevó a cabo a 100 °C durante 12 horas. El producto resultante se lavó con metanol y se secó a 60 °C durante la noche. El esquema de reacción general se muestra en la Figura 1.
Las muestras se desgasificaron a 393 K durante 1 hora para obtener una presión residual de menos de 10-3 Torr. La cantidad de N2 adsorbido a una presión relativa de P/P0 = 0,99 se utilizó para determinar el volumen total de poros. columna de aluminio con cinta adhesiva de carbono. Se sembró oro sobre las muestras con un recubridor de pulverización catódica Q150T y se depositó una capa de Au de 5 nm sobre las muestras. Esto mejora la eficiencia del proceso utilizando voltajes bajos y proporciona pulverización catódica en frío de grano fino. Se utilizó un analizador elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EE. UU.) Flash EA1112 para el análisis elemental. Las partículas de sílice y las partículas de sílice unidas a ligandos (5 mg cada una) se dispersaron en 5 ml de isopropanol, se sonicaron durante 10 min, se sometieron a agitación vorticial durante 5 min y se colocaron en el banco óptico del Mastersizer. El análisis termogravimétrico se realizó a una velocidad de 5 °C por minuto en un rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Las columnas de diámetro estrecho de acero inoxidable revestidas de vidrio de dimensiones (100 × 1,8 mm de d.i.) se empaquetaron utilizando el método de empaque de suspensión, aplicando el mismo procedimiento utilizado en la Ref.31. Se conectó una columna de acero inoxidable (revestida de vidrio, 100 × 1,8 mm de d.i.) con un accesorio de salida que contenía una frita de 1 µm a un empacador de lechada (Alltech Deerfield, IL, EE. UU.). Prepare una lechada de fase estacionaria suspendiendo 150 mg de fase estacionaria en 1,2 ml de metanol y envíela a la columna de almacenamiento. la columna de forma secuencial aplicando presiones de 100 MP durante 10 minutos, 80 MP durante 15 minutos y 60 MP durante 30 minutos. Durante el llenado, se aplicó vibración mecánica con dos agitadores de columna de GC (Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.) para garantizar un llenado uniforme de la columna. el sistema LC para comprobar su rendimiento.
Se construyó una bomba LC (10AD Shimadzu, Japón), inyector (Valco (EE. UU.) C14 W.05) con bucle de inyección de 50 nL, desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), ventana capilar UV-VIS Detector de dispositivo µLC especial (UV-2075) y microcolumnas revestidas de vidrio. 365 y capilares de unión reductora (50 μm) se instalaron en la salida de 1/16" de la unión reductora. La recopilación de datos y el procesamiento cromatográfico se realizaron con el software Multichro 2000. Monitoreo a 254 nm Se analizó la absorbancia UV de los analitos. Los datos cromatográficos se analizaron con OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina de suero humano, polvo liofilizado, ≥ 96 % (electroforesis en gel de agarosa) 3 mg mezclados con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) y bicarbonato de amonio 0,2 M (1 mL). ºC
La separación de las mezclas de péptidos y los digeridos de tripsina de HSA se evaluaron por separado en columnas PMP. Verifique la separación de la mezcla de péptidos y el digerido de tripsina de HSA mediante la columna PMP y compare los resultados con la columna Ascentis Express RP-Amide. El número de placa teórico se calcula de la siguiente manera:
Las imágenes SEM de partículas de sílice desnudas y partículas de sílice ligadas se muestran en la FIG.2. Las imágenes SEM de las partículas de sílice desnuda (A, B) muestran que, a diferencia de nuestros estudios anteriores, estas partículas son esféricas, en las que las partículas están alargadas o tienen una simetría irregular. La superficie de las partículas de sílice unidas por ligando (C, D) es más suave que la de las partículas de sílice desnuda, lo que puede deberse al recubrimiento de cadenas de poliestireno en la superficie de las partículas de sílice.
Imágenes de microscopio electrónico de barrido de partículas de sílice desnudas (A, B) y partículas de sílice unidas a ligandos (C, D).
En la Figura 3(A) se muestran las distribuciones de tamaño de partícula de las partículas de sílice desnuda y las partículas de sílice unida a ligando. Las curvas de distribución del tamaño de partícula basadas en el volumen mostraron que el tamaño de las partículas de sílice aumentó después de la modificación química (Fig. 3A). Los datos de distribución del tamaño de partícula de las partículas de sílice del estudio actual y el estudio anterior se comparan en la Tabla 1(A). ) de 3,05 μm (partículas de sílice unida a poliestireno)34. Este lote tenía una distribución de tamaño de partícula más estrecha en comparación con nuestro estudio anterior debido a las proporciones variables de PEG, urea, TMOS y ácido acético en la mezcla de reacción. El tamaño de partícula de la fase PMP es ligeramente mayor que el de la fase de partículas de sílice unida a poliestireno que estudiamos anteriormente. Esto significa que la funcionalización de la superficie de las partículas de sílice con estireno solo depositó una capa de poliestireno (0. 97 µm) en la superficie de sílice, mientras que en la fase PMP el espesor de la capa fue de 1,38 µm.
Distribución de tamaño de partícula (A) y distribución de tamaño de poro (B) de partículas de sílice desnuda y partículas de sílice unidas a ligando.
El tamaño de poro, el volumen de poro y el área de superficie de las partículas de sílice del estudio actual se muestran en la Tabla 1(B). Los perfiles de PSD de las partículas de sílice desnuda y las partículas de sílice unida a ligando se muestran en la Figura 3(B). Los resultados son comparables con nuestro estudio anterior. de la curva se muestra en la Fig. 3(B). De manera similar, el volumen de poro de las partículas de sílice disminuyó de 0,67 a 0,58 cm3/g después de la modificación química. a 105 m2/g después de la modificación química.
Los resultados del análisis elemental de la fase estacionaria se muestran en la Tabla 2. La carga de carbono de la fase estacionaria actual es del 6,35 %, que es inferior a la carga de carbono de nuestro estudio anterior (partículas de sílice unidas con poliestireno, 7,93 %35 y 10,21 %, respectivamente) 42. La carga de carbono de la fase estacionaria actual es baja, porque en la preparación del SP actual, además del estireno, algunos ligandos polares como Se utilizaron metilvinilisocianato (PCMP) y 4-hidroxi-TEMPO. El porcentaje en peso de nitrógeno de la fase estacionaria actual es 2,21 %, en comparación con 0,1735 y 0,85 % en peso de nitrógeno en estudios anteriores, respectivamente. Esto significa que el % en peso de nitrógeno es mayor en la fase estacionaria actual debido a la fenilmaleimida. respectivamente, mientras que la carga de carbono del producto final (6) fue del 6,35 %, como se muestra en la Tabla 2. La pérdida de peso se comprobó con la fase estacionaria PMP y la curva TGA se muestra en la Figura 4. La curva TGA muestra una pérdida de peso del 8,6 %, lo que concuerda bien con la carga de carbono (6,35 %) porque los ligandos contienen no solo C sino también N, O y H.
El ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato se eligió para la modificación de la superficie de las partículas de sílice porque tiene grupos polares de fenilmaleimida y grupos de vinilisocianato. Los grupos de vinilisocianato pueden reaccionar aún más con el estireno mediante polimerización por radicales vivos. La fase estacionaria se puede controlar mediante la cantidad óptima de estireno y el tiempo de reacción de la polimerización por radicales libres. El último paso de la reacción (polimerización por radicales libres) es crítico y puede cambiar la polaridad de la fase estacionaria. Se realizó un análisis elemental para comprobar la carga de carbono de estas fases estacionarias. Se observó que al aumentar la cantidad de estireno y el tiempo de reacción aumentaba la carga de carbono de la fase estacionaria y viceversa. cargue estas fases estacionarias en columnas de acero inoxidable y compruebe su rendimiento cromatográfico (selectividad, resolución, valor de N, etc.). Sobre la base de estos experimentos, se seleccionó una formulación optimizada para preparar la fase estacionaria de PMP para garantizar una polaridad controlada y una buena retención del analito.
También se evaluaron cinco mezclas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) usando una columna PMP usando una fase móvil;Acetonitrilo/agua 60/40 (v/v) (0,1 % TFA) a un caudal de 80 μL/min. En condiciones de elución óptimas, el número teórico de platos (N) por columna (100 × 1,8 mm de d.i.) es de 20 000 ± 100 (200 000 platos/m²). La Tabla 3 proporciona los valores de N para las tres columnas PMP y los cromatogramas se muestran en la Figura 5 A. Análisis rápido en una columna PMP a una velocidad de flujo alta (700 μl/min), se eluyeron cinco péptidos en un minuto, los valores de N fueron muy buenos, 13 500 ± 330 por columna (100 × 1,8 mm de d.i.), corresponde a 135 000 placas/m (Figura 5B). Tres columnas de tamaño idéntico (100 × 1,8 mm de d.i.) se empaquetaron con tres lotes diferentes de estación PMP La concentración del analito para cada columna se registró usando las condiciones de elución óptimas y el número de platos teóricos N y el tiempo de retención para separar la misma mezcla de prueba en cada columna. Los datos de reproducibilidad para las columnas PMP se muestran en la Tabla 4. La reproducibilidad de la columna PMP se correlaciona bien con valores de % RSD muy bajos, como se muestra en la Tabla 3.
Separación de la mezcla de péptidos en la columna PMP (B) y la columna Ascentis Express RP-Amide (A);fase móvil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiones de la columna PMP (100 × 1,8 mm de d.i.);analítico El orden de elución de los compuestos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) y 5 (leucina) encefalina ácida).
Se evaluó una columna PMP (100 × 1,8 mm id) para la separación de digestos trípticos de albúmina sérica humana en cromatografía líquida de alta resolución. El cromatograma de la Figura 6 muestra que la muestra está bien separada y la resolución es muy buena. la digestión se ha dividido en 17 picos correspondientes a 17 péptidos. Se calculó la eficiencia de separación de cada pico en la digestión HSA y los valores se dan en la Tabla 5.
Se separó un digerido tríptico de HSA (100 × 1,8 mm de d.i.) en una columna PMP;caudal (100 µL/min), fase móvil 60/40 acetonitrilo/agua con TFA al 0,1 %.
donde L es la longitud de la columna, η es la viscosidad de la fase móvil, ΔP es la contrapresión de la columna y u es la velocidad lineal de la fase móvil. La permeabilidad de la columna PMP fue de 2,5 × 10-14 m2, la velocidad de flujo fue de 25 μL/min y se utilizó 60/40 v/v ACN/agua. La permeabilidad de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) fue similar a la de nuestro estudio anterior Ref. .34.La permeabilidad de la columna rellena con partículas superficialmente porosas es: 1,7 × 10-15 para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 y 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 2,6 μm Para partículas de 5 μm 43. Por lo tanto, la permeabilidad de la fase PMP es similar a la de Partículas de núcleo-corteza de 5 μm.
donde Wx es el peso de la columna rellena con cloroformo, Wy es el peso de la columna rellena con metanol y ρ es la densidad del disolvente.Densidades de metanol (ρ = 0,7866) y cloroformo (ρ = 1,484). fueron 0,63 y 0,55, respectivamente. Esto significa que la presencia de ligandos de urea reduce la permeabilidad de la fase estacionaria. Por otro lado, la porosidad total de la columna de PMP (100 × 1,8 mm de d.i.) es de 0,60. La permeabilidad de las columnas de PMP es menor que la de las columnas rellenas con partículas de sílice enlazadas con C18 porque en las fases estacionarias de tipo C18 los ligandos de C18 están unidos a las partículas de sílice de forma lineal. cadenas, mientras que en las fases estacionarias de tipo poliestireno, se forma una capa de polímero relativamente gruesa a su alrededor. En un experimento típico, la porosidad de la columna se calcula como:
Las Figuras 7A y B muestran la columna PMP (100 × 1,8 mm de d.i.) y la columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de d.i.) utilizando las mismas condiciones de elución (es decir, 60/40 ACN/H2O y 0,1 % de TFA).) del diagrama de van Deemter.Se prepararon mezclas de péptidos seleccionados (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) en 20 µL/ El caudal mínimo para ambas columnas es de 800 µL/min. Los valores mínimos de HETP en el caudal óptimo (80 µL/min) para la columna PMP y el Ascentis Express RP-Ami de columna fueron 2,6 µm y 3,9 µm, respectivamente. Los valores de HETP indican que la eficiencia de separación de la columna PMP (100 × 1,8 mm de d.i.) es mucho mejor que la columna Ascentis Express RP-Amide disponible en el mercado (100 × 1,8 mm de d.i.). 100 × 1,8 mm de d.i.) en comparación con la columna Ascentis Express RP-Amide se basa en las mejoras en la forma y el tamaño de las partículas y en los complejos procedimientos de relleno de la columna utilizados en el trabajo actual34.
(A) gráfico de van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido con una columna PMP (100 × 1,8 mm de d.i.) en ACN/H2O 60/40 con TFA al 0,1 %. F.A.
Se preparó y evaluó una fase estacionaria de poliestireno polar incrustado para la separación de mezclas de péptidos sintéticos y digeridos de tripsina de albúmina de suero humano (HAS) en cromatografía líquida de alto rendimiento. El rendimiento cromatográfico de las columnas PMP para mezclas de péptidos es excelente en cuanto a eficiencia y resolución de separación. La eficiencia, la baja contrapresión de la columna a altas velocidades de flujo es otra ventaja de esta fase estacionaria. Las columnas PMP exhiben una buena reproducibilidad y se pueden usar para el análisis de mezclas de péptidos y la digestión con tripsina de varias proteínas. Pretendemos usar esta columna para la separación de productos naturales, compuestos bioactivos de plantas medicinales y extractos fúngicos en cromatografía líquida. En el futuro, las columnas PMP también se evaluarán para la separación de proteínas y anticuerpos monoclonales.
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