Gracias por visitar Nature.com. Está utilizando una versión de navegador con compatibilidad limitada con CSS. Para una mejor experiencia, le recomendamos usar un navegador actualizado (o desactivar el modo de compatibilidad en Internet Explorer). Además, para garantizar la compatibilidad continua, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.
Muestra un carrusel de tres diapositivas a la vez. Use los botones Anterior y Siguiente para desplazarse por las tres diapositivas a la vez, o use los botones deslizantes al final para desplazarse por las tres diapositivas a la vez.
Se prepararon partículas de sílice porosa mediante el método sol-gel con algunas modificaciones para obtener partículas de poro ancho. Estas partículas se derivatizaron con isocianato de metilvinilo-N-fenilmaleimida (PMI) y estireno mediante polimerización por fragmentación por transferencia de cadena inversa (RAFT) para producir poliamidas intercaladas con N-fenilmaleimida. La fase estacionaria fue estireno (PMP). Las columnas de acero inoxidable de diámetro interior estrecho (100 × 1,8 mm) se rellenaron con una suspensión. Se evaluó el rendimiento cromatográfico de la columna de PMP para separar una mezcla de péptidos sintéticos compuesta por cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoácido encefalina) e hidrolizado tripsídico de albúmina sérica humana (HAS). En condiciones óptimas de elución, el número teórico de placas con una mezcla de péptidos alcanzó las 280.000 placas/m². Al comparar el rendimiento de separación de la columna desarrollada con la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, se observó que la eficiencia de separación de la columna PMP fue superior a la de la columna comercial en términos de eficiencia de separación y resolución.
La industria biofarmacéutica se ha convertido en un mercado global en expansión, con un aumento significativo de su cuota de mercado en los últimos años. Con el crecimiento explosivo de la industria biofarmacéutica1,2,3, existe una gran necesidad de análisis de péptidos y proteínas. Además del péptido diana, durante la síntesis de péptidos se forman diversas impurezas, por lo que se requiere la purificación cromatográfica para obtener la pureza deseada del péptido. El análisis y la caracterización de proteínas en fluidos corporales, tejidos y células es una tarea extremadamente compleja debido a la gran cantidad de especies potencialmente detectables presentes en una sola muestra. Si bien la espectrometría de masas es una herramienta eficaz para la secuenciación de péptidos y proteínas, si dichas muestras se introducen directamente en el espectrómetro de masas, la separación será insatisfactoria. Este problema se puede solucionar realizando cromatografía líquida (LC) antes del análisis MS, lo que reducirá la cantidad de analitos que entran al espectrómetro de masas en un momento dado4,5,6. Además, los analitos pueden concentrarse en una región estrecha durante la separación de la fase líquida, lo que aumenta la concentración de estos analitos y la sensibilidad de la detección por MS. La cromatografía líquida (LC) ha avanzado significativamente en la última década y se ha convertido en un método ampliamente utilizado para el análisis proteómico7,8,9,10.
La cromatografía líquida de fase reversa (RP-LC) se utiliza ampliamente para purificar y separar mezclas de péptidos utilizando sílice modificada con octadecilo (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Sin embargo, debido a su compleja estructura y naturaleza anfótera14,15, las fases estacionarias de RP no pueden proporcionar una separación satisfactoria de péptidos y proteínas. Por lo tanto, el análisis de péptidos y proteínas con fragmentos polares y apolares requiere fases estacionarias especialmente diseñadas para interactuar y retener estos analitos16. La cromatografía mixta, que ofrece interacciones multimodales, puede ser una alternativa a la RP-LC para separar péptidos, proteínas y otras mezclas complejas. Se prepararon varias fases estacionarias de tipo mixto y se utilizaron columnas llenas con estas fases estacionarias para separar péptidos y proteínas17,18,19,20,21. Debido a la presencia de grupos polares y no polares, las fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalación polar/RPLC) son adecuadas para la separación de péptidos y proteínas22,23,24,25,26,27,28. , las fases estacionarias intercaladas polares con grupos polares unidos covalentemente muestran buenas capacidades de separación y una selectividad única para analitos polares y no polares porque la separación depende de la interacción entre el analito y la fase estacionaria Interacciones multimodales 29,30,31,32. Recientemente, Zhang et al. 30 obtuvieron fases estacionarias terminadas en behenilo de poliaminas y separaron con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estrógenos y algunos otros analitos. El material estacionario incrustado polar tiene grupos polares y no polares, por lo que se puede utilizar para separar péptidos y proteínas en partes hidrófobas e hidrófilas. Las columnas polares en línea (por ejemplo, columnas C18 con amida en línea) están disponibles bajo el nombre comercial de columnas Ascentis Express RP-Amide, pero estas columnas solo se han utilizado para el análisis de la amina 33.
En el presente estudio, se preparó una fase estacionaria de inclusión polar (N-fenilmaleimida, poliestireno de inclusión) y se evaluó para la separación de péptidos y la escisión tríptica de HSA. Se utilizó la siguiente estrategia para preparar la fase estacionaria. Las partículas de sílice porosa se prepararon de acuerdo con los procedimientos descritos en nuestras publicaciones anteriores, con algunos cambios en los esquemas de preparación 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Se ajustaron las proporciones de urea, polietilenglicol (PEG), TMOS y ácido acético acuoso para obtener partículas de sílice con tamaños de poro grandes. En segundo lugar, se sintetizó un nuevo ligando de fenilmaleimida-metilvinil isocianato y sus partículas de sílice derivatizadas se utilizaron para preparar fases estacionarias incrustadas polares. La fase estacionaria obtenida se empaquetó en una columna de acero inoxidable (diámetro interno de 100 × 1,8 mm) de acuerdo con un esquema de empaquetamiento optimizado. El empaque de la columna se asiste mediante vibración mecánica para asegurar una capa uniforme dentro de la columna. Se evaluó la columna empaquetada para la separación de una mezcla de péptidos compuesta por cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, péptido leucina-encefalina) e hidrolizados tripsídicos de albúmina sérica humana (HSA). Se observó que la mezcla de péptidos y el digesto tripsídico de HSA se separaron con buena resolución y eficiencia. La eficiencia de separación de la columna PMP se comparó con la de la columna Ascentis Express RP-Amide. Se observó que los péptidos y las proteínas tienen buena resolución y alta eficiencia de separación en la columna PMP, y la eficiencia de separación de la columna PMP es mayor que la de la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, trimetoxiortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albúmina sérica humana (HSA), cloruro de amonio, urea, hexametilmetacriloildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloílo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoilo (BPO), acetonitrilo (ACN) para HPLC, metanol, 2-propanol y acetona. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, EE. UU.).
Una mezcla de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) y 8 ml de ácido acético 0,01 N se agitó durante 10 minutos, y se añadieron 24 ml de TMOS con refrigeración por hielo. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C durante 6 horas y, posteriormente, a 120 °C durante 8 horas en un autoclave de acero inoxidable. El agua se decantó y el residuo se secó a 70 °C durante 12 horas. Los bloques blandos secos se molieron suavemente y se calcinaron en un horno a 550 °C durante 12 horas. Se prepararon y caracterizaron tres lotes para comprobar la reproducibilidad del tamaño de partícula, el tamaño de poro y el área superficial.
Grupo polar y fase estacionaria para cadenas de poliestireno. El procedimiento de preparación se describe a continuación.
Se disolvieron N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de metil vinilo (100 mg) en tolueno anhidro y luego se añadieron 0,1 ml de 2,2′-azoisobutironitrilo (AIBN) al matraz de reacción para obtener un copolímero de fenilmaleimida y isocianato de metil vinilo (PMCP). ) La mezcla se calentó a 60 °C durante 3 horas, se filtró y se secó en un horno a 40 °C durante 3 horas.
Se dispersaron 2 g de partículas de sílice secas en 100 ml de tolueno seco, se agitaron y se sonicaron durante 10 min en un matraz de fondo redondo de 500 ml. Se disolvió 10 mg de PMCP en tolueno y se añadió gota a gota al matraz de reacción mediante un embudo de adición. La mezcla se calentó a reflujo a 100 °C durante 8 horas, se filtró, se lavó con acetona y se secó a 60 °C durante 3 horas. A continuación, las partículas de sílice asociadas con el PMCP (100 g) se disolvieron en 200 ml de tolueno y se añadió 2 ml de 4-hidroxi-TEMPO en presencia de 100 μl de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. La mezcla se agitó a 50 °C durante 8 horas, se filtró y se secó a 50 °C durante 3 horas.
Se dispersaron estireno (1 ml), peróxido de benzoilo (BPO) (0,5 ml) y partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP (1,5 g) en tolueno y se purgaron con nitrógeno. La polimerización del estireno se llevó a cabo a 100 °C durante 12 horas. El producto resultante se lavó con metanol y se secó durante la noche a 60 °C. El esquema general de la reacción se muestra en la figura 1.
Las muestras se desgasificaron a 393 K durante 1 h hasta obtener una presión residual inferior a 10–3 Torr. La cantidad de N2 adsorbida a la presión relativa P/P0 = 0,99 se utilizó para determinar el volumen poroso total. La morfología de las partículas de sílice pura y ligada a ligando se examinó utilizando un microscopio electrónico de barrido (Hitachi High Technologies, Tokio, Japón). Las muestras secas (sílice pura y partículas de sílice ligada a ligando) se colocaron en varillas de aluminio utilizando cinta de carbono. Se depositó oro sobre la muestra utilizando un dispositivo de pulverización catódica Q150T y se depositó una capa de Au de 5 nm de espesor sobre la muestra. Esto mejora la eficiencia del proceso de bajo voltaje y proporciona una pulverización en frío fina. El análisis elemental se realizó utilizando un analizador de composición elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EE. UU.) Flash EA1112. Se utilizó un analizador de tamaño de partícula Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 para obtener la distribución del tamaño de partícula. Las partículas de sílice sin recubrimiento y las partículas de sílice unidas a ligando (5 mg cada una) se dispersaron en 5 ml de isopropanol, se sonicaron durante 10 minutos, se agitaron durante 5 minutos y se colocaron en una mesa óptica Mastersizer. El análisis termogravimétrico se realizó a una velocidad de 5 °C por minuto en un rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Las columnas de acero inoxidable de diámetro interior estrecho revestidas de fibra de vidrio con dimensiones (DI 100 × 1,8 mm) se rellenaron mediante el método de llenado de pulpa siguiendo el mismo procedimiento que en la referencia 31. La columna de acero inoxidable (revestida de vidrio, DI 100 × 1 .8 mm) y una salida que contenía una frita de 1 µm se conectaron a una máquina de envasado de pulpa (Alltech Deerfield, IL, EE. UU.). Prepare una suspensión de la fase estacionaria suspendiendo 150 mg de la fase estacionaria en 1,2 ml de metanol y alimentándola a una columna de reservorio. Se utilizó metanol como disolvente de la pulpa y disolvente de control. Empaque la columna aplicando una secuencia de presión de 100 MP durante 10 min, 80 MP durante 15 min y 60 MP durante 30 min. El proceso de empaque utilizó dos vibradores de columna de cromatografía de gases (Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.) para la vibración mecánica para asegurar un empaque uniforme de la columna. Cierre el empacador de pulpa y libere la presión lentamente para evitar dañar la columna. Se desconectó la columna de la boquilla de pulpa y se conectó otra conexión a la entrada, la cual se conectó al sistema de cromatografía líquida (LC) para probar su funcionamiento.
Se construyó un MLC personalizado utilizando una bomba LC (10AD Shimadzu, Japón), un muestreador con un bucle de inyección de 50 nL (Valco (EE. UU.) C14 W.05), un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A) y una ventana capilar UV-VIS. Dispositivo detector (UV-2075) y microcolumna esmaltada. Utilice tubos de conexión muy estrechos y cortos para minimizar el efecto de la expansión adicional de la columna. Después de llenar la columna, instale un capilar (50 µm de diámetro interior 365) en la salida de la unión reductora de 1/16″ e instale un capilar (50 µm) de la unión reductora. La recopilación de datos y el procesamiento del cromatograma se realizan utilizando el software Multichro 2000. A 254 nm, la absorbancia UV de los analitos de los sujetos se monitorizó a 0. Los datos cromatográficos se analizaron utilizando OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina sérica humana, polvo liofilizado, ≥ 96 % (electroforesis en gel de agarosa), 3 mg mezclados con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) y bicarbonato de amonio 0,2 M (1 ml). La solución se agitó durante 10 min y se mantuvo en baño maría a 37 °C durante 6 h. Posteriormente, se extinguió con 1 ml de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. Filtrar la solución y conservar a una temperatura inferior a 4 °C.
La separación de una mezcla de péptidos y HSA digerido con tripsina en una columna de PMP se evaluó por separado. Verifique la hidrólisis tripsina de una mezcla de péptidos y HSA separados por una columna de PMP y compare los resultados con una columna Ascentis Express RP-Amide. El número de platos teóricos se calcula mediante la siguiente ecuación:
En la Figura 2 se muestran imágenes de SEM de partículas de sílice pura y de partículas de sílice unidas al ligando. Las imágenes de SEM de partículas de sílice pura (A, B) muestran una forma esférica alargada o con simetría irregular, en comparación con nuestros estudios previos. La superficie de las partículas de sílice unidas al ligando (C, D) es más lisa que la de las partículas de sílice pura, lo que podría deberse a las cadenas de poliestireno que recubren su superficie.
Micrografías electrónicas de barrido de partículas de sílice pura (A, B) y partículas de sílice unidas a ligando (C, D).
La distribución del tamaño de partícula de partículas de sílice pura y partículas de sílice unidas a ligando se muestra en la Fig. 2.3(A). Las curvas de distribución del tamaño de partícula volumétrica mostraron que el tamaño de partícula de sílice aumentó después de la modificación química (Fig. 3A). Los datos de distribución del tamaño de partícula de sílice del estudio actual y el estudio previo se comparan en la Tabla 1(A). El tamaño de partícula volumétrico d(0.5) de PMP fue de 3.36 µm, en comparación con el valor ad(0.5) de 3.05 µm en nuestro estudio previo (partículas de sílice unidas a poliestireno)34. Debido al cambio en la proporción de PEG, urea, TMOS y ácido acético en la mezcla de reacción, la distribución del tamaño de partícula de este lote fue más estrecha en comparación con nuestro estudio previo. El tamaño de partícula de la fase de PMP es ligeramente mayor que el de la fase de partículas de sílice unidas a poliestireno que estudiamos anteriormente. Esto significa que la funcionalización de la superficie de las partículas de sílice con estireno depositó solo una capa de poliestireno (0,97 µm) sobre la superficie de la sílice, mientras que en la fase PMP el espesor de la capa fue de 1,38 µm.
Distribución del tamaño de partículas (A) y distribución del tamaño de poro (B) de partículas de sílice pura y partículas de sílice unidas a ligando.
El tamaño de poro, el volumen de poro y el área superficial de las partículas de sílice utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla 1 (B). Los perfiles PSD de partículas de sílice pura y partículas de sílice unidas a ligando se muestran en las Figs. 3 (B). Los resultados fueron comparables a nuestro estudio anterior34. Los tamaños de poro de partículas de sílice pura y unida a ligando fueron 310 Å y 241 Å, respectivamente, lo que indica que después de la modificación química, el tamaño de poro disminuyó en 69 Å, como se muestra en la Tabla 1 (B), y la curva de desplazamiento se muestra en la Fig. El área superficial específica de partículas de sílice en el estudio actual es de 116 m2/g, que es comparable a nuestro estudio anterior (124 m2/g). Como se muestra en la Tabla 1 (B), el área superficial (m2/g) de partículas de sílice después de la modificación química también disminuyó de 116 m2/g a 105 m2/g.
Los resultados del análisis elemental de la fase estacionaria se presentan en la Tabla 2. El contenido de carbono de la fase estacionaria actual es del 6,35 %, que es inferior al de nuestro estudio anterior (partículas de sílice asociadas al poliestireno, 7,93 %35 y 10,21 %, respectivamente) 42. El contenido de carbono de la fase estacionaria actual es inferior, ya que se han utilizado algunos ligandos polares como el metil vinil isocianato de fenilmaleimida (PCMP) y el 4-hidroxi-TEMPO, además del estireno, en la preparación de SP. El porcentaje en peso de nitrógeno en la fase estacionaria actual es del 2,21 %, en comparación con el 0,1735 y el 0,85 % de estudios anteriores42. Esto significa que la fase estacionaria actual tiene un alto porcentaje en peso de nitrógeno debido a la fenilmaleimida. De manera similar, los productos (4) y (5) tienen un contenido de carbono de 2,7% y 2,9%, respectivamente, mientras que el producto final (6) tiene un contenido de carbono de 6,35%, como se muestra en la Tabla 2. El análisis termogravimétrico (TGA) se utilizó en la fase estacionaria de PMP para probar la pérdida de peso, y la curva de TGA se muestra en la Figura 4. La curva de TGA muestra una pérdida de peso de 8,6%, que está en buen acuerdo con el contenido de carbono (6,35%), ya que los ligandos contienen no solo C, sino también N, O y H.
Se seleccionó el ligando fenilmaleimida-metilvinil isocianato para modificar la superficie de las partículas de sílice debido a sus grupos polares fenilmaleimida y vinil isocianato. Los grupos vinil isocianato pueden reaccionar con el estireno mediante polimerización por radicales vivos. La segunda razón es insertar un grupo con interacciones moderadas con el analito y sin interacciones electrostáticas fuertes entre este y la fase estacionaria, ya que la fracción fenilmaleimida no tiene carga virtual a pH normal. La polaridad de la fase estacionaria se puede controlar mediante la cantidad óptima de estireno y el tiempo de reacción de la polimerización por radicales libres. El paso final de la reacción (polimerización por radicales libres) es crítico, ya que modifica la polaridad de la fase estacionaria. Se realizó un análisis elemental para verificar el contenido de carbono en estas fases estacionarias. Se observó que al aumentar la cantidad de estireno y el tiempo de reacción, aumenta el contenido de carbono de la fase estacionaria y viceversa. Los SP preparados con diferentes concentraciones de estireno presentan diferentes cargas de carbono. De igual forma, estas fases estacionarias se colocaron en columnas de acero inoxidable y se verificaron sus características cromatográficas (selectividad, resolución, valor de N, etc.). Con base en estos experimentos, se seleccionó una composición optimizada para la preparación de la fase estacionaria de PMP, a fin de proporcionar una polaridad controlada y una buena retención del analito.
La columna PMP también se evaluó para el análisis de cinco mezclas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilizando la capacidad de la fase móvil. 60/40 (v/v) ACN/agua (0,1 % TFA) a un caudal de 80 µl/min. En condiciones óptimas de elución (200 000 platos/m), el número de platos teóricos (N) por columna (100 × 1,8 mm) es de 20 000 ± 100. Los valores de N para las tres columnas PMP se muestran en la tabla 3 y los cromatogramas en la figura 5A. Análisis rápido a alto caudal (700 µl/min) en una columna de PMP. Cinco péptidos eluidos en un minuto. Excelente valor de N de 13 500 ± 330 por columna (100 x 1,8 mm de diámetro), equivalente a 135 000 platos/m (Fig. 5B). Se llenaron tres columnas del mismo tamaño (diámetro interior de 100 x 1,8 mm) con tres lotes diferentes de fase estacionaria de PMP para comprobar la reproducibilidad. Los analitos se registraron en cada columna separando la misma mezcla de prueba en cada una, utilizando condiciones de elución óptimas, número de platos teóricos (N) y tiempo de retención. Los datos de reproducibilidad de las columnas de PMP se muestran en la Tabla 4. La reproducibilidad de la columna de PMP mostró una buena correlación con valores muy bajos de %RSD, como se muestra en la Tabla 3.
Separación de mezclas de péptidos en una columna PMP (B) y una columna Ascentis Express RP-Amide (A), fase móvil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiones de la columna PMP (100 x 1,8 mm d.i.), análisis Orden de elución de los compuestos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) y 5 (ácido leúcico encefalina).
Se evaluó una columna de PMP (diámetro interno de 100 x 1,8 mm) para la separación del hidrolizado tripsídico de albúmina sérica humana mediante HPLC. El cromatograma de la Figura 6 muestra una buena separación de las muestras con muy buena resolución. Las soluciones de HSA se analizaron utilizando un caudal de 100 μl/min, una fase móvil de acetonitrilo/agua 70/30 y TFA al 0,1 %. La escisión de HSA se dividió en 17 picos, como se muestra en el cromatograma (Fig. 6), correspondientes a 17 péptidos. Se calcularon las eficiencias de separación de los picos individuales del hidrolizado de HSA, cuyos valores se muestran en la Tabla 5.
Los hidrolizados tripticos de HSA se separaron en una columna PMP (diámetro interno 100 x 1,8 mm), velocidad de flujo (100 μl/min), fase móvil 60/40 acetonitrilo/agua y 0,1 % de TFA.
donde L es la longitud de la columna, η es la viscosidad de la fase móvil, ΔP es la contrapresión de la columna y u es la velocidad lineal de la fase móvil. La permeabilidad de la columna de PMP fue de 2,5 × 10–14 m2, el caudal fue de 25 µl/min, se utilizó 60/40 v/v. ACN/agua. La permeabilidad de la columna de PMP (DI 100 × 1,8 mm) fue similar a la de nuestro estudio previo Ref.34. La permeabilidad de una columna llena de partículas superficialmente porosas es de 1,7 × 10 ,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 5 µm43. Por lo tanto, la permeabilidad de la fase de PMP es similar a la permeabilidad de las partículas core-shell con un tamaño de 5 μm.
Donde Wx es la masa de la columna llena de cloroformo, Wy es la masa de la columna llena de metanol y ρ es la densidad del disolvente. Densidad del metanol (ρ = 0,7866) y del cloroformo (ρ = 1,484). La porosidad total de la columna de partículas de sílice-C18 (100 × 1,8 mm de diámetro interior)³⁴ y de la columna de urea-C18³¹ estudiada previamente fue de 0,63 y 0,55, respectivamente. Esto significa que la presencia de ligandos de urea reduce la permeabilidad de la fase estacionaria. Por otro lado, la porosidad total de la columna de PMP (diámetro interior de 100 × 1,8 mm) es de 0,60. Las columnas de PMP son menos permeables que las columnas rellenas de partículas de sílice unidas a C18 porque en las fases estacionarias de tipo C18 los ligandos de C18 están unidos a las partículas de sílice en cadenas lineales, mientras que en las fases estacionarias de tipo poliestireno se forma un polímero relativamente grueso alrededor de las partículas. capa A. En un experimento típico, la porosidad de la columna se calcula de la siguiente manera:
En las figuras 7A y B se muestran los gráficos de Van Deemter para una columna de PMP (diámetro interior de 100 x 1,8 mm) y una columna Ascentis Express RP-Amide (diámetro interior de 100 x 1,8 mm) bajo las mismas condiciones de elución: 60/40 ACN/H₂O y 0,1 % de TFA, de 20 µl/min a 800 µl/min en ambas columnas. Los valores mínimos de HETP a la velocidad de flujo óptima (80 µl/min) fueron de 2,6 µm y 3,9 µm para la columna de PMP y la columna Ascentis Express RP-Amide, respectivamente. Los valores de HETP muestran que la eficiencia de separación de la columna de PMP (100 x 1,8 mm de diámetro interior) es mucho mayor que la de la columna Ascentis Express RP-Amide disponible comercialmente (100 x 1,8 mm de diámetro interior). El gráfico de van Deemter de la Fig. 7(A) muestra que la disminución del valor de N no es significativamente mayor al aumentar el flujo, en comparación con nuestro estudio anterior. La mayor eficiencia de separación de la columna PMP (diámetro interior 100 × 1,8 mm) en comparación con la columna Ascentis Express RP-Amide se basa en la mejora de la forma y el tamaño de las partículas, así como en el sofisticado procedimiento de empaquetamiento de la columna empleado en el presente trabajo34.
(A) Gráfico de Van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido en una columna PMP (diámetro interior 100 x 1,8 mm) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA. (B) Gráfico de Van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido en una columna Ascentis Express RP-Amide (diámetro interior 100 x 1,8 mm) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA.
Se preparó y evaluó una fase estacionaria polar de poliestireno intercalado para la separación de una mezcla de péptidos sintéticos e hidrolizado tripsídico de albúmina sérica humana (HSA) mediante cromatografía líquida de alta resolución. El rendimiento cromatográfico de las columnas de PMP para mezclas de péptidos es excelente en términos de eficiencia y resolución de separación. Esta mayor eficiencia de separación se debe a diversas razones, como el tamaño de partícula y poro de la sílice, la síntesis controlada de las fases estacionarias y la complejidad de los materiales de relleno de la columna. Además de la alta eficiencia de separación, otra ventaja de esta fase estacionaria es la baja contrapresión de la columna a altos caudales. Las columnas de PMP son altamente reproducibles y pueden utilizarse para analizar mezclas de péptidos y la digestión tripsídica de diversas proteínas. Nuestro objetivo es utilizar esta columna para la separación de compuestos bioactivos de productos naturales, extractos de plantas medicinales y hongos mediante cromatografía líquida. En el futuro, las columnas de PMP también se evaluarán para la separación de proteínas y anticuerpos monoclonales.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. y Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa, parte I: Desarrollo de un protocolo para la caracterización de columnas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. y Petersson, P. Investigación en sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa parte I: Desarrollo de un protocolo para la caracterización de columnas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. y Petersson, P. Investigación de sistemas de separación de péptidos mediante cromatografía de fase inversa, parte I: desarrollo de un protocolo para la caracterización de columnas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. y Petersson, P. Investigación en sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa parte I: Desarrollo de un protocolo para las características de la columna. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. y Petersson, P. Investigación en sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa parte I: Desarrollo de un protocolo para las características de la columna.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. y Petersson, P. Investigación de sistemas de separación de péptidos mediante cromatografía de fase inversa, parte I: desarrollo de un protocolo para la caracterización de columnas.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Métodos para la creación de péptidos activos mejorados para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Biotecnología. Logros 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia y mercado. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia y mercado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J y Chreschatyski M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia y mercado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J y Khreschatsky M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia y mercado. Descubrimiento de fármacos. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD y Shen, Y. Cromatografía líquida proteómica avanzada. Xie, F., Smith, RD y Shen, Y. Cromatografía líquida proteómica avanzada.Véase F., Smith RD y Shen Yu. Cromatografía líquida proteómica avanzada. Xie, F., Smith, RD y Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD y Shen, Y. Composición proteica avanzada 液相色谱。Véase F., Smith RD y Shen Yu. Cromatografía líquida proteómica avanzada.J. Cromatografía. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. La cromatografía líquida-espectrometría de masas avanzada permite combinar la metabolómica y la proteómica de amplio espectro. ano. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM y Salisbury, JJ El papel de la UHPLC en el desarrollo farmacéutico. Chesnut, SM y Salisbury, JJ El papel de la UHPLC en el desarrollo farmacéutico.Chesnut, SM y Salisbury, JJ El papel de la UHPLC en el desarrollo farmacéutico.Chesnut, SM y Salisbury, JJ El papel de la UHPLC en el desarrollo de fármacos. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspectos fundamentales y prácticos de la cromatografía líquida de ultra alta presión para separaciones rápidas. Wu, N. & Clausen, AM Aspectos fundamentales y prácticos de la cromatografía líquida de ultra alta presión para separaciones rápidas.Wu, N. y Clausen, AM Aspectos fundamentales y prácticos de la cromatografía líquida de alta presión para separación rápida. Wu, N. & Clausen, AM Wu, N. & Clausen, AM Aspectos básicos y prácticos de la cromatografía líquida de ultra alta presión para separación rápida.Wu, N. y Clausen, AM Aspectos fundamentales y prácticos de la cromatografía líquida de alta presión para separación rápida.Revista de Ciencias Atmosféricas. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA y Tchelitcheff, P. Uso de cromatografía líquida de ultra rendimiento en el desarrollo farmacéutico. Wren, SA y Tchelitcheff, P. Uso de cromatografía líquida de ultra rendimiento en el desarrollo farmacéutico.Ren, SA y Chelischeff, P. El uso de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento en el desarrollo farmacéutico. Wren, SA y Tchelitcheff, P. Wren, SA y Tchelitcheff, P.Ren, SA y Chelischeff, P. Aplicación de la cromatografía líquida de ultra rendimiento en el desarrollo de fármacos.J. Cromatografía. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Un hidrogel macroporoso monolítico derivado de una emulsión de aceite en agua con una alta fase interna para la purificación eficiente del enterovirus 71. Chemical. Project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. y Wilkins, JA El papel de la cromatografía líquida en la proteómica. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. y Wilkins, JA El papel de la cromatografía líquida en la proteómica.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. y Wilkins, JA El papel de la cromatografía líquida en la proteómica. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. y Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. y Wilkins, JA El papel de la cromatografía líquida en la proteómica.J. Cromatografía. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nuevas tendencias en separaciones cromatográficas líquidas de fase reversa de péptidos y proteínas terapéuticas: teoría y aplicaciones. & Guillarme, D. Nuevas tendencias en separaciones cromatográficas líquidas de fase reversa de péptidos y proteínas terapéuticas: teoría y aplicaciones. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: teoría y promoción. & Guillarme, D. Nuevas tendencias en la separación de péptidos y proteínas terapéuticas mediante cromatografía líquida de fase reversa: teoría y aplicaciones. & Guillarme, D. y Guillarme, D.y Guillarmé, D. Nuevas tendencias en la separación de péptidos y proteínas terapéuticas mediante cromatografía líquida de fase inversa: teoría y aplicaciones.J. Pharm. Ciencias Biomédicas. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE y Gebler, JC Separación bidimensional de péptidos utilizando el sistema RP-RP-HPLC con diferentes pH en la primera y segunda dimensión de separación. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE y Gebler, JC Separación bidimensional de péptidos utilizando el sistema RP-RP-HPLC con diferentes pH en la primera y segunda dimensión de separación.Gilar M., Olivova P., Dali AE y Gebler JK Separación bidimensional de péptidos utilizando el sistema RP-RP-HPLC con diferentes pH en la primera y segunda dimensión de separación.Gilar M., Olivova P., Dali AE y Gebler JK. Separación bidimensional de péptidos utilizando diferentes valores de pH en la primera y segunda dimensión de separación mediante el sistema RP-RP-HPLC. J. Sept. Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Investigación de la transferencia de masa y las características cinéticas de columnas de cromatografía de alto rendimiento rellenas con partículas C18 completamente porosas y superficialmente porosas menores de 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendencias recientes y desafíos analíticos en el aislamiento, identificación y validación de péptidos bioactivos vegetales. ano. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Panorama proteómico del reino de la vida. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Postratamiento de péptidos terapéuticos mediante cromatografía líquida preparativa. Molecules (Basilea, Suiza) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. y Geng, X. Cromatografía de modo mixto y sus aplicaciones a biopolímeros. Yang, Y. y Geng, X. Cromatografía de modo mixto y sus aplicaciones a biopolímeros.Yang, Yu. y Geng, X. Cromatografía en modo mixto y su aplicación a biopolímeros. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. y Geng, X. Cromatografía en modo mixto y su aplicación en biopolímeros.Yang, Yu. y Gene, X. Cromatografía en modo mixto y su aplicación a biopolímeros.J. Cromatografía. A 1218(49), 8813–8825 (2011).