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Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) es una planta leguminosa utilizada para la producción de alimentos y la mejora del suelo.La expansión global de NLL como cultivo ha atraído a muchos hongos patógenos, incluida la antracnosis de lupino, que causa la devastadora enfermedad de la antracnosis.Se han utilizado dos alelos, Lanr1 y AnMan, que confieren mayor resistencia, en el mejoramiento de NLL, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún se desconocen.En este estudio, los marcadores Lanr1 y AnMan se usaron para seleccionar muestras europeas de NLL.Las pruebas de la vacuna en un entorno controlado confirmaron la eficacia de ambos donantes resistentes.El perfil de expresión génica diferencial se realizó en líneas resistentes y susceptibles representativas.La resistencia a la antracnosis se asoció con la sobreexpresión de los términos de ontología génica "GO: 0006952 Respuesta de defensa", "GO: 0055114 Proceso redox" y "GO: 0015979 Fotosíntesis".Además, la línea Lanr1(83A:476) mostró una reprogramación significativa del transcriptoma rápidamente después de la inoculación, mientras que las otras líneas mostraron un retraso en esta respuesta de unas 42 horas.Las respuestas de defensa están asociadas con los genes TIR-NBS, CC-NBS-LRR y NBS-LRR, 10 proteínas involucradas en la patogénesis, proteínas de transferencia de lípidos, endoglucano-1,3-β-glucosidasa, proteínas de la pared celular ricas en glicina y genes de la ruta reactiva del oxígeno.Las primeras respuestas a 83A:476, incluida la supresión cuidadosa de los genes asociados con la fotosíntesis, coincidieron con una protección exitosa durante la fase de crecimiento vegetativo de la biología fúngica, lo que sugiere que un efector desencadena la inmunidad.La reacción de Mandeloop se ralentiza, al igual que el arrastre horizontal general.
El lupino de hoja estrecha (NLL, Lupinus angustifolius L.) es un cereal rico en proteínas originario de la región del Mediterráneo occidental1,2.Actualmente se cultiva como alimento para animales y humanos.También se considera abono verde en los sistemas de rotación de cultivos debido a la fijación de nitrógeno por bacterias fijadoras de nitrógeno simbióticas y la mejora general de la estructura del suelo.NLL ha sufrido un rápido proceso de domesticación en el siglo pasado y todavía está bajo una alta presión de reproducción3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Con el cultivo generalizado de NLL, la sucesión de hongos patógenos desarrolló nuevos nichos agrícolas y provocó nuevas enfermedades que destruyen los cultivos. La más destacable para los criadores y criadores de chocho fue la aparición de la antracnosis, provocada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. La más destacable para los criadores y criadores de chocho fue la aparición de la antracnosis, provocada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызва нного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lo más notable para los criadores y criadores de lupinos fue la aparición de antracnosis causada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar) 嵵Ha enojado。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вы зываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lo más sorprendente para los criadores y criadores de lupinos es la aparición de antracnosis causada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Los primeros informes de la enfermedad provinieron de Brasil y Estados Unidos, y los síntomas típicos aparecieron en 1912 y 1929 respectivamente.Sin embargo, después de unos 30 años, el patógeno se designó como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Tel. Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld en Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld en Morfología dirigida. y H. Schrenk,. y H. Schrenk, .y H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。y H. Schlenk, .El fenotipado preliminar de la enfermedad realizado a mediados del siglo XX mostró cierta resistencia en las accesiones de NLL y lupino amarillo (L. luteus L.), pero todas las accesiones de lupino blanco (L. albus L.) analizadas fueron altamente susceptibles15,16.Los estudios han demostrado que el desarrollo de la antracnosis está asociado con el aumento de la precipitación (humedad del aire) y la temperatura (en el rango de 12-28 °C), lo que lleva a una violación de la resistencia a temperaturas más altas17, 18. De hecho, el tiempo requerido para que los conidios germinen y comience la enfermedad fue cuatro veces más corto a 24 °C (4 horas) que a 12 °C (16 horas) en condiciones de alta humedad19.Por lo tanto, el calentamiento global en curso ha llevado a la propagación de la antracnosis.Sin embargo, la enfermedad se observó en Francia (1982) y Ucrania (1983) como presagio de una amenaza inminente, pero aparentemente fue ignorada por la industria del lupino en ese momento20,21.Unos años más tarde, esta devastadora enfermedad se extendió por todo el mundo y afectó también a los principales países productores de lupino como Australia, Polonia y Alemania22,23,24.Luego de un brote de antracnosis a mediados de la década de 1990, una evaluación exhaustiva dio como resultado la identificación de varios donantes resistentes en muestras de NLL19.La resistencia de NLL a la antracnosis está controlada por dos alelos dominantes separados que se encuentran en diferentes fuentes de germoplasma: Lanr1 en el cultivar Tanjil y Wonga y AnMan en el cultivar.Mandalay 25, 26. Estos alelos complementan los marcadores moleculares que apoyan la selección de germoplasma resistente en programas de mejoramiento25,26,27,28,29,30.La línea de reproducción resistente 83A:476 que porta el alelo Lanr1 se cruzó con la línea silvestre susceptible P27255 para obtener una población RIL que se segregaba para la resistencia a la antracnosis, lo que hizo posible asignar el locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. La alineación de los marcadores del mapa de ligamiento de los loci de resistencia flanqueantes a la antracnosis con un marco genómico, NLL reveló la ubicación de los tres alelos en el mismo cromosoma (NLL-11), pero en posiciones diferentes29,34,35.Sin embargo, debido al pequeño número de RIL y la gran distancia genética entre los marcadores y los alelos correspondientes, no se pueden sacar conclusiones fiables sobre sus genes subyacentes.Por otro lado, el uso de genética inversa en lupinos es difícil debido a su muy bajo potencial de regeneración, lo que hace que la manipulación genética sea engorrosa37.
El desarrollo de germoplasma domesticado portador del alelo deseado en estado homocigoto, como 83A:476 (Lanr1) y Mandelup (AnMan), ha abierto la puerta al estudio de la resistencia a la antracnosis ante la presencia de combinaciones opuestas de alelos en poblaciones silvestres.Posibilidades de los mecanismos moleculares.Comparar las respuestas de defensa generadas por genotipos específicos.Este estudio evaluó la respuesta transcriptómica temprana de NLL a la vacunación contra C. lupini.En primer lugar, se evaluó un panel de germoplasma NLL europeo que contenía 215 líneas utilizando marcadores moleculares que marcan los alelos Lanr1 y AnMan.Luego se realizó el fenotipado de antracnosis en 50 líneas NLL, previamente seleccionadas para marcadores moleculares, en condiciones controladas.Sobre la base de estos experimentos, se seleccionaron cuatro líneas que diferían en la resistencia a la antracnosis y la composición alélica de Lanr1/AnMan para el perfil de expresión génica de defensa diferencial utilizando dos enfoques complementarios: secuenciación de ARN de alto rendimiento y cuantificación por PCR en tiempo real.
La selección de un conjunto de germoplasma NLL (N = 215) con marcadores Lanr1 (Anseq3 y Anseq4) y AnMan (Anseq4) y AnMan (AnManM1) mostró que solo una línea (95726, cerca de Salamanca-b) amplifica el alelo "resistencia" para todos los marcadores, mientras que "Presencia de alelos 'susceptibles'" encontró la proporción de todos los marcadores en 158 (~ 73.5 % líneas.Trece líneas produjeron dos alelos "resistentes" del marcador Lanr1 y 8 líneas produjeron alelos "resistentes" de Lanr1.marcador.El alelo de "resistencia" del marcador AnMan (Tabla complementaria S1).Dos líneas eran heterocigotas para el marcador Anseq3 y una heterocigota para el marcador AnManM1.42 líneas (19,5%) portaban fases opuestas de los alelos Anseq3 y Anseq4, lo que indica una alta frecuencia de recombinación entre estos dos loci.Los fenotipos de antracnosis en condiciones controladas (Tabla complementaria S2) revelaron una variabilidad en la resistencia de los genotipos probados, que se reflejó en la gravedad de la antracnosis.Las diferencias en las puntuaciones medias oscilaron entre 1,8 (moderadamente resistente) y 6,9 (susceptibles) y las diferencias en el peso de las plantas oscilaron entre 0,62 (susceptibles) y 4,45 g (resistentes). Hubo una correlación significativa entre los valores observados en dos réplicas del experimento (0,51 para las puntuaciones de gravedad de la enfermedad, P = 0,00017 y 0,61 para el peso de la planta, P < 0,0001), así como entre estos dos parámetros (-0,59 y -0,77, P < 0,0001). Hubo una correlación significativa entre los valores observados en dos repeticiones del experimento (0,51 para puntajes de severidad de la enfermedad, P = 0,00017 y 0,61 para el peso de la planta, P < 0,0001), así como entre estos dos parámetros (-0,59 y -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях экспе римента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также межд у этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Se encontró una correlación significativa entre los valores observados en dos repeticiones del experimento (0,51 para puntajes de severidad de la enfermedad, P = 0,00017 y 0,61 para peso de la planta, P < 0,0001), así como entre estos dos parámetros (-0,59 y -0,77, P < 0,0001) 0,0001).0,51, P = 0,00017,物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。0.5 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностя х (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 y масса растения 0,61, P <0,0001), y между этими двумя пара metrams (-0,59 y -0,0001) 0,77, P <0,0001. Hubo una correlación significativa entre los valores observados por duplicado (puntuación de gravedad de la enfermedad 0,51, P = 0,00017 y peso de la planta 0,61, P < 0,0001) y entre estos dos parámetros (-0,59 y -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Los síntomas típicos que se observan en las plantas susceptibles incluyen torceduras y retorcimientos del tallo que se asemejan a una estructura de "arco de pastor", seguidos de lesiones ovales con esporozoitos de color naranja/rosado (Figura complementaria 1).Las accesiones australianas que portan los genes Lanr1 (83A:476 y Tanjil) y AnMan (Mandelup) son moderadamente resistentes, 0,0331 y 0,0036).Algunas líneas que también portan alelos Lanr1 y/o AnMan “resistentes” muestran síntomas de la enfermedad.
Curiosamente, algunas líneas de NLL que carecían de algún alelo marcador "resistente" revelaron un alto nivel de resistencia a la antracnosis (comparable o mayor que para los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para puntuación y 0,001 para peso de la planta) y Población B-549/79b (valor de P < 0,0001 para puntuación y no significativo para el peso). Curiosamente, algunas líneas de NLL que carecían de algún alelo marcador "resistente" revelaron un alto nivel de resistencia a la antracnosis (comparable o mayor que para los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para puntuación y 0,001 para peso de la planta) y Población B-549/79b (valor de P < 0,0001 para puntuación y no significativo para el peso). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 и ли AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для м ассы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, varias líneas de NLL que carecían de cualquier alelo marcador 'resistente' mostraron un alto nivel de resistencia a la antracnosis (comparable o superior a los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para evaluación y 0,001 para el peso de la planta) y población B-549/79b (valor de P < 0,0001 para evaluación). y no significativa para el peso).AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.0 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Es interesante que algunos sistemas NLL que no tienen ningún marcador “antigénico” muestran una alta resistencia horizontal (equivalente a los genes Lanr1 o AnMan o superior), como Boregine (ambos parámetros P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso de la planta 0,001) y cepa B-549/79b (valor P < 0,0001, peso no significativo). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали вы сокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значе ние P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P -значение <0,0001, масса незначительна). Curiosamente, algunas líneas NLL que carecían de alelos marcadores de "resistencia" mostraron altos niveles de resistencia a la antracnosis (comparables o superiores a los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor P para ambos parámetros <0,0001), Bojar (valor P <0,0001, peso de la planta 0,001) y población B-549/79b (valor P <0,0001, peso no significativo).Este fenómeno sugiere la posibilidad de una nueva fuente genética de resistencia, lo que explica la falta de correlación observada entre los genotipos marcadores y los fenotipos de la enfermedad (valores de P de ~0,42 a ~0,98).Por lo tanto, la prueba de Kolmogorov-Smirnov mostró que los datos sobre la resistencia a la antracnosis tenían una distribución aproximadamente normal para las puntuaciones (valores de P de 0,25 y 0,11) y la masa de la planta (valores de P de 0,47 y 0,55), lo que sugiere que hay más alelos involucrados que Lanr1 y AnMan.
Con base en los resultados de la detección de resistencia a la antracnosis, se seleccionaron 4 líneas para el análisis del transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup y Población 22660. Estas líneas se volvieron a analizar para determinar la resistencia al ántrax en experimentos de inoculación mediante secuenciación de ARN, siempre que fueran las mismas que en la prueba anterior.Los valores de puntuación fueron los siguientes: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) y población 22660 (6,11 ± 1,29).
El protocolo Illumina NovaSeq 6000 logró un promedio de 40,5 pares de Mread por muestra (29,7 a 54,4 Mreads) (Tabla complementaria S3).Las puntuaciones de alineación en la secuencia de referencia oscilaron entre el 75,5 % y el 88,6 %.La correlación promedio de datos de recuento de lectura entre variantes experimentales entre réplicas biológicas osciló entre 0,812 y 0,997 (media 0,959). De los 35170 genes analizados, 2917 no revelaron expresión y los otros 4785 genes se expresaron a un nivel insignificante (media base <5). De los 35170 genes analizados, 2917 no revelaron expresión y los otros 4785 genes se expresaron a un nivel insignificante (media base <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессиров ались на незначительном уровне (базовое среднее <5). De los 35170 genes analizados, 2917 no mostraron expresión y los 4785 genes restantes se expresaron a un nivel insignificante (base media <5).35.170 unidades, 2917 unidades, 4785 unidades, 4785 unidades值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначите льную экспрессию (базовое среднее значение <5). De los 35170 genes analizados, 2917 no se expresaron y los 4785 genes restantes tenían una expresión insignificante (base media <5).Por lo tanto, la cantidad de genes considerados expresados ​​(media base ≥ 5) durante el experimento fue de 27 468 (78, 1%) (Tabla complementaria S4).
Desde el primer momento, todas las líneas NLL respondieron a la inoculación de C. lupini (cepa Col-08) mediante la reprogramación del transcriptoma (Tabla 1), sin embargo, se observaron diferencias significativas entre las líneas.Por lo tanto, la línea de resistencia 83A: 476 (que lleva el gen Lanr1) mostró una reprogramación significativa del transcriptoma en el primer punto de tiempo (6 hpi) con un aumento de 31 a 69 veces en el número de genes arriba y abajo aislados en comparación con otros puntos de tiempo en este punto de tiempo.Además, este pico fue de corta duración, ya que la expresión de solo unos pocos genes permaneció significativamente alterada en el segundo punto de tiempo (12 hpi).Curiosamente, Boregine, que también mostró un alto nivel de resistencia en la prueba de injerto, no experimentó una reprogramación transcripcional tan masiva durante el experimento.Sin embargo, el número de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) fue el mismo para Boregine y 83A:476 a 12 HPI.Tanto Mandelup como la población 22660 mostraron picos de DEG en el último punto de tiempo (48 l/s), lo que indica un retraso relativo en las respuestas de defensa.
Debido a que 83A:476 se sometió a una reprogramación masiva del transcriptoma en respuesta a C. lupini en 6 HPI en comparación con todas las demás líneas, ~91 % de los DEG observados en este momento fueron específicos del linaje (Fig. 1).Sin embargo, hubo cierta superposición en las primeras respuestas entre las líneas de estudio, ya que 68,5 %, 50,9 % y 52,6 % DEG en Boregine, Mandelup y la población 22660, respectivamente, se superpusieron con las encontradas en 83A:476 en ciertos momentos.Sin embargo, estos DEG representaron solo una pequeña fracción (0,97–1,70 %) de todos los DEG detectados actualmente con 83A:476.Además, 11 DEG de todas las líneas eran coherentes en este momento (Tablas complementarias S4-S6), incluidos los componentes comunes de las respuestas de defensa de las plantas: proteína de transferencia de lípidos (TanjilG_32225), enzima endoglucano-1,3-β-glucósido (TanjilG_23384), dos proteínas inducibles por estrés como SAM22 (TanjilG_31528 y TanjilG_31531), la tex (TanjilG_32352) y dos proteínas estructurales de la pared celular ricas en glicina (TanjilG_19701 y TanjilG_19702).También hubo una superposición relativamente alta en las respuestas del transcriptoma entre 83A:476 y Boregine a 24 HPI (total 16-38 % DEG) y entre Mandelup y la Población 22660 a 48 HPI (total 14-20 % DEG).
Diagrama de Venn que muestra el número de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en líneas de lupino de hoja estrecha (NLL) inoculadas con Colletotrichum lupini (cepa Col-08 obtenida de campos de lupino en Wierzhenice, Polonia, 1999).Las líneas NLL analizadas fueron: 83A:476 (resistente, portadora del alelo Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo AnMan) y la población 22660 (muy susceptible).La abreviatura hpi significa horas después de la vacunación.Se han eliminado los valores cero para simplificar el gráfico.
El conjunto de genes sobreexpresados ​​a las 6 hpi se analizó para detectar la presencia de dominios del gen R canónico (Tabla complementaria S7).Este estudio reveló la inducción del transcriptoma de genes clásicos de resistencia a enfermedades con dominios NBS-LRR solo en 83A:476.Este conjunto constaba de un gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco genes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 y tanjilg_16162), y cuatro NBS-LR, Tanjilg_16162) y cuatro NBS-LRRE (tanjilg _16162), así como Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) y Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Todos estos genes tienen dominios canónicos dispuestos en secuencias conservadas.Además de los genes del dominio NBS-LRR, varias quinasas RLL se activaron a 6 hpi, a saber, una en boregina (tanjilg_19877), dos en Mandelup (tanjilg_07141 y tanjilg_19877) y en la población 22660 (Tanjilg_09014 y tanjilg_10361)
Los genes con una expresión significativamente alterada en respuesta a la inoculación con C. lupini (cepa Col-08) se sometieron a análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) (Tabla complementaria S8). El término de proceso biológico sobrerrepresentado con mayor frecuencia fue "GO: 0006952 respuesta de defensa" que apareció en 6 de 16 (tiempo × línea) combinaciones con alta significación (valor P <0.001) (Fig. 2). El término de proceso biológico sobrerrepresentado con mayor frecuencia fue "GO: 0006952 respuesta de defensa" que apareció en 6 de 16 (tiempo × línea) combinaciones con alta significación (valor P <0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитн ый ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0 ,001) (ris. 2). El término de proceso biológico sobrerrepresentado con mayor frecuencia fue 'GO: 0006952 respuesta de defensa', que apareció en 6 de 16 (tiempo × linaje) combinaciones con alta significancia (valor P <0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 El término de proceso biológico más representativo es “GO:0006952 respuesta de defensa”, que aparece en 6 de las 16 (时间×线) combinaciones, con alta significación (valor P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», texto ый появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (ris. 2). El término de proceso biológico sobrerrepresentado con mayor frecuencia fue 'GO: 0006952 Respuesta de defensa', que apareció en 6 de 16 combinaciones (tiempo × línea) con alta significancia (valor P < 0,001) (Fig. 2).Este término estuvo sobrerrepresentado en dos puntos de tiempo en 83A: 476 y Boregine (6 y 24 hpi) y en un punto de tiempo en Mandelup y Población 22660 (12 y 6 hpi, respectivamente).Este es un resultado esperado, destacando la respuesta antifúngica de las líneas resistentes.Además, 83A:476 respondió a C. lupini al inducir rápidamente genes relacionados con el estallido oxidativo representado por el término "GO:0055114 proceso redox", lo que indica una respuesta de defensa específica, mientras que Boregine reveló respuestas de defensa específicas, relacionadas con el término 'GO'.:0006950 Respuesta al estrés”.La población 22660 activó la respuesta de resistencia horizontal involucrando metabolitos secundarios, destacándose el excesivo número de términos “GO:0016104 Proceso de biosíntesis de triterpenos” y “GO:0006722 Proceso de metabolismo de triterpenos” (ambos términos pertenecen al mismo conjunto de genes), teniendo en cuenta los resultados del análisis de enriquecimiento de términos GO, la estabilidad de la reacción de Mandelup estuvo entre Boregine y la Población 22660. Además, la reacción temprana 83A:47 6 (6 hpi) y reacción retardada Mandelup y Población 22660 incluyen el término GO:0015979 'fotosíntesis' y otros procesos biológicos relacionados.
Los términos de ontología de genes de bioprocesos seleccionados en la anotación de genes expresados ​​diferencialmente durante las respuestas del transcriptoma de lupino de hoja estrecha (NLL) inoculados con lupino de ántrax (cepa Col-08 obtenida de campos de lupino en Wierzhenice, Polonia, en 1999) son muy exagerados.Las líneas NLL analizadas fueron: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y la población 22660 (susceptible).
Debido a que este estudio tuvo como objetivo identificar los genes que contribuyen a la resistencia a la antracnosis, los genes asignados a los términos GO "GO: 0006952 Respuestas defensivas" y "GO: 0055114 Procesos redox" se analizaron con puntos de corte desde la línea base significa ≥ 30 con al menos una línea.× punto en el tiempo que combina valores estadísticamente significativos de log2 (fold change).El número de genes que cumplen estos criterios fue de 65 para GO:0006952 y 524 para GO:0055114.
83A:476 reveló dos picos DEG anotados con el término GO:0006952, el primero a 6 genes por pulgada (64 genes, regulación ascendente y descendente) y el segundo a 24 genes por pulgada (15 genes, regulación ascendente únicamente).Boregine también mostró que GO: 0006952 alcanzó su punto máximo en el mismo punto de tiempo, pero con menos DEG (11 y 8) y activación preferencial.Mandeloop mostró dos picos de GO:0006952 a los 12 y 48 HPI, ambos portadores de 12 genes (el primero con genes activadores y el segundo solo con genes supresores), mientras que la población 22660 a los 6 HPI (13 genes) tuvo un mayor predominio del pico de aumento.regulación.Cabe señalar que el 96,4% de GO:0006952 DEG en estos picos tuvo el mismo tipo de respuesta (hacia arriba o hacia abajo), lo que indica una superposición significativa en las respuestas de defensa a pesar de las diferencias en la cantidad de genes involucrados.El grupo más grande de secuencias relacionadas con el término GO: 0006952 codifica la proteína 22 del mensaje asociado al estrés por inanición (similar a SAM22), que pertenece al clado de proteínas de la proteína asociada a la patogénesis de clase 10 (PR-10) y al látex de la proteína central.proteína similar (proteína similar a MLP) (Fig. 3).Los dos grupos diferían en la naturaleza de la expresión y la dirección de la respuesta.Los genes que codifican proteínas similares a SAM22 mostraron una inducción consistente y significativa en puntos de tiempo tempranos (6 o 12 hpi) y generalmente no respondieron al final del experimento (48 hpi), mientras que las proteínas similares a MLP mostraron coordinación a las 6 hpi.hpi.83A:476 y Mandelup a 48 hp/in, casi todos los demás puntos de datos no respondían.Además, las diferencias en los perfiles de expresión de los genes de proteínas similares a SAM22 siguieron a la variabilidad observada en la resistencia a la antracnosis, ya que las líneas más resistentes tenían más puntos de tiempo que inducían significativamente estos genes que los genes más susceptibles.Otro gen PR-10 similar a LlR18A/B mostró un patrón de expresión muy similar al gen de la proteína similar a SAM22.
Se identificaron los principales componentes del término del proceso biológico “GO:0006952 Defense Response” y los patrones de expresión de los genes candidatos de los alelos Lanr1 y AnMan.La escala Log2 representa los valores log2 (cambio de veces) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupinos, Wizhenica, Polonia, 1999) y plantas de control (inoculadas simuladamente) en el mismo punto de tiempo.Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y Población 22660 (susceptible).
Además, se evaluaron los perfiles de expresión de los genes candidatos de RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) y AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).El gen TanjilG_05042 mostró una respuesta significativa (activación) en 83A:476 solo en el primer punto de tiempo (6 hpi), mientras que TanjilG_12861 fue significativo en Mandeloop solo en dos puntos de tiempo: 6 hpi (regulación descendente) y 24 hpi (6 hpi).Con.).ajustable) ).
Los genes más sobreexpresados ​​en el término GO: 0055114 "proceso redox" fueron genes que codifican proteínas del citocromo P450 y peroxidasa (Fig. 4).Para las muestras aisladas de 83A:476 a 6 HPI, se observaron valores máximos o mínimos de log2 (fold change) (para el 86,6 % de los genes) entre las plantas inoculadas y las de control, lo que destaca la alta respuesta de este genotipo al sexo inoculante.83A:476 mostró el GO: 0055114 DEG más significativo a las 6 hpi (503 genes), mientras que el resto de las líneas a las 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; y Población 22660, 78 genes)).En la mayoría de los genes de la familia GO:0055114 se observaron dos tipos de respuestas a la vacunación (activación e inhibición).Curiosamente, hasta el 97,6 % de los DEG identificados para el término GO: 0055114 en Mandelupe a 48 hp. Estas observaciones sugieren que, a pesar de la escala significativamente menor (es decir, el número de genes redox mutados, 85 frente a 503), el patrón de respuestas transcriptómicas retardadas de mandeloup a la antracnosis es similar a la respuesta temprana de 83A:476.En Boregine y Población 22660, esta convergencia es menor en 51,6% y 75,6%, respectivamente.
Se revelaron los patrones de expresión de los principales componentes del término del proceso biológico “GO:0055114 Redox process”.La escala Log2 representa los valores log2 (cambio de veces) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupinos, Wizhenica, Polonia, 1999) y plantas de control (inoculadas simuladamente) en el mismo punto de tiempo.Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y Población 22660 (susceptible).
83A:476 Las respuestas transcriptómicas a la inoculación con C. lupini (cepa Col-08) también incluyeron el silenciamiento coordinado de genes atribuidos al término GO:0015979 "fotosíntesis" y otros procesos biológicos relacionados (FIG. 5).Este conjunto GO: 0015979 DEG contenía 105 genes que se reprimieron significativamente a las 6 hpi en 83A: 476.En este subconjunto, 37 genes también se regularon a la baja en Mandelup en 48 HPI y 35 al mismo tiempo en la población 22660, incluidos 19 DEG comunes a ambos genotipos.Ningún DEG relacionado con el término GO: 0015979 se activó significativamente en ninguna combinación (línea x tiempo).
Se revelaron los patrones de expresión de los principales componentes del término del proceso biológico “GO:0015979 Fotosíntesis”.La escala Log2 representa los valores log2 (cambio de veces) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupinos, Wizhenica, Polonia, 1999) y plantas de control (inoculadas simuladamente) en el mismo punto de tiempo.Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y Población 22660 (susceptible).
Según los resultados del análisis de expresión diferencial y presumiblemente involucrado en las respuestas de defensa contra hongos patógenos, este conjunto de siete genes se seleccionó para la cuantificación de los perfiles de expresión mediante PCR en tiempo real (Tabla complementaria S9).
El gen de proteína putativo TanjilG_10657 se indujo significativamente en todas las líneas y puntos de tiempo estudiados en comparación con las plantas de control (imitadoras) (Tablas complementarias S10, S11).Además, el perfil de expresión de TanjilG_10657 mostró una tendencia creciente en el transcurso del experimento para todas las líneas.La población 22660 mostró la sensibilidad más alta de TanjilG_10657 a la inoculación con una activación de 114 veces y el nivel de expresión relativa más alto (4.4 ± 0.4) a 24 HPI (Fig. 6a).El gen de la proteína PR10 LlR18A TanjilG_27015 también mostró activación en todas las líneas y puntos de tiempo, con significación estadística en la mayoría de los puntos de datos (Fig. 6b).Similar a TanjilG_10657, el nivel de expresión relativo más alto de TanjilG_27015 se observó en la población inoculada con 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4).El gen de la endoquitinasa ácida TanjilG_04706 se reguló significativamente en todas las líneas y en todos los puntos de tiempo excepto para Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Fue fuertemente inducido en el primer punto de tiempo (6 HPI) en 83A:476 (en 10,5 veces) y aumentó moderadamente en otras líneas (en 6,6-7,5 veces).Durante el experimento, la expresión de TanjilG_04706 se mantuvo en niveles similares en 83A:476 y Boregine, mientras que en Mandelup y Población 22660 aumentó significativamente, alcanzando valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 y 6,2 ± 1,5, respectivamente).El gen similar a endoglucano-1,3-β-glucosidasa TanjilG_23384 mostró una alta activación en los dos primeros puntos de tiempo (6 y 12 hpi) en todas las líneas excepto en la población 22660 (Fig. 6d).Los niveles de expresión relativos más altos de TanjilG_23384 se observaron en el segundo punto temporal (12 hpi) en Mandelup (2,7 ± 0,3) y 83A:476 (1,5 ± 0,1).A las 24 HPI, la expresión de TanjilG_23384 fue relativamente baja en todas las líneas estudiadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfiles de expresión de genes seleccionados (ag) revelados por PCR cuantitativa.Los números 6, 12 y 24 representan horas después de la vacunación.Los genes LanDExH7 y LanTUB6 se usaron para la normalización y LanTUB6 se usó para la calibración entre series.Las barras de error representan la desviación estándar basada en tres réplicas biológicas, cada una de las cuales es el promedio de tres réplicas técnicas. La significación estadística de las diferencias en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida en 1999 del campo de lupino en Wierzenica, Polonia) y las plantas de control (inoculadas de forma simulada) están marcadas por encima de los puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). La significación estadística de las diferencias en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida en 1999 del campo de lupino en Wierzenica, Polonia) y las plantas de control (inoculadas de forma simulada) están marcadas por encima de los puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированным и) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Las diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida en 1999 de un campo de lupinos en Wierzhenice, Polonia) y las plantas de control (inoculadas de forma simulada) se indican arriba de los puntos de datos (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达(*P < 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。接种 (colletotrichum lupini, color-08 株, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 对照 （接种 植物 之间*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Colletotrichum lupini, штамм Col-08 ; ыми) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P- значение ≤ 0,01, *** P- значение ≤ 0,001 ). Las diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino en Verzhenice, Polonia, en 1999) y las plantas de control (inoculadas de forma simulada) se observan arriba de los puntos de datos (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001).Las líneas NLL analizadas fueron: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos) y la población 22660 (susceptible).
El gen candidato TanjilG_05042 en el locus Lanr1 mostró un patrón de expresión marcadamente diferente de los perfiles obtenidos de los estudios de RNA-seq (Fig. 6e).Se observó una activación significativa de este gen en Mandelup y la población 22660 (hasta 39,7 y 11,7 veces, respectivamente), dando como resultado niveles de expresión relativamente altos (hasta 1,4 ± 0,14 y 7,2 ± 1,3, respectivamente).83A:476 también reveló cierta regulación al alza del gen TanjilG_05042 (hasta 3,8 veces); sin embargo, los niveles de expresión relativos alcanzados (0,044 ± 0,002) fueron más de 30 veces menores que los observados en Mandelup y la población 22660.analizados por qPCR mostraron diferencias significativas en los niveles de expresión entre los genotipos en las variantes con vacunación simulada (control), alcanzando una diferencia de 58 veces entre las poblaciones 22660 y 83A:476, así como entre las poblaciones 22660 y 22660. Se logró una diferencia de dos veces entre Boregine y Mandalup.
El gen candidato en el locus AnMan, TanjilG_12861, se activó en respuesta a la vacunación en 83A:476 y Mandelup, fue neutral en la población 22660 y se reguló a la baja en Boregine (Fig. 6f).La expresión relativa del gen TanjilG_12861 fue la más alta en 83A inoculado: 476 (0,14 ± 0,01).El gen de la proteína de choque térmico de clase I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 mostró niveles de expresión relativos más bajos en todas las cepas y puntos de tiempo estudiados (Fig. 6g).El valor más alto se observó en 24 HPI en la población 22660 (0,14 ± 0,02, un aumento de ocho veces en respuesta a la vacunación).
La comparación de los perfiles de expresión génica (Fig. 7) reveló una alta correlación entre TanjilG_10657 y otros cuatro genes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) y TanjilG_04706 (r = 0,79).Dichos resultados pueden indicar la co-regulación de estos genes durante las respuestas de defensa.Los genes TanjilG_12861 y TanjilG_23384 mostraron diferentes perfiles de expresión con valores de coeficiente de correlación de Pearson más bajos (de 0,08 a 0,43 y -0,19 a 0,28, respectivamente) en comparación con otros genes.
Las correlaciones entre los perfiles de expresión génica se detectaron mediante PCR cuantitativa.Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconocidos) y Población 22660 (susceptible).Se calcularon tres puntos de tiempo (6, 12 y 24 horas después de la inoculación), incluidas las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino en Wierzhenice, Polonia, en 1999) y control (inoculadas simuladamente).La escala muestra el valor del coeficiente de correlación de Pearson.
Según los datos obtenidos a 6 caballos de fuerza por pulgada, la WGCNA se realizó en 9981 DEG identificados mediante la comparación de plantas inoculadas y de control para centrarse en las respuestas de defensa tempranas (Tabla complementaria S12).Se encontraron veintidós módulos de genes (grupos) con perfiles de expresión correlacionados (positivos o negativos) entre genotipos y variantes experimentales. En promedio, los niveles de expresión génica descendían en orden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (en ambas variantes, sin embargo, esta tendencia fue más fuerte en las plantas de control). En promedio, los niveles de expresión génica descendían en orden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (en ambas variantes, sin embargo, esta tendencia fue más fuerte en las plantas de control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (en обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). En promedio, los niveles de expresión génica disminuyeron en el orden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (sin embargo, en ambas variantes, esta tendencia fue más fuerte en las plantas de control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> población 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). En promedio, los niveles de expresión génica disminuyeron en la serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (sin embargo, en ambas variantes, esta tendencia fue más fuerte en las plantas de control).La vacunación resultó en una regulación positiva de la expresión génica, especialmente en los módulos 18, 19, 14, 6 y 1 (en orden descendente de efecto), regulación negativa (p. ej., módulos 9 y 20) o con efectos neutrales (p. ej., módulos 11, 22, 8 y 13).El análisis de enriquecimiento del término GO (Tabla complementaria S13) reveló "GO: 0006952 Respuestas protectoras" para el módulo inoculado (18) con activación máxima, incluidos los genes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 y TanjilG_27015), así como muchos módulos de fotosíntesis más suprimidos de Inoculate (9).El concentrador del módulo 18 (Fig. 8) se identificó como el gen TanjilG_26536 que codifica la proteína LlR18B similar a PR-10, y el concentrador del módulo 9 se identificó como el gen TanjilG_28955 que codifica la proteína PsbQ del fotosistema II.Un gen de resistencia a la antracnosis candidato Lanr1, TanjilG_05042, se encontró en el módulo 22 (Fig. 9) y está asociado con los términos "GO: 0044260 Procesos metabólicos macromoleculares celulares" y "GO: 0006355 Regulación transcripcional, plantilla de ADN" que lleva el concentrador TanjilG_01212.el gen codifica el factor de transcripción del estrés por calor A-4a (HSFA4a).
Análisis de red ponderado de la coexpresión de genes de módulos con términos de procesos biológicos sobrerrepresentados "GO: 0006952 Respuestas de defensa".La ligadura se simplificó para resaltar los cuatro genes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 y TanjilG_27015).
Análisis de red ponderado de la coexpresión génica de un módulo con un término de proceso biológico sobrerrepresentado "GO: 0006355: regulación transcripcional, plantilla de ADN" y portador de un gen candidato de resistencia a la antracnosis Lanr1 TanjilG_05042.La ligación se simplificó para aislar el gen TanjilG_05042 y el gen central TanjilG_01212.
La detección de resistencia a la antracnosis recolectada en Australia mostró que la mayoría de los cultivares liberados temprano eran susceptibles;Kalya, Coromup y Mandelup se han descrito como moderadamente resistentes, mientras que Wonga, Tanjil y 83A:476 se han descrito como altamente resistentes26,27,31.tenía el mismo alelo de resistencia, designado Lanr1, y Coromup y Mandelup tenían un alelo diferente, designado AnMan10, 26, 39, mientras que Kalya transmitía un alelo diferente., Lanr2.La detección de resistencia a la antracnosis en Alemania dio como resultado la identificación de una línea resistente Bo7212 con un alelo candidato distinto de Lanr1, denominado LanrBo36.
Nuestro estudio reveló una frecuencia muy baja (alrededor del 6%) del alelo Lanr1 en el germoplasma analizado.Esta observación es consistente con los resultados de la selección de germoplasma de Europa del Este utilizando los marcadores Anseq3 y Anseq4, que mostraron que el alelo Lanr1 está presente en solo dos líneas bielorrusas.Esto sugiere que el alelo Lanr1 aún no se usa ampliamente en los programas de mejoramiento locales, a diferencia de Australia, donde es uno de los alelos clave para el mejoramiento asistido por marcadores.Esto puede deberse al menor nivel de resistencia proporcionado por el alelo Lanr1 en condiciones de campo europeas en comparación con el informe australiano.Además, los estudios de antracnosis en áreas de alta precipitación en Australia han demostrado que las respuestas de resistencia mediadas por el alelo Lanr1 pueden no ser efectivas en condiciones climáticas que favorecen el crecimiento y rápido desarrollo del patógeno19,42.De hecho, en el presente estudio también se observaron algunos síntomas de antracnosis en genotipos portadores del alelo Lanr1, lo que sugiere que la resistencia puede desaparecer en condiciones óptimas para el desarrollo de C. lupini.Además, son posibles interpretaciones falsas positivas de la presencia de los marcadores Anseq3 y Anseq4, que se encuentran aproximadamente a 1 cM del locus Lanr1 28,30,43 .
Nuestro estudio mostró que 83A:476, que porta el alelo Lanr1, respondió a la inoculación de C. lupini con una reprogramación transcriptómica a gran escala en el primer momento analizado (6 hpi), mientras que en Mandelup, que porta el alelo AnMan, las respuestas transcriptómicas se observaron mucho más tarde.(de 24 a 48 cv).Estas variaciones temporales en las respuestas de defensa están asociadas con diferencias en los síntomas de la enfermedad, lo que destaca la importancia del reconocimiento temprano de patógenos para una respuesta exitosa a la resistencia.Para infectar el tejido vegetal, las esporas de ántrax deben pasar por varias etapas de desarrollo en la superficie del huésped, incluida la germinación, la división celular y la formación de un apresorio.Un apéndice es una estructura infecciosa que se adhiere a la superficie del huésped y facilita la penetración en los tejidos del huésped.Así, las esporas de C. gloeosporioides en extracto de guisante mostraron la primera división del núcleo después de 75-90 minutos de incubación, la formación de un tubo germinativo después de 90-120 minutos y la supresión después de 4 horas 45 .Mango C. gloeosporioides mostró más del 40% de germinación de conidios después de 3 horas de incubación y alrededor del 20% de formación de apresores después de 4 horas.El gen CAP20 asociado a la virulencia de C. gloeosporioides mostró actividad transcripcional en conidias formadoras de epífitas después de 3,5 h de incubación en cera superficial de aguacate con altas concentraciones de proteína CAP20 después de 4 h 46 min.De manera similar, la actividad de los genes de biosíntesis de melanina en C. trifolii se indujo durante una incubación de 2 horas seguida de la formación de un apresorio después de 1 hora.Los estudios de tejidos foliares han demostrado que las fresas inoculadas con C. acutatum tienen la primera supresión a las 8 hpi, mientras que los tomates inoculados con C. coccodes tienen la primera supresión a las 4 hpi48,49.en gran parte consistente con la escala de tiempo de Colletotrichum spp.proceso infeccioso.Las respuestas de defensa rápida a 83A:476 sugieren la participación de genes de resistencia de plantas e inmunidad desencadenada por efectores (ETI) en esta línea, mientras que las respuestas retardadas de Mandelup respaldan la hipótesis de inmunidad desencadenada por patrones moleculares microasociados (MTI) 50. Respuestas tempranas a 83A: 476 y Mandelup.La superposición parcial entre genes regulados hacia arriba o hacia abajo en la respuesta tardía también respalda este concepto, ya que la ETI a menudo se considera una respuesta MTI acelerada y mejorada que culmina en la muerte celular programada en el sitio de la infección, conocida como shock anafiláctico 51,52.
La mayoría de los genes atribuidos al término sobrerrepresentado Gene Ontology GO: 0006952 "Respuesta de defensa" son los 11 homólogos de la proteína 22 del mensaje de ayuno inducido por estrés (similar a SAM22) y los siete principales similares a proteínas de látex (MLP).Las proteínas similares a 31, 34, 43 y 423 mostraron similitud de secuencia.Los genes similares a SAM22 mostraron una activación significativa que duró más, mostrando mayores niveles de resistencia a la antracnosis (83A:476 y Boregine).Sin embargo, los genes similares a MLP se regularon a la baja solo en las líneas que portaban el alelo de resistencia candidato (83A:476/Lanr1 a las 6 hpi y Mandelup/AnMan a las 24 hpi).Cabe señalar que todos los homólogos similares a SAM22 identificados se originan en un grupo de genes que abarca aproximadamente 105 kb, mientras que los genes similares a MLP se originan en regiones separadas del genoma.La activación coordinada de tales genes similares a SAM22 también se encontró en nuestro estudio anterior de la resistencia de NLL a la inoculación de Diaporthetoxica, lo que sugiere que están involucrados en los componentes horizontales de la respuesta de defensa.Esta conclusión también está respaldada por informes de una respuesta positiva de genes similares a SAM22 a la lesión o al tratamiento con ácido salicílico, inductores de hongos o peróxido de hidrógeno.
Se ha demostrado que los genes similares a MLP responden a diversos estreses abióticos y bióticos, incluidas infecciones bacterianas, víricas y fúngicas patógenas en muchas especies de plantas55.Las direcciones de respuesta a ciertas interacciones entre plantas y patógenos variaron desde un fuerte aumento (es decir, durante la infestación del algodón con Verticillium dahliae) hasta una disminución significativa (es decir, después de la infección del manzano con Alternaria spp.)56,57.Se ha observado una regulación a la baja significativa del gen 423 similar a MLP durante las defensas del aguacate frente a la infección por F. niger y durante la infección del manzano Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola y Alternaria alternata son patotipos de manzana58,59.Además, los callos de manzana que sobreexpresaban el gen 423 similar a MLP tenían una menor expresión de genes asociados con la resistencia y eran más susceptibles a la infección fúngica59.Después de Fusarium oxysporum f, el gen 423 similar a MLP también fue suprimido en el germoplasma de frijol común resistente.cn.Infección de frijol 60.
Otros miembros de la familia PR-10 identificados en nuestro estudio de RNA-seq fueron los genes LlR18A y LlR18B en respuesta a la regulación al alza, así como el gen regulado al alza (1 gen) o regulado a la baja (3 genes) para la proteína de transferencia de lípidos DIR1..Además, WGCNA destaca el gen LlR18B como centro de este módulo, que es muy susceptible a la vacunación y porta varios genes de respuesta protectora.Los genes LlR18A y LlR18B fueron inducidos en hojas amarillas de lupino en respuesta a bacterias patógenas, así como en tallos de NLL después de la inoculación de D. toxica, mientras que el homólogo de estos genes en arroz, RSOsPR10, fue inducido rápidamente por una infección fúngica presuntamente involucrada en la vía de señalización del ácido jasmónico53,61,62. El gen DIR1 codifica proteínas de transporte de lípidos no específicas que se requieren para el inicio de la resistencia sistémica adquirida ( RAE).Con el desarrollo de reacciones protectoras, la proteína DIR1 se transporta desde el foco de infección a través del floema para inducir SAR en órganos distantes.Curiosamente, el gen TanjilG_02313 DIR1 se indujo significativamente en el primer momento en las líneas 84A:476 y la Población 22660, pero la resistencia a la antracnosis se desarrolló con éxito solo en la línea 84A:476.Esto puede indicar cierta subfuncionalización del gen DIR1 en NLL, ya que los tres homólogos restantes respondieron a la inoculación solo en la línea 83A:476 a las 6 hpi, y esta respuesta se dirigió hacia abajo.
En nuestro estudio, los componentes más comunes correspondientes al proceso biológico denominado “GO:0055114 Redox process” fueron la proteína citocromo P450, la peroxidasa, el ácido linoleico 9S-/13S-lipoxigenasa y el ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico oxidasa.Además, nuestro WGCNA define el homólogo de HSFA4a como un concentrador que transporta módulos como el candidato del gen de resistencia Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a es un componente de la regulación dependiente de redox de la transcripción nuclear en las plantas.
Las proteínas del citocromo P450 son oxidorreductasas que catalizan reacciones de hidroxilación dependientes de NADPH y O2 en el metabolismo primario y secundario, incluido el metabolismo de xenobióticos, así como hormonas, ácidos grasos, esteroles, componentes de la pared celular, biopolímeros y la biosíntesis de compuestos protectores 69. debido a una gran cantidad de homólogos alterados (37) y diferencias en los patrones de respuesta entre genes específicos, lo que refleja una revisión al alza..Usar solo datos de RNA-seq para dilucidar la supuesta función biológica de los genes NLL en una superfamilia de proteínas tan grande sería altamente especulativo.Sin embargo, vale la pena señalar que algunos genes del citocromo P450 están asociados con una mayor resistencia a hongos o bacterias patógenos, incluida una contribución a las reacciones alérgicas69,70,71.
Las peroxidasas de clase III son enzimas vegetales multifuncionales involucradas en una amplia gama de procesos metabólicos durante el crecimiento y desarrollo de la planta, así como en respuesta a estrés ambiental como salinidad, sequía, alta intensidad de luz y ataque de patógenos72.Las peroxidasas están involucradas en la interacción de varias especies de plantas con Anthracis, incluyendo Stylosanthes humilis y C. gloeosporioides, Lens culinaris y C. truncatum, Phaseolus vulgaris y C. lindemuthianum, Cucumis sativus y C. lagenarium73,74,75,76.La respuesta es muy rápida, a veces incluso a 4 HPI, antes de que el hongo penetre en el tejido vegetal73.El gen de la peroxidasa también respondió a la inoculación de NLL con D. toxica.Además de sus funciones típicas para regular el estallido oxidativo o eliminar el estrés oxidativo, las peroxidasas pueden interferir con el crecimiento de patógenos mediante la creación de barreras físicas basadas en el refuerzo de la pared celular durante la lignificación, la subunidad o el entrecruzamiento de compuestos específicos.Esta función se puede atribuir in silico al gen TanjilG_03329 que codifica una supuesta anión peroxidasa formadora de lignina que se reguló significativamente en nuestro estudio en la línea resistente 83A:476 a 6 HPI, pero no en otras cepas y puntos de tiempo que no respondieron.
La 9S-/13S-lipoxigenasa del ácido linoleico es el primer paso en la ruta oxidativa de la biosíntesis de lípidos78.Los productos de esta vía tienen múltiples funciones en la defensa de las plantas, incluido el fortalecimiento de la pared celular a través de la formación de depósitos de calosa y pectina, y la regulación del estrés oxidativo a través de la producción de especies reactivas de oxígeno79,80,81,82,83.En el presente estudio, la expresión del ácido linoleico 9S-/13S-lipoxigenasa se vio alterada en todas las cepas, pero en la población susceptible 22660 prevaleció la sobrerregulación en diferentes momentos, mientras que en las cepas portadoras de Lanr1 resistente y el alelo AnMan, enfatiza la diversificación de la capa de oxilipina en las reacciones protectoras del ántrax entre estos genotipos.
El homólogo de 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACO) aumentó significativamente (9 genes) o disminuyó (2 genes) cuando se inoculó con lupino.Con dos excepciones, todas estas respuestas ocurrieron a las 6 hp.en 83A:476.La reacción enzimática mediada por proteínas ACO es el paso limitante de la velocidad en la producción de etileno y, por lo tanto, está altamente regulada84.El etileno es una hormona vegetal que desempeña una variedad de funciones en la regulación del desarrollo de las plantas y la respuesta a condiciones de estrés abiótico y biótico.La inducción de la transcripción de ACO y la activación de la vía de señalización del etileno están involucradas en el aumento de la resistencia del arroz al hongo hemibiotrófico oryzae oryzae mediante la regulación de la producción de especies reactivas de oxígeno y fitoalexinas.Un proceso de infección foliar muy similar encontrado entre M. oryzae y C. lupini88,89, en el contexto de una regulación al alza significativa de los homólogos de ACO en la línea 83A:476 informada en este estudio, cambia la posibilidad de conferir resistencia al etileno de antracnosis NLL como un paso central de señalización en las vías moleculares.
En el presente estudio, se observó la supresión a gran escala de muchos genes asociados con la fotosíntesis a las 6 hpi en 83A:476 ya las 48 hpi en Mandeloop y la población 22660.La extensión y progresión de estos cambios es proporcional al nivel.En este experimento se observó resistencia a la antracnosis.Recientemente, se ha informado una represión fuerte y temprana de las transcripciones relacionadas con la fotosíntesis en varios modelos de interacciones planta-patógeno, incluidas bacterias y hongos patógenos.La prisa (de 2 HPI en algunas interacciones) y la supresión global de genes asociados con la fotosíntesis en respuesta a la infección pueden desencadenar la inmunidad de la planta basada en el despliegue de especies reactivas de oxígeno y su interacción con la vía del ácido salicílico para mediar reacciones alérgicas 90,94.
En conclusión, los mecanismos de respuesta de defensa propuestos para el linaje más resistente (83A:476) incluyen el reconocimiento rápido de patógenos por el gen R (presumiblemente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) y la señalización de ácido salicílico y etileno mediada por la respuesta alérgica, seguida del establecimiento de SAR de largo alcance.la acción es apoyada por la proteína DIR-1.Cabe señalar que el período biotrófico para la infección por C. lupini es muy corto (aproximadamente 2 días), seguido de un crecimiento necrótico95.La transición entre estas etapas puede estar asociada con la necrosis y la expresión de proteínas inducibles por etileno que actúan como desencadenantes de reacciones de hipersensibilidad en las plantas huésped.Por lo tanto, la ventana de tiempo para la captura exitosa de C. lupini en la etapa biotrófica es muy estrecha.La reprogramación de genes asociados con la redox y la fotosíntesis observada en 83A:476 a las 6 hpi es consistente con la progresión de las hifas fúngicas y presagia el desarrollo de una respuesta protectora exitosa en la etapa biotrófica.Las respuestas transcriptómicas de Mandelup y la población 22660 pueden retrasarse demasiado para capturar el hongo antes de cambiar al crecimiento necrótico; sin embargo, Mandelup puede ser más efectivo que la población 22660 porque la regulación relativamente rápida de la proteína PR-10 promueve la resistencia horizontal.
La ETI, impulsada por el gen canónico R, parece ser un mecanismo común para la resistencia del frijol a la antracnosis.Así, en la leguminosa modelo Medicago truncatula, la resistencia a la antracnosis es conferida por el gen RCT1, un miembro de la clase de genes R de la planta TIR-NBS-LRR97.Este gen también confiere resistencia a la antracnosis de amplio espectro en la alfalfa cuando se transfiere a plantas susceptibles.En el frijol común (P. vulgaris), hasta la fecha se han identificado más de dos docenas de genes de resistencia a la antracnosis.Algunos de estos genes se encuentran en regiones que carecen de genes R canónicos, sin embargo, muchos otros están ubicados en los bordes de los cromosomas que llevan el grupo de genes NBS-LRR, incluido TIR-NBS-LRRs99.El estudio SSR del genoma completo también confirmó la asociación del gen NBS-LRR con la resistencia a la antracnosis en el frijol común.El gen canónico R también se encontró en la región genómica que porta el locus principal de resistencia a la antracnosis en el lupino blanco 101.
Nuestro trabajo muestra que una reacción de resistencia inmediata, activada en una etapa temprana de la infección de la planta (preferiblemente no más tarde de 12 hpi), protege eficazmente al lupino de hoja estrecha de la antracnosis causada por el hongo patógeno Collelotrichum lupini.Usando secuenciación de alto rendimiento, demostramos perfiles de expresión diferencial de genes de resistencia a la antracnosis en plantas NLL mediados por los genes de resistencia Lanr1 y AnMan.Una defensa exitosa implica diseñar cuidadosamente los genes de las proteínas involucradas en la redox, la fotosíntesis y la patogénesis a las pocas horas del primer contacto de la planta con un patógeno.Reacciones protectoras similares, pero retrasadas en el tiempo, son mucho menos efectivas para proteger a las plantas de enfermedades.La resistencia al ántrax mediada por el gen Lanr1 se asemeja a la típica respuesta rápida del gen R (inmunidad desencadenada por efectores), mientras que el gen AnMan probablemente proporciona una respuesta horizontal (inmunidad desencadenada por un patrón molecular asociado a microbios), proporcionando un nivel moderado de sostenibilidad.
Las 215 líneas de NLL utilizadas para detectar marcadores de antracnosis consistieron en 74 cultivares, 60 líneas obtenidas por cruzamiento o reproducción, 5 mutantes y 76 germoplasmas silvestres u originales.Las líneas procedían de 17 países, principalmente de Polonia (58), España (47), Alemania (27), Australia (26), Rusia (19), Bielorrusia (7), Italia (5) y otras líneas.de 10 países.El conjunto también incluye líneas resistentes de referencia: 83A:476, Tanjil, Wonga con el alelo Lanr1 y Mandelup con el alelo AnMan.Las líneas se obtuvieron de la base de datos europea de recursos genéticos de lupino mantenida por Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabla complementaria S1).
Las plantas se cultivaron en condiciones controladas (fotoperiodo 16 horas, temperatura 25°C durante el día y 18°C ​​por la noche).Se analizaron dos réplicas biológicas.El ADN se aisló de hojas de tres semanas utilizando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo.La calidad y concentración del ADN aislado se evaluó mediante métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).Se analizaron el marcador AnManM1 que marca el gen de resistencia a la antracnosis AnMan (derivado del cv. Mandelup) y los marcadores Anseq3 y Anseq4 que flanquean el gen Lanr1 (derivado del cv. Tanjil) 11,26,28.Los homocigotos para el alelo resistente se calificaron como "1", los susceptibles como "0" y los heterocigotos como 0,5.
En función de los resultados de la detección de los marcadores AnManM1, AnSeq3 y AnSeq4 y la disponibilidad de semillas para los experimentos finales de seguimiento, se seleccionaron 50 líneas NLL para el fenotipado de resistencia a la antracnosis.El análisis se realizó por duplicado en un invernadero controlado por computadora con un fotoperíodo de 14 horas con un rango de temperatura de 22°C durante el día y 19°C durante la noche.Las semillas se raspan (cortando la cubierta de la semilla en el lado opuesto del embrión con una cuchilla afilada) antes de sembrarlas para evitar la latencia de la semilla debido a que la cubierta de la semilla es demasiado dura y para asegurar una germinación uniforme.Las plantas se cultivaron en macetas (11 × 11 × 21 cm) con suelo estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovia, Polonia).La inoculación se llevó a cabo con la cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada en 1999 a partir de tallos de plantas de lupino de hoja estrecha cultivadas en un campo en Verzhenitsa, Gran Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Consigue un área.Los aislados se cultivaron en medio SNA a 20°C bajo luz negra durante 21 días para inducir la esporulación.Cuatro semanas después de la siembra, cuando las plantas habían alcanzado el estadio de 4-6 hojas, se procedió a la inoculación mediante aspersión con una suspensión de conidios a una concentración de 0,5 x 106 conidios por ml.Después de la inoculación, las plantas se mantuvieron en la oscuridad durante 24 horas a una humedad de alrededor del 98% y una temperatura de 25°C para facilitar la germinación de los conidios y el proceso de infección.A continuación, las plantas se cultivaron bajo un fotoperíodo de 14 horas a 22 °C día/19 °C noche y 70 % de humedad.El puntaje de la enfermedad se realizó 22 días después de la inoculación y varió de 0 (inmune) a 9 (muy susceptible) dependiendo de la presencia o ausencia de lesiones necróticas en tallos y hojas.Además, después de la puntuación, se midió el peso de las plantas.Las relaciones entre los genotipos marcadores y los fenotipos de la enfermedad se calcularon como correlaciones puntuales de dos secuencias (ausencia de marcadores heterocigóticos en el conjunto de líneas para el análisis del fenotipo de resistencia a la antracnosis).