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Existe la necesidad de un sistema in vitro confiable que pueda reproducir con precisión el entorno fisiológico del corazón para el análisis de fármacos. La disponibilidad limitada de sistemas de cultivo de tejido cardíaco humano ha dado lugar a interpretaciones inexactas de los efectos de los fármacos cardíacos. En este estudio, hemos desarrollado un modelo de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) que estimula electromecánicamente cortes de corazón y experimenta estiramiento fisiológico durante las fases sistólica y diastólica del ciclo cardíaco. Tras 12 días de cultivo, este enfoque mejoró parcialmente la viabilidad de los cortes de corazón, pero no conservó por completo su integridad estructural. Por lo tanto, tras el cribado de moléculas pequeñas, observamos que la adición de 100 nM de triyodotironina (T3) y 1 μM de dexametasona (Dex) a nuestro medio mantuvo la microestructura de los cortes durante 12 días. En combinación con el tratamiento con T3/Dex, el sistema CTCM mantuvo los perfiles transcripcionales, la viabilidad, la actividad metabólica y la integridad estructural al mismo nivel que el tejido cardíaco fresco durante 12 días. Además, el estiramiento excesivo del tejido cardíaco en cultivo induce una señalización cardíaca hipertrófica, lo que demuestra la capacidad del CTCM para imitar las condiciones hipertróficas inducidas por el estiramiento cardíaco. En conclusión, el CTCM puede modelar la fisiología y la fisiopatología del corazón en cultivo durante largos periodos, lo que permite una detección fiable de fármacos.
Previo a la investigación clínica, se necesitan sistemas in vitro confiables que reproduzcan con precisión el entorno fisiológico del corazón humano. Dichos sistemas deben simular alteraciones en la distensión mecánica, la frecuencia cardíaca y las propiedades electrofisiológicas. Los modelos animales se utilizan comúnmente como plataforma de cribado para la fisiología cardíaca, con una fiabilidad limitada a la hora de reflejar los efectos de los fármacos en el corazón humano1,2. En definitiva, el Modelo Experimental de Cultivo de Tejido Cardíaco Ideal (CTCM) es un modelo altamente sensible y específico para diversas intervenciones terapéuticas y farmacológicas, que reproduce con precisión la fisiología y la fisiopatología del corazón humano3. La ausencia de un sistema de este tipo limita el descubrimiento de nuevos tratamientos para la insuficiencia cardíaca4,5 y ha llevado a que la cardiotoxicidad de los fármacos sea una de las principales razones de la retirada del mercado6.
Durante la última década, ocho fármacos no cardiovasculares se han retirado del uso clínico debido a que causan prolongación del intervalo QT, lo que conduce a arritmias ventriculares y muerte súbita7. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de estrategias de cribado preclínico confiables para evaluar la eficacia y la toxicidad cardiovascular. El uso reciente de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS-CM) en el cribado de fármacos y las pruebas de toxicidad proporciona una solución parcial a este problema. Sin embargo, la naturaleza inmadura de los hiPS-CM y la falta de complejidad multicelular del tejido cardíaco son limitaciones importantes de este método. Estudios recientes han demostrado que esta limitación puede superarse en parte mediante el uso temprano de hiPS-CM para formar hidrogeles de tejido cardíaco poco después del inicio de las contracciones espontáneas y el aumento gradual de la estimulación eléctrica con el tiempo. Sin embargo, estos microtejidos de hiPS-CM carecen de las propiedades electrofisiológicas y contráctiles maduras del miocardio adulto. Además, el tejido cardíaco humano presenta una estructura más compleja, compuesta por una mezcla heterogénea de diferentes tipos celulares, incluyendo células endoteliales, neuronas y fibroblastos estromales, interconectados por conjuntos específicos de proteínas de la matriz extracelular. Esta heterogeneidad de las poblaciones de no cardiomiocitos11,12,13 en el corazón de mamíferos adultos constituye una importante barrera para el modelado de tejido cardíaco utilizando tipos celulares individuales. Estas importantes limitaciones subrayan la importancia de desarrollar métodos para el cultivo de tejido miocárdico intacto en condiciones fisiológicas y patológicas.
Las secciones delgadas cultivadas (300 µm) del corazón humano han demostrado ser un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Este método proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo similar al tejido cardíaco humano. Sin embargo, hasta 2019, el uso de secciones de corazón cultivadas estaba limitado por la corta supervivencia del cultivo (24 h). Esto se debe a una serie de factores que incluyen la falta de estiramiento físico-mecánico, la interfaz aire-líquido y el uso de medios simples que no satisfacen las necesidades del tejido cardíaco. En 2019, varios grupos de investigación demostraron que la incorporación de factores mecánicos en los sistemas de cultivo de tejido cardíaco puede extender la vida del cultivo, mejorar la expresión cardíaca e imitar la patología cardíaca. Dos estudios elegantes 17 y 18 muestran que la carga mecánica uniaxial tiene un efecto positivo en el fenotipo cardíaco durante el cultivo. Sin embargo, estos estudios no utilizaron la carga físico-mecánica tridimensional dinámica del ciclo cardíaco, ya que las secciones del corazón se cargaron con fuerzas de tensión isométricas 17 o carga auxotónica lineal 18. Estos métodos de estiramiento tisular resultaron en la supresión de numerosos genes cardíacos o en la sobreexpresión de genes asociados con respuestas anormales al estiramiento. Cabe destacar que Pitoulis et al. 19 desarrollaron un baño de cultivo dinámico de cortes cardíacos para la reconstrucción del ciclo cardíaco mediante retroalimentación con transductores de fuerza y ​​unidades de tensión. Si bien este sistema permite un modelado in vitro más preciso del ciclo cardíaco, su complejidad y bajo rendimiento limitan su aplicación. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un sistema de cultivo simplificado mediante estimulación eléctrica y un medio optimizado para mantener la viabilidad de secciones de tejido cardíaco porcino y humano hasta por 6 días 20,21.
En el presente manuscrito, describimos un modelo de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) que utiliza secciones de corazón porcino e incorpora señales humorales para recapitular la fisiología cardíaca tridimensional y la distensión fisiopatológica durante el ciclo cardíaco. Este CTCM puede aumentar la precisión de la predicción preclínica de fármacos a un nivel nunca antes alcanzado, proporcionando un sistema cardíaco rentable y de rendimiento medio que imita la fisiología/fisiopatología del corazón de mamíferos para las pruebas preclínicas de fármacos.
Las señales mecánicas hemodinámicas desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la función cardiomiocítica in vitro 22,23,24. En este manuscrito, desarrollamos un CTCM (Figura 1a) que simula el entorno cardíaco adulto mediante la inducción de estimulación eléctrica y mecánica a frecuencias fisiológicas (1,2 Hz, 72 latidos por minuto). Para evitar un estiramiento excesivo del tejido durante la diástole, se utilizó un dispositivo de impresión 3D para aumentar su tamaño en un 25 % (Fig. 1b). La estimulación eléctrica inducida por el sistema C-PACE se programó para que comenzara 100 ms antes de la sístole mediante un sistema de adquisición de datos para reproducir completamente el ciclo cardíaco. El sistema de cultivo tisular utiliza un actuador neumático programable (LB Engineering, Alemania) para expandir cíclicamente una membrana flexible de silicona y provocar la expansión de los cortes cardíacos en la cámara superior. El sistema se conectó a una línea de aire externa mediante un transductor de presión, lo que permitió ajustar con precisión la presión (± 1 mmHg) y el tiempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Conecte la sección de tejido al anillo de soporte de 7 mm, que se muestra en azul, dentro de la cámara de cultivo del dispositivo. La cámara de cultivo está separada de la cámara de aire por una membrana delgada y flexible de silicona. Coloque una junta entre cada cámara para evitar fugas. La tapa del dispositivo contiene electrodos de grafito que proporcionan estimulación eléctrica. b Representación esquemática del dispositivo de tejido grande, el anillo guía y el anillo de soporte. Las secciones de tejido (marrón) se colocan en el dispositivo sobredimensionado con el anillo guía colocado en la ranura en el borde exterior del dispositivo. Usando la guía, coloque cuidadosamente el anillo de soporte recubierto con adhesivo acrílico tisular sobre la sección de tejido cardíaco. c Gráfico que muestra el tiempo de estimulación eléctrica como una función de la presión de la cámara de aire controlada por un actuador neumático programable (PPD). Se utilizó un dispositivo de adquisición de datos para sincronizar la estimulación eléctrica usando sensores de presión. Cuando la presión en la cámara de cultivo alcanza el umbral establecido, se envía una señal de pulso al C-PACE-EM para activar la estimulación eléctrica. d Imagen de cuatro CTCM colocados en un estante de incubadora. Cuatro dispositivos se conectan a un PPD mediante un circuito neumático, y se insertan sensores de presión en la válvula hemostática para monitorizar la presión en dicho circuito. Cada dispositivo contiene seis secciones de tejido.
Utilizando un único actuador neumático, pudimos controlar cuatro dispositivos CTCM, cada uno con capacidad para seis secciones de tejido (Fig. 1d). En el CTCM, la presión del aire en la cámara de aire se convierte en presión sincrónica en la cámara de fluido e induce la expansión fisiológica del corte cardíaco (Figura 2a y Película suplementaria 1). La evaluación del estiramiento tisular a 80 mmHg. Art. mostró un estiramiento del 25% en las secciones de tejido (Fig. 2b). Se ha demostrado que este porcentaje de estiramiento corresponde a una longitud fisiológica del sarcómero de 2,2-2,3 µm para la contractilidad normal de la sección cardíaca17,19,25. El movimiento tisular se evaluó utilizando ajustes personalizados de la cámara (Figura suplementaria 1). La amplitud y la velocidad del movimiento tisular (Figs. 2c, d) correspondieron al estiramiento durante el ciclo cardíaco y al tiempo durante la sístole y la diástole (Fig. 2b). El estiramiento y la velocidad del tejido cardíaco durante la contracción y la relajación se mantuvieron constantes durante 12 días en cultivo (Fig. 2f). Para evaluar el efecto de la estimulación eléctrica sobre la contractilidad durante el cultivo, desarrollamos un método para determinar la deformidad activa mediante un algoritmo de sombreado (Figs. 2a y 2b del Suplemento). Se logró distinguir entre deformidades con y sin estimulación eléctrica. La misma sección del corazón (Fig. 2f). En la región móvil del corte (R6-9), el voltaje durante la estimulación eléctrica fue un 20 % mayor que en ausencia de ella, lo que indica la contribución de la estimulación eléctrica a la función contráctil.
Los rastros representativos de las mediciones de presión de la cámara de aire, presión de la cámara de fluido y movimiento del tejido confirman que la presión de la cámara cambia la presión de la cámara de fluido, lo que causa un movimiento correspondiente del corte de tejido. b Rastros representativos del porcentaje de estiramiento (azul) de secciones de tejido correspondientes al porcentaje de estiramiento (naranja). c El movimiento medido del corte cardíaco es consistente con la velocidad de movimiento medida. (d) Trayectorias representativas del movimiento cíclico (línea azul) y velocidad (línea punteada naranja) en un corte del corazón. e Cuantificación del tiempo de ciclo (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), tiempo de contracción (n = 19 cortes por grupo), tiempo de relajación (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), movimiento del tejido (n = 25 cortes)/grupo de diferentes cerdos), velocidad sistólica máxima (n = 24(D0), 25(D12) cortes/grupo de diferentes cerdos) y tasa de relajación máxima (n = 24(D0), 25(D12) cortes/grupo de diferentes cerdos). La prueba t de Student bilateral no mostró diferencias significativas en ningún parámetro. f Trazas representativas del análisis de deformación de secciones de tejido con (rojo) y sin (azul) estimulación eléctrica, diez áreas regionales de secciones de tejido de la misma sección. Los paneles inferiores muestran la cuantificación de la diferencia porcentual de deformación en secciones de tejido con y sin estimulación eléctrica en diez áreas de diferentes secciones. (n = 8 rebanadas/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rebanadas/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba t de Student de dos colas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 secciones/grupo, de diferentes cerdos, prueba t de Student de dos colas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
En nuestro sistema de cultivo biomimético estático de cortes de corazón [20, 21], mantuvimos la viabilidad, función e integridad estructural de los cortes de corazón durante 6 días mediante la aplicación de estimulación eléctrica y la optimización de la composición del medio. Sin embargo, después de 10 días, estas cifras cayeron drásticamente. Nos referiremos a las secciones cultivadas en nuestro sistema de cultivo biomimético estático anterior 20, 21 condiciones de control (Ctrl) y utilizaremos nuestro medio previamente optimizado como condiciones MC y cultivo bajo estimulación mecánica y eléctrica simultánea (CTCM). llamado . En primer lugar, determinamos que la estimulación mecánica sin estimulación eléctrica fue insuficiente para mantener la viabilidad del tejido durante 6 días (Fig. 3a,b suplementaria). Curiosamente, con la introducción de la estimulación fisiomecánica y eléctrica utilizando STCM, la viabilidad de las secciones de corazón de 12 días se mantuvo igual que en las secciones de corazón frescas en condiciones MS, pero no en condiciones Ctrl, como lo muestra el análisis MTT (Fig. 1). 3a). Esto sugiere que la estimulación mecánica y la simulación del ciclo cardíaco pueden mantener las secciones de tejido viables durante el doble de tiempo que lo informado en nuestro sistema de cultivo estático anterior. Sin embargo, la evaluación de la integridad estructural de las secciones de tejido mediante inmunomarcaje de la troponina T cardíaca y la conexina 43 mostró que la expresión de la conexina 43 fue significativamente mayor en los tejidos MC el día 12 que en los controles el mismo día. Sin embargo, la expresión uniforme de la conexina 43 y la formación del disco Z no se mantuvieron completamente (Fig. 3b). Utilizamos un marco de inteligencia artificial (IA) para cuantificar la integridad estructural del tejido26, una canalización de aprendizaje profundo basada en imágenes basada en la tinción de troponina-T y conexina43 para cuantificar automáticamente la integridad estructural y la fluorescencia de los cortes cardíacos en términos de fuerza de localización. Este método utiliza una red neuronal convolucional (CNN) y un marco de aprendizaje profundo para cuantificar de forma fiable la integridad estructural del tejido cardíaco de forma automatizada e imparcial, como se describe en la referencia 26. El tejido MC mostró una similitud estructural mejorada con respecto al día 0 en comparación con las secciones de control estáticas. Además, la tinción tricrómica de Masson reveló un porcentaje significativamente menor de fibrosis en condiciones de MS en comparación con las condiciones control al día 12 de cultivo (Fig. 3c). Si bien la CTCM aumentó la viabilidad de las secciones de tejido cardíaco al día 12 a un nivel similar al del tejido cardíaco fresco, no mejoró significativamente la integridad estructural de las secciones.
Un gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad de MTT de cortes de corazón frescos (D0) o de cultivos de cortes de corazón durante 12 días, ya sea en cultivo estático (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). Un gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad de MTT de cortes de corazón frescos (D0) o de cultivos de cortes de corazón durante 12 días, ya sea en cultivo estático (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl).el histograma muestra la cuantificación de la viabilidad de secciones de corazón fresco MTT (D0) o cultivo de secciones de corazón durante 12 días en cultivo estático (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12). ) ), 12 (D12 MC) secciones/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA de una vía;####p < 0,0001 para escribir con D0 y **p < 0,01 para escribir con D12 Ctrl). ####p < 0,0001 comparado con D0 y **p < 0,01 comparado con D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 (D12 MC) 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比，####p < 0.0001, o D12 Ctrl (**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histograma que muestra la cuantificación de la viabilidad del MTT en secciones de corazón fresco (D0) o secciones de corazón cultivadas durante 12 días en cultivo estático (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA de una vía;####p < 0,0001 para escribir con D0, **p < 0,01 para escribir con D12 Ctrl). ####p < 0,0001 comparado con D0, **p < 0,01 comparado con D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (roja) y DAPI (azul) en secciones de corazón recién aisladas (D0) o secciones de corazón cultivadas en condiciones estáticas (Ctrl) o condiciones CTCM (MC) durante 12 días) de imágenes de inmunofluorescencia representativas (escala en blanco = 100 µm). Cuantificación mediante inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada uno de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Cuantificación mediante inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo de cada uno de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/group от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 para escribir con D0 y ****p < 0,0001 para escribir con D12 Ctrl). Cuantificación de la integridad estructural del tejido cardíaco mediante inteligencia artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secciones/grupos de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; ####p < 0,0001 frente a D0 y ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo cada una de cerdo diferente, prueba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo de cada uno de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тесте ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Inteligencia artificial para cuantificar la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secciones/grupo de cada uno de diferentes cerdos, prueba ANOVA de una vía; ####p<0,0001 frente a .D0. Para comparación ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de cortes de corazón teñidos con el colorante tricrómico de Masson (Escala desnuda = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo cada uno de diferente cerdo, se realiza una prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de cortes de corazón teñidos con el colorante tricrómico de Masson (Escala desnuda = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo de cada uno de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA de una vía; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) окрашенных оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/group от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 y ***p < 0,001 по presione D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de secciones de corazón teñidas con el colorante tricrómico de Masson (escala sin recubrimiento = 500 µm) (n = 10 secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA de una vía realizada; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/gruppa, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного análisis de dispersión ;### #p < 0,0001 para escribir con D0, ***p < 0,001 para escribir con D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de secciones de corazón teñidas con tinción tricrómica de Masson (blanco = 500 µm) (n = 10 secciones/grupo, cada una de un cerdo diferente, probado mediante análisis de varianza de una vía; ### # p < 0,0001 comparado con D0, ***p < 0,001 comparado con D12 Ctrl).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
Planteamos la hipótesis de que, añadiendo pequeñas moléculas al medio de cultivo, se podría mejorar la integridad de los cardiomiocitos y reducir el desarrollo de fibrosis durante el cultivo de CTCM. Por lo tanto, realizamos un cribado de pequeñas moléculas utilizando nuestros cultivos de control estático20,21 debido al escaso número de factores de confusión. Para este cribado se seleccionaron dexametasona (Dex), triyodotironina (T3) y SB431542 (SB). Estas pequeñas moléculas se han utilizado previamente en cultivos de hiPSC-CM para inducir la maduración de los cardiomiocitos mediante el aumento de la longitud del sarcómero, los túbulos T y la velocidad de conducción. Además, se sabe que tanto Dex (un glucocorticoide) como SB suprimen la inflamación29,30. Por lo tanto, evaluamos si la inclusión de una o una combinación de estas pequeñas moléculas mejoraría la integridad estructural de las secciones cardíacas. Para la evaluación inicial, la dosis de cada compuesto se seleccionó con base en las concentraciones comúnmente utilizadas en modelos de cultivo celular (1 μM de Dex27, 100 nM de T327 y 2,5 μM de SB31). Tras 12 días de cultivo, la combinación de T3 y Dex resultó en una integridad estructural óptima de los cardiomiocitos y una remodelación fibrosa mínima (Figuras Suplementarias 4 y 5). Además, el uso de concentraciones dobles de T3 y Dex produjo efectos perjudiciales en comparación con las concentraciones normales (Figuras Suplementarias 6a,b).
Después de la selección inicial, realizamos una comparación directa de 4 condiciones de cultivo (Figura 4a): Ctrl: secciones de corazón cultivadas en nuestro cultivo estático descrito previamente utilizando nuestro medio optimizado; 20.21 TD: T3 y Ctrl s Dex añadido el miércoles; MC: secciones de corazón cultivadas en CTCM utilizando nuestro medio previamente optimizado; y MT: CTCM con T3 y Dex añadidos al medio. Después de 12 días de cultivo, la viabilidad de los tejidos MS y MT permaneció igual que en los tejidos frescos evaluados por el ensayo MTT (Fig. 4b). Curiosamente, la adición de T3 y Dex a los cultivos transwell (TD) no resultó en una mejora significativa de la viabilidad en comparación con las condiciones Ctrl, lo que indica un papel importante de la estimulación mecánica en el mantenimiento de la viabilidad de las secciones de corazón.
Diagrama de diseño experimental que representa las cuatro condiciones de cultivo utilizadas para evaluar los efectos de la estimulación mecánica y la suplementación con T3/Dex en el medio durante 12 días. b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 ctrl). b El sistema operativo está disponible durante 12 días después de 4 usos. культивирования (control, TD, MC y MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, prueba de diseño ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 para escribir con D0 y **p < 0,01 para escribir con D12 Ctrl). b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad a los 12 días posteriores al cultivo en las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 frente a D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Sistema, posición entre 4 ciclos de cultivo (control, TD, MC y MT) después de la selección de servidores (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/grouppa, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 en el control D0, **p <0,01 en el control D12). b Histograma que muestra las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), de diferentes cerdos 12 (D12 MC) secciones/grupo, prueba ANOVA de una vía; ####p<0,0001, ###p<0,001 frente a D0, **p<0,01 frente a control D12). El gráfico de barras c muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón frescos (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). El gráfico de barras c muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón frescos (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (control, TD, MC y MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/group от разных свиней, односторонний Prueba de ANOVA; ###p < 0,001 para escribir con D0 y ***p < 0,001 para escribir con D12 Ctrl). c El histograma muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón frescas (D0) (n = 6 secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; ###p < 0,001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (control, TD, MC y MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/group, от разных свиней, односторонний Были pruebas anteriores ANOVA; ###p < 0,001 para la escritura con D0, ***p < 0,001 para la escritura con D12 (contraste). c Histograma que muestra la cuantificación del flujo de glucosa a los 12 días posteriores al cultivo para las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 6 secciones/grupo, de diferentes cerdos, unilateral). Se realizaron pruebas ANOVA, ###p < 0,001 en comparación con D0, ***p < 0,001 en comparación con D12 (control).d Gráficos de análisis de cepas de tejido fresco (azul), tejido MC del día 12 (verde) y tejido MT del día 12 (rojo) en diez puntos de cortes regionales (n = 4 cortes/grupo, prueba ANOVA unidireccional; no hubo diferencia significativa entre los grupos). e Gráfico de volcán que muestra genes expresados ​​diferencialmente en cortes de corazón frescos (D0) en comparación con cortes de corazón cultivados en condiciones estáticas (Ctrl) o en condiciones MT (MT) durante 10-12 días. f Mapa de calor de genes del sarcómero para cortes de corazón cultivados en cada una de las condiciones de cultivo. Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
La dependencia metabólica del cambio de la oxidación de ácidos grasos a la glucólisis es un sello distintivo de la desdiferenciación de los cardiomiocitos. Los cardiomiocitos inmaduros utilizan principalmente glucosa para la producción de ATP y presentan mitocondrias hipoplásicas con pocas crestas5,32. Los análisis de utilización de glucosa mostraron que, en condiciones de MC y MT, la utilización de glucosa fue similar a la de los tejidos del día 0 (Figura 4c). Sin embargo, las muestras Ctrl mostraron un aumento significativo en la utilización de glucosa en comparación con el tejido fresco. Esto indica que la combinación de CTCM y T3/Dex mejora la viabilidad tisular y preserva el fenotipo metabólico de secciones de corazón cultivadas durante 12 días. Además, el análisis de deformación mostró que los niveles de deformación se mantuvieron iguales que en el tejido cardíaco fresco durante 12 días en condiciones de MT y MS (Fig. 4d).
Para analizar el impacto global de CTCM y T3/Dex en el panorama transcripcional global del tejido de cortes cardíacos, realizamos RNAseq en cortes cardíacos de las cuatro condiciones de cultivo diferentes (Datos suplementarios 1). Curiosamente, las secciones MT mostraron una alta similitud transcripcional con el tejido cardíaco fresco, con solo 16 genes expresados ​​diferencialmente de 13.642. Sin embargo, como mostramos anteriormente, los cortes Ctrl mostraron 1229 genes expresados ​​diferencialmente después de 10-12 días en cultivo (Fig. 4e). Estos datos se confirmaron mediante qRT-PCR de genes cardíacos y de fibroblastos (Fig. suplementaria 7a-c). Curiosamente, las secciones Ctrl mostraron una regulación negativa de los genes cardíacos y del ciclo celular, y la activación de programas génicos inflamatorios. Estos datos sugieren que la desdiferenciación, que normalmente ocurre después de un cultivo a largo plazo, se atenúa completamente en condiciones MT (Fig. suplementaria 8a,b). Un estudio minucioso de los genes del sarcómero mostró que solo en condiciones de MT se conservan los genes que codifican el sarcómero (Fig. 4f) y el canal iónico (Fig. Suplementaria 9), lo que los protege de la supresión en condiciones de Ctrl, TD y MC. Estos datos demuestran que, con una combinación de estimulación mecánica y humoral (T3/Dex), el transcriptoma de los cortes de corazón puede permanecer similar al de los cortes de corazón frescos después de 12 días de cultivo.
Estos hallazgos transcripcionales se sustentan en que la integridad estructural de los cardiomiocitos en secciones cardíacas se conserva mejor en condiciones de MT durante 12 días, como lo demuestra la conexina 43 intacta y localizada (Fig. 5a). Además, la fibrosis en secciones cardíacas en condiciones de MT se redujo significativamente en comparación con Ctrl y de forma similar a la de secciones cardíacas frescas (Fig. 5b). Estos datos demuestran que la combinación de estimulación mecánica y tratamiento con T3/Dex preserva eficazmente la estructura cardíaca en secciones cardíacas en cultivo.
a Imágenes representativas de inmunofluorescencia de troponina-T (verde), conexina 43 (roja) y DAPI (azul) en secciones de corazón recién aisladas (D0) o cultivadas durante 12 días en las cuatro condiciones de cultivo de secciones de corazón (barra de escala = 100 µm). ). Cuantificación mediante inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Cuantificación mediante inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 para escribir con D0 y *p < 0,05 o ****p < 0,0001 para escribir con D12 Ctrl). Cuantificación de la integridad estructural del tejido cardíaco mediante inteligencia artificial (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05 o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 o D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 (d0 y d12 ctrl) （5 (d12 td, d12 mc y d12 mt) 组) 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）。Cuantificación de la integridad estructural del tejido cardíaco mediante inteligencia artificial en diferentes cerdos (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) secciones/grupo) con una prueba ANOVA de una vía;#### p < 0,0001 para escribir con D0 y *p < 0,05 o ****p < 0,0001 para escribir con D12 Ctrl). #### p < 0,0001 comparado con D0 y *p < 0,05 o ****p < 0,0001 comparado con D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de cortes de corazón teñidos con el colorante tricrómico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de cortes de corazón teñidos con el colorante tricrómico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения and количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем МасSONA (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 por сравнению с D0 y ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de secciones de corazón teñidas con el colorante tricrómico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) secciones/grupo de diferentes cerdos, se realizó ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 frente a D0 y ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 frente a D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl, d12 td y d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 与D0相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 en la tecla D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 en la tecla D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de secciones de corazón teñidas con tricrómico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) secciones de diferentes cerdos/grupo, un método ANOVA; ####p < 0,0001 comparado con D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 comparado con D12 Ctrl).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
Finalmente, se evaluó la capacidad de CTCM para imitar la hipertrofia cardíaca aumentando el estiramiento del tejido cardíaco. En CTCM, la presión máxima de la cámara de aire aumentó de 80 mmHg a 80 mmHg. Art. (estiramiento normal) hasta 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Esto corresponde a un aumento del 32% en el estiramiento (Fig. 6b), que se mostró previamente como el porcentaje de estiramiento correspondiente requerido para que las secciones del corazón alcancen una longitud del sarcómero similar a la observada en la hipertrofia. El estiramiento y la velocidad del tejido cardíaco durante la contracción y la relajación se mantuvieron constantes durante seis días de cultivo (Fig. 6c). El tejido cardíaco de condiciones MT se sometió a condiciones de estiramiento normal (MT (Normal)) o sobreestiramiento (MT (OS)) durante seis días. Ya después de cuatro días en cultivo, el biomarcador hipertrófico NT-ProBNP se elevó significativamente en el medio en condiciones MT (OS) en comparación con las condiciones MT (normales) (Fig. 7a). Además, tras seis días de cultivo, el tamaño celular en MT (OS) (Fig. 7b) aumentó significativamente en comparación con secciones de corazón MT (normal). Asimismo, la translocación nuclear de NFATC4 aumentó significativamente en tejidos sobreestirados (Fig. 7c). Estos resultados muestran el desarrollo progresivo de la remodelación patológica tras la hiperdistensión y respaldan la idea de que el dispositivo CTCM puede utilizarse como plataforma para estudiar la señalización de la hipertrofia cardíaca inducida por el estiramiento.
Los rastros representativos de las mediciones de presión de la cámara de aire, presión de la cámara de fluido y movimiento del tejido confirman que la presión de la cámara cambia la presión de la cámara de fluido, lo que causa un movimiento correspondiente del corte de tejido. b Curvas representativas de porcentaje de estiramiento y tasa de estiramiento para secciones de tejido normalmente estiradas (naranja) y sobreestiradas (azul). c Gráfico de barras que muestra el tiempo del ciclo (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), tiempo de contracción (n = 18-19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), tiempo de relajación (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos) ), amplitud del movimiento del tejido (n = 14 cortes/grupo, de diferentes cerdos), velocidad sistólica máxima (n = 14 cortes/grupo, de diferentes cerdos) y tasa de relajación máxima (n = 14 (D0), 15 (D6) ) secciones/grupos) de diferentes cerdos), la prueba t de Student de dos colas no mostró diferencias significativas en ningún parámetro, lo que indica que estos parámetros permanecieron constantes durante 6 días de cultivo con sobrevoltaje. Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
a Cuantificación en gráfico de barras de la concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal (Norm) o sobreestiramiento (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos. Se realiza un ANOVA de dos vías; **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal). a Cuantificación en gráfico de barras de la concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal (Norm) o sobreestiramiento (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza ANOVA de dos vías; **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal).Histograma cuantitativo de la concentración de NT-ProBNP en medio de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal de MT (norma) o sobreestiramiento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4).MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza un análisis de varianza de dos factores;**p < 0,01 según la configuración normal). **p < 0,01 comparado con el estiramiento normal). a 在MT 正常拉伸(Norma) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm y D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0,01）。 a Cuantificación de la concentración de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal (Norm) o sobreestiramiento (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4 MTOS) de diferentes 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **en comparación con el estiramiento normal, p < 0,01).Cuantificación de las concentraciones de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal de MT (norma) o sobreestiramiento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, análisis de varianza de dos vías;**p < 0,01 según la configuración normal). **p < 0,01 comparado con el estiramiento normal). b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con troponina T y WGA (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de distintos cerdos, se realiza una prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con el estiramiento normal). b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con troponina T y WGA (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de distintos cerdos, se realiza una prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con el estiramiento normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т and АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imágenes representativas de secciones del corazón teñidas con troponina T y AZP (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 secciones diferentes de distintos cerdos, se realizó una prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con la cepa normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con calcareína-T y WGA (izquierda) y tamaño de célula (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 cortes diferentes (D6 MTNorm)) Células/组，Prueba t de estiramiento en China; en comparación con el estiramiento normal, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т and АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) y 10 caracteres diferentes de dispositivos/grupos pequeños, criterios de configuración de fábrica; ****p < 0,0001 según lo normal rastrillaje). b Imágenes representativas de secciones del corazón teñidas con troponina-T y AZP (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 secciones diferentes de distintos cerdos) Células/grupo, criterio t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con la cepa normal). c Imágenes representativas de cortes de corazón con MTOS del día 0 y del día 6 inmunomarcados para troponina T y NFATC4 y cuantificación de la translocación de NFATC4 a los núcleos de los CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba t de Student de dos colas; *p < 0,05). c Imágenes representativas de cortes de corazón con MTOS del día 0 y del día 6 inmunomarcados para troponina T y NFATC4 y cuantificación de la translocación de NFATC4 a los núcleos de los CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba t de Student de dos colas; *p < 0,05). c Representación isométrica de las secuencias 0 y 6 de MTOS, inmunidad de la troponina-T y NFATC4 y colectividades оценка транслокации NFATC4 en ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imágenes representativas de secciones de corazón a los 0 y 6 días MTOS, inmunomarcadas para troponina T y NFATC4, y cuantificación de la translocación de NFATC4 en el núcleo de células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos) realizadas mediante prueba t de Student de dos colas; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Imágenes representativas de inmunomarcaje de calcanina-T y NFATC4 con cortes de corazón de 0,6 MTOS y NFATC4 de diferentes cantidades de núcleos de células CM de NFATC4 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) /,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Representación isométrica de los valores MTOS en 0 y 6 días para el sistema inmunológico-T y NFATC4 y otras funciones translocaciones NFATC4 en ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imágenes representativas de cortes de corazón MTOS en el día 0 y 6 para el inmunomarcaje de troponina T y NFATC4 y la cuantificación de la translocación de NFATC4 en el núcleo de CM de diferentes cerdos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo, criterio t de Student de dos colas; *p < 0,05).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
La investigación cardiovascular traslacional requiere modelos celulares que reproduzcan con precisión el entorno cardíaco. En este estudio, se desarrolló y caracterizó un dispositivo CTCM capaz de estimular secciones ultrafinas del corazón. El sistema CTCM incluye estimulación electromecánica fisiológicamente sincronizada y enriquecimiento con fluidos T3 y Dex. Al exponer secciones de corazón porcino a estos factores, su viabilidad, integridad estructural, actividad metabólica y expresión transcripcional se mantuvieron iguales a las del tejido cardíaco fresco tras 12 días de cultivo. Además, el estiramiento excesivo del tejido cardíaco puede causar hipertrofia cardíaca por hiperextensión. En general, estos resultados respaldan la importancia crucial de las condiciones fisiológicas de cultivo para mantener un fenotipo cardíaco normal y proporcionan una plataforma para el cribado de fármacos.
Numerosos factores contribuyen a la creación de un entorno óptimo para el funcionamiento y la supervivencia de los cardiomiocitos. Los más evidentes se relacionan con (1) las interacciones intercelulares, (2) la estimulación electromecánica, (3) los factores humorales y (4) los sustratos metabólicos. Las interacciones fisiológicas intercelulares requieren redes tridimensionales complejas de múltiples tipos celulares soportadas por una matriz extracelular. Estas complejas interacciones celulares son difíciles de reconstruir in vitro mediante cocultivo de tipos celulares individuales, pero pueden lograrse fácilmente utilizando la naturaleza organotípica de las secciones cardíacas.
El estiramiento mecánico y la estimulación eléctrica de los cardiomiocitos son fundamentales para mantener el fenotipo cardíaco33,34,35. Si bien la estimulación mecánica se ha utilizado ampliamente para el acondicionamiento y la maduración de hiPSC-CM, varios estudios de alta calidad han intentado recientemente la estimulación mecánica de cortes cardíacos en cultivo mediante carga uniaxial. Estos estudios demuestran que la carga mecánica uniaxial 2D tiene un efecto positivo en el fenotipo cardíaco durante el cultivo. En estos estudios, las secciones del corazón se cargaron con fuerzas de tensión isométricas17, carga auxotónica lineal18 o se recreó el ciclo cardíaco mediante retroalimentación con transductores de fuerza y ​​unidades de tensión. Sin embargo, estos métodos utilizan estiramiento tisular uniaxial sin optimización ambiental, lo que resulta en la supresión de muchos genes cardíacos o la sobreexpresión de genes asociados con respuestas anormales al estiramiento. El CTCM descrito aquí proporciona un estímulo electromecánico 3D que imita el ciclo cardíaco natural en términos de tiempo de ciclo y estiramiento fisiológico (25 % de estiramiento, 40 % de sístole, 60 % de diástole y 72 latidos por minuto). Aunque esta estimulación mecánica tridimensional por sí sola no es suficiente para mantener la integridad del tejido, se requiere una combinación de estimulación humoral y mecánica con T3/Dex para mantener adecuadamente la viabilidad, la función y la integridad del tejido.
Los factores humorales desempeñan un papel importante en la modulación del fenotipo cardíaco adulto. Esto se destacó en estudios de HiPS-CM en los que se añadieron T3 y Dex a medios de cultivo para acelerar la maduración celular. La T3 puede influir en el transporte de aminoácidos, azúcares y calcio a través de las membranas celulares36. Además, la T3 promueve la expresión de MHC-α y la regulación negativa de MHC-β, lo que promueve la formación de miofibrillas de contracción rápida en cardiomiocitos maduros en comparación con las miofibrillas de contracción lenta en el CM fetal. La deficiencia de T3 en pacientes hipotiroideos resulta en la pérdida de bandas miofibrilares y una tasa reducida de desarrollo del tono muscular37. La Dex actúa sobre los receptores de glucocorticoides y se ha demostrado que aumenta la contractilidad miocárdica en corazones perfundidos aislados; 38 se cree que esta mejora está relacionada con el efecto sobre la entrada impulsada por depósitos de calcio (SOCE) 39,40. Además, la Dex se une a sus receptores, lo que provoca una amplia respuesta intracelular que suprime la función inmunitaria y la inflamación30.
Nuestros resultados indican que la estimulación mecánica física (EM) mejoró el rendimiento general del cultivo en comparación con Ctrl, pero no logró mantener la viabilidad, la integridad estructural y la expresión cardíaca durante 12 días en cultivo. En comparación con Ctrl, la adición de T3 y Dex a los cultivos de CTCM (MT) mejoró la viabilidad y mantuvo perfiles de transcripción, integridad estructural y actividad metabólica similares con tejido cardíaco fresco durante 12 días. Además, al controlar el grado de estiramiento del tejido, se creó un modelo de hipertrofia cardíaca inducida por hiperextensión utilizando STCM, lo que ilustra la versatilidad del sistema STCM. Cabe señalar que, aunque la remodelación cardíaca y la fibrosis generalmente involucran órganos intactos cuyas células circulantes pueden proporcionar las citocinas apropiadas, así como la fagocitosis y otros factores de remodelación, las secciones del corazón aún pueden imitar el proceso fibrótico en respuesta al estrés y al trauma. en miofibroblastos. Esto se ha evaluado previamente en este modelo de corte cardíaco. Cabe destacar que los parámetros de CTCM pueden modularse modificando la presión/amplitud eléctrica y la frecuencia para simular diversas afecciones, como taquicardia, bradicardia y soporte circulatorio mecánico (corazón en descarga mecánica). Esto convierte al sistema en un sistema de rendimiento medio para la evaluación de fármacos. La capacidad de CTCM para modelar la hipertrofia cardíaca inducida por sobreesfuerzo abre el camino para la evaluación de este sistema con fines terapéuticos personalizados. En conclusión, el presente estudio demuestra que el estiramiento mecánico y la estimulación humoral son cruciales para el mantenimiento del cultivo de secciones de tejido cardíaco.
Aunque los datos presentados aquí sugieren que la CTCM es una plataforma muy prometedora para modelar el miocardio intacto, este método de cultivo presenta algunas limitaciones. La principal limitación del cultivo con CTCM reside en que impone tensiones mecánicas dinámicas continuas a los cortes, lo que impide la monitorización activa de las contracciones cardíacas durante cada ciclo. Además, debido al pequeño tamaño de los cortes cardíacos (7 mm), la capacidad para evaluar la función sistólica fuera de los sistemas de cultivo mediante sensores de fuerza tradicionales es limitada. En el presente manuscrito, superamos parcialmente esta limitación mediante la evaluación del voltaje óptico como indicador de la función contráctil. Sin embargo, esta limitación requerirá mayor investigación y podría abordarse en el futuro mediante la introducción de métodos para la monitorización óptica de la función de los cortes cardíacos en cultivo, como el mapeo óptico con calcio y colorantes sensibles al voltaje. Otra limitación de la CTCM es que el modelo de trabajo no manipula el estrés fisiológico (precarga y poscarga). En la CTCM, se indujo presión en direcciones opuestas para reproducir un 25 % de estiramiento fisiológico en diástole (estiramiento completo) y sístole (duración de la contracción durante la estimulación eléctrica) en tejidos muy grandes. Esta limitación debería eliminarse en futuros diseños de CTCM mediante una presión adecuada sobre el tejido cardíaco desde ambos lados y aplicando las relaciones exactas de presión-volumen que ocurren en las cámaras del corazón.
La remodelación inducida por sobreestiramiento descrita en este manuscrito se limita a imitar las señales de hiperestiramiento hipertrófico. Por lo tanto, este modelo puede contribuir al estudio de la señalización hipertrófica inducida por estiramiento sin necesidad de factores humorales o neurales (que no existen en este sistema). Se requieren más estudios para aumentar la multiplicidad de CTCM; por ejemplo, el cocultivo con células inmunitarias, los factores humorales plasmáticos circulantes y la inervación al cocultivar con células neuronales mejorarán las posibilidades de modelado de enfermedades con CTCM.
Se utilizaron trece cerdos en este estudio. Todos los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Louisville. Se pinzó el arco aórtico y se perfundió el corazón con 1 L de cardioplejía estéril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl₂, 16 mM KCl, 16 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 5 U/mL de heparina, pH hasta 7,4). Los corazones se conservaron en una solución cardiopléjica helada hasta que se transportaron al laboratorio en hielo, lo que suele durar menos de 10 minutos. Los corazones se conservaron en una solución cardiopléjica helada hasta que se transportaron al laboratorio en hielo, lo que suele durar menos de 10 minutos. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. Los corazones se almacenaron en una solución cardiopléjica helada hasta su transporte al laboratorio en hielo, lo que suele tardar <10 minutos.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Deje que el paciente se traslade a un laboratorio de cardioplegía durante <10 minutos. Mantener los corazones en cardioplejía con hielo hasta su transporte al laboratorio en hielo, generalmente <10 min.
El dispositivo CTCM se desarrolló con el software de diseño asistido por computadora (CAD) SolidWorks. Las cámaras de cultivo, los divisores y las cámaras de aire están fabricados con plástico acrílico transparente CNC. El anillo de soporte de 7 mm de diámetro está fabricado con polietileno de alta densidad (HDPE) en el centro y cuenta con una ranura para junta tórica que aloja la junta tórica de silicona que se utiliza para sellar el medio subyacente. Una fina membrana de sílice separa la cámara de cultivo de la placa de separación. La membrana de silicona se corta con láser a partir de una lámina de silicona de 0,02″ de espesor y tiene una dureza de 35A. Las juntas de silicona inferior y superior se cortan con láser a partir de una lámina de silicona de 1/16″ de espesor y tienen una dureza de 50A. Se utilizan tornillos y tuercas de mariposa de acero inoxidable 316L para fijar el bloque y crear un sello hermético.
Se diseñó una placa de circuito impreso (PCB) dedicada para integrarse con el sistema C-PACE-EM. Los conectores de la máquina suiza en la PCB se conectan a electrodos de grafito mediante cables de cobre plateados y tornillos de bronce 0-60 atornillados a los electrodos. La placa de circuito impreso se coloca en la cubierta de la impresora 3D.
El dispositivo CTCM está controlado por un actuador neumático programable (PPD) que crea una presión circulatoria controlada similar a un ciclo cardíaco. A medida que aumenta la presión dentro de la cámara de aire, la membrana flexible de silicona se expande hacia arriba, forzando el fluido a descender por debajo del tejido. El tejido se estira debido a esta expulsión de fluido, imitando la expansión fisiológica del corazón durante la diástole. En el punto máximo de relajación, se aplicó estimulación eléctrica mediante electrodos de grafito, lo que redujo la presión en la cámara de aire y provocó la contracción de las secciones de tejido. Dentro del tubo se encuentra una válvula hemostática con un sensor de presión que detecta la presión en el sistema de aire. La presión detectada por el sensor se aplica a un colector de datos conectado a la computadora portátil. Esto permite la monitorización continua de la presión dentro de la cámara de gas. Al alcanzar la presión máxima de la cámara (80 mmHg estándar, 140 mmHg OS), se ordenó al dispositivo de adquisición de datos que enviara una señal al sistema C-PACE-EM para generar una señal de voltaje bifásica de 2 ms, ajustada a 4 V.
Se obtuvieron secciones de corazón y las condiciones de cultivo en 6 pocillos se realizaron de la siguiente manera: transferir los corazones cosechados del recipiente de transferencia a una bandeja que contenía cardioplejía fría (4 °C). El ventrículo izquierdo se aisló con una cuchilla estéril y se cortó en trozos de 1-2 cm3. Estos bloques de tejido se unieron a soportes de tejido con adhesivo tisular y se colocaron en un baño de tejido de micrótomo vibratorio que contenía solución de Tyrode y oxigenada continuamente (3 g/L 2,3-butanodiona monooxima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml solución 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml solución 1 M), hasta 1 L ddH2O). El micrótomo vibratorio se ajustó para cortar cortes de 300 µm de grosor a una frecuencia de 80 Hz, una amplitud de vibración horizontal de 2 mm y una velocidad de avance de 0,03 mm/s. El baño de tejido se rodeó de hielo para mantener la solución fría y la temperatura se mantuvo a 4 °C. Transferir las secciones de tejido del baño del micrótomo a un baño de incubación que contenía solución de Tyrode oxigenada continuamente en hielo hasta obtener suficientes secciones para una placa de cultivo. Para los cultivos transwell, las secciones de tejido se unieron a soportes de poliuretano estériles de 6 mm de ancho y se colocaron en 6 ml de medio optimizado (medio 199, 1x suplemento ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalino y 2X antibiótico-antifúngico). Se aplicó estimulación eléctrica (10 V, frecuencia 1,2 Hz) a las secciones de tejido a través del C-Pace. Para las condiciones de TD, se añadieron T3 y Dex frescos a 100 nM y 1 μM en cada cambio de medio. El medio se satura con oxígeno antes de la sustitución 3 veces al día. Las secciones de tejido se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO₂.
Para los cultivos de CTCM, se colocaron secciones de tejido en una impresora 3D personalizada dentro de una placa de Petri con solución de Tyrode modificada. El dispositivo está diseñado para aumentar el tamaño del corte de corazón en un 25 % del área del anillo de soporte. Esto se hace para que las secciones de corazón no se estiren después de ser transferidas de la solución de Tyrode al medio y durante la diástole. Con pegamento histoacrílico, se fijaron secciones de 300 µm de grosor en un anillo de soporte de 7 mm de diámetro. Después de fijar las secciones de tejido al anillo de soporte, se cortaron las secciones sobrantes y se colocaron de nuevo en el baño de solución de Tyrode en hielo (4 °C) hasta que se hayan preparado suficientes secciones para un dispositivo. El tiempo total de procesamiento para todos los dispositivos no debe exceder las 2 horas. Después de fijar 6 secciones de tejido a sus anillos de soporte, se ensambló el dispositivo CTCM. La cámara de cultivo de CTCM está precargada con 21 ml de medio preoxigenado. Transfiera las secciones de tejido a la cámara de cultivo y elimine cuidadosamente las burbujas de aire con una pipeta. Luego, guíe la sección de tejido hacia el orificio y presiónela suavemente en su lugar. Finalmente, coloque la tapa del electrodo en el dispositivo y transfiéralo a la incubadora. Luego, conecte el CTCM al tubo de aire y al sistema C-PACE-EM. El actuador neumático se abre y la válvula de aire abre el CTCM. El sistema C-PACE-EM se configuró para suministrar 4 V a 1,2 Hz durante la estimulación bifásica durante 2 ms. El medio se cambió dos veces al día y los electrodos se cambiaron una vez al día para evitar la acumulación de grafito en los electrodos. Si es necesario, las secciones de tejido se pueden retirar de sus pocillos de cultivo para expulsar cualquier burbuja de aire que pueda haber caído debajo de ellos. Para las condiciones de tratamiento MT, se agregó T3/Dex fresco con cada cambio de medio con 100 nM de T3 y 1 μM de Dex. Los dispositivos CTCM se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2.
Para obtener trayectorias estiradas de cortes cardíacos, se desarrolló un sistema de cámara especial. Se utilizó una cámara SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japón) con un objetivo macro Navitar Zoom 7000 de 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). La visualización se realizó a temperatura ambiente tras sustituir el medio por uno nuevo. La cámara se posicionó en un ángulo de 51° y el vídeo se grabó a 30 fotogramas por segundo. En primer lugar, se utilizó software de código abierto (MUSCLEMOTION43) con Image-J para cuantificar el movimiento de los cortes cardíacos. La máscara se creó con MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) para definir las regiones de interés de los cortes cardíacos con latidos y evitar el ruido. Se aplicaron máscaras segmentadas manualmente a todas las imágenes de una secuencia de fotogramas y, a continuación, se pasaron al complemento MUSCLEMOTION. Muscle Motion utiliza la intensidad media de los píxeles de cada fotograma para cuantificar su movimiento en relación con el fotograma de referencia. Los datos se registraron, filtraron y utilizaron para cuantificar el tiempo de ciclo y evaluar el estiramiento tisular durante el ciclo cardíaco. El vídeo grabado se posprocesó con un filtro digital de fase cero de primer orden. Para cuantificar el estiramiento tisular (pico a pico), se realizó un análisis de pico a pico para distinguir entre picos y valles en la señal grabada. Además, se realizó una des-tendencia mediante un polinomio de sexto orden para eliminar la deriva de la señal. El código del programa se desarrolló en MATLAB para determinar el movimiento tisular global, el tiempo de ciclo, el tiempo de relajación y el tiempo de contracción (Código de Programa Suplementario 44).
Para el análisis de la deformación, utilizando los mismos vídeos creados para la evaluación del estiramiento mecánico, primero trazamos dos imágenes que representan los picos de movimiento (los puntos de movimiento más alto (superior) y más bajo (inferior)) según el software MUSCLEMOTION. A continuación, segmentamos las regiones de tejido y aplicamos un algoritmo de sombreado al tejido segmentado (Fig. Suplementaria 2a). El tejido segmentado se dividió en diez subsuperficies, y la tensión en cada superficie se calculó mediante la siguiente ecuación: Deformación = (Sup - Sdown)/Sdown, donde Sup y Sdown son las distancias de la forma a las sombras superior e inferior del tejido, respectivamente (Fig. Suplementaria 2b).
Las secciones de corazón se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 horas. Los tejidos fijados se deshidrataron en sacarosa al 10% y al 20% durante 1 hora, y posteriormente en sacarosa al 30% durante la noche. Posteriormente, las secciones se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptima (compuesto OCT) y se congelaron gradualmente en un baño de isopentano/hielo seco. Los bloques de inclusión de OCT se almacenaron a -80 °C hasta su separación. Los portaobjetos se prepararon como secciones con un espesor de 8 μm.
Para extraer la OCT de las secciones de corazón, caliente los portaobjetos en un bloque calefactor a 95 °C durante 5 minutos. Añada 1 ml de PBS a cada portaobjetos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, permee los cortes con Triton-X al 0,1 % en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos a la muestra, añada 1 ml de solución de BSA al 3 % a los portaobjetos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, retire la BSA y lave los portaobjetos con PBS. Marque cada muestra con un lápiz. Se añadieron anticuerpos primarios (diluidos 1:200 en BSA al 1%) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) y troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) durante 90 minutos, luego anticuerpos secundarios (diluidos 1:200 en BSA al 1%) contra Alexa Fluor 488 de ratón (Thermo Scientific; #A16079), contra Alexa Fluor 594 de conejo (Thermo Scientific; #T6391) durante 90 minutos más. Se lavaron 3 veces con PBS. Para distinguir la tinción del objetivo del fondo, utilizamos solo el anticuerpo secundario como control. Finalmente, se añadió el tinte nuclear DAPI y los portaobjetos se colocaron en un vectashield (Vector Laboratories) y se sellaron con esmalte de uñas. -x aumento) y microscopio Keyence con aumento de 40x.
Se utilizó WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml en PBS para la tinción de WGA y se aplicó a las secciones fijadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con PBS y se añadió negro Sudán a cada uno, incubándose durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavaron con PBS y se añadió medio de inclusión Vectashield. Los portaobjetos se visualizaron en un microscopio Keyence con un aumento de 40x.
Se extrajo el OCT de las muestras como se describió anteriormente. Después de retirar el OCT, sumerja los portaobjetos en solución de Bouin durante la noche. Luego, los portaobjetos se enjuagaron con agua destilada durante 1 hora y luego se colocaron en una solución de fucsina ácida de aloe de Bibrich durante 10 minutos. Luego, los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se colocaron en una solución de fosfomolibdeno al 5%/ácido fosfotúngstico al 5% durante 10 minutos. Sin enjuagar, transfiera los portaobjetos directamente a la solución de azul de anilina durante 15 minutos. Luego, los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se colocaron en una solución de ácido acético al 1% durante 2 minutos. Los portaobjetos se secaron en etanol 200 N y se transfirieron a xileno. Los portaobjetos teñidos se visualizaron utilizando un microscopio Keyence con un objetivo de 10x. El porcentaje del área de fibrosis se cuantificó utilizando el software Keyence Analyzer.
Ensayo de viabilidad celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, según el protocolo del fabricante con algunas modificaciones. En particular, se utilizó un sacabocados quirúrgico de 6 mm de diámetro para asegurar un tamaño uniforme del tejido durante el análisis de MTT. Los tejidos se sembraron individualmente en los pocillos de una placa de 12 pocillos con sustrato de MTT, según el protocolo del fabricante. Las secciones se incubaron a 37 °C durante 3 horas y el tejido vivo metabolizó el sustrato de MTT para formar un compuesto de formazán púrpura. Se reemplazó la solución de MTT con 1 ml de DMSO y se incubó a 37 °C durante 15 minutos para extraer el formazán púrpura de las secciones de corazón. Las muestras se diluyeron 1:10 en DMSO en placas de 96 pocillos de fondo transparente y se midió la intensidad del color púrpura a 570 nm con un lector de placas Cytation (BioTek). Las lecturas se normalizaron según el peso de cada corte de corazón.
El medio de corte de corazón se sustituyó por medio con 1 μCi/ml de [5-3H]-glucosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EE. UU.) para el ensayo de utilización de glucosa, como se describió previamente. Tras 4 horas de incubación, se añadieron 100 µl de medio a un tubo de microcentrífuga abierto que contenía 100 µl de HCl 0,2 N. A continuación, el tubo se colocó en un tubo de centelleo con 500 µl de dH₂O para evaporar [3H]₂O durante 72 horas a 37 °C. A continuación, se retiró el tubo de microcentrífuga del tubo de centelleo y se añadieron 10 ml de líquido de centelleo. Los recuentos de centelleo se realizaron con un analizador de centelleo líquido Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EE. UU.). La utilización de glucosa se calculó considerando la actividad específica de la [5-3H]-glucosa, el equilibrio incompleto y el fondo, la dilución de [5-3H]-glucosa a glucosa no marcada y la eficiencia del contador de centelleo. Los datos se normalizaron según la masa de las secciones del corazón.
Tras la homogeneización tisular en Trizol, se aisló el ARN de secciones de corazón utilizando el kit Qiagen miRNeasy Micro n.° 210874, según el protocolo del fabricante. La preparación, secuenciación y análisis de datos de la biblioteca RNAsec se realizó de la siguiente manera:
Se utilizó 1 μg de ARN por muestra como material de partida para la preparación de la biblioteca de ARN. Las bibliotecas de secuenciación se generaron utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra™ para Illumina (NEB, EE. UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y se añadieron códigos de índice a las secuencias de atributos de cada muestra. Brevemente, el ARNm se purificó a partir del ARN total utilizando microesferas magnéticas unidas con oligonucleótidos poli-T. La fragmentación se llevó a cabo utilizando cationes divalentes a alta temperatura en el tampón de reacción de síntesis de primera cadena NEBNext (5X). El ADNc de primera cadena se sintetizó utilizando cebadores hexaméricos aleatorios y la transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H-). El ADNc de segunda cadena se sintetizó posteriormente utilizando la ADN polimerasa I y la ARNasa H. Los extremos salientes restantes se convirtieron en extremos romos mediante la actividad de la exonucleasa/polimerasa. Tras la adenilación del extremo 3' del fragmento de ADN, se le une un adaptador NEBNext con una estructura de horquilla para prepararlo para la hibridación. Para la selección de fragmentos de ADNc con una longitud preferida de 150-200 pb, los fragmentos de la biblioteca se purificaron utilizando el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EE. UU.). A continuación, se utilizaron 3 μl de enzima USER (NEB, EE. UU.) con ADNc de tamaño seleccionado ligado con un adaptador durante 15 minutos a 37 °C y, posteriormente, durante 5 minutos a 95 °C antes de la PCR. A continuación, se realizó la PCR utilizando la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion, cebadores universales para PCR y cebadores Index (X). Finalmente, se purificaron los productos de PCR (sistema AMPure XP) y se evaluó la calidad de la biblioteca en un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. A continuación, se secuenció la biblioteca de ADNc utilizando un secuenciador Novaseq. Los archivos de imagen sin procesar de Illumina se convirtieron en lecturas sin procesar utilizando CASAVA Base Calling. Los datos sin procesar se almacenan en archivos con formato FASTQ(fq) que contienen las secuencias de lectura y sus correspondientes calidades de base. Seleccione HISAT2 para que las lecturas de secuenciación filtradas coincidan con el genoma de referencia Sscrofa11.1. En general, HISAT2 admite genomas de cualquier tamaño, incluidos aquellos con más de 4 mil millones de bases, y la mayoría de los parámetros tienen valores predeterminados. Las lecturas de empalme de los datos de secuenciación de ARN se pueden alinear eficientemente con HISAT2, el sistema más rápido disponible actualmente, con la misma o mejor precisión que cualquier otro método.
La abundancia de transcripciones refleja directamente el nivel de expresión génica. Los niveles de expresión génica se evalúan mediante la abundancia de transcripciones (recuento de secuenciación) asociadas al genoma o a los exones. El número de lecturas es proporcional a los niveles de expresión génica, la longitud del gen y la profundidad de secuenciación. Se calcularon los FPKM (fragmentos por mil pares de bases de transcrito secuenciado por millón de pares de bases) y se determinaron los valores P de expresión diferencial mediante el paquete DESeq2. A continuación, se calculó la tasa de falsos descubrimientos (FDR) para cada valor P mediante el método de Benjamini-Hochberg9, basado en la función R integrada «p.adjust».
El ARN aislado de secciones de corazón se convirtió en ADNc a una concentración de 200 ng/μl utilizando la mezcla maestra SuperScript IV Vilo de Thermo (Thermo, n.º de cat. 11756050). La RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando una placa de reacción transparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp de 384 pocillos (Thermo, n.º de cat. 4483319) y adhesivo óptico microamp (Thermo, n.º de cat. 4311971). La mezcla de reacción consistió en 5 µl de mezcla maestra Taqman Fast Advanced (Thermo, n.º de cat. 4444557), 0,5 µl de cebador Taqman y 3,5 µl de H₂O por pocillo. Se realizaron ciclos estándar de qPCR y se midieron los valores de CT utilizando un instrumento de PCR en tiempo real Applied Biosystems Quantstudio 5 (módulo de 384 pocillos; n.º de producto A28135). Los cebadores Taqman se adquirieron de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Los valores de CT de todas las muestras se normalizaron con el gen de mantenimiento GAPDH.
La liberación de NT-ProBNP en los medios se evaluó utilizando el kit NT-ProBNP (pig) (n.º de cat. MBS2086979, MyBioSource) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 250 µl de cada muestra y estándar por duplicado a cada pocillo. Inmediatamente después de añadir la muestra, se añadieron 50 µl de reactivo de ensayo A a cada pocillo. Agitar suavemente la placa y sellarla con sellador. A continuación, las tabletas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. A continuación, aspirar la solución y lavar los pocillos 4 veces con 350 µl de solución de lavado 1X, incubando la solución de lavado durante 1-2 minutos cada vez. A continuación, añadir 100 µl de reactivo de ensayo B por pocillo y sellarla con sellador de placa. La tableta se agitó suavemente y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Aspire la solución y lave los pocillos 5 veces con 350 µl de solución de lavado 1X. Añada 90 µl de solución de sustrato a cada pocillo y selle la placa. Incube la placa a 37 °C durante 10-20 minutos. Añada 50 µl de solución de parada a cada pocillo. La placa se midió inmediatamente con un lector de placas Cytation (BioTek) configurado a 450 nm.
Se realizaron análisis de potencia para elegir los tamaños de grupo que proporcionarán >80 % de potencia para detectar un cambio absoluto del 10 % en el parámetro con una tasa de error tipo I del 5 %. Se realizaron análisis de potencia para elegir los tamaños de grupo que proporcionarán >80% de potencia para detectar un cambio absoluto del 10% en el parámetro con una tasa de error tipo I del 5%. Análisis de la cantidad de personas incluidas en el grupo de grupos de personas, cuyo porcentaje es >80% de la cantidad total del 10% изменения parámetro con 5% частотой ошибок типа I. Se realizó un análisis de potencia para seleccionar tamaños de grupo que proporcionaran >80 % de potencia para detectar un cambio absoluto de parámetros del 10 % con una tasa de error tipo I del 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小. Según el análisis de la mayoría de los grupos de grupos, la mayoría de los participantes son > 80% de la cantidad total del 10%. изменения parámetros y 5% частоты ошибок типа I. Se realizó un análisis de potencia para seleccionar un tamaño de grupo que proporcionara >80% de potencia para detectar un cambio absoluto de parámetros del 10% y una tasa de error tipo I del 5%.Las secciones de tejido se seleccionaron aleatoriamente antes del experimento. Todos los análisis fueron ciegos a la condición y las muestras se decodificaron solo después de analizar todos los datos. Se utilizó el software GraphPad Prism (San Diego, CA) para realizar todos los análisis estadísticos. Para todas las estadísticas, los valores p se consideraron significativos en valores <0,05. Para todas las estadísticas, los valores p se consideraron significativos en valores < 0,05. Todas las estadísticas p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas las estadísticas, los valores p se consideraron significativos en valores < 0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Todas las estadísticas p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas las estadísticas, los valores p se consideraron significativos en valores < 0,05.Se realizó una prueba t de Student bilateral con los datos, con solo dos comparaciones. Se utilizó un ANOVA unidireccional o bidireccional para determinar la significancia entre múltiples grupos. Al realizar pruebas post hoc, se aplicó la corrección de Tukey para considerar las comparaciones múltiples. Los datos de RNAsec tienen consideraciones estadísticas especiales al calcular la FDR y el p.adjust, como se describe en la sección de Métodos.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Nature Research Report vinculado a este artículo.