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Existe la necesidad de un sistema in vitro confiable que pueda reproducir con precisión el entorno fisiológico del corazón para las pruebas de drogas.La disponibilidad limitada de sistemas de cultivo de tejidos cardíacos humanos ha dado lugar a interpretaciones inexactas de los efectos cardíacos de los fármacos.Aquí, hemos desarrollado un modelo de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) que estimula electromecánicamente rebanadas de corazón y se somete a un estiramiento fisiológico durante las fases sistólica y diastólica del ciclo cardíaco.Después de 12 días de cultivo, este enfoque mejoró parcialmente la viabilidad de las secciones del corazón, pero no conservó por completo su integridad estructural.Por lo tanto, después de la selección de moléculas pequeñas, encontramos que la adición de triyodotironina (T3) 100 nM y dexametasona (Dex) 1 μM a nuestro medio mantuvo la microestructura de las secciones durante 12 días.En combinación con el tratamiento con T3/Dex, el sistema CTCM mantuvo los perfiles transcripcionales, la viabilidad, la actividad metabólica y la integridad estructural al mismo nivel que el tejido cardíaco fresco durante 12 días.Además, el estiramiento excesivo del tejido cardíaco en cultivo induce la señalización cardíaca hipertrófica, lo que proporciona evidencia de la capacidad de CTCM para imitar las condiciones hipertróficas inducidas por el estiramiento cardíaco.En conclusión, CTCM puede modelar la fisiología y la fisiopatología del corazón en cultivo durante largos períodos de tiempo, lo que permite una detección de drogas confiable.
Antes de la investigación clínica, se necesitan sistemas in vitro fiables que puedan reproducir con precisión el entorno fisiológico del corazón humano.Dichos sistemas deben imitar el estiramiento mecánico alterado, la frecuencia cardíaca y las propiedades electrofisiológicas.Los modelos animales se usan comúnmente como una plataforma de detección para la fisiología cardíaca con confiabilidad limitada para reflejar los efectos de las drogas en el corazón humano1,2.En última instancia, el Modelo Experimental de Cultivo de Tejido Cardíaco Ideal (CTCM) es un modelo altamente sensible y específico para diversas intervenciones terapéuticas y farmacológicas, que reproduce con precisión la fisiología y la fisiopatología del corazón humano3.La ausencia de un sistema de este tipo limita el descubrimiento de nuevos tratamientos para la insuficiencia cardíaca4,5 y ha llevado a la cardiotoxicidad de los fármacos como una de las principales razones para salir del mercado6.
Durante la última década, se han retirado del uso clínico ocho fármacos no cardiovasculares porque provocan una prolongación del intervalo QT que conduce a arritmias ventriculares y muerte súbita7.Por lo tanto, existe una necesidad creciente de estrategias de detección preclínica confiables para evaluar la eficacia y toxicidad cardiovascular.El uso reciente de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS-CM) en la detección de drogas y pruebas de toxicidad proporciona una solución parcial a este problema.Sin embargo, la naturaleza inmadura de hiPS-CM y la falta de complejidad multicelular del tejido cardíaco son las principales limitaciones de este método.Estudios recientes han demostrado que esta limitación se puede superar en parte mediante el uso temprano de hiPS-CM para formar hidrogeles de tejido cardíaco poco después del inicio de las contracciones espontáneas y aumentando gradualmente la estimulación eléctrica con el tiempo.Sin embargo, estos microtejidos hiPS-CM carecen de las propiedades contráctiles y electrofisiológicas maduras del miocardio adulto.Además, el tejido cardíaco humano tiene una estructura más compleja, que consiste en una mezcla heterogénea de diferentes tipos de células, incluidas células endoteliales, neuronas y fibroblastos del estroma, interconectados por conjuntos específicos de proteínas de matriz extracelular.Esta heterogeneidad de poblaciones de no cardiomiocitos 11,12,13 en el corazón de mamíferos adultos es una barrera importante para el modelado de tejido cardíaco utilizando tipos de células individuales.Estas importantes limitaciones enfatizan la importancia de desarrollar métodos para cultivar tejido miocárdico intacto en condiciones fisiológicas y patológicas.
Secciones finas cultivadas (300 µm) del corazón humano han demostrado ser un modelo prometedor de miocardio humano intacto.Este método proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo similar al tejido del corazón humano.Sin embargo, hasta 2019, el uso de secciones de corazón cultivadas estaba limitado por la corta supervivencia del cultivo (24 h).Esto se debe a una serie de factores que incluyen la falta de estiramiento físico-mecánico, la interfaz aire-líquido y el uso de medios simples que no satisfacen las necesidades del tejido cardíaco.En 2019, varios grupos de investigación demostraron que la incorporación de factores mecánicos en los sistemas de cultivo de tejido cardíaco puede prolongar la vida útil del cultivo, mejorar la expresión cardíaca e imitar la patología cardíaca.Dos elegantes estudios 17 and 18 muestran que la carga mecánica uniaxial tiene un efecto positivo sobre el fenotipo cardíaco durante el cultivo.Sin embargo, estos estudios no utilizaron la carga fisicomecánica tridimensional dinámica del ciclo cardíaco, ya que las secciones del corazón se cargaron con fuerzas de tracción isométricas 17 o carga auxotónica lineal 18 .Estos métodos de estiramiento de tejidos dieron como resultado la supresión de muchos genes cardíacos o la sobreexpresión de genes asociados con respuestas de estiramiento anormales.En particular, Pitoulis et al.19 desarrollaron un baño de cultivo dinámico de cortes de corazón para la reconstrucción del ciclo cardíaco mediante la retroalimentación del transductor de fuerza y ​​las unidades de tensión.Aunque este sistema permite un modelado del ciclo cardíaco in vitro más preciso, la complejidad y el bajo rendimiento del método limitan la aplicación de este sistema.Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un sistema de cultivo simplificado que utiliza estimulación eléctrica y un medio optimizado para mantener la viabilidad de secciones de tejido cardíaco porcino y humano hasta 6 días20,21.
En el manuscrito actual, describimos un modelo de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) utilizando secciones del corazón porcino que incorpora señales humorales para recapitular la fisiología cardíaca tridimensional y la distensión fisiopatológica durante el ciclo cardíaco.Este CTCM puede aumentar la precisión de la predicción preclínica de fármacos a un nivel nunca antes alcanzado al proporcionar un sistema cardíaco rentable y de rendimiento medio que imita la fisiología/fisiopatología del corazón de los mamíferos para las pruebas preclínicas de fármacos.
Las señales mecánicas hemodinámicas juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la función de los cardiomiocitos in vitro 22,23,24.En el manuscrito actual, hemos desarrollado un CTCM (Figura 1a) que puede imitar el entorno cardíaco adulto al inducir estimulación eléctrica y mecánica a frecuencias fisiológicas (1,2 Hz, 72 latidos por minuto).Para evitar un estiramiento excesivo del tejido durante la diástole, se utilizó un dispositivo de impresión 3D para aumentar el tamaño del tejido en un 25% (Fig. 1b).La estimulación eléctrica inducida por el sistema C-PACE se programó para comenzar 100 ms antes de la sístole mediante un sistema de adquisición de datos para reproducir completamente el ciclo cardíaco.El sistema de cultivo de tejidos utiliza un actuador neumático programable (LB Engineering, Alemania) para expandir cíclicamente una membrana de silicona flexible para provocar la expansión de los cortes de corazón en la cámara superior.El sistema se conectó a una línea de aire externa a través de un transductor de presión, lo que permitió ajustar con precisión la presión (± 1 mmHg) y el tiempo (± 1 ms) (fig. 1c).
a Fije la sección de tejido al anillo de soporte de 7 mm, que se muestra en azul, dentro de la cámara de cultivo del dispositivo.La cámara de cultivo está separada de la cámara de aire por una fina membrana de silicona flexible.Coloque una junta entre cada cámara para evitar fugas.La tapa del dispositivo contiene electrodos de grafito que proporcionan estimulación eléctrica.b Representación esquemática del dispositivo de tejido grande, el anillo guía y el anillo de soporte.Las secciones de tejido (marrones) se colocan en el dispositivo de gran tamaño con el anillo guía colocado en la ranura del borde exterior del dispositivo.Utilizando la guía, coloque con cuidado el anillo de soporte cubierto con adhesivo acrílico tisular sobre la sección de tejido cardíaco.c Gráfico que muestra el tiempo de estimulación eléctrica en función de la presión de la cámara de aire controlada por un actuador neumático programable (PPD).Se utilizó un dispositivo de adquisición de datos para sincronizar la estimulación eléctrica mediante sensores de presión.Cuando la presión en la cámara de cultivo alcanza el umbral establecido, se envía una señal de pulso al C-PACE-EM para activar la estimulación eléctrica.d Imagen de cuatro CTCM colocados en un estante de incubadora.Se conectan cuatro dispositivos a un PPD a través de un circuito neumático y se insertan sensores de presión en la válvula hemostática para monitorear la presión en el circuito neumático.Cada dispositivo contiene seis secciones de tejido.
Usando un solo actuador neumático, pudimos controlar 4 dispositivos CTCM, cada uno de los cuales podía contener 6 secciones de tejido (Fig. 1d).En CTCM, la presión de aire en la cámara de aire se convierte en presión sincrónica en la cámara de líquido e induce la expansión fisiológica de la rebanada del corazón (Figura 2a y Película complementaria 1).Evaluación del estiramiento tisular a 80 mm Hg.Arte.mostró estiramiento de las secciones de tejido en un 25% (Fig. 2b).Se ha demostrado que este porcentaje de estiramiento corresponde a una longitud fisiológica del sarcómero de 2,2 a 2,3 µm para la contractilidad normal de la sección cardíaca17,19,25.El movimiento del tejido se evaluó utilizando configuraciones de cámara personalizadas (Figura 1 complementaria).La amplitud y velocidad del movimiento del tejido (Fig. 2c, d) correspondieron al estiramiento durante el ciclo cardíaco y al tiempo durante la sístole y la diástole (Fig. 2b).El estiramiento y la velocidad del tejido cardíaco durante la contracción y la relajación permanecieron constantes durante 12 días en cultivo (Fig. 2f).Para evaluar el efecto de la estimulación eléctrica sobre la contractilidad durante el cultivo, desarrollamos un método para determinar la deformidad activa utilizando un algoritmo de sombreado (Fig. 2a,b complementaria) y pudimos distinguir entre deformidades con y sin estimulación eléctrica.La misma sección del corazón (Fig. 2f).En la región móvil del corte (R6-9), el voltaje durante la estimulación eléctrica fue un 20% mayor que en ausencia de estimulación eléctrica, lo que indica la contribución de la estimulación eléctrica a la función contráctil.
Los rastros representativos de la presión de la cámara de aire, la presión de la cámara de fluido y las mediciones del movimiento del tejido confirman que la presión de la cámara cambia la presión de la cámara de fluido, lo que provoca el movimiento correspondiente de la rebanada de tejido.b Rastros representativos del porcentaje de estiramiento (azul) de las secciones de tejido correspondientes al porcentaje de estiramiento (naranja).c El movimiento medido del corte cardíaco es consistente con la velocidad de movimiento medida.(d) Trayectorias representativas de movimiento cíclico (línea azul) y velocidad (línea de puntos naranja) en una porción del corazón.e Cuantificación del tiempo de ciclo (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), tiempo de contracción (n = 19 cortes por grupo), tiempo de relajación (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), movimiento de tejido (n = 25).rebanadas)/grupo de diferentes cerdos), velocidad sistólica máxima (n = 24(D0), 25(D12) rebanadas/grupo de diferentes cerdos) y tasa de relajación máxima (n=24(D0), 25(D12) rebanadas/grupo de diferentes cerdos).La prueba t de Student de dos colas no mostró diferencias significativas en ningún parámetro.f Rastros de análisis de tensión representativos de secciones de tejido con (rojo) y sin estimulación eléctrica (azul), diez áreas regionales de secciones de tejido de la misma sección.Los paneles inferiores muestran la cuantificación de la diferencia porcentual en la tensión en secciones de tejido con y sin estimulación eléctrica en diez áreas de diferentes secciones. (n = 8 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01 , *p<0,05). (n = 8 secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba t de Student de dos colas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 secciones/grupo, de diferentes cerdos, prueba t de Student de dos colas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
En nuestro anterior sistema biomimético estático de cultivo de cortes de corazón [20, 21], mantuvimos la viabilidad, la función y la integridad estructural de los cortes de corazón durante 6 días mediante la aplicación de estimulación eléctrica y la optimización de la composición del medio.Sin embargo, después de 10 días, estas cifras se redujeron drásticamente.Nos referiremos a secciones cultivadas en nuestro anterior sistema de cultivo biomimético estático 20, 21 condiciones de control (Ctrl) y utilizaremos nuestro medio previamente optimizado como condiciones MC y cultivo bajo estimulación mecánica y eléctrica simultánea (CTCM).llamado .Primero, determinamos que la estimulación mecánica sin estimulación eléctrica era insuficiente para mantener la viabilidad del tejido durante 6 días (Fig. 3a, b complementaria).Curiosamente, con la introducción de la estimulación fisiomecánica y eléctrica mediante STCM, la viabilidad de las secciones de corazón de 12 días siguió siendo la misma que en las secciones de corazón fresco en condiciones de EM, pero no en condiciones de Ctrl, como se muestra en el análisis MTT (Fig. 1).3a).Esto sugiere que la estimulación mecánica y la simulación del ciclo cardíaco pueden mantener viables las secciones de tejido durante el doble de tiempo que el informado en nuestro sistema de cultivo estático anterior.Sin embargo, la evaluación de la integridad estructural de las secciones de tejido mediante el inmunomarcaje de la troponina T cardíaca y la conexina 43 mostró que la expresión de la conexina 43 fue significativamente mayor en los tejidos MC el día 12 que en los controles el mismo día.Sin embargo, la expresión uniforme de conexina 43 y la formación del disco Z no se mantuvieron por completo (Fig. 3b).Utilizamos un marco de inteligencia artificial (IA) para cuantificar la integridad estructural de los tejidos26, una canalización de aprendizaje profundo basada en imágenes basada en la tinción de troponina-T y conexina43 para cuantificar automáticamente la integridad estructural y la fluorescencia de los cortes de corazón en términos de fuerza de localización.Este método utiliza una red neuronal convolucional (CNN) y un marco de aprendizaje profundo para cuantificar de manera confiable la integridad estructural del tejido cardíaco de manera automatizada e imparcial, como se describe en la referencia.26. El tejido MC mostró una similitud estructural mejorada hasta el día 0 en comparación con las secciones de control estáticas.Además, la tinción tricrómica de Masson reveló un porcentaje significativamente menor de fibrosis en condiciones de EM en comparación con las condiciones de control en el día 12 de cultivo (Fig. 3c).Si bien CTCM aumentó la viabilidad de las secciones de tejido cardíaco en el día 12 a un nivel similar al del tejido cardíaco fresco, no mejoró significativamente la integridad estructural de las secciones del corazón.
un gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad de MTT de cortes de corazón fresco (D0) o cultivo de cortes de corazón durante 12 días en cultivo estático (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). un gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad de MTT de cortes de corazón fresco (D0) o cultivo de cortes de corazón durante 12 días en cultivo estático (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ** p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl).el histograma muestra la cuantificación de la viabilidad de secciones de corazón frescas MTT (D0) o cultivo de secciones de corazón durante 12 días en cultivo estático (control D12) o CTCM (MC D12) (n = 18 (D0), 15 (control D12). ), 12 (MC D12) secciones/grupo de diferentes cerdos, se realiza una prueba de ANOVA de una vía;####p < 0,0001 para la evaluación de D0 y **p < 0,01 para la evaluación de D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histograma que muestra la cuantificación de la viabilidad de MTT en secciones de corazón frescas (D0) o secciones de corazón cultivadas durante 12 días en cultivo estático (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 por valor de D0, **p < 0,01 por valor de D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparación con D0, **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (rojo) y DAPI (azul) en secciones de corazón recién aisladas (D0) o secciones de corazón cultivadas en condiciones estáticas (Ctrl) o condiciones CTCM (MC) durante 12 días) de imágenes de inmunofluorescencia representativas (escala en blanco = 100 µm). Cuantificación de inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada uno de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Cuantificación de inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo cada uno de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интелектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D 0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cuantificación de la integridad estructural del tejido cardíaco por inteligencia artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secciones/grupos de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; ####p < 0,0001 vs. con D0 y ****p < 0,0001 comparado con D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo de cada cerdo diferente, prueba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo de cada cerdo diferente, prueba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA, ####p <0,0001 vs D0 Для сравне ния ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Inteligencia artificial para cuantificar la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secciones/grupo de cada uno de los diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional; ####p<0.0001 vs .D0 Para comparación ****p < 0.0001 comparado con D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de cortes de corazón teñidos con tinción tricrómica de Masson (escala desnuda = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo cada uno de un cerdo diferente, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de cortes de corazón teñidos con la tinción tricrómica de Masson (escala desnuda = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo cada uno de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихр омным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, вы полняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de secciones de corazón teñidas con tinción tricrómica de Masson (escala sin recubrimiento = 500 µm) (n = 10 secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). C 用 Masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 的 代表性 图像 （（） 和 量化 （右） （裸尺度 = 500 µm） （（n = 10 个 切片/组 ， 每 组 来自 不同 的 猪 ， ， 进行 进行 单向 测试 测试 #### P <0.0001 与 D0 相比 相比 相比 猪 ， 进行 进行 单向 测试 测试 ### 30001 与 D0 相比 相比 相比 猪 ， 进行 进行 进行 单向 测试 ### 30001 l 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） (n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных три хромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 п o сравнению с D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de secciones de corazón teñidas con tinción tricrómica de Masson (en blanco = 500 µm) (n = 10 secciones/grupo, cada una de un cerdo diferente, analizadas mediante análisis de varianza unidireccional; ### # p < 0,0001 en comparación con D0, ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
Presumimos que al agregar moléculas pequeñas al medio de cultivo, se podría mejorar la integridad de los cardiomiocitos y reducir el desarrollo de fibrosis durante el cultivo de CTCM.Por lo tanto, buscamos moléculas pequeñas usando nuestros cultivos de control estáticos20,21 debido a la pequeña cantidad de factores de confusión.Para esta selección se eligieron dexametasona (Dex), triyodotironina (T3) y SB431542 (SB).Estas pequeñas moléculas se han utilizado previamente en cultivos de hiPSC-CM para inducir la maduración de los cardiomiocitos aumentando la longitud del sarcómero, los túbulos T y la velocidad de conducción.Además, se sabe que tanto Dex (un glucocorticoide) como SB suprimen la inflamación29,30.Por lo tanto, probamos si la inclusión de una o una combinación de estas pequeñas moléculas mejoraría la integridad estructural de las secciones del corazón.Para la selección inicial, la dosis de cada compuesto se seleccionó en función de las concentraciones comúnmente utilizadas en los modelos de cultivo celular (1 μM Dex27, 100 nM T327 y 2,5 μM SB31).Después de 12 días de cultivo, la combinación de T3 y Dex dio como resultado una integridad estructural óptima de los cardiomiocitos y una remodelación fibrosa mínima (Figuras complementarias 4 y 5).Además, el uso del doble o el doble de estas concentraciones de T3 y Dex produjo efectos nocivos en comparación con las concentraciones normales (Figura complementaria 6a, b).
Después de la selección inicial, realizamos una comparación directa de 4 condiciones de cultivo (Figura 4a): Ctrl: secciones de corazón cultivadas en nuestro cultivo estático descrito anteriormente utilizando nuestro medio optimizado;20.21 TD: T3 y Ctrl s agregaron Dex el miércoles;MC: secciones de corazón cultivadas en CTCM usando nuestro medio previamente optimizado;y MT: CTCM con T3 y Dex añadidos al medio.Después de 12 días de cultivo, la viabilidad de los tejidos MS y MT permaneció igual que en los tejidos frescos evaluados mediante el ensayo MTT (Fig. 4b).Curiosamente, la adición de T3 y Dex a cultivos transwell (TD) no dio como resultado una mejora significativa en la viabilidad en comparación con las condiciones Ctrl, lo que indica un papel importante de la estimulación mecánica en el mantenimiento de la viabilidad de las secciones del corazón.
un diagrama de diseño experimental que representa las cuatro condiciones de cultivo utilizadas para evaluar los efectos de la estimulación mecánica y la suplementación con T3/Dex en el medio durante 12 días. b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón frescos (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón frescos (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 ctrl). b ния во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC y MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ## ##p < 0,0001, ###p < 0,001 en función de D0 y **p < 0,01 en función de D12 Ctrl). b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad a los 12 días posteriores al cultivo en las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 frente a D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC y MT) по сравнению со свежи ми срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонни © тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 por valor de D0, **p <0,01 por valor de control D12). b Histograma que muestra las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), de diferentes cerdos 12 (D12 MC) secciones/grupo, prueba ANOVA unidireccional; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.0 1 frente al control D12). c El gráfico de barras muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c El gráfico de barras muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c ния во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC y MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 por сравнению с D12 Ctrl). c El histograma muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 6 secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; ###p < 0,001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培ANOVA试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культи вирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC y MT) по сравнению со свежими срезами серд ца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнен ию с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma que muestra la cuantificación del flujo de glucosa a los 12 días posteriores al cultivo para las 4 condiciones de cultivo (control, TD, MC y MT) en comparación con secciones de corazón fresco (D0) (n = 6 secciones/grupo, de diferentes cerdos, se realizaron pruebas ANOVA unilaterales, ###p < 0,001 en comparación con D0, ***p < 0,001 en comparación con D12 (control).d Gráficos de análisis de tensión de tejidos frescos (azul), día 12 MC (verde) y día 12 MT (rojo) en diez puntos de sección de tejido regional (n = 4 cortes/grupo, prueba ANOVA unidireccional; no hubo diferencias significativas entre los grupos).e Gráfico de volcán que muestra genes expresados ​​diferencialmente en secciones de corazón frescas (D0) en comparación con secciones de corazón cultivadas en condiciones estáticas (Ctrl) o en condiciones MT (MT) durante 10-12 días.f Mapa de calor de genes de sarcómero para secciones de corazón cultivadas en cada una de las condiciones de cultivo.Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
La dependencia metabólica del cambio de la oxidación de ácidos grasos a la glucólisis es un sello distintivo de la desdiferenciación de los cardiomiocitos.Los cardiomiocitos inmaduros utilizan principalmente glucosa para la producción de ATP y tienen mitocondrias hipoplásicas con pocas crestas5,32.Los análisis de utilización de glucosa mostraron que en condiciones de MC y MT, la utilización de glucosa fue similar a la de los tejidos del día 0 (Figura 4c).Sin embargo, las muestras de Ctrl mostraron un aumento significativo en la utilización de glucosa en comparación con el tejido fresco.Esto indica que la combinación de CTCM y T3/Dex mejora la viabilidad del tejido y conserva el fenotipo metabólico de las secciones de corazón cultivadas de 12 días.Además, el análisis de tensión mostró que los niveles de tensión permanecieron iguales que en el tejido cardíaco fresco durante 12 días en condiciones de MT y MS (Fig. 4d).
Para analizar el impacto general de CTCM y T3/Dex en el panorama transcripcional global del tejido de corte cardíaco, realizamos RNAseq en cortes cardíacos de las cuatro condiciones de cultivo diferentes (Datos complementarios 1).Curiosamente, las secciones de MT mostraron una gran similitud transcripcional con el tejido cardíaco fresco, con solo 16 expresados ​​diferencialmente de 13.642 genes.Sin embargo, como mostramos anteriormente, los cortes de Ctrl mostraron 1229 genes expresados ​​​​diferencialmente después de 10 a 12 días en cultivo (Fig. 4e).Estos datos fueron confirmados por qRT-PCR de genes de corazón y fibroblastos (Fig. 7a-c complementaria).Curiosamente, las secciones de Ctrl mostraron una regulación a la baja de los genes cardíacos y del ciclo celular y la activación de programas de genes inflamatorios.Estos datos sugieren que la desdiferenciación, que normalmente ocurre después de un cultivo a largo plazo, se atenúa por completo en condiciones de MT (Figuras complementarias 8a, b).Un estudio cuidadoso de los genes del sarcómero mostró que solo en condiciones MT se conservan los genes que codifican el sarcómero (Fig. 4f) y el canal iónico (Fig. 9 complementaria), protegiéndolos de la supresión en condiciones Ctrl, TD y MC.Estos datos demuestran que con una combinación de estimulación mecánica y humoral (T3/Dex), el transcriptoma de cortes de corazón puede permanecer similar a los cortes de corazón frescos después de 12 días en cultivo.
Estos hallazgos transcripcionales están respaldados por el hecho de que la integridad estructural de los cardiomiocitos en las secciones del corazón se conserva mejor en condiciones de MT durante 12 días, como lo muestra la conexina 43 intacta y localizada (Fig. 5a).Además, la fibrosis en secciones de corazón en condiciones de MT se redujo significativamente en comparación con Ctrl y de manera similar a las secciones de corazón fresco (Fig. 5b).Estos datos demuestran que la combinación de estimulación mecánica y tratamiento con T3/Dex preserva eficazmente la estructura cardíaca en secciones de corazón en cultivo.
a Imágenes representativas de inmunofluorescencia de troponina-T (verde), conexina 43 (roja) y DAPI (azul) en secciones de corazón recién aisladas (D0) o cultivadas durante 12 días en las cuatro condiciones de cultivo de sección de corazón (barra de escala = 100 µm).). Cuantificación de inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) rebanadas/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Cuantificación de inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) rebanadas/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 ( D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) prueba de ANOVA; 1 para сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 para сравнению с D12 Ctrl). Cuantificación de la integridad estructural del tejido cardíaco mediante inteligencia artificial (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) secciones/grupo de diferentes cerdos, prueba ANOVA unidireccional realizada; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05 o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Cuantificación de la integridad estructural del tejido cardíaco mediante inteligencia artificial en diferentes cerdos (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) secciones/grupo) con una prueba ANOVA de una vía;#### p < 0,0001 por сравнению с D0 y *p < 0,05 или ****p < 0,0001 por сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05 o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de cortes de corazón teñidos con la tinción tricrómica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de cortes de corazón teñidos con la tinción tricrómica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b лем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных с виней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 para сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 para сравнению Pulse D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de secciones de corazón teñidas con tinción tricrómica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) secciones/grupo de diferentes cerdos, realizado ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 frente a D0 y ***p < 0,001 o ****p < 0,0 001 frente a D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析;####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） (n = 10 （d0 、 d12 ct rl, d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 por valor de D0, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001 por valor de D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de secciones de corazón teñidas con tricrómico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) secciones de diferentes cerdos/grupo, un método ANOVA; ####p < 0,0001 en comparación con D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
Finalmente, la capacidad de CTCM para imitar la hipertrofia cardíaca se evaluó aumentando el estiramiento del tejido cardíaco.En CTCM, la presión máxima de la cámara de aire aumentó de 80 mmHg a 80 mmHg.Arte.(estiramiento normal) hasta 140 mmHg art.(Figura 6a).Esto corresponde a un aumento del 32 % en el estiramiento (Fig. 6b), que se mostró anteriormente como el porcentaje de estiramiento correspondiente requerido para que las secciones del corazón alcancen una longitud de sarcómero similar a la observada en la hipertrofia.El estiramiento y la velocidad del tejido cardíaco durante la contracción y la relajación permanecieron constantes durante seis días de cultivo (Fig. 6c).El tejido cardíaco de las condiciones MT se sometió a condiciones de estiramiento normal (MT (Normal)) o sobreestiramiento (MT (OS)) durante seis días.Ya después de cuatro días de cultivo, el biomarcador hipertrófico NT-ProBNP se elevó significativamente en el medio en condiciones MT (OS) en comparación con las condiciones MT (normales) (Fig. 7a).Además, después de seis días de cultivo, el tamaño celular en MT (OS) (Fig. 7b) aumentó significativamente en comparación con las secciones de corazón MT (normal).Además, la translocación nuclear de NFATC4 aumentó significativamente en los tejidos sobrecargados (Fig. 7c).Estos resultados muestran el desarrollo progresivo de la remodelación patológica después de la hiperdistensión y respaldan el concepto de que el dispositivo CTCM puede usarse como una plataforma para estudiar la señalización de hipertrofia cardíaca inducida por estiramiento.
Los rastros representativos de la presión de la cámara de aire, la presión de la cámara de fluido y las mediciones del movimiento del tejido confirman que la presión de la cámara cambia la presión de la cámara de fluido, lo que provoca el movimiento correspondiente de la rebanada de tejido.b Curvas representativas de porcentaje de estiramiento y tasa de estiramiento para secciones de tejido normalmente estiradas (naranja) y sobre estiradas (azul).c Gráfico de barras que muestra el tiempo del ciclo (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), el tiempo de contracción (n = 18-19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), el tiempo de relajación (n = 19 cortes por grupo, de diferentes cerdos), la amplitud del movimiento del tejido (n = 14 cortes/grupo, de diferentes cerdos), la velocidad sistólica máxima (n = 14 cortes/grupo, de diferentes cerdos) y la tasa máxima de relajación (n = 14 (D0), 15 (D6) ) secciones/grupos) de diferentes cerdos), la prueba t de Student de dos colas no mostró diferencias significativas en ningún parámetro, lo que indica que estos parámetros se mantuvieron constantes durante 6 días de cultivo con sobretensión.Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
a Cuantificación del gráfico de barras de la concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal MT (Norma) o sobreestiramiento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza ANOVA de dos vías; **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal). a Cuantificación del gráfico de barras de la concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal MT (Norma) o sobreestiramiento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza ANOVA de dos vías; **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal).Histograma cuantitativo de la concentración de NT-ProBNP en medio de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal de MT (norma) o sobreestiramiento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4).MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza un análisis de varianza de dos factores;**p < 0,01 сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal). a 在MT 正常拉伸(Norma) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS) <0.01）。 a Cuantificación de la concentración de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal (Norm) o sobreestiramiento (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferentes 猪的切片/组，可以双向方方发发动; ** en comparación con el estiramiento normal, p < 0,01).histograma Cuantificación de las concentraciones de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal de MT (norma) o sobreestiramiento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, análisis de varianza bidireccional;**p < 0,01 сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal). b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con troponina-T y WGA (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con el estiramiento normal). b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con troponina-T y WGA (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con el estiramiento normal). b го определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от раз ных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным раст яжением). b Imágenes representativas de secciones de corazón teñidas con troponina-T y AZP (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 secciones diferentes de diferentes cerdos, se realizó la prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001 en comparación con la cepa normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con calcareína-T y WGA (izquierda) y tamaño de celda (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 cortes diferentes (D6 MTNorm)) Células/组，两方法有尾学生t test；comparado con estiramiento normal，****p < 0.0001). b я оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/ группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imágenes representativas de secciones de corazón teñidas con troponina-T y AZP (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 secciones diferentes de diferentes cerdos) Células/grupo, criterio de dos colas t de Student;****p < 0,0001 en comparación con la tensión normal). c Imágenes representativas para los días 0 y 6 de cortes cardíacos de MTOS inmunomarcados para troponina-T y NFATC4 y cuantificación de la translocación de NFATC4 a los núcleos de CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; *p < 0,05). c Imágenes representativas para los días 0 y 6 de cortes cardíacos de MTOS inmunomarcados para troponina-T y NFATC4 y cuantificación de la translocación de NFATC4 a los núcleos de CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; *p < 0,05). c NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу о т разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imágenes representativas de secciones de corazón a los días 0 y 6 de MTOS, inmunomarcadas para troponina-T y NFATC4, y cuantificación de la translocación de NFATC4 en el núcleo de células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rebanadas/grupo de diferentes cerdos) realizadas con la prueba t de Student de dos colas;*p < 0,05). c.的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Imágenes representativas del inmunomarcaje de calcanina-T y NFATC4 第0天和第6天MTOS cortes de corazón, y NFATC4 de diferentes NFATC4 易位至Núcleo de células CM的cantidad化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC 4 y количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imágenes representativas de cortes de corazón de MTOS en los días 0 y 6 para el inmunomarcaje de troponina-T y NFATC4 y la cuantificación de la translocación de NFATC4 en el núcleo de CM de diferentes cerdos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo, criterio t de Student de dos colas; *p < 0,05).Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
La investigación cardiovascular traslacional requiere modelos celulares que reproduzcan con precisión el entorno cardíaco.En este estudio, se desarrolló y caracterizó un dispositivo CTCM que puede estimular secciones ultrafinas del corazón.El sistema CTCM incluye estimulación electromecánica fisiológicamente sincronizada y enriquecimiento de fluidos T3 y Dex.Cuando se expusieron secciones de corazón porcino a estos factores, su viabilidad, integridad estructural, actividad metabólica y expresión transcripcional permanecieron iguales que en tejido de corazón fresco después de 12 días de cultivo.Además, el estiramiento excesivo del tejido cardíaco puede provocar una hipertrofia del corazón causada por la hiperextensión.En general, estos resultados respaldan el papel fundamental de las condiciones de cultivo fisiológico en el mantenimiento de un fenotipo cardíaco normal y proporcionan una plataforma para la detección de fármacos.
Muchos factores contribuyen a crear un entorno óptimo para el funcionamiento y la supervivencia de los cardiomiocitos.Los más obvios de estos factores están relacionados con (1) interacciones intercelulares, (2) estimulación electromecánica, (3) factores humorales y (4) sustratos metabólicos.Las interacciones fisiológicas de célula a célula requieren redes tridimensionales complejas de múltiples tipos de células soportadas por una matriz extracelular.Tales interacciones celulares complejas son difíciles de reconstruir in vitro mediante el cultivo conjunto de tipos de células individuales, pero se pueden lograr fácilmente utilizando la naturaleza organotípica de las secciones del corazón.
El estiramiento mecánico y la estimulación eléctrica de los cardiomiocitos son fundamentales para mantener el fenotipo cardíaco33,34,35.Si bien la estimulación mecánica se ha utilizado ampliamente para el acondicionamiento y la maduración de hiPSC-CM, varios estudios elegantes han intentado recientemente la estimulación mecánica de cortes de corazón en cultivo utilizando carga uniaxial.Estos estudios muestran que la carga mecánica uniaxial 2D tiene un efecto positivo en el fenotipo del corazón durante el cultivo.En estos estudios, las secciones del corazón se cargaron con fuerzas de tensión isométricas17, carga auxotónica lineal18, o se recreó el ciclo cardíaco utilizando la retroalimentación del transductor de fuerza y ​​los impulsos de tensión.Sin embargo, estos métodos utilizan estiramiento de tejido uniaxial sin optimización ambiental, lo que da como resultado la supresión de muchos genes cardíacos o la sobreexpresión de genes asociados con respuestas de estiramiento anormales.El CTCM descrito aquí proporciona un estímulo electromecánico 3D que imita el ciclo cardíaco natural en términos de tiempo de ciclo y estiramiento fisiológico (25 % de estiramiento, 40 % de sístole, 60 % de diástole y 72 latidos por minuto).Aunque esta estimulación mecánica tridimensional por sí sola no es suficiente para mantener la integridad del tejido, se requiere una combinación de estimulación mecánica y humoral usando T3/Dex para mantener adecuadamente la viabilidad, función e integridad del tejido.
Los factores humorales juegan un papel importante en la modulación del fenotipo cardíaco adulto.Esto se destacó en los estudios de HiPS-CM en los que se agregaron T3 y Dex a los medios de cultivo para acelerar la maduración celular.T3 puede influir en el transporte de aminoácidos, azúcares y calcio a través de las membranas celulares36.Además, T3 promueve la expresión de MHC-α y la regulación a la baja de MHC-β, promoviendo la formación de miofibrillas de contracción rápida en los cardiomiocitos maduros en comparación con las miofibrillas de contracción lenta en la MC fetal.La deficiencia de T3 en pacientes hipotiroideos da como resultado la pérdida de bandas miofibrilares y una tasa reducida de desarrollo del tono37.Dex actúa sobre los receptores de glucocorticoides y se ha demostrado que aumenta la contractilidad miocárdica en corazones perfundidos aislados;38 se cree que esta mejora está relacionada con el efecto sobre la entrada impulsada por el depósito de calcio (SOCE) 39,40.Además, Dex se une a sus receptores, provocando una amplia respuesta intracelular que suprime la función inmunitaria y la inflamación30.
Nuestros resultados indican que la estimulación mecánica física (MS) mejoró el rendimiento general del cultivo en comparación con Ctrl, pero no pudo mantener la viabilidad, la integridad estructural y la expresión cardíaca durante 12 días en cultivo.En comparación con Ctrl, la adición de T3 y Dex a los cultivos de CTCM (MT) mejoró la viabilidad y mantuvo perfiles de transcripción, integridad estructural y actividad metabólica similares con tejido cardíaco fresco durante 12 días.Además, al controlar el grado de estiramiento del tejido, se creó un modelo de hipertrofia cardíaca inducida por hiperextensión utilizando STCM, lo que ilustra la versatilidad del sistema STCM.Cabe señalar que aunque la remodelación cardíaca y la fibrosis generalmente involucran órganos intactos cuyas células circulantes pueden proporcionar las citoquinas apropiadas, así como la fagocitosis y otros factores de remodelación, las secciones del corazón aún pueden imitar el proceso fibrótico en respuesta al estrés y al trauma.en miofibroblastos.Esto se ha evaluado previamente en este modelo de corte cardíaco.Cabe señalar que los parámetros de CTCM se pueden modular cambiando la presión/amplitud eléctrica y la frecuencia para simular muchas condiciones como taquicardia, bradicardia y soporte circulatorio mecánico (corazón mecánico descargado).Esto hace que el sistema tenga un rendimiento medio para las pruebas de drogas.La capacidad de CTCM para modelar la hipertrofia cardíaca inducida por el sobreesfuerzo allana el camino para probar este sistema para una terapia personalizada.En conclusión, el presente estudio demuestra que el estiramiento mecánico y la estimulación humoral son fundamentales para mantener la cultura de las secciones de tejido cardíaco.
Aunque los datos presentados aquí sugieren que CTCM es una plataforma muy prometedora para el modelado de miocardio intacto, este método de cultivo tiene algunas limitaciones.La principal limitación de la cultura CTCM es que impone tensiones mecánicas dinámicas continuas en los cortes, lo que impide la capacidad de monitorear activamente las contracciones del corte cardíaco durante cada ciclo.Además, debido al pequeño tamaño de las secciones cardíacas (7 mm), la capacidad de evaluar la función sistólica fuera de los sistemas de cultivo utilizando sensores de fuerza tradicionales es limitada.En el manuscrito actual, superamos parcialmente esta limitación al evaluar el voltaje óptico como indicador de la función contráctil.Sin embargo, esta limitación requerirá más trabajo y puede abordarse en el futuro mediante la introducción de métodos para el control óptico de la función de los cortes de corazón en cultivo, como el mapeo óptico con calcio y tintes sensibles al voltaje.Otra limitación de CTCM es que el modelo de trabajo no manipula el estrés fisiológico (precarga y poscarga).En CTCM, se indujo presión en direcciones opuestas para reproducir un 25% de estiramiento fisiológico en diástole (estiramiento completo) y sístole (duración de la contracción durante la estimulación eléctrica) en tejidos muy grandes.Esta limitación debe eliminarse en futuros diseños de CTCM mediante la presión adecuada sobre el tejido cardíaco desde ambos lados y aplicando las relaciones exactas de presión-volumen que ocurren en las cavidades del corazón.
La remodelación inducida por sobreestiramiento informada en este manuscrito se limita a imitar las señales de hiperestiramiento hipertróficas.Por lo tanto, este modelo puede ayudar en el estudio de la señalización hipertrófica inducida por estiramiento sin la necesidad de factores humorales o neurales (que no existen en este sistema).Se necesitan más estudios para aumentar la multiplicidad de CTCM, por ejemplo, el cocultivo con células inmunitarias, los factores humorales del plasma circulante y la inervación cuando el cocultivo con células neuronales mejorará las posibilidades de modelado de enfermedades con CTCM.
En este estudio se utilizaron trece cerdos.Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Louisville.Se pinza el arco aórtico y se perfunde el corazón con 1 L de cardioplegia estéril (NaCl 110 mM, CaCl2 1,2 mM, KCl 16 mM, MgCl2 16 mM, NaHCO3 10 mM, heparina 5 U/mL, pH hasta 7,4); los corazones se conservaron en solución cardiopléjica helada hasta que se transportaron al laboratorio en hielo, lo que suele ser <10 min. los corazones se conservaron en solución cardiopléjica helada hasta que se transportaron al laboratorio en hielo, lo que suele ser <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. los corazones se almacenaron en solución cardiopléjica helada hasta el transporte al laboratorio en hielo, lo que generalmente toma <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Mantenga los corazones en hielo con cardioplejía hasta el transporte al laboratorio en hielo, por lo general <10 min.
El dispositivo CTCM se desarrolló en el software de diseño asistido por computadora (CAD) SolidWorks.Las cámaras de cultivo, los divisores y las cámaras de aire están hechos de plástico acrílico transparente CNC.El anillo de respaldo de 7 mm de diámetro está hecho de polietileno de alta densidad (HDPE) en el centro y tiene una ranura para junta tórica para acomodar la junta tórica de silicona que se usa para sellar el medio debajo.Una fina membrana de sílice separa la cámara de cultivo de la placa de separación.La membrana de silicona está cortada con láser a partir de una lámina de silicona de 0,02″ de espesor y tiene una dureza de 35A.Las juntas de silicona inferior y superior están cortadas con láser a partir de una lámina de silicona de 1/16″ de espesor y tienen una dureza de 50A.Se utilizan tornillos de acero inoxidable 316L y tuercas de mariposa para sujetar el bloque y crear un sello hermético.
Se ha diseñado una placa de circuito impreso (PCB) dedicada para integrarse con el sistema C-PACE-EM.Los enchufes del conector de la máquina suiza en la PCB están conectados a los electrodos de grafito mediante cables de cobre plateados y tornillos de bronce 0-60 atornillados en los electrodos.La placa de circuito impreso se coloca en la tapa de la impresora 3D.
El dispositivo CTCM está controlado por un actuador neumático programable (PPD) que crea una presión circulatoria controlada similar a un ciclo cardíaco.A medida que aumenta la presión dentro de la cámara de aire, la membrana de silicona flexible se expande hacia arriba, empujando el medio debajo del sitio del tejido.El área de tejido se estirará entonces por esta expulsión de líquido, imitando la expansión fisiológica del corazón durante la diástole.En el punto máximo de relajación, se aplicó estimulación eléctrica a través de electrodos de grafito, lo que redujo la presión en la cámara de aire y provocó la contracción de las secciones de tejido.Dentro de la tubería hay una válvula hemostática con un sensor de presión para detectar la presión en el sistema de aire.La presión detectada por el sensor de presión se aplica a un colector de datos conectado a la computadora portátil.Esto permite el monitoreo continuo de la presión dentro de la cámara de gas.Cuando se alcanzó la presión máxima de la cámara (estándar 80 mmHg, 140 mmHg OS), se ordenó al dispositivo de adquisición de datos que enviara una señal al sistema C-PACE-EM para generar una señal de voltaje bifásico durante 2 ms, ajustado a 4 V.
Se obtuvieron secciones de corazón y se realizaron las condiciones de cultivo en 6 pocillos como sigue: Transferir los corazones recogidos del recipiente de transferencia a una bandeja que contenía cardioplegia fría (4ºC).El ventrículo izquierdo se aisló con una cuchilla estéril y se cortó en trozos de 1-2 cm3.Estos bloques de tejido se unieron a soportes de tejido con adhesivo tisular y se colocaron en un baño de tejido de micrótomo vibratorio que contenía solución de Tyrode y se oxigenaron continuamente (3 g/L de 2,3-butanodiona monooxima (BDM), NaCl 140 mM (8,18 g), KCl 6 mM (0,447 g), D-glucosa 10 mM (1,86 g), HEPES 10 mM (2,38 g), MgCl2 (1 ml de solución 1 M), CaCl2 1,8 mM (1,8 ml de solución 1 M), hasta 1 L ddH2O).El micrótomo vibratorio se configuró para cortar rebanadas de 300 µm de espesor a una frecuencia de 80 Hz, una amplitud de vibración horizontal de 2 mm y una velocidad de avance de 0,03 mm/s.El baño de tejido se rodeó de hielo para mantener fría la solución y la temperatura se mantuvo a 4°C.Transfiera las secciones de tejido del baño de micrótomo a un baño de incubación que contenga solución de Tyrode oxigenada continuamente en hielo hasta que se obtengan suficientes secciones para una placa de cultivo.Para los cultivos transwell, las secciones de tejido se unieron a soportes de poliuretano estériles de 6 mm de ancho y se colocaron en 6 ml de medio optimizado (medio 199, suplemento 1x ITS, FBS al 10 %, VEGF 5 ng/ml, FGF alcalino 10 ng/ml y antibiótico antifúngico 2X).Se aplicó estimulación eléctrica (10 V, frecuencia 1,2 Hz) a las secciones de tejido a través del C-Pace.Para las condiciones de TD, se agregaron T3 y Dex frescos a 100 nM y 1 μM en cada cambio de medio.El medio se satura con oxígeno antes de la sustitución 3 veces al día.Las secciones de tejido se cultivaron en una incubadora a 37°C y 5% de CO2.
Para los cultivos de CTCM, las secciones de tejido se colocaron en una impresora 3D hecha a medida en una placa de Petri que contenía solución de Tyrode modificada.El dispositivo está diseñado para aumentar el tamaño de la rebanada del corazón en un 25% del área del anillo de soporte.Esto se hace para que las secciones del corazón no se estiren después de ser transferidas de la solución de Tyrode al medio y durante la diástole.Utilizando cola histoacrílica, se fijaron secciones de 300 µm de espesor sobre un anillo soporte de 7 mm de diámetro.Después de unir las secciones de tejido al anillo de soporte, corte el exceso de secciones de tejido y vuelva a colocar las secciones de tejido adheridas en el baño de solución de Tyrode en hielo (4 °C) hasta que se hayan preparado suficientes secciones para un dispositivo.El tiempo total de procesamiento para todos los dispositivos no debe exceder las 2 horas.Después de unir 6 secciones de tejido a sus anillos de soporte, se ensambló el dispositivo CTCM.La cámara de cultivo CTCM se llena previamente con 21 ml de medio preoxigenado.Transfiera las secciones de tejido a la cámara de cultivo y elimine con cuidado las burbujas de aire con una pipeta.Luego, la sección de tejido se guía hacia el orificio y se presiona suavemente en su lugar.Finalmente, coloque la tapa del electrodo en el dispositivo y transfiera el dispositivo a la incubadora.A continuación, conecte el CTCM al tubo de aire y al sistema C-PACE-EM.El actuador neumático se abre y la válvula de aire abre el CTCM.El sistema C-PACE-EM se configuró para suministrar 4 V a 1,2 Hz durante la estimulación bifásica durante 2 ms.El medio se cambió dos veces al día y los electrodos se cambiaron una vez al día para evitar la acumulación de grafito en los electrodos.Si es necesario, las secciones de tejido se pueden retirar de sus pocillos de cultivo para expulsar las burbujas de aire que puedan haber caído debajo de ellos.Para las condiciones de tratamiento MT, se añadió T3/Dex fresco con cada cambio de medio con T3 100 nM y Dex 1 μM.Los dispositivos CTCM se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2.
Para obtener trayectorias extendidas de cortes de corazón, se desarrolló un sistema de cámara especial.Se utilizó una cámara SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japón) con una lente macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).La visualización se realizó a temperatura ambiente después de reemplazar el medio con medio fresco.La cámara se coloca en un ángulo de 51° y el video se graba a 30 cuadros por segundo.En primer lugar, se utilizó un software de código abierto (MUSCLEMOTION43) con Image-J para cuantificar el movimiento de los cortes de corazón.La máscara se creó utilizando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) para definir regiones de interés para los cortes de corazón latiendo para evitar el ruido.Las máscaras segmentadas manualmente se aplican a todas las imágenes en una secuencia de cuadros y luego se pasan al complemento MUSCLEMOTION.Muscle Motion utiliza la intensidad promedio de los píxeles en cada cuadro para cuantificar su movimiento en relación con el cuadro de referencia.Los datos se registraron, filtraron y usaron para cuantificar el tiempo del ciclo y evaluar el estiramiento del tejido durante el ciclo cardíaco.El video grabado fue post-procesado utilizando un filtro digital de fase cero de primer orden.Para cuantificar el estiramiento del tejido (pico a pico), se realizó un análisis de pico a pico para distinguir entre picos y valles en la señal registrada.Además, la eliminación de tendencias se realiza utilizando un polinomio de sexto orden para eliminar la desviación de la señal.El código del programa se desarrolló en MATLAB para determinar el movimiento global del tejido, el tiempo del ciclo, el tiempo de relajación y el tiempo de contracción (Código de programa complementario 44).
Para el análisis de tensión, usando los mismos videos creados para la evaluación del estiramiento mecánico, primero rastreamos dos imágenes que representan picos de movimiento (los puntos de movimiento más alto (superior) y más bajo (inferior)) de acuerdo con el software MUSCLEMOTION.Luego segmentamos las regiones de tejido y aplicamos una forma de algoritmo de sombreado al tejido segmentado (Fig. 2a complementaria).Luego, el tejido segmentado se dividió en diez subsuperficies y la tensión en cada superficie se calculó mediante la siguiente ecuación: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, donde Sup y Sdown son las distancias de la forma desde las sombras superior e inferior de la tela, respectivamente (Fig. 2b complementaria).
Las secciones del corazón se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 horas.Los tejidos fijados se deshidrataron en sacarosa al 10 % y al 20 % durante 1 h, luego en sacarosa al 30 % durante la noche.Luego, las secciones se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptima (compuesto OCT) y se congelaron gradualmente en un baño de isopentano/hielo seco.Guarde los bloques de inclusión de OCT a -80 oC hasta la separación.Los portaobjetos se prepararon como secciones con un espesor de 8 μm.
Para eliminar la OCT de las secciones del corazón, caliente los portaobjetos en un bloque calefactor a 95 oC durante 5 min.Agregue 1 ml de PBS a cada portaobjetos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego permee las secciones configurando Triton-X al 0,1 % en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.Para evitar que los anticuerpos no específicos se unan a la muestra, agregue 1 ml de solución de BSA al 3 % a los portaobjetos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente.A continuación, se retiró el BSA y se lavaron los portaobjetos con PBS.Marque cada muestra con un lápiz.Se agregaron anticuerpos primarios (diluidos 1:200 en BSA al 1 %) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) y troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) durante 90 minutos, luego se agregaron anticuerpos secundarios (diluidos 1:200 en BSA al 1 %) contra Alexa Fluor 488 de ratón (Thermo Scientific; #A). 16079), contra el conejo Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) durante 90 minutos adicionales Lavado 3 veces con PBS Para distinguir la tinción objetivo del fondo, usamos solo el anticuerpo secundario como control. Finalmente, se agregó la tinción nuclear DAPI y los portaobjetos se colocaron en un vectashield (Vector Laboratories) y se sellaron con esmalte de uñas. -x aumento) y un microscopio Keyence con un aumento de 40x.
Se usó WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml en PBS para la tinción WGA y se aplicó a secciones fijas durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS y se añadió negro de Sudán a cada portaobjetos y se incubaron durante 30 minutos.A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS y se añadió medio de inclusión vectashield.Los portaobjetos se visualizaron en un microscopio Keyence con un aumento de 40x.
Se eliminó OCT de las muestras como se describe anteriormente.Después de retirar el OCT, sumerja los portaobjetos en la solución de Bouin durante la noche.Luego, los portaobjetos se enjuagaron con agua destilada durante 1 hora y luego se colocaron en una solución de fucsina ácida de aloe Bibrich durante 10 minutos.Luego los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se colocaron en una solución de fosfomolibdeno al 5%/ácido fosfotúngstico al 5% durante 10 minutos.Sin enjuagar, transfiera los portaobjetos directamente a la solución de azul de anilina durante 15 minutos.Luego, los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se colocaron en una solución de ácido acético al 1% durante 2 minutos.Los portaobjetos se secaron en etanol 200 N y se transfirieron a xileno.Los portaobjetos teñidos se visualizaron utilizando un microscopio Keyence con un objetivo de 10x.El porcentaje de área de fibrosis se cuantificó utilizando el software Keyence Analyzer.
Ensayo de viabilidad celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, según el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.En particular, se utilizó un punzón quirúrgico con un diámetro de 6 mm para garantizar un tamaño de tejido uniforme durante el análisis de MTT.Los tejidos se sembraron individualmente en los pocillos de una placa de 12 pocillos que contenía sustrato MTT según el protocolo del fabricante.Las secciones se incuban a 37 ºC durante 3 horas y el tejido vivo metaboliza el sustrato de MTT para formar un compuesto de formazán púrpura.Reemplace la solución de MTT con 1 ml de DMSO e incube a 37 oC durante 15 minutos para extraer el formazán púrpura de las secciones del corazón.Las muestras se diluyeron 1:10 en DMSO en placas de fondo transparente de 96 pocillos y se midió la intensidad del color púrpura a 570 nm utilizando un lector de placas Cytation (BioTek).Las lecturas se normalizaron al peso de cada rebanada del corazón.
Los medios de corte de corazón se reemplazaron con medios que contenían 1 μCi/ml de [5-3H]-glucosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EE. UU.) para el ensayo de utilización de glucosa como se describió anteriormente.Después de 4 horas de incubación, agregue 100 µl de medio a un tubo de microcentrífuga abierto que contenga 100 µl de HCl 0,2 N.Luego, el tubo se colocó en un tubo de centelleo que contenía 500 μl de dH2O para evaporar [3H]2O durante 72 horas a 37 °C.Luego retire el tubo de microcentrífuga del tubo de centelleo y agregue 10 ml de líquido de centelleo.Los recuentos de centelleo se realizaron utilizando un analizador de centelleo líquido Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EE. UU.).A continuación, se calculó la utilización de glucosa teniendo en cuenta la actividad específica de [5-3H]-glucosa, el equilibrio incompleto y el fondo, la dilución de [5-3H]-a glucosa no marcada y la eficacia del contador de centelleo.Los datos se normalizan a la masa de las secciones del corazón.
Después de la homogeneización del tejido en Trizol, se aisló el ARN de las secciones del corazón utilizando el Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 de acuerdo con el protocolo del fabricante.La preparación de la biblioteca RNAsec, la secuenciación y el análisis de datos se realizaron de la siguiente manera:
Se usó 1 μg de ARN por muestra como material de partida para la preparación de la biblioteca de ARN.Las bibliotecas de secuenciación se generaron utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraTM para Illumina (NEB, EE. UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y se agregaron códigos de índice a las secuencias de atributos para cada muestra.Brevemente, el ARNm se purificó a partir del ARN total usando perlas magnéticas unidas con oligonucleótidos poli-T.La fragmentación se lleva a cabo usando cationes divalentes a alta temperatura en NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).La primera cadena de ADNc se sintetizó utilizando cebadores hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H-).La segunda cadena de ADNc se sintetiza luego usando ADN polimerasa I y RNasa H. Los salientes restantes se convierten en extremos romos mediante la actividad de exonucleasa/polimerasa.Después de la adenilación del extremo 3 'del fragmento de ADN, se le une un adaptador NEBNext con una estructura de bucle de horquilla para prepararlo para la hibridación.Para la selección de fragmentos de ADNc de longitud preferida de 150-200 pb.los fragmentos de la biblioteca se purificaron utilizando el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EE. UU.).Luego, se usaron 3 μl de enzima USER (NEB, EE. UU.) con ADNc de tamaño seleccionado ligado con un adaptador durante 15 minutos a 37 °C y luego durante 5 minutos a 95 °C antes de la PCR.A continuación, se realizó la PCR utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion, cebadores de PCR universales y cebadores Index (X).Finalmente, los productos de PCR se purificaron (sistema AMPure XP) y la calidad de la biblioteca se evaluó en un sistema Agilent Bioanalyzer 2100.A continuación, la biblioteca de ADNc se secuenció utilizando un secuenciador Novaseq.Los archivos de imágenes sin procesar de Illumina se convirtieron en lecturas sin procesar utilizando CASAVA Base Calling.Los datos sin procesar se almacenan en archivos de formato FASTQ(fq) que contienen secuencias de lectura y las calidades base correspondientes.Seleccione HISAT2 para hacer coincidir las lecturas de secuenciación filtradas con el genoma de referencia Sscrofa11.1.En general, HISAT2 admite genomas de cualquier tamaño, incluidos genomas de más de 4 mil millones de bases, y se establecen valores predeterminados para la mayoría de los parámetros.Las lecturas de empalme de los datos de RNA Seq se pueden alinear de manera eficiente utilizando HISAT2, el sistema más rápido disponible actualmente, con la misma o mejor precisión que cualquier otro método.
La abundancia de transcritos refleja directamente el nivel de expresión génica.Los niveles de expresión génica se evalúan por la abundancia de transcritos (recuento de secuenciación) asociados con el genoma o los exones.El número de lecturas es proporcional a los niveles de expresión génica, la longitud del gen y la profundidad de secuenciación.Se calcularon los FPKM (fragmentos por mil pares de bases de la transcripción secuenciada por millón de pares de bases) y se determinaron los valores P de la expresión diferencial utilizando el paquete DESeq2.Luego calculamos la tasa de descubrimiento falso (FDR) para cada valor P utilizando el método Benjamini-Hochberg9 basado en la función R incorporada "p.adjust".
El ARN aislado de secciones de corazón se convirtió en ADNc a una concentración de 200 ng/μl utilizando la mezcla SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, n.° de cat. 11756050).La RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando una placa de reacción transparente de 384 pocillos Endura Plate Microamp de Applied Biosystems (Thermo, n.º de cat. 4483319) y adhesivo óptico de microamp (Thermo, n.º de cat. 4311971).La mezcla de reacción constaba de 5 µl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, nº de cat. 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer y 3,5 µl de H2O mezclados por pocillo.Se ejecutaron ciclos de qPCR estándar y los valores de CT se midieron con un instrumento de PCR en tiempo real Quantstudio 5 de Applied Biosystems (módulo de 384 pocillos; producto n.º A28135).Los cebadores Taqman se compraron de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Los valores de CT de todas las muestras se normalizaron al gen de limpieza GAPDH.
La liberación de NT-ProBNP en los medios se evaluó con el kit NT-ProBNP (cerdo) (n.º de catálogo MBS2086979, MyBioSource) de acuerdo con el protocolo del fabricante.Brevemente, se añadieron 250 µl de cada muestra y estándar por duplicado a cada pocillo.Inmediatamente después de agregar la muestra, agregue 50 µl de reactivo de ensayo A a cada pocillo.Agite suavemente la placa y selle con sellador.Luego, las tabletas se incubaron a 37°C durante 1 hora.A continuación, aspire la solución y lave los pocillos 4 veces con 350 µl de solución de lavado 1X, incubando la solución de lavado durante 1 o 2 minutos cada vez.A continuación, añada 100 µl del reactivo de ensayo B por pocillo y séllelo con sellador de placas.La tableta se agitó suavemente y se incubó a 37°C durante 30 minutos.Aspire la solución y lave los pocillos 5 veces con 350 µl de solución de lavado 1X.Agregue 90 µl de solución de sustrato a cada pozo y selle la placa.Incubar la placa a 37°C durante 10-20 minutos.Agregue 50 µl de solución de parada a cada pocillo.La placa se midió inmediatamente utilizando un lector de placas Cytation (BioTek) ajustado a 450 nm.
Se realizaron análisis de potencia para elegir los tamaños de grupo que proporcionarán >80 % de potencia para detectar un cambio absoluto del 10 % en el parámetro con una tasa de error Tipo I del 5 %. Se realizaron análisis de potencia para elegir los tamaños de grupo que proporcionarán >80 % de potencia para detectar un cambio absoluto del 10 % en el parámetro con una tasa de error Tipo I del 5 %. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Se realizó un análisis de potencia para seleccionar tamaños de grupo que proporcionarían >80 % de potencia para detectar un cambio de parámetro absoluto del 10 % con una tasa de error de tipo I del 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Más de 80% de porcentaje для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Se realizó un análisis de potencia para seleccionar un tamaño de grupo que proporcionaría una potencia >80 % para detectar un cambio de parámetro absoluto del 10 % y una tasa de error de tipo I del 5 %.Las secciones de tejido se seleccionaron al azar antes del experimento.Todos los análisis fueron ciegos a la condición y las muestras se decodificaron solo después de que se analizaron todos los datos.Se utilizó el software GraphPad Prism (San Diego, CA) para realizar todos los análisis estadísticos. Para todas las estadísticas, los valores de p se consideraron significativos en valores <0,05. Para todas las estadísticas, los valores de p se consideraron significativos en valores <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas las estadísticas, los valores de p se consideraron significativos en valores <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas las estadísticas, los valores de p se consideraron significativos en valores <0,05.Se realizó la prueba t de Student de dos colas en los datos con solo 2 comparaciones.Se usó ANOVA unidireccional o bidireccional para determinar la importancia entre múltiples grupos.Al realizar pruebas post hoc, se aplicó la corrección de Tukey para tener en cuenta múltiples comparaciones.Los datos de RNAsec tienen consideraciones estadísticas especiales al calcular FDR y p.adjust como se describe en la sección Métodos.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Informe de investigación de Nature vinculado a este artículo.