Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on CSS-i jaoks piiratud tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Inimese soolestiku morfogenees loob krüpti-villase tunnused 3D epiteeli mikroarhitektuuris ja ruumilises korralduses. See ainulaadne struktuur on vajalik soolestiku homöostaasi säilitamiseks, kaitstes tüvirakkude nišši basaalkrüptis eksogeensete mikroobsete antigeenide ja nende metaboliitide eest. Lisaks esindavad soolevillid ja sekreteeriv lima funktsionaalselt diferentseerunud epiteelirakke, millel on soole limaskesta pinnal kaitsebarjäär. Seetõttu on 3D epiteeli struktuuride taasloomine in vitro soolemudelite konstrueerimisel ülioluline. Märkimisväärne on see, et orgaaniline mimeetiline gut-on-a-chip suudab indutseerida sooleepiteeli spontaanset 3D morfogeneesi, millel on täiustatud füsioloogilised funktsioonid ja biomehaanika. Siin pakume reprodutseeritavat protokolli soolemorfogeneesi tugevaks indutseerimiseks soolestikus nii mikrofluidkiibil kui ka Transwelli manustatud hübriidkiibis. Kirjeldame üksikasjalikke meetodeid seadmete valmistamiseks, Caco-2 või soole organoidsete epiteelirakkude kultiveerimiseks nii tavapärastes tingimustes kui ka mikrofluidplatvormil, 3D morfogeneesi indutseerimiseks ja väljakujunenud 3D epiteeli iseloomustamiseks, kasutades mitut pildistamisviisi. See protokoll saavutab funktsionaalse soole regenereerimise. mikroarhitektuuri, kontrollides basolateraalset vedelikuvoolu 5 päeva jooksul. Meie in vitro morfogeneesi meetod kasutab füsioloogiliselt olulist nihkepinget ja mehaanilist liikumist ning ei vaja keerukat rakkude insenerimist ega manipuleerimist, mis võib olla parem kui teised olemasolevad tehnikad. Meie arvates võiks meie pakutud protokollil olla laialdane mõju biomeditsiiniliste uuringute kogukonnale, pakkudes meetodit 3D-soole epiteelikihtide taastamiseks in vitro biomeditsiiniliste, kliiniliste ja farmaatsiarakenduste jaoks.
Katsed näitavad, et soolestiku epiteeli Caco-2 rakud, mida kultiveeritakse gut-on-a-chip1,2,3,4,5 või kahekihilistes mikrofluidikaseadmetes6,7, võivad in vitro läbida spontaanse 3D morfogeneesi ilma selge arusaamata selle aluseks olevast mehhanismist. Meie hiljutises uuringus leidsime, et basolateraalselt sekreteeritud morfogeeni antagonistide eemaldamine kultuuriseadmetest on vajalik ja piisav 3D epiteeli morfogeneesi esilekutsumiseks in vitro, mida on demonstreeritud Caco-2 ja patsientidelt saadud sooleorganoidide abil. Epiteelirakud valideeriti. Selles uuringus keskendusime spetsiifiliselt tugeva Wnt antagonisti Dickkopf-1 (DKK-1) rakkude tootmisele ja kontsentratsiooni jaotusele kiibil paiknevates soolestikus ja modifitseeritud mikrofluidikaseadmetes, mis sisaldavad Transwelli inserte ja mida nimetatakse "hübriidkiibiks". Me demonstreerime, et eksogeensete Wnt antagonistide (nagu DKK-1, Wnt repressor 1, sekreteeritud frizzled-seotud valk 1 või Soggy-1) lisamine kiibil paiknevale soolestikku pärsib morfogeneesi või häirib eelstruktureeritud 3D epiteelikihti, mis viitab sellele, et antagonistlik stress kultuuri ajal vastutab soole morfogeneesi eest in vitro. Seetõttu on praktiline lähenemisviis epiteeli liidesel tugeva morfogeneesi saavutamiseks Wnt antagonistide taseme eemaldamine või minimaalne säilitamine basolateraalses sektsioonis aktiivse loputamise (nt kiibil paiknevates soolestikus või hübriidkiibi platvormidel) või difusiooni teel. Basolateraalne keskkond (nt Transwelli insertidest suurtesse basolateraalsetesse reservuaaridesse süvendites)
Selles protokollis pakume üksikasjalikku meetodit kiibil olevate gut-on-a-chip mikroseadmete ja Transwelli sisestatavate hübriidkiipide valmistamiseks (etapid 1-5), et kultiveerida soole epiteelirakke polüdimetüülsiloksaanil (PDMS) põhinevatel poorsetel membraanidel (etapid 6A, 7A, 8, 9) või Transwelli sisestatavate polüestermembraanidel (etapid 6B, 7B, 8, 9) ja indutseerida 3D morfogeneesi in vitro (etapp 10). Samuti tuvastasime rakulisi ja molekulaarseid tunnuseid, mis viitavad koespetsiifilisele histogeneesile ja liinist sõltuvale rakkude diferentseerumisele, rakendades mitmeid pildistamisviise (etapid 11-24). Indutseerime morfogeneesi, kasutades inimese soole epiteelirakke, näiteks Caco-2 või soole organoide, kahes kultuuriformaadis koos tehniliste üksikasjadega, sealhulgas poorsete membraanide pinna modifitseerimine, 2D monokihide loomine ning soole biokeemiline ja biomehaanilise mikrokeskkonna reprodutseerimine in vitro. 3D morfogeneesi indutseerimiseks 2D epiteeli monokihidest eemaldasime morfogeeni antagonistid mõlemast kultiveeritud vormist, voolates keskkonda... kultuuri basolateraalne kamber. Lõpuks pakume esitust regenereeruva 3D-epiteelikihi kasulikkusest, mida saab kasutada morfogeenist sõltuva epiteeli kasvu, peremeesorganismi ja mikrobioomi pikisuunaliste ühiskultuuride, patogeeniinfektsiooni, põletikulise kahjustuse, epiteeli barjääri düsfunktsiooni ja probiootikumidel põhinevate ravimeetodite modelleerimiseks. Näide.mõjud.
Meie protokoll võib olla kasulik laiale teadlaste ringile nii põhiuuringutes (nt soole limaskesta bioloogia, tüvirakkude bioloogia ja arengubioloogia) kui ka rakendusuuringutes (nt prekliiniline ravimite testimine, haiguste modelleerimine, koetehnoloogia ja gastroenteroloogia) ning sellel võib olla lai mõju. Kuna meie protokoll on reprodutseeritav ja robustne sooleepiteeli 3D-morfogeneesi indutseerimiseks in vitro, näeme, et meie tehnilist strateegiat saab levitada publikule, kes uurib rakkude signaaliülekande dünaamikat soole arengu, regeneratsiooni või homöostaasi ajal. Lisaks on meie protokoll kasulik erinevate nakkustekitajate, näiteks noroviirus 8, raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 või Vibrio cholerae, põhjustatud infektsioonide uurimiseks. Kasulikud on ka haiguse patoloogia ja patogeneesi sihtrühmad. Kiibil oleva soolestiku mikrofüsioloogiasüsteemi kasutamine võib võimaldada pikisuunalist koekultuuri 10 ja sellele järgnevat peremeesorganismi kaitse, immuunvastuste ja patogeenidega seotud kahjustuste parandamise hindamist seedetraktis (GI) 11. Teisi lekkiva soole sündroomi, tsöliaakia, Crohni tõve, haavandilise koliidi, kuseteede põletiku või ärritunud soole sündroomiga seotud seedetrakti häireid saab simuleerida, kui patsiendi 3D-soole epiteeli kihtide abil valmistatakse 3D-soole epiteeli kihid. Nende haiguste hulka kuuluvad villusatroofia, krüptide lühenemine, limaskesta kahjustus või epiteeli barjääri kahjustus. Biopsia või tüvirakkudest saadud soole organoidid 12,13. Haiguskeskkonna suurema keerukuse paremaks modelleerimiseks võivad lugejad kaaluda haigusega seotud rakutüüpide, näiteks patsiendi perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (PBMC-de), lisamist mudelitele, mis sisaldavad 3D-soole villus-krüpti mikroarhitektuure. Koespetsiifilised immuunrakud, 5.
Kuna 3D epiteeli mikrostruktuuri saab fikseerida ja visualiseerida ilma sektsiooniprotsessita, võivad ruumilise transkriptoomika ja kõrgresolutsiooniga või superresolutsiooniga pildistamisega tegelevad vaatajad olla huvitatud meie geenide ja valkude spatiotemporaalse dünaamika kaardistamisest epiteeli niššides. Huvitatud tehnoloogiast. Reaktsioon mikroobsetele või immuunstimulitele. Lisaks saab 3D soole limaskesta kihis luua pikisuunalise peremeesorganismi ja mikrobioomi vahelise seose 10, 14, mis koordineerib soolestiku homöostaasi, kasvatades koos erinevaid mikroobiliike, mikroobikooslusi või fekaalse mikrobioota, eriti kiibil gut-on-a-chip. platvormil. See lähenemisviis on eriti atraktiivne publikule, kes uurib limaskesta immunoloogiat, gastroenteroloogiat, inimese mikrobioomi, kulturoomikat ja kliinilist mikrobioloogiat ning soovib laboris kultiveerida varem kultiveerimata soolestiku mikrobiootat. Kui meie in vitro morfogeneesi protokolli saab kohandada skaleeritavate kultuurivormingutega, näiteks 24-, 96- või 384-süvendiliste plaatide mitmesüvendiliste insertidega, mis pidevalt täiendavad basolateraalseid sektsioone, saab protokolli levitada ka neile, kes arendavad toiduainetööstusele farmaatsia-, biomeditsiini- või suure läbilaskevõimega sõelumis- või valideerimisplatvorme. Põhimõttelise tõestusena demonstreerisime hiljuti mitmekordse suure läbilaskevõimega morfogeneesi süsteemi teostatavust, mida saab skaleerida 24-süvendilise plaadi formaadile. Lisaks on turustatud mitu organ-kiibil toodet16,17,18. Seetõttu saab meie in vitro morfogeneesi meetodi valideerimist kiirendada ja potentsiaalselt kasutusele võtta paljud uurimislaborid, tööstus või valitsus ja regulatiivsed asutused, et mõista in vitro soolestiku morfogeneesi rakulist ümberprogrammeerimist transkriptoomilisel tasandil ravimite või bioterapeutikumide testimiseks. Ravimikandidaatide imendumist ja transporti hinnati, kasutades 3D-soole surrogaadid või kohandatud või kaubanduslike organ-on-a-chip mudelite kasutamine soolestiku morfogeneesi protsessi reprodutseeritavuse hindamiseks.
Soole epiteeli morfogeneesi uurimiseks on kasutatud piiratud arvul inimese jaoks olulisi eksperimentaalseid mudeleid, peamiselt seetõttu, et puuduvad rakendatavad protokollid 3D-morfogeneesi esilekutsumiseks in vitro. Tegelikult põhineb suur osa praegustest teadmistest soole morfogeneesi kohta loomkatsetel (nt sebrakala20, hiired21 või kanad22). Need on aga töömahukad ja kulukad, võivad olla eetiliselt küsitavad ja mis kõige tähtsam, ei määra täpselt inimese arenguprotsesse. Nende mudelite võimekus mitmesuunaliselt skaleeritaval viisil testida on samuti väga piiratud. Seetõttu ületab meie protokoll 3D-koestruktuuride regenereerimiseks in vitro in vivo loommudeleid ja teisi traditsioonilisi staatilisi 2D-rakukultuuri mudeleid. Nagu varem kirjeldatud, võimaldas 3D-epiteelistruktuuride kasutamine uurida diferentseerunud rakkude ruumilist lokaliseerimist krüpti-villase teljel vastusena erinevatele limaskesta või immuunstimulitele. 3D-epiteelikihid võivad pakkuda ruumi uurida, kuidas mikroobsed rakud konkureerivad ruumiliste niššide moodustamiseks ja ökoloogiliseks evolutsiooniks vastusena peremeesorganismi teguritele (nt sisemine versus välimine limakiht, IgA ja antimikroobsete peptiidide sekretsioon). Lisaks, 3D-epiteeli morfoloogia võimaldab meil mõista, kuidas soole mikrobioota struktureerib oma kooslusi ja sünergistlikult toodab mikroobseid metaboliite (nt lühikese ahelaga rasvhappeid), mis kujundavad rakkude organisatsiooni ja tüvirakkude nišše basaalkrüptides. Neid omadusi saab demonstreerida ainult siis, kui 3D-epiteeli kihid on in vitro loodud.
Lisaks meie meetodile 3D-sooleepiteeli struktuuride loomiseks on mitmeid in vitro meetodeid. Soole organoidkultuur on tipptasemel koetehnoloogia tehnika, mis põhineb soole tüvirakkude kultiveerimisel spetsiifilistes morfogeensetes tingimustes23,24,25. 3D-organoidmudelite kasutamine transpordianalüüsiks või peremeesorganismi ja mikrobioomi ühiskultuurideks on aga sageli keeruline, kuna soole valendik on organoidi sees ja seetõttu on valendiku komponentide, näiteks mikroobrakkude või eksogeensete antigeenide sissetoomine piiratud. Juurdepääsu organoidluumenitele saab parandada mikroinjektori abil26,27, kuid see meetod on invasiivne ja töömahukas ning nõuab eriteadmisi. Lisaks ei kajasta staatilistes tingimustes hüdrogeelkarkassidel hoitud traditsioonilised organoidkultuurid täpselt aktiivset in vivo biomehaanikat.
Mitmete uurimisrühmade poolt kasutatavad teised lähenemisviisid kasutavad soole epiteeli struktuuri jäljendamiseks eelstruktureeritud 3D-hüdrogeelkarkasse, kultiveerides isoleeritud inimese soolerakke geeli pinnal. Valmistage hüdrogeelkarkasse 3D-prinditud, mikrofreesitud või litograafiliselt valmistatud vormide abil. See meetod näitab isoleeritud epiteelirakkude iseorganiseeruvat paigutust in vitro füsioloogiliselt oluliste morfogeenide gradientidega, luues kõrge kuvasuhtega epiteeli struktuuri ja strooma-epiteeli läbilõike, lisades karkassi stroomarakke. Eelstruktureeritud karkasside olemus võib aga takistada spontaanse morfogeneetilise protsessi enda kuvamist. Need mudelid ei paku ka dünaamilist luminaalset ega interstitsiaalset voolu, kuna neil puudub vedeliku nihkepinge, mida soolerakud vajavad morfogeneesi läbimiseks ja füsioloogilise funktsiooni saavutamiseks. Teises hiljutises uuringus kasutati hüdrogeelkarkasse mikrofluidilises platvormis ja mustrilisi soole epiteeli struktuure lasersöövitustehnikate abil. Hiire sooleorganoidid järgivad söövitatud mustreid, et moodustada soole torukujulisi struktuure, ja luminaalset vedeliku voolu saab mikrofluidika mooduli abil uuesti kokku võtta. See mudel aga ei näita spontaanseid morfogeneetilisi protsesse ega hõlma soolestiku mehanobioloogilised liikumised. Sama grupi 3D-printimise tehnikad suutsid luua miniatuurseid soolestiku torusid spontaansete morfogeneetiliste protsessidega. Vaatamata erinevate soolestiku segmentide keerulisele valmistamisele torus puudub sellel mudelil ka luminaalse vedeliku vool ja mehaaniline deformatsioon. Lisaks võib mudeli toimivus olla piiratud, eriti pärast bioprintimise protsessi lõppu, häirides katsetingimusi või rakkudevahelisi interaktsioone. Selle asemel pakub meie pakutud protokoll spontaanset soolestiku morfogeneesi, füsioloogiliselt olulist nihkepinget, biomehaanikat, mis jäljendab soolestiku motoorikat, ligipääsu sõltumatutele apikaalsetele ja basolateraalsetele sektsioonidele ning keerukate modulaarsete bioloogiliste mikrokeskkondade taasloomist. Seetõttu võib meie in vitro 3D-morfogeneesi protokoll pakkuda täiendavat lähenemisviisi olemasolevate meetodite väljakutsete ületamiseks.
Meie protokoll keskendub täielikult 3D epiteeli morfogeneesile, kusjuures kultuuris on ainult epiteelirakud ja puuduvad muud tüüpi ümbritsevad rakud, näiteks mesenhümaalsed rakud, endoteelirakud ja immuunrakud. Nagu varem kirjeldatud, on meie protokolli tuumaks epiteeli morfogeneesi indutseerimine, eemaldades sisseviidud söötme basolateraalsel küljel sekreteeritavad morfogeeni inhibiitorid. Kuigi meie gut-on-a-chip ja hybrid-on-a-chip tugev modulaarsus võimaldab meil taastada lainelise 3D epiteelikihi, tuleb edasi kaaluda täiendavaid bioloogilisi keerukusi, nagu epiteeli-mesenhümaalsed interaktsioonid33,34, rakuvälise maatriksi (ECM) ladestumine35 ja meie mudelis krüpti-villuse tunnused, mis kannavad tüvirakkude nišše basaalsetes krüptides. Mesenhüümi stroomarakud (nt fibroblastid) mängivad võtmerolli ECM-valkude tootmisel ja soole morfogeneesi reguleerimisel in vivo35,37,38. Mesenhümaalsete rakkude lisamine meie mudelisse parandas morfogeneetilist protsessi ja rakkude kinnitumise efektiivsust. Endoteelikiht (st kapillaarid või lümfisooned) mängib olulist rolli molekulaarne transport39 ja immuunrakkude värbamine40 soolestiku mikrokeskkonnas. Lisaks on veresoonkonna komponendid, mida saab koemudelite vahel ühendada, eeltingimuseks koemudelite kavandamisel mitme organi interaktsioonide demonstreerimiseks. Seetõttu võib olla vaja kaasata endoteelirakke, et modelleerida täpsemaid füsioloogilisi tunnuseid organitaseme resolutsiooniga. Patsiendilt pärinevad immuunrakud on olulised ka kaasasündinud immuunvastuste, antigeeni esitlemise, kaasasündinud adaptiivse immuunvastuse ja koespetsiifilise immuunsuse kuvamiseks soolehaiguste jäljendamise kontekstis.
Hübriidkiipide kasutamine on lihtsam kui soolestik-kiibil meetod, kuna seadme seadistamine on lihtsam ja Transwelli insertide kasutamine võimaldab sooleepiteeli skaleeritavat kultuuri. Kaubanduslikult saadaval olevad polüestermembraanidega Transwelli insertid ei ole aga elastsed ega suuda simuleerida peristaltilise liikumise sarnaseid liikumisi. Lisaks jäi hübriidkiibile asetatud Transwelli inserti apikaalne kamber paigale ilma apikaalse külje nihkepingeta. On selge, et apikaalse sektsiooni staatilised omadused võimaldavad harva hübriidkiipides pikaajalist bakterite ühiskultuuri. Kuigi hübriidkiipide kasutamisel saame Transwelli insertides kindlalt esile kutsuda 3D-morfogeneesi, võib füsioloogiliselt olulise biomehaanika ja apikaalse vedeliku voolu puudumine piirata hübriidkiibiplatvormide teostatavust potentsiaalsete rakenduste jaoks.
Inimese krüpti-hattu telje täismõõdulisi rekonstruktsioone kiibisoole ja hübriid-kiibikultuurides pole veel täielikult välja töötatud. Kuna morfogenees algab epiteeli monokihist, ei taga 3D-mikroarhitektuurid tingimata morfoloogilist sarnasust krüptidega in vivo. Kuigi me iseloomustasime proliferatiivset rakkude populatsiooni mikroinseneri abil loodud 3D-epiteeli basaalse krüpti domeeni lähedal, ei olnud krüpti ja hattu piirkonnad selgelt piiritletud. Kuigi kiibi kõrgemad ülemised kanalid suurendavad mikroinseneri abil loodud epiteeli kõrgust, on maksimaalne kõrgus siiski piiratud ~300–400 µm-ga. Inimese soolekrüptide tegelik sügavus peen- ja jämesooles on vastavalt ~135 µm ja ~400 µm ning peensoole hattude kõrgus on ~600 µm41.
Pildistamise seisukohast võib 3D-mikroarhitektuuride kohapealne üliresolutsiooniline pildistamine piirduda kiibil oleva soolestikuga, kuna objektiivi ja epiteelikihi vaheline töökaugus on suurusjärgus paar millimeetrit. Selle probleemi lahendamiseks võib olla vaja kaugemat objektiivi. Lisaks on õhukeste sektsioonide valmistamine pildistamisproovi ettevalmistamiseks keeruline PDMS-i suure elastsuse tõttu. Lisaks, kuna soolestiku kiht-kihilt mikrotootmine kiibil hõlmab iga kihi vahel püsivat adhesiooni, on epiteelikihi pinnastruktuuri uurimiseks ülemise kihi avamine või eemaldamine äärmiselt keeruline. Näiteks skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) abil.
PDMS-i hüdrofoobsus on olnud piiravaks teguriks hüdrofoobsete väikeste molekulidega tegelevates mikrofluidikapõhistes uuringutes, kuna PDMS suudab selliseid hüdrofoobseid molekule mittespetsiifiliselt adsorbeerida. PDMS-i alternatiive võib kaaluda teiste polümeersete materjalidega. Teise võimalusena võib kaaluda PDMS-i pinna modifitseerimist (nt katmine lipofiilsete materjalidega 42 või polü(etüleenglükooliga) 43), et minimeerida hüdrofoobsete molekulide adsorptsiooni.
Lõpuks, meie meetodit pole veel hästi iseloomustatud suure läbilaskevõimega sõeluuringu või universaalse kasutajasõbraliku eksperimentaalse platvormi pakkumise osas. Praegune protokoll nõuab iga mikroseadme kohta süstlapumpa, mis võtab CO2 inkubaatoris ruumi ja takistab suuremahulisi katseid. Seda piirangut saab oluliselt parandada uuenduslike kultuurivormingute skaleeritavusega (nt 24-, 96- või 384-süvendiga poorsed sisetükid, mis võimaldavad basolateraalse söötme pidevat täiendamist ja eemaldamist).
Inimese sooleepiteeli 3D-morfogeneesi esilekutsumiseks in vitro kasutasime mikrofluidset kiibi sooleseadet, mis sisaldas kahte paralleelset mikrokanalit ja nende vahel elastset poorset membraani, et luua luumeni-kapillaari liides. Samuti demonstreerime ühekanalilise mikrofluidse seadme (hübriidkiibi) kasutamist, mis tagab pideva basolateraalse voolu Transwelli insertidele kasvatatud polariseeritud epiteelikihtide all. Mõlemal platvormil saab demonstreerida erinevate inimese sooleepiteelirakkude morfogeneesi, rakendades voolu suunatud manipuleerimist, et eemaldada morfogeeni antagonistid basolateraalsest sektsioonist. Kogu eksperimentaalne protseduur (joonis 1) koosneb viiest osast: (i) soolekiibi või Transwelli sisestatava hübriidkiibi mikrotootmine (etapid 1-5; kast 1), (ii) sooleepiteelirakkude (Caco-2 rakud) või inimese sooleorganoidide ettevalmistamine; kastid 2–5), (iii) sooleepiteelirakkude kultiveerimine soolekiipidel või hübriidkiipidel (etapid 6–9), (iv) 3D-morfogeneesi indutseerimine in vitro (etapp 10) ja (v) 3D-epiteeli mikrostruktuuri iseloomustamiseks (etapid 11–24). Lõpuks loodi sobiv kontrollrühm (mida käsitletakse allpool lähemalt), et valideerida in vitro morfogeneesi efektiivsust, võrreldes epiteeli morfogeneesi ruumiliste, ajaliste, tingimuslike või protseduuriliste kontrollidega.
Kasutasime kahte erinevat kultuuriplatvormi: sirgete kanalitega gut-on-a-chip või mittelineaarsete keerdkanalitega hübriidkiipe või Transwelli (TW) insertidega hübriidkiipe mikrofluidseadmes, mis on valmistatud kastis 1 kirjeldatud viisil ja etapid 1–5. „Seadme valmistamine“ näitavad ühe kiibi või hübriidkiibi valmistamise peamisi samme. „Inimese sooleepiteelirakkude kultiveerimine“ selgitab selles protokollis kasutatavat rakkude allikat (Caco-2 või inimese soole organoidid) ja kultiveerimisprotseduuri. „In vitro morfogenees“ näitab üldisi samme, mille käigus Caco-2 või organoididest saadud epiteelirakke kultiveeritakse soolekiibil või hübriidkiibi Transwelli insertidel, millele järgneb 3D-morfogeneesi indutseerimine ja iseloomustatud epiteelistruktuuri moodustumine. Programmi etapi number või kasti number kuvatakse iga noole all. Rakendus pakub näiteid selle kohta, kuidas väljakujunenud sooleepiteelikihte saab kasutada näiteks rakkude diferentseerumise iseloomustamiseks, soolefüsioloogia uuringuteks, peremeesorganismi ja mikrobioomi ökosüsteemide loomiseks ja haiguste modelleerimiseks. Immunofluorestsentspildid jaotises „Rakkude diferentseerumine“ näitavad tuumasid, F-aktiini ja MUC2 ekspresseerub sooleseina kiibil genereeritud 3D Caco-2 epiteelikihis. MUC2 signaaliülekanne esineb karikrakkudes ja limaskestadelt erituvas limas. Fluorestseeruvad pildid Gut Physiology's näitavad lima, mis on toodetud siaalhappe ja N-atsetüülglükosamiini jääkide värvimisel fluorestseeruva nisuidu aglutiniini abil. Kaks kattuvat pilti jaotises „Peremeesorganismi ja mikroobide kokultuurid” näitavad tüüpilisi peremeesorganismi ja mikrobioomi kokultuure soolestikus kiibil. Vasakpoolne paneel näitab rohelist fluorestseeruvat valku (GFP) ekspresseeriva E. coli kokultuuri mikroinseneritud 3D Caco-2 epiteelirakkudega. Parempoolne paneel näitab GFP E. coli lokaliseerimist, mida kultiveeriti koos 3D Caco-2 epiteelirakkudega, millele järgnes immunofluorestsentsvärvimine F-aktiiniga (punane) ja tuumadega (sinine). Haiguse modelleerimine illustreerib terve ja lekkiva soole erinevust soolepõletiku kiipides füsioloogilise koormuse all bakteriaalsete antigeenide (nt lipopolüsahhariid, LPS) ja immuunrakkudega (nt PBMC; roheline). Caco-2 rakke kultiveeriti 3D epiteelikihi loomiseks. Skaala tulp, 50 µm. Alumise rea pildid: „Rakkude diferentseerumine“, mugandatud viitest 2 saadud loal. Oxford University Press; reprodutseeritud viitest 5 saadud loal. NAS; „Peremeesorganismi ja mikroobi kooskultuur“, mugandatud viitest 3 saadud loal. NAS; „Haiguste modelleerimine“, mugandatud viitest 5 saadud loal. NAS.
Nii soolestik-kiibile kui ka hübriidkiibid valmistati PDMS-koopiate abil, mis võeti silikoonvormidest pehme litograafia abil lahti1,44 ja mustriti SU-8-ga. Iga kiibi mikrokanalite disain määratakse kindlaks, võttes arvesse hüdrodünaamikat, nagu nihkepinge ja hüdrodünaamiline rõhk1,4,12. Algne soolestik-kiibile disain (laiendatud andmed, joonis 1a), mis koosnes kahest kõrvuti asetsevast paralleelsest sirgest mikrokanalist, on arenenud keeruliseks soolestik-kiibile (laiendatud andmed, joonis 1b), mis sisaldab paari kõverat mikrokanalit, et indutseerida suurenenud vedeliku viibimisaega, mittelineaarseid voolumustreid ja kultiveeritud rakkude mitmeteljelist deformatsiooni (joonis 2a–f)12. Kui on vaja taastada keerukamat soole biomehaanikat, saab valida keerulised soolestik-kiibile. Oleme näidanud, et keerdunud Gut-Chip indutseerib tugevalt ka 3D-morfogeneesi sarnase aja jooksul ja sarnase epiteeli kasvuastmega võrreldes algse Gut-Chipiga, olenemata kultiveeritud rakutüüp. Seega on 3D-morfogeneesi esilekutsumiseks lineaarsed ja keerulised kiibil olevad soolestiku kujundused omavahel asendatavad. SU-8 mustritega ränivormidel kõvendatud PDMS-koopiad andsid pärast vormist eemaldamist negatiivseid omadusi (joonis 2a). Soolestiku valmistamiseks kiibil liideti ettevalmistatud ülemine PDMS-kiht järjestikku poorse PDMS-kilega ja seejärel joondati alumise PDMS-kihiga pöördumatu liimimise teel, kasutades koroonatöötlusseadet (joonis 2b–f). Hübriidkiipide valmistamiseks liideti kõvendatud PDMS-koopiad klaasplaatidele, et luua ühekanalilised mikrofluidilised seadmed, mis mahutavad Transwelli sisestusi (joonis 2h ja laiendatud andmed joonisel 2). Liimimisprotsess viiakse läbi PDMS-koopia ja klaasi pindade töötlemisel hapnikuplasma või koroonatöötlusega. Pärast silikoontoru külge kinnitatud mikrotoodetud seadme steriliseerimist oli seadme seadistus valmis sooleepiteeli 3D-morfogeneesi teostamiseks (joonis 2g).
a, SU-8 mustriga ränivormidest PDMS-i osade valmistamise skemaatiline illustratsioon. Kõvendamata PDMS-i lahus valati ränivormi (vasakul), kõvendati temperatuuril 60 °C (keskel) ja vormist lahti võeti (paremal). Vormist lahti võetud PDMS lõigati tükkideks ja puhastati edasiseks kasutamiseks. b, PDMS-i ülemise kihi valmistamiseks kasutatud ränivormi foto. c, PDMS-i poorse membraani valmistamiseks kasutatud ränivormi foto. d, PDMS-i ülemise ja alumise komponendi ning kokkupandud kiibil oleva sooleseadme fotoseeria. e, PDMS-i ülemise, membraani ja alumise komponendi joondamise skeem. Iga kiht on pöördumatult ühendatud plasma- või koroonatöötlusega. f, Valmistatud kiibil oleva sooleseadme skeem koos üksteise peale asetatud keerdunud mikrokanalite ja vaakumkambritega. g, Mikrofluidse rakukultuuri jaoks mõeldud kiibil oleva soole seadistamine. Silikoontoru ja süstlaga kokku pandud valmistatud kiibil olev soolestik asetati katteklaasile. Kiibiseade asetati 150 mm Petri tassi kaanele. töötlemine. Sideainet kasutatakse silikoontoru sulgemiseks. h, Hübriidkiibi valmistamise ja 3D-morfogeneesi visuaalsed hetktõmmised hübriidkiipide abil. Sooleepiteelirakkude 2D-monokihide kultiveerimiseks eraldi valmistatud Transwelli insertid sisestati hübriidkiibi, et indutseerida soole 3D-morfogeneesi. Keskkonda perfundeeritakse mikrokanalite kaudu Transwelli insertile loodud rakukihi all. Skaalariba, 1 cm. h Avaldatud viite loal. 4. Elsevier.
Selles protokollis kasutati epiteeliallikatena Caco-2 rakuliini ja sooleorganoide (joonis 3a). Mõlemat tüüpi rakke kultiveeriti iseseisvalt (kast 2 ja kast 5) ning neid kasutati kiibil olevate soole- või Transwelli insertide ECM-kattega mikrokanalite külvamiseks. Kui rakud on konfluentsed (>95% katvus kolbides), kogutakse tavapäraselt kultiveeritud Caco-2 rakke (passaažide 10 ja 50 vahel) T-kolbides, et valmistada trüpsiniseerimisvedeliku abil dissotsieerunud rakususpensioone (kast 2). Inimese soolebiopsiatest või kirurgilistest resektsioonidest saadud sooleorganoide kultiveeriti Matrigeli karkasskuplites 24-süvendilistel plaatidel, et toetada struktuurilist mikrokeskkonda. Olulisi morfogeene (nagu Wnt, R-spondiin ja Noggin) ja kastis 3 kirjeldatud viisil valmistatud kasvufaktoreid sisaldavat keskkonda täiendati ülepäeviti, kuni organoidide läbimõõt ulatus ~500 µm-ni. Täielikult kasvanud organoidid kogutakse ja dissotsieeritakse üksikuteks rakkudeks külvamiseks kiibil olevatele soole- või Transwelli insertidele (kast 5). Nagu me varem oleme teatanud, saab seda diferentseerida vastavalt haiguse tüübile12,13 (nt haavandiline koliit, Crohni tõbi, kolorektaalvähk või normaalne doonor), kahjustuse asukohale (nt kahjustus versus kahjustamata piirkond) ja seedetrakti asukohale (nt kaksteistsõrmiksool, tühisool, niudesool, pimesool, käärsool või pärasool). Kastis 5 pakume optimeeritud protokolli käärsoole organoidide (koloidide) kultiveerimiseks, mis tavaliselt vajavad suuremaid morfogeenide kontsentratsioone kui peensoole organoidid.
a, Töövoog soole morfogeneesi indutseerimiseks soole kiibil. Selles protokollis kasutatakse Caco-2 inimese soole epiteeli ja soole organoide 3D morfogeneesi demonstreerimiseks. Isoleeritud epiteelirakud külvati ettevalmistatud gut-on-a-chip seadmesse (kiibi ettevalmistamine). Kui rakud on külvatud ja kinnitatud PDMS poorsele membraanile 0. päeval (D0), käivitatakse apikaalne (AP) vool ja seda hoitakse esimese 2 päeva jooksul (vool, AP, D0-D2). Samuti käivitatakse basolateraalne (BL) vool koos tsükliliste venitusliigutustega (venitus, vool, AP ja BL), kui moodustub täielik 2D monokiht. Soole 3D morfogenees toimus spontaanselt pärast 5-päevast mikrofluidkultuuri (morfogenees, D5). Faasikontrastpildid näitavad Caco-2 rakkude representatiivset morfoloogiat igas eksperimentaalses etapis või ajapunktis (tulpdiagramm, 100 µm). Neli skemaatilist diagrammi, mis illustreerivad vastavaid soole morfogeneesi kaskaade (üleval paremal). Skeemil olevad katkendlikud nooled tähistavad suunda Vedelikuvool.b, SEM-pilt, mis näitab väljakujunenud 3D Caco-2 epiteeli pinnatopoloogiat (vasakul). Suurendatud ala esiletõstev sisestus (valge katkendlik kast) näitab regenereerunud mikroville 3D Caco-2 kihil (paremal).c, Väljakujunenud Caco-2 3D horisontaalne frontaalvaade, klaudiin (ZO-1, punane) ja pidevad harjasäärisega membraanid, mis on märgistatud F-aktiiniga (roheline) ja tuumadega (sinine). Epiteelirakkude immunofluorestsents-konfokaalne visualiseerimine soolekiipidel. Keskmisele skeemile osutavad nooled näitavad iga konfokaalse vaate fokaaltasandi asukohta.d, Kiibil kultiveeritud organoidide morfoloogiliste muutuste ajaline kulg, mis on saadud faasikontrastmikroskoopia abil 3., 7., 9., 11. ja 13. päeval. Sisestus (üleval paremal) näitab esitatud pildi suurt suurendust.e, DIC-mikrofoto soolestikus väljakujunenud organoidsest 3D epiteelist, mis on tehtud 7. päeval.f, Kattuvad immunofluorestsentspildid, mis näitavad tüvirakkude (LGR5; magenta) ja karikrakkude (MUC2; roheline) markereid. F-aktiin (hall) ja tuumad (tsüaan), mida kasvatati vastavalt 3 päeva soolestiku kiipide peal (vasakul) ja 13-päevased (keskel) organoidid epiteelikihil. Vt ka laiendatud andmete joonis 3, mis toob esile LGR5 signaaliülekande ilma MUC2 signaaliülekandeta. Fluorestsentspildid, mis näitavad 3D organoidse epiteeli epiteeli mikrostruktuuri (paremal), mis on loodud soolestikus kiibil plasmamembraani värvimisega CellMask värvainega (paremal) kultiveerimise 13. päeval. Skaalariba on 50 μm, kui pole teisiti märgitud. b Kordustrükk viite loal.2. Oxford University Press; c Kohandatud viite loal.2. Oxford University Press; e ja f kohandatud viite loal.12 Creative Commonsi litsentsi CC BY 4.0 alusel.
Kiibi soolestikus on vaja PDMS-i poorse membraani hüdrofoobset pinda modifitseerida, et saavutada edukas ECM-katmine. Selles protokollis rakendame PDMS-membraanide hüdrofoobsuse muutmiseks kahte erinevat meetodit. Caco-2 rakkude kultiveerimiseks piisas UV/osooniga pinna aktiveerimisest, et vähendada PDMS-i pinna hüdrofoobsust, katta ECM ja kinnitada Caco-2 rakud PDMS-i membraanile. Organoidse epiteeli mikrofluidne kultiveerimine nõuab aga keemilisel alusel pinna funktsionaliseerimist, et saavutada ECM-valkude efektiivne ladestumine, kandes PDMS-i mikrokanalitele järjestikku polüetüleenimiini (PEI) ja glutaraldehüüdi. Pärast pinna modifitseerimist sadestati ECM-valgud funktsionaliseeritud PDMS-i pinna katmiseks ja seejärel viidi isoleeritud organoidsesse epiteeli. Pärast rakkude kinnitumist alustatakse mikrofluidse rakukultuuriga ainult keskkonna perfundeerimist ülemisse mikrokanalisse, kuni rakud moodustavad tervikliku monokihi, samal ajal kui alumine mikrokanal säilitab staatilised tingimused. See optimeeritud pinna aktiveerimise ja ECM-katmise meetod võimaldab organoidse epiteeli kinnitumist, et indutseerida 3D-morfogeneesi PDMS-i pinnal.
Transwelli kultuurid vajavad enne rakkude külvamist ka ECM-katet; Transwelli kultuurid ei vaja aga keerulisi eeltöötlusetappe poorsete insertide pinna aktiveerimiseks. Caco-2 rakkude kasvatamiseks Transwelli insertidel kiirendab poorsete insertide ECM-kate dissotsieerunud Caco-2 rakkude kinnitumist (<1 tund) ja tiheda ühendusbarjääri moodustumist (<1-2 päeva). Organoidide kultiveerimiseks Transwelli insertidel külvatakse isoleeritud organoidid ECM-kattega insertidele, kinnitatakse membraani pinnale (<3 tundi) ja hoitakse seni, kuni organoidid moodustavad tervikliku monokihi, millel on barjääri terviklikkus. Transwelli kultuurid viiakse läbi 24-süvendilistel plaatidel ilma hübriidkiipe kasutamata.
In vitro 3D-morfogeneesi saab käivitada vedelikuvoolu rakendamisega väljakujunenud epiteelikihi basolateraalsele küljele. Kiibi soolestikus algas epiteeli morfogenees siis, kui keskkond perfundeeriti ülemisse ja alumisse mikrokanalisse (joonis 3a). Nagu eelnevalt kirjeldatud, on kriitilise tähtsusega vedelikuvoolu sisseviimine alumisse (basolateraalsesse) sektsiooni, et pidevalt eemaldada suunatud sekreteeritud morfogeeni inhibiitoreid. Poorsetele membraanidele kinnitunud rakkudele piisava toitainete ja seerumi tagamiseks ning luminaalse nihkepinge tekitamiseks rakendame kiibi soolestikus tavaliselt kahekordset voolu. Hübriidkiipides sisestati hübriidkiipidesse epiteeli monokihte sisaldavad Transwelli insertid. Seejärel kanti keskkond poorse Transwelli inserdi basolateraalse külje alla mikrokanali kaudu. Soole morfogenees toimus 3-5 päeva pärast basolateraalse voolu alustamist mõlemas kultuuriplatvormis.
Mikroinseneri abil loodud 3D-epiteelikihtide morfoloogilisi tunnuseid saab analüüsida mitmesuguste pildistamismeetodite abil, sealhulgas faasikontrastmikroskoopia, diferentsiaalse interferentsi kontrastmikroskoopia (DIC), SEM-i või immunofluorestsents-konfokaalse mikroskoopia abil (joonised 3 ja 4). Faasikontrast- ehk DIC-kuvamist saab hõlpsasti teha igal ajal kultiveerimise ajal, et jälgida 3D-epiteelikihtide kuju ja eendit. Tänu PDMS-i ja polüesterkilede optilisele läbipaistvusele saavad nii kiibi-sisu- kui ka hübriidkiibiplatvormid pakkuda reaalajas in situ pildistamist ilma seadme lõikamise või lahtivõtmise vajaduseta. Immunofluorestsentskuvamise tegemisel (joonised 1, 3c, f ja 4b, c) fikseeritakse rakud tavaliselt 4% (massiprotsent/mahtprotsent) paraformaldehüüdiga (PFA), millele järgnevad Triton X-100 ja 2% (massiprotsent/mahtprotsent) veise seerumi albumiin (BSA), selles järjekorras. Sõltuvalt rakutüübist saab kasutada erinevaid fikseerivaid aineid, permeabilisaatoreid ja blokeerivaid aineid. Liikumatute rakkude esiletõstmiseks kasutatakse primaarseid antikehi, mis on suunatud liinist sõltuvatele rakkudele või piirkondadele. kiibil kohapeal, millele järgnevad sekundaarsed antikehad koos kontrastvärviga, mis on suunatud kas tuumale (nt 4',6-diamidino-2-fenüleen)indool, DAPI) või F-aktiinile (nt fluorestsentsmärgistatud falloidiin). Fluorestsentsil põhinevat reaalajas pildistamist saab teha ka kohapeal, et tuvastada lima tootmist (joonis 1, „Rakkude diferentseerumine“ ja „Soolestiku füsioloogia“), mikroobirakkude juhuslikku koloniseerimist (joonis 1, „Peremeesorganismi ja mikroobi kooskultuur“), immuunrakkude värbamist (joonis 1, „Haiguse modelleerimine“) või 3D epiteeli morfoloogia kontuure (joonis 3c, f ja 4b, c). Kui kiibil olevat soolestikku modifitseeritakse, et eraldada ülemine kiht alumisest mikrokanali kihist, nagu on kirjeldatud viites. Nagu on näidatud joonisel 2, saab 3D epiteeli morfoloogiat ja apikaalse harja serva mikrovilli visualiseerida SEM-i abil (joonis 3b). Diferentseerumismarkerite ekspressiooni saab hinnata kvantitatiivse PCR5 või üherakulise RNA sekveneerimise abil. Sel juhul kogutakse trüpsiinimise teel soolestiku kiipides või hübriidkiipides kasvatatud epiteelirakkude 3D-kihid ja seejärel kasutatakse neid molekulaarseks või geneetiliseks analüüsiks.
a, Hübriidkiibi soolemorfogeneesi indutseerimise töövoog. Selles protokollis kasutatakse Caco-2 ja sooleorganoide, et demonstreerida 3D-morfogeneesi hübriidkiibi platvormil. Dissotsieerunud epiteelirakud külvati ettevalmistatud Transwelli insertidesse (TW ettevalmistus; vt allolevat joonist). Kui rakud olid külvatud ja Transwelli insertides polüestermembraanidele kinnitatud, kultiveeriti kõiki rakke staatilistes tingimustes (TW kultuur). 7 päeva pärast integreeriti hübriidkiibi üks Transwelli insert, mis sisaldas epiteelirakkude 2D monokihti, et sisse viia basolateraalne vool (Flow, BL), mis viis lõpuks 3D epiteelikihi tekkeni (morfogenees). Faasikontrastmikrofotod, mis näitavad normaalse doonori (C103 liin) tõusvast käärsoolest saadud inimese organi epiteelirakkude morfoloogilisi tunnuseid igas eksperimentaalses etapis või ajapunktis. Ülemiste kihtide skeemid illustreerivad iga etapi eksperimentaalset konfiguratsiooni. b, Hübriidkiibid (vasakpoolne skeem) võivad viia organoidsete epiteelirakkude 3D-morfogeneesini, kasutades ülalt-alla konfokaalse mikroskoopia vaateid erinevates Z-positsioonides (ülemine, keskmine ja alumine; vt parempoolset skeemi ja vastavaid punktiirjooni). näitasid ilmseid morfoloogilisi tunnuseid. F-aktiin (tsüaan), tuum (hall). c, Staatilises Transwelli (TW; valge katkendliku kasti sees olev sisestus) ja hübriidkiibi (suurim täisvõte) kultiveeritud organoidse päritoluga epiteelirakkude fluorestsentskonfokaalsed mikrofotod (3D nurgavaade), võrreldes vastavalt 2D ja 3D morfoloogiat. Paar 2D vertikaalset ristlõiget (paremas ülanurgas olev sisestus; „XZ“) näitavad ka 2D ja 3D tunnuseid. Skaalariba, 100 µm. c Kordustrükk viite loal. 4. Elsevier.
Kontrollproove saab valmistada samade rakkude (Caco-2 või soole organoidsete epiteelirakkude) kultiveerimise teel kahemõõtmelisteks monokihideks tavapärastes staatilistes kultuuritingimustes. Märkimisväärne on toitainete ammendumine mikrokanalite piiratud mahutavuse tõttu (st ~4 µL ülemises kanalis algsel soole-kiibi disainil). Seega saab võrrelda ka epiteeli morfoloogiat enne ja pärast basolateraalse voolu rakendamist.
Pehme litograafia protsess tuleks läbi viia puhtas ruumis. Iga kiibi kihi (ülemine ja alumine kiht ning membraanid) ja hübriidkiibi jaoks kasutati erinevaid fotomaske, mis valmistati eraldi räniplaatidele, kuna mikrokanalite kõrgused olid erinevad. Kiibi soole ülemise ja alumise mikrokanali sihtmärgi kõrgused on vastavalt 500 µm ja 200 µm. Hübriidkiibi kanali sihtmärgi kõrgus on 200 µm.
Aseta 3-tolline ränivahvel atsetooniga anumasse. Keeruta plaati õrnalt 30 sekundit ja kuivata seejärel vahvel õhu käes. Vii vahvel IPA-ga plaadile ja tsentrifuugi plaati 30 sekundit puhastamiseks.
Orgaaniliste jääkide eemaldamise maksimeerimiseks räniplaadi pinnalt võib valikuliselt kasutada piraaja lahust (vesinikperoksiidi ja kontsentreeritud väävelhappe segu, 1:3 (maht/maht)).
Piraaja lahus on äärmiselt söövitav ja tekitab kuumust. Vajalikud on täiendavad ohutusabinõud. Jäätmete kõrvaldamiseks laske lahusel jahtuda ja valage see puhtasse, kuiva jäätmekonteinerisse. Kasutage teiseseid konteinereid ja märgistage jäätmekonteinerid korralikult. Täpsemate protseduuride saamiseks järgige asutuse ohutusjuhiseid.
Vahvlite kuivatamiseks asetage need 10 minutiks 200 °C kuumutusplaadile. Pärast kuivatamist loksutage vahvlit viis korda õhu käes jahtuma.
Vala puhastatud ränivahvli keskele ~10 g fotoresist SU-8 2100. Jaota fotoresist vahvlile ühtlaselt pintsettidega. Aseta vahvel aeg-ajalt 65 °C kuumale plaadile, et fotoresist oleks vähem kleepuv ja kergemini määritav. Ära aseta vahvlit otse kuumale plaadile.
SU-8 jaotati vahvlile ühtlaselt tsentrifuugkatmise abil. Programmeerige SU-8 sissetulev pöörlemine 5–10 sekundiks, et levida kiirusel 500 p/min kiirendusega 100 p/min/s. Seadke peamine pöörlemine 200 µm paksuse mustri loomiseks kiirusel 1500 p/min või saavutage 250 µm paksus (tegemine teeb kiibi soole ülemise kihi jaoks 500 µm kõrguse; vt allpool „Kriitilised sammud“) kiirendusega 300 p/min/s 30 sekundit kiirusel 1200 p/min.
Peamist tsentrifuugimiskiirust saab reguleerida vastavalt räniplaadil oleva SU-8 mustri sihtpaksusele.
Kiibi soole ülemise kihi jaoks 500 µm kõrguste SU-8 mustrite valmistamiseks korrati selle karbi tsentrifuugkatmise ja pehme küpsetamise etappe (etapid 7 ja 8) järjestikku (vt etapp 9), et saada kaks 250 µm paksust SU-8 kihti, mida saab selle karbi 12. etapis UV-kiirgusega kihistada ja ühendada, moodustades 500 µm kõrguse kihi.
Küpseta SU-8-ga kaetud vahvleid pehmeks, asetades vahvlid ettevaatlikult kuumale plaadile temperatuuril 65 °C 5 minutiks, seejärel lülita temperatuur 95 °C-ni ja inkubeerides veel 40 minutit.
Ülemises mikrokanalis SU-8 mustri 500 μm kõrguse saavutamiseks korrake samme 7 ja 8, et genereerida kaks 250 μm paksust SU-8 kihti.
UV-maski joondaja abil tehke lambitest vastavalt tootja juhistele, et arvutada kiibi säritusaeg (säritusaeg, ms) = (säritusdoos, mJ/cm2)/(lambi võimsus, mW/cm2).
Pärast säriaja määramist asetage fotomask UV-maski joondaja maskihoidikule ja asetage fotomask SU-8-ga kaetud vahvlile.
UV-kiirguse hajumise minimeerimiseks asetage fotomaski trükitud pind otse ränivahvli SU-8-ga kaetud küljele.
Säilitage SU-8-ga kaetud vahvlit ja fotomaski vertikaalselt 260 mJ/cm2 UV-valgusega etteantud säriaja jooksul (vt käesoleva kasti 10. samm).
Pärast UV-kiirgusega kokkupuudet küpsetati SU-8-kattega ränivahvleid igal kuumutusplaadil temperatuuril 65 °C 5 minutit ja temperatuuril 95 °C 15 minutit, et valmistada 200 μm kõrguseid mustreid. Pikendage järelküpsetusaega temperatuuril 95 °C 30 minutini, et valmistada 500 µm kõrgusi mustreid.
Ilmuti valatakse klaasnõusse ja küpsetatud vahvel asetatakse nõusse. SU-8 ilmuti maht võib varieeruda sõltuvalt klaasplaadi suurusest. Veenduge, et kasutate piisavalt SU-8 ilmutit, et täielikult eemaldada valgustamata SU-8. Näiteks 150 mm läbimõõduga ja 1-liitrise mahutavusega klaasnõu kasutamisel kasutage ~300 ml SU-8 ilmutit. Ilmutage vormi 25 minutit, aeg-ajalt õrnalt pöörates.
Loputage ilmutuslahustunud vormi ~10 ml värske ilmutuslahusega ja seejärel IPA-ga, pihustades lahust pipeti abil.
Asetage vahvel plasmapuhastisse ja puutuge kokku hapnikuplasmaga (atmosfäärigaas, sihtrõhk 1 × 10−5 Torri, võimsus 125 W) 1,5 minuti jooksul.
Asetage vahvel vaakumeksikaatorisse, mille sees on klaasslaid. Vahvlid ja slaidid saab asetada kõrvuti. Kui vaakumeksikaator on plaadiga jagatud mitmeks kihiks, asetage slaidid alumisse kambrisse ja vahvlid ülemisse kambrisse. Tilgutage 100 μL trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktüül)silaani lahust klaasslaidile ja rakendage silaniseerimiseks vaakumit.
Sulata külmutatud Caco-2 rakkudega viaal 37 °C veevannis ja seejärel vii sulatatud rakud T75 kolbi, mis sisaldab 15 ml 37 °C eelsoojendatud Caco-2 söödet.
Caco-2 rakkude läbilaskmiseks ~90% konfluentsuse juures soojendage esmalt Caco-2 keskkonda, PBS-i ja 0,25% trüpsiini/1 mM EDTA-d 37 °C veevannis.
Aspireerige sööde vaakumaspiratsiooni teel. Peske rakke kaks korda 5 ml sooja PBS-iga, korrates vaakumaspiratsiooni ja lisades värsket PBS-i.