Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com. Kasutataval brauseri versioonil on CSS-i tugi piiratud. Parima kasutuskogemuse tagamiseks soovitame teil kasutada uuendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame jätkuva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Inimese soolestiku morfogenees loob 3D epiteeli mikroarhitektuuri ja ruumilise korralduse krüpti-villuse tunnused. See ainulaadne struktuur on vajalik soolestiku homöostaasi säilitamiseks, kaitstes basaalkrüptis olevat tüvirakkude nišši eksogeensete mikroobsete antigeenide ja nende metaboliitide eest. Lisaks on soolestiku funktsionaalsetel villidel ja erinevatel limaskestadel sekreteerivatel epiteeli pinnal erituvad limaskestad. .Seetõttu on 3D-epiteeli struktuuride taasloomine in vitro soolemudelite konstrueerimisel ülioluline.Eelkõige võib orgaaniline mimeetiline soolestik kiibil esile kutsuda sooleepiteeli spontaanset 3D-morfogeneesi koos täiustatud füsioloogiliste funktsioonide ja biomehaanikaga.Siin on me võimelised taasesitama morfogeenset morfogeneesi. t nii mikrofluidkiibil kui ka Transwelli sisseehitatud hübriidkiibil. Kirjeldame üksikasjalikke meetodeid seadme valmistamiseks, Caco-2 või soole organoidsete epiteelirakkude kultiveerimiseks nii tavatingimustes kui ka mikrofluidsel platvormil, 3D-morfogeneesi esilekutsumist ja väljakujunenud 3D-epiteeli funktsionaalsete elementide iseloomustamist. See võimaldab mitmekordset pilti taastava mikrokolgutuuride kontrollimise meetodil. vedeliku vool 5 päevaks.Meie in vitro morfogeneesi meetod kasutab füsioloogiliselt olulist nihkepinget ja mehaanilist liikumist ning ei nõua keerulist rakutehnoloogiat ega manipuleerimist, mis võib ületada muid olemasolevaid tehnikaid. Arvame, et meie pakutud protokollil võib olla biomeditsiiniliste teadlasringkondade jaoks laialdane mõju, pakkudes meetodit 3D-soolestiku regenereerimiseks, kliiniliste, in vitro ja farmaatsia epiteeli kihtide jaoks.
Katsed näitavad, et sooleepiteeli Caco-2 rakud, mida on kultiveeritud gut-on-a-chip1, 2, 3, 4, 5 või kahekihilistes mikrofluidilistes seadmetes6, 7, võivad in vitro läbida spontaanse 3D-morfogeneesi, ilma et oleks selge arusaam selle aluseks olevast mehhanismist. Hiljutises uuringus leidsime, et epiteelirakkude eemaldamine on vajalik epiteeli- ja antagonistlikest rakkudest morfoliidsetest seadmetest3. esis in vitro, mida on näidanud Caco-2 ja patsiendilt saadud soole organoidid.Epiteelirakud valideeriti. Selles uuringus keskendusime konkreetselt tugeva Wnt-i antagonisti Dickkopf-1 (DKK-1) rakkude tootmisele ja kontsentratsiooni jaotusele gut-on-a-kiibil ja modifitseeritud mikrofluidseadmetes, mis sisaldavad Transwelli sisestusi, mida nimetatakse hübriidkiibiks. Näitame, et eksogeensete Wnt-ga seotud antagonistide (nt Wnt-ga seotud salajased antagonistid (nagu Wnt-, DKK-1,1nt-repressed frizz-1) lisamine oggy-1) pärsib morfogeneesi või häirib eelstruktureeritud 3D-epiteelikihti, mis viitab sellele, et kultiveerimise ajal tekitatud antagonistlik stress põhjustab in vitro soolestiku morfogeneesi. Seetõttu on praktiline lähenemisviis epiteeli liideses tugeva morfogeneesi saavutamiseks eemaldada fluoosne fluoosne, külgmise aktiivsuse antagonisti tase või seda minimaalselt säilitada. -kiibil või hübriid-kiibil platvormid) või difusioon .Basolateraalne meedium (nt Transwelli sisestustest süvendite suurtesse basolateraalsetesse reservuaaridesse).
Selles protokollis pakume üksikasjalikku meetodit gut-on-a-chip-mikroseadmete ja Transwell-sisestatavate hübriidkiipide valmistamiseks (etapid 1–5), et kasvatada sooleepiteelirakke polüdimetüülsiloksaanil (PDMS) põhinevatel poorsetel membraanidel (etapid 6A, 7A, 8, 9) või polüestermembraanidel (7, 8, 7, 8-astmelise sisestuskihiga). 3D morfogenees in vitro (etapp 10). Samuti tuvastasime rakulised ja molekulaarsed tunnused, mis viitavad koespetsiifilisele histogeneesile ja liinist sõltuvale rakulisele diferentseerumisele, rakendades mitut kujutise modaalsust (etapid 11–24). Indutseerime morfogeneesi, kasutades inimese sooleepiteelirakke või tehnilisi membraani pinnamodifikatsioone, kaasa arvatud kaaliumi kahes vormis. s, 2D monokihtide loomine ja soolestiku biokeemiline ja biomehaanilise mikrokeskkonna reprodutseerimine.in vitro. 3D-morfogeneesi esilekutsumiseks 2D-epiteeli monokihtidest eemaldasime mõlema kultiveeritud vormi morfogeenantagonistid, juhtides söödet basolateraalsesse sektsiooni, mis võib olla kultuuri taaskasutamiseks3. et modelleerida morfogeenist sõltuvat epiteeli kasvu, pikisuunalisi peremees-mikrobioomi kaaskultuure, patogeeniga nakatumist, põletikulist vigastust, epiteeli barjääri düsfunktsiooni ja probiootikumidel põhinevaid ravimeetodeid Näide.mõjutused.
Meie protokoll võib olla kasulik paljudele teadlastele laialdase mõjuga alus- (nt soole limaskesta bioloogia, tüvirakubioloogia ja arengubioloogia) ja rakendusuuringute (nt prekliiniline ravimite testimine, haiguste modelleerimine, koetehnoloogia ja gastroenteroloogia) valdkonnas. Meie protokolli reprodutseeritavuse ja tugevuse tõttu saame meie 3D-morfoloogilist morfoloogiat esile kutsuda. levitatakse publikule, kes uurib rakkude signaaliülekande dünaamikat soolestiku arengu, regeneratsiooni või homöostaasi ajal. Lisaks on meie protokoll kasulik infektsioonide uurimiseks erinevate nakkusetekitajate, nagu noroviirus 8, raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium Vibrphimurium Salmonella9 või Tybrichoraere.Kasulikud on ka haiguse patoloogia ja patogeneesi vaatajaskonnad. Kiibipõhise soolestiku mikrofüsioloogia süsteemi kasutamine võib võimaldada pikisuunalist kaaskultuuri 10 ja sellele järgnevat hinnata peremeesorganismi kaitset, immuunvastuseid ja patogeeniga seotud vigastuste paranemist seedetraktis 11 .Muud GI häired, mis on seotud lekkiva soolestiku haigusega, pooceliitiidi sündroomiga, pooceliitiidi sündroomiga, soolestiku sündroomi saab simuleerida, kui 3D sooleepiteeli kihte valmistatakse ette, kasutades patsiendi 3D sooleepiteeli kihte, nende haiguste hulka kuuluvad villoode atroofia, krüptide lühenemine, limaskesta kahjustus või epiteeli barjääri kahjustus. Biopsia või tüvirakkudest pärinev soolehaigus võib kaaluda paremat lugejakeskkonda. sipelgarakkude tüübid, nagu patsiendi perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC-d), mudelitele, mis sisaldavad 3D soole villus-krüpti mikroarhitektuure.koespetsiifilised immuunrakud, 5.
Kuna 3D-epiteeli mikrostruktuuri saab fikseerida ja visualiseerida ilma jaotusprotsessita, võivad ruumilise transkriptoomika ja kõrge eraldusvõimega või ülieraldusvõimega pildistamise kallal töötavad vaatajad olla huvitatud meie geenide ja valkude spatiotemporaalse dünaamika kaardistamisest epiteeli niššides.Tehnoloogiahuviline.Reageerimine mikroobsetele või immuunstiimulitele.Lisaks saab soolestiku homöostaasi koordineerivat pikisuunalist peremees-mikrobiomi läbirääkimist 10, 14 luua 3D-soole limaskesta kihis, kultiveerides koos erinevaid mikroobiliike, mikroobikooslusi, eriti fekaalses mikrobiotapis.platvormil.See lähenemine on eriti atraktiivne publikule, kes uurib limaskesta immunoloogiat, gastroenteroloogiat, inimese mikrobioomi, kulturoomikat ja kliinilist mikrobioloogiat, kes soovivad laboris kultiveerida varem kultiveerimata soolestiku mikrobiotot.Kui meie in vitro morfogeneesi protokolli saab kohandada skaleeritavate kultuurivormingutega, nagu näiteks pidevad 3-lateraalsed plaadid või plaadid. Protokolli saab levitada ka neile, kes arendavad toiduainetööstuse farmaatsia-, biomeditsiini- või suure läbilaskevõimega sõelumis- või valideerimisplatvorme. Põhimõtte tõestuseks demonstreerisime hiljuti mitmekordse suure läbilaskevõimega morfogeneesisüsteemi teostatavust, mida saab skaleerida 24-süvendilisele plaadivormingule. Meie in vitro morfogeneesimeetodit saab kiirendada ja potentsiaalselt kasutusele võtta paljudes uurimislaborites, tööstuses või valitsus- ja reguleerivates asutustes, et mõista in vitro soolestiku morfogeneesi rakkude ümberprogrammeerimist transkriptoomilisel tasemel, et testida ravimeid või bioterapeutilisi aineid. soolestiku morfogeneesi protsess.
Sooleepiteeli morfogeneesi uurimiseks on kasutatud piiratud arvu inimese jaoks olulisi eksperimentaalseid mudeleid, peamiselt seetõttu, et puuduvad rakendatavad protokollid 3D-morfogeneesi in vitro esilekutsumiseks. Tegelikult põhineb suur osa praegustest teadmistest soolestiku morfogeneesi kohta loomkatsetel (nt sebrakala20, hiired21 või kanad võivad olla töömahukad,21 või kanad). ja mis kõige tähtsam, ei määra täpselt inimese arenguprotsesse.Neid mudeleid on väga piiratud ka mitmesuunalise skaleeritava testimise võimalusega. Seetõttu ületab meie 3D-koestruktuuride in vitro regenereerimise protokoll in vivo loommudelite ja teiste traditsiooniliste staatiliste 2D-rakukultuurimudelite toimivuse. vastuseks erinevatele limaskestade või immuunstiimulitele. 3D-epiteelikihid võivad pakkuda ruumi uurida, kuidas mikroobirakud konkureerivad ruumiliste niššide moodustamise nimel, ja ökoloogilise arenguga vastusena peremeesfaktoritele (nt sisemine ja välimine limakiht, IgA ja antimikroobsete antimikroobsete stiimulite sekretsioon). Peale selle võimaldab 3D-süntoloogia mõista selle epiteeli ja epiteeli limaskesta struktuuri. toodab ergistiliselt mikroobseid metaboliite (nt lühikese ahelaga rasvhappeid), mis kujundavad rakkude struktuuri ja tüvirakkude nišše basaalkrüptides. Neid omadusi saab demonstreerida ainult siis, kui 3D epiteeli kihid on loodud in vitro.
Lisaks meie meetodile 3D sooleepiteeli struktuuride loomiseks on mitmeid in vitro meetodeid. Soole organoidkultuur on tipptasemel koetehnoloogia tehnika, mis põhineb soolestiku tüvirakkude kultiveerimisel spetsiifilistes morfogeensetes tingimustes23, 24, 25. 3D organoidmudelite kasutamine on aga sageli transpordianalüüsi või kaaskultiveerimise protsessis. organoidi sees ja seetõttu on luminaalsete komponentide, näiteks mikroobirakkude või eksogeensete antigeenide sisseviimine piiratud.Juurdepääsu organoidsetele luumenitele saab parandada mikroinjektoriga, 26, 27 kuid see meetod on invasiivne ja töömahukas ning selle teostamiseks on vaja eriteadmisi. Peale selle ei peegelda traditsioonilised organoidkultuurid, mida hoitakse hüdrogeelkarkassides staatilistes tingimustes, täpselt aktiivset in vivo biomehaanikat.
Teised mitme uurimisrühma kasutatud lähenemisviisid kasutavad soolestiku epiteeli struktuuri jäljendamiseks eelstruktureeritud 3D-hüdrogeeli karkasse, kultiveerides geeli pinnal isoleeritud inimese soolerakke. Valmistage hüdrogeelkarkassid, kasutades 3D-prinditud, mikrojahvatatud või litograafiliselt valmistatud vorme. See meetod näitab isoleeritud grafioloogiliselt isoleeritud grafioloogiliselt rakkude morfoloogiat. s, luues kõrge kuvasuhtega epiteeli struktuuri ja strooma-epiteeli läbirääkimise, kaasates karkassi stroomarakud.Kuid eelstruktureeritud karkasside iseloom võib takistada spontaanse morfogeneetilise protsessi enda ilmnemist.Need mudelid ei paku ka dünaamilist luminaalset või interstitsiaalset moraalset voolu, mis ei vaja vedelike füsioloogilist aktiivsust, mis ei vajaks veresuhkrut. üheski hiljutises uuringus ei kasutatud mikrofluidilisel platvormil hüdrogeelkarkasse ja lasersöövitustehnikaid kasutades mustrilisi sooleepiteeli struktuure.Hiire soole organoidid järgivad söövitatud mustreid, moodustades soole torukujulisi struktuure, ja intraluminaalse vedeliku voolu saab kokku võtta mikrofluidikamooduli abil.Kuid see ei sisalda morfogeenset liikumismudelit ega spontaanilist liikumist. Sama rühma 3D-printimise tehnikad suutsid luua spontaansete morfogeneetiliste protsessidega miniatuurseid sooletorusid.Vaatamata erinevate soolestiku segmentide keerukale valmistamisele toru sees, puudub sellel mudelil ka valgusvedeliku vool ja mehaaniline deformatsioon.Lisaks võib mudeli töövõime olla piiratud, eriti pärast bioprintimise protsessi lõppemist, või häirivad raku-protokologeense interaktsiooni tingimused. esis, füsioloogiliselt oluline nihkepinge, soolestiku motoorikat jäljendav biomehaanika, juurdepääs sõltumatutele apikaalsetele ja basolateraalsetele sektsioonidele ning kompleksse modulaarsusega bioloogilise mikrokeskkonna taasloomine. Seetõttu võib meie in vitro 3D morfogeneesi protokoll pakkuda täiendavat lähenemisviisi olemasolevate meetodite väljakutsete ületamiseks.
Meie protokoll on täielikult keskendunud 3D-epiteeli morfogeneesile, kultuuris on ainult epiteelirakud ja mitte ühtegi muud tüüpi ümbritsevat rakku, nagu mesenhümaalsed rakud, endoteelirakud ja immuunrakud. Nagu eelnevalt kirjeldatud, on meie protokolli tuumaks epiteeli morfogeneesi esilekutsumine, eemaldades morfogeeni inhibiitorid, mis on sisestatud robustsesse söötmesse sisestatud basaalmooduli poolelt. a-kiip ja hübriid-kiibil võimaldavad meil taastada lainelise 3D-epiteelikihi, täiendavaid bioloogilisi keerukusi, nagu epiteeli-mesenhümaalsed interaktsioonid33, 34, rakuvälise maatriksi (ECM) ladestumine 35 ja meie mudelis krüpti-villuse tunnused, mis edastavad krüptirakkudes (fibroblastide tüvirakkude nišid jäävad bassenaalsetesse rakkudesse). mängin võtmerolli ECM-i valkude tootmisel ja soolestiku morfogeneesi reguleerimisel in vivo35,37,38.Mesenhümaalsete rakkude lisamine meie mudelisse suurendas morfogeneetilist protsessi ja raku kinnitumise efektiivsust.Endoteelikiht (st kapillaarid või lümfisüsteemid) mängib olulist rolli molekulaarsete rakkude transpordi39, rakkude taastumise ja mikrotsirkulatsiooni reguleerimisel. koemudelite vahel ühendatavad kultuurikomponendid on eeltingimuseks, kui koemudelid on loodud näitama mitme elundi interaktsioone. Seetõttu võib olla vaja endoteelirakke kaasata, et modelleerida täpsemaid füsioloogilisi tunnuseid elunditaseme eraldusvõimega. Patsiendist pärinevad immuunrakud on samuti olulised kaasasündinud immuunvastuste kuvamiseks, antigeeni esitlemiseks, kaasasündinud adaptiivseks immuunhaiguseks koe-spetsiifilises immuunsüsteemi kontekstis.
Hübriidkiipide kasutamine on lihtsam kui gut-on-a-kiibil, kuna seadme seadistamine on lihtsam ja Transwelli sisestuste kasutamine võimaldab skaleeritavat sooleepiteeli kultiveerimist. Kaubanduslikult saadavad polüestermembraanidega Transwelli sisestused ei ole aga elastsed ega suuda simuleerida peristaltikat sarnaseid liikumisi. Lisaks jäi apikaalsele kiibile paigutatud külgmise kiibi apikaalne osa pingevabaks. .On selge, et apikaalse sektsiooni staatilised omadused võimaldavad harva hübriidkiipides pikaajalist bakterite kaaskultuuri. Kuigi me saame hübriidkiipide kasutamisel tugevalt esile kutsuda 3D-morfogeneesi Transwelli lisades, võib füsioloogiliselt olulise biomehaanika ja apikaalse vedeliku voolu vähesus piirata hübriidkiibi platvormide võimalike rakenduste teostatavust.
Inimese krüpti-villuse telje täiemahulisi rekonstruktsioone gut-on-a-chip ja hübriid-kiibil kultuurides ei ole täielikult kindlaks tehtud. Kuna morfogenees algab epiteeli ühekihilisest kihist, ei pruugi 3D-mikroarhitektuurid tagada morfoloogilist sarnasust krüptidega in vivo. Kuigi me iseloomustasime vohavat rakupopulatsiooni 3 lähedal. krüpti- ja villipiirkonnad ei olnud selgelt piiritletud. Kuigi kiibi kõrgemad ülemised kanalid suurendavad mikrotehnilise epiteeli kõrgust, on maksimaalne kõrgus siiski piiratud ~300–400 µm-ga. Inimese soolekrüptide tegelik sügavus peen- ja jämesooles on ~135 µm ja peensoole kõrgus on ~400 µm. m41.
Pildistamise seisukohast võib 3D-mikroarhitektuuride in situ ülieraldusvõimega pildistamine piirduda kiibil oleva sisikonnaga, kuna nõutav töökaugus objektiivi läätse ja epiteelikihi vahel on suurusjärgus paar millimeetrit. Selle probleemi lahendamiseks võib olla vaja kauget objektiivi. Lisaks on õhukeste sektsioonide valmistamine PDMS-i, kuna on vaja suure elastsusega pildistamist. soolestiku kiht-kihiline mikrotöötlus kiibil hõlmab püsivat adhesiooni iga kihi vahel, ülemise kihi avamine või eemaldamine on äärmiselt keeruline, et uurida epiteelikihi pinnastruktuuri. Näiteks skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) abil.
PDMS-i hüdrofoobsus on olnud piiravaks teguriks mikrofluidipõhistes uuringutes, mis käsitlevad hüdrofoobseid väikemolekule, kuna PDMS suudab selliseid hüdrofoobseid molekule mittespetsiifiliselt adsorbeerida. PDMS-i alternatiive võib kaaluda ka teiste polümeersete materjalidega. Alternatiivina võib kaaluda PDMS-i pinna modifitseerimist (nt katmine lipofiilsete materjalidega3 või polüetüleen- või polüetülainetega4) hüdrofoobsete molekulide moodustumine.
Lõpuks ei ole meie meetodit hästi iseloomustatud suure läbilaskevõimega sõelumise või kõigile sobiva kasutajasõbraliku katseplatvormi pakkumise osas. Praegune protokoll nõuab süstlapumpa iga mikroseadme kohta, mis võtab CO2 inkubaatoris ruumi ja hoiab ära suuremahulised katsed. Seda piirangut saab oluliselt parandada uuenduslike kultuurivormingute skaleeritavusega (nt. mis võimaldavad basolateraalset söödet pidevalt täiendada ja eemaldada).
Inimese sooleepiteeli 3D-morfogeneesi esilekutsumiseks in vitro kasutasime luumeni-kapillaari liidese loomiseks mikrofluidkiibi sooleseadet, mis sisaldas kahte paralleelset mikrokanalit ja nende vahel elastset poorset membraani. Samuti demonstreerime ühe kanaliga mikrofluidse seadme (hübriidse) kasutamist, mis tagab pideva basolateraalse kiibi voo mõlemas kaevu all olevas epiteelikihis. on erinevatest inimese sooleepiteelirakkudest, saab demonstreerida voolu suunaga manipuleerimisega, et eemaldada morfogeenantagonistid basolateraalsest sektsioonist.Kogu eksperimentaalne protseduur (joonis 1) koosneb viiest osast: (i) soolestiku kiibi või Transwelli sisestatava hübriidkiibi mikrotootmine (etapid 1–5; lahter 1) inimese epiteelirakkude ettevalmistamine, (2) organoidid;lahtrid 2–5), (iii) sooleepiteelirakkude kultiveerimine soolekiipidel või hübriidkiipidel (etapid 6–9), (iv) 3D-morfogeneesi indutseerimine in vitro (samm 10) ja (v) 3D-epiteeli mikrostruktuuri iseloomustamiseks in vitro (etapid 11–24). genees, võrreldes epiteeli morfogeneesi ruumilise, ajalise, tingimusliku või protseduurilise kontrolliga.
Kasutasime kahte erinevat kultiveerimisplatvormi: gut-on-a-chip sirgete kanalitega või mittelineaarsete keerdunud kanalitega või hübriidkiipe, mis sisaldavad Transwelli (TW) sisestusi mikrofluidiseadmes, mis on valmistatud lahtris 1 kirjeldatud viisil, ja etappi 1–5. „Seadme valmistamine” näitab peamisi samme ühe kiibi või hübriidkiibi valmistamisel. munandite organoidid) ja selles protokollis kasutatud kultiveerimisprotseduur."In vitro morfogenees" näitab üldetappe, mille käigus Caco-2 või organoididest pärinevaid epiteelirakke kultiveeritakse soolekiibil või hübriidkiibi Transwelli sisestustel, millele järgneb 3D-morfogeneesi esilekutsumine ja iseloomustatud epiteeli struktuuri moodustamine. Allpool on iga testrea kasti näidatud programmi sammu number või kasti näidis. al kihte saab kasutada näiteks rakkude diferentseerumise iseloomustamisel, soolestiku füsioloogia uuringutes, peremees-mikrobioomi ökosüsteemide loomisel ja haiguste modelleerimisel. Immunofluorestsentskujutised programmis "Cell Differentiation", mis näitavad tuumasid, F-aktiini ja MUC2, mis ekspresseeritakse 3D Caco-2 epiteeli pinnakihi rakkudest, mis esinevad goC2 salajases signaalkihis ja muco-2-s s. Fluorestseeruvad kujutised soolestiku füsioloogias näitavad lima, mis on toodetud siaalhappe ja N-atsetüülglükoosamiini jääkide värvimisel, kasutades nisuidu fluorestseeruvat aglutiniini. Kaks kattuvat pilti jaotises „Peremees-mikroobi kaaskultuurid” näitavad esinduslikku peremees-mikroobikookultuuri paneeli. (GFP) mikrotehniliste 3D Caco-2 epiteelirakkudega. Parempoolne paneel näitab 3D Caco-2 epiteelirakkudega koos kultiveeritud GFP E. coli lokaliseerumist, millele järgneb immunofluorestsentsvärvimine F-aktiiniga (punane) ja tuumadega (sinine).Haiguse modelleerimine illustreerib terveid versus bakterite polüfüsioloogiline provotseerimine, lekkiv põletikuvastane põletik. ahhariid, LPS) ja immuunrakud (nt PBMC;roheline).Caco-2 rakke kultiveeriti 3D epiteelikihi moodustamiseks.Skaalariba, 50 µm.Pildid alumises reas: "Rakkude eristamine" kohandatud loaga viitest.2.Oxford University Press;Reprodutseeritud viite 5 loal.NAS;"Peremees-mikroobi ühiskultuur" kohandatud viite 3 loal.NAS;“Haiguse modelleerimine” kohandatud loaga viitest.5.NAS.
Nii gut-on-chip kui ka hübriidkiibid valmistati PDMS-i koopiate abil, mis eemaldati ränivormidest pehme litograafia abil1,44 ja mustriga SU-8. Iga kiibi mikrokanalite kujundus määratakse hüdrodünaamikat arvesse võttes, nagu nihkepinge ja hüdrodünaamiline rõhk1,4,12. Algne gut-chip-disain, mis koosnes kahest kiibist. ed paralleelsete sirgete mikrokanalitega, on arenenud keerukaks gut-on-a-kiibil (laiendatud andmed, joonis 1b), mis sisaldab paari kõveraid mikrokanaleid, et kutsuda esile vedeliku viibimise aja pikenemine, mittelineaarsed voolumustrid ja kultiveeritud rakkude mitmeteljeline deformatsioon (joonis 2a–f) 12. Oleme näidanud, et keerdunud Gut-Chip indutseerib tugevalt 3D-morfogeneesi sarnase aja jooksul ja sarnase epiteeli kasvuga võrreldes algse Gut-Chipiga, olenemata kultiveeritud raku tüübist.Seetõttu on 3D-morfogeneesi esilekutsumiseks vaja lineaarset ja kompleksset ümberkorraldatavat SUPD-disaini, mis on omavahel silmutatud. -8 mustrit andsid pärast lahtivõtmist negatiivseid jooni (joonis 1).2a). Kiibile soolestiku valmistamiseks liideti ettevalmistatud ülemine PDMS-kiht järjestikku poorse PDMS-kilega ja joondati seejärel alumise PDMS-i kihiga pöördumatu sidumise teel, kasutades koroonatöötlusseadet (joonis 2b–f). Hübriidkiipide valmistamiseks ühendati kõvastunud PDMS-i koopiad, et luua ühekordselt ühendatud moodulid, mis võimaldasid hästi modifitseerida klaasslaide. 2h ja laiendatud andmed joonis 2).Sidumisprotsess viiakse läbi PDMS-i koopia ja klaasi pindade töötlemisel hapnikuplasma või koroonatöötlusega.Pärast silikoontoru külge kinnitatud mikrotöötlusseadme steriliseerimist oli seadme seadistus valmis sooleepiteeli 3D-morfogeneesi läbiviimiseks2g (joonis).
a, Skemaatiline illustratsioon PDMS-i osade valmistamisest SU-8 mustriga ränivormidest. Kõvenemata PDMS-i lahus valati ränivormi (vasakul), kuivatati temperatuuril 60 °C (keskel) ja eemaldati vormist (paremal).Vormilt eemaldatud PDMS lõigati tükkideks ja puhastati edasiseks kasutamiseks.b, PDMS-i foto, mida kasutati silikoonkihi valmistamiseks. d, mida kasutatakse PDMS-i poorse membraani valmistamiseks.d, fotoseeria PDMS-i ülemisest ja alumistest komponentidest ning kokkupandud kiibil olevast sooleseadmest.e, Ülemise, membraani ja alumise PDMS-i komponentide joondamise skeem.Iga kiht on pöördumatult seotud plasma- või koroonatöötlusega.f, Skeem mikrokanaliga valmistatud ja superkiibil valmistatud seadmest um chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture.The Valmistatud sisikond kiibil, mis on kokku pandud silikoontoru ja süstlaga, asetati katteklaasile.Kiibi seade pandi töötlemiseks 150 mm Petri tassi kaanele.Sideainet kasutatakse hübriidse kiibi D-hübriidkiibi3 ja silikoontuubi sulgemiseks. Sooleepiteelirakkude 2D monokihtide kultiveerimiseks sõltumatult valmistatud Transwelli sisestused sisestati hübriidkiibile, et kutsuda esile soolestiku 3D morfogenees. Söödet perfuseeritakse läbi mikrokanalite, mis asuvad Transwelli sisestusega rakukihi all. Skaalariba, 1 cm.h Trükitud uuesti viite 4 loal.Elsevier.
Selles protokollis kasutati epiteeli allikatena Caco-2 rakuliini ja sooleorganoide (joonis 3a). Mõlemat tüüpi rakke kultiveeriti eraldi (kast 2 ja lahter 5) ja neid kasutati kiibil oleva soolestiku või Transwelli rakkude ECM-kattega mikrokanalite külvamiseks. et lõigud 10 ja 50) kogutakse T-kolbidesse, et valmistada dissotsieerunud rakususpensioone trüpsiniseerimisvedeliku abil (kast 2). Inimese soolestiku biopsiatest või kirurgilistest resektsioonidest saadud sooleorganoide kultiveeriti Matrigeli karkasskuplites 24-süvendilistel plaatidel, mis sisaldasid strukturaalset asendusainet. ggin) ja 3. lahtris kirjeldatud viisil valmistatud kasvufaktoreid lisati ülepäeviti, kuni organoidid kasvasid ~500 µm-ni. Täielikult kasvanud organoidid kogutakse ja dissotsieeritakse üksikuteks rakkudeks, et külvata soolestikku või Transwelli sisestesse kiibile (kast 5). Nagu oleme varem teatanud, saab seda eristada vastavalt vähktõve tüübile, koliidi, koliidi,13 haiguse tüübile. või normaalne doonor), kahjustuskoht (nt kahjustus võrreldes kahjustamata alaga) ja seedetrakti asukoht traktis (nt kaksteistsõrmiksool, tühisool, niudesool, pimesool, käärsool või pärasool). Kastis 5 pakume optimeeritud protokolli käärsoole organoidide (koloidide) kultiveerimiseks, mis tavaliselt nõuavad suuremat kontsentratsiooni morfogeensetes organoidides.
a, Töövoog soolestiku morfogeneesi esilekutsumiseks soolestiku kiibis.Selles protokollis kasutatakse 3D-morfogeneesi demonstreerimiseks Caco-2 inimese sooleepiteeli ja soole organoide.Isoleeritud epiteelirakud külvati ettevalmistatud gut-on-a-chip seadmesse (kiibi preparaat). (D0), apikaalne (AP) vool käivitatakse ja seda hoitakse esimesed 2 päeva (vool, AP, D0-D2). Basolateraalne (BL) vool käivitatakse ka koos tsükliliste venitusliigutustega (venitus, vool, AP ja BL), kui moodustub täielik 2D monokiht.Soolestiku 3D morfogenees pärast mikrofluogeneesi ilmnemist 5 päeva jooksul. kujutised näitavad Caco-2 rakkude tüüpilist morfoloogiat igal katseetapil või ajahetkel (tulpdiagramm, 100 µm).Neli skemaatilised diagrammid, mis illustreerivad soolestiku morfogeneesi vastavaid kaskaade (paremal ülaosas). Katkendlikud nooled skeemil tähistavad vedeliku voolu suunda.b, SEM-pilt, mis näitab kindlaksmääratud 3D-suurendatud 3D-epiteeli kasti pinna topoloogiat. ) näitab regenereeritud mikrovillid 3D Caco-2 kihil (paremal).c, Horisontaalne esivaade väljakujunenud Caco-2 3D-st, claudiinist (ZO-1, punane) ja pidevate pintsliäärsete membraanide märgistusega F-aktiini (roheline) ja tuumad (sinine) Immunofluorestsents näitab epiteelirakkude iga fookuspunkti konfokaalset asukohta testimisel. fookusvaade.d, 3., 7., 9., 11. ja 13. päeval saadud faasikontrastmikroskoopia abil saadud kiibil kultiveeritud organoidide morfoloogiliste muutuste ajaline kulg. Sisend (paremal ülaosas) näitab esitatud kujutise suurt suurendust.e, DIC-foto mikrofoto organoidsest 3D-epiteeli rakkudest, mis on tuvastatud soolestikus ülemäärase fluorestsentsi rakkudes. 5;magenta), karikakrarakud (MUC2; roheline), F-aktiin (hall) ja tuumad (tsüaan), mida kasvatati soolestiku kiipidel 3 päeva jooksul (vasakul) ja 13-päevastel (keskmisel) organoididel epiteelikihil. Vaadake ka laiendatud andmeid joonist 3, mis tõstab esile LGR5 signaalimiseD ilma MUC2-signaalipiltide mikrostruktureerimiseta. epiteel, mis moodustub soolestikus kiibil, värvides plasmamembraani värviga CellMask (paremal) 13. kultiveerimispäeval.Skaalariba on 50 μm, kui pole öeldud teisiti.b Kordustrükk loal viitest.2.Oxford University Press;c Kohandatud viites.2 loal.Oxford University Press;e ja f kohandatud viitega loaga.12 Creative Commonsi litsentsi CC BY 4.0 alusel.
Kiibil olevas soolestikus on edukaks ECM-i katmiseks vaja modifitseerida PDMS-i poorse membraani hüdrofoobset pinda.Selles protokollis kasutame PDMS-membraanide hüdrofoobsuse muutmiseks kahte erinevat meetodit. Caco-2 rakkude kultiveerimiseks piisas pinnaaktiveerimisest ainult UV/osoontöötlusega, et vähendada membraani ECM-i, CaH-2 ja PDCM-i membraani pinna, coatow-PDCM-i pinna ja coatco-2-rakkude hüdrofoobsust. Organoidse epiteeli mikrofluidkultuur nõuab keemiliselt põhinevat pinna funktsionaliseerimist, et saavutada ECM-valkude tõhus sadestumine polüetüleenimiini (PEI) ja glutaaraldehüüdi järjestikuse pealekandmisega PDMS-i mikrokanalitele. Pärast pinna modifitseerimist kanti ECM-valgud funktsionaliseeritud PDMS-i pinna katmiseks ja seejärel sisestati eraldatud organoidse rakukultuuri kaudu ainult perfuusioonepiteeli mikrofluidsöötmesse. ülemine mikrokanal, kuni rakud moodustavad tervikliku monokihi, samal ajal kui alumine mikrokanal säilitab staatilised tingimused. See optimeeritud meetod pinna aktiveerimiseks ja ECM-i katmiseks võimaldab kinnitada organoidset epiteeli, et kutsuda esile 3D-morfogenees PDMS-i pinnal.
Transwelli kultuurid vajavad enne rakkude külvamist ka ECM-katmist;Transwelli kultuurid ei vaja aga keerulisi eeltöötlusetappe, et aktiveerida poorsete sisestuste pinda. Caco-2 rakkude kasvatamiseks Transwelli sisestustel kiirendab poorsete vahetükkide ECM-i katmine dissotsieerunud Caco-2 rakkude kinnitumist (<1 tund) ja tiheda ühendusbarjääri moodustumist (<1-2 päeva). Organoidide kasvatamiseks Transwelli pinnal (Transwelli membraani külge kinnitatud organoidid on ühendatud membraaniga, CM-i on isoleeritud, E-pinnale on lisatud isoleeritud organid,3) hoitakse seni, kuni organoidid moodustavad tervikliku monokihi, millel on barjääri terviklikkus. Transwell kultuurid viiakse läbi 24 süvendiga plaatidel ilma hübriidkiipe kasutamata.
In vitro 3D-morfogeneesi saab algatada vedeliku voolu rakendamisel väljakujunenud epiteelikihi basolateraalsele aspektile. Kiibil olevas soolestikus algas epiteeli morfogenees, kui sööde perfuseeriti ülemisse ja alumisse mikrokanalisse (joonis 3a). Nagu eelnevalt kirjeldatud, on kriitiline tagada vedeliku vool piisava sekretsiooni suunas moraalsesse alaosasse. toitaineid ja seerumit rakkudele, mis on seotud poorsetel membraanidel ja tekitavad luminaalset nihkepinget, rakendame tavaliselt kiibil soolestikus kahekordset voolu.Hübriidkiipides sisestati hübriidkiipidesse epiteeli monokihte sisaldavad Transwelli lisad.Seejärel kanti sööde poorse Transwelli kultuuri inserdi basolateraalse külje alla läbi mikrokanali. Soolestiku morfogenees ilmnes mõlemal päeval morfogenees5 päeva jooksul.
Mikrotehniliste 3D-epiteelikihtide morfoloogilisi tunnuseid saab analüüsida erinevate pildistamisviiside abil, sealhulgas faasikontrastmikroskoopia, diferentsiaal-interferentskontrastmikroskoopia (DIC) mikroskoopia, SEM või immunofluorestsentskonfokaalne mikroskoopia (joonised 3 ja 4). PDMS-i ja polüesterkilede optilise läbipaistvuse tagamiseks suudavad nii gut-on-a-chip kui ka hübriidkiibi platvormid pakkuda reaalajas in situ pildistamist, ilma et oleks vaja seadet tükeldada või lahti võtta. Immunofluorestsentskujutiste tegemisel (joonised 1, 3c, f ja 4b, c) on rakud tavaliselt fikseeritud (XFA) (järgneb /vold) 100 ja 2% (mass/maht) ) veise seerumi albumiini (BSA), järjekorras. Sõltuvalt rakutüübist võib kasutada erinevaid fiksaate, permeabilisaatoreid ja blokeerivaid aineid. Primaarseid antikehi, mis on suunatud liinist sõltuvatele raku- või piirkonnamarkeritele, kasutatakse in situ immobiliseeritud rakkude esiletõstmiseks kiibil (millele järgneb sekundaarne antiboost, nt 4 koos sekundaarse antiboostaadiga). -diamidino-2-fenüleen) indool, DAPI) või F-aktiin (nt fluorestseeruvalt märgistatud falloidiin). Fluorestsentsipõhist reaalajas pildistamist saab teha ka kohapeal, et tuvastada lima teket (joonis 1).1, "Rakkude diferentseerumine" ja "Soolestiku füsioloogia"), mikroobirakkude juhuslik koloniseerimine (joonis 1, "Peremees-mikroobide kaaskultuur"), immuunrakkude värbamine (joonis 1, "Haiguse modelleerimine") või 3D epiteeli kontuurid, eraldavad, modifitseerivad ja modifitseerivad. ülemine kiht alumisest mikrokanalikihist, nagu on kirjeldatud viites. Nagu on näidatud joonisel 2, saab 3D-epiteeli morfoloogiat ja ka apikaalse harja piiril olevaid mikrovillusid visualiseerida SEM-iga (joonis 3b). Diferentseerumismarkerite ekspressiooni saab hinnata kvantitatiivse PCR5 või üherakulise RNA kiibikihiga3D-sellel juhul kasvavate rakkude epiteeli järjestuse korral. hübriidkiibid kogutakse trüpsiniseerimisega ja seejärel kasutatakse neid molekulaar- või geneetiliseks analüüsiks.
a, Töövoog soolestiku morfogeneesi esilekutsumiseks hübriidkiibis.Selles protokollis kasutatakse Caco-2 ja sooleorganoide, et demonstreerida 3D-morfogeneesi hübriidkiibi platvormil.Dissotsieerunud epiteelirakud külvati ettevalmistatud Transwelli sisestustesse (TW prep; vt joonist allpool). Kui rakud olid külvatud transsüvendi membraaniga (külvati polüesterrakkudega) W-kultuur). 7 päeva pärast integreeriti üks Transwelli sisestus, mis sisaldas epiteelirakkude 2D monokihti, hübriidkiibile, et viia sisse basolateraalne vool (Flow, BL), mis viis lõpuks 3D-epiteelikihi tekkeni (morfogenees).Faasikontrastsed mikrograafid, mis näitavad inimese elundi epiteelirakkude morfoloogilisi tunnuseid igas doonori ajapunktis (Ccenlonal3) doonorirakud. s ülemistes kihtides illustreerivad iga etapi eksperimentaalset konfiguratsiooni.b Hübriidkiibid (vasakul skeem) võivad viia organoidsete epiteelirakkude 3D-morfogeneesini ülalt-alla konfokaalse mikroskoopia vaadetega, mis on tehtud erinevates Z-positsioonides (ülemine, keskmine ja alumine;vaata parempoolset skeemi ja vastavaid punktiirjooni).näitasid ilmseid morfoloogilisi omadusi.F-aktiin (tsüaan), tuum (hall).c, Staatilises Transwellis kultiveeritud organoididest saadud epiteelirakkude fluorestsents-konfokaalsed mikropildid (TW; sisestus valge katkendliku kastiga) versus hübriidkiip (suurim täispilt), milles võrreldakse 2D morfoloogiat (vastav 2D-morfoloogia, 3D ristvaade) paremas ülanurgas; “XZ”) kuvavad ka 2D- ja 3D-funktsioone.Skaalariba, 100 µm.c Trükitud uuesti loal viitest.4.Elsevier.
Kontrolli saab valmistada samade rakkude kultiveerimisega (CACO-2 või soolestiku organoidsed epiteelirakud) kahemõõtmelisteks monokihtideks tavapäraste staatiliste kultuuritingimuste korral. Nohitusi võib toitainete kahanemine tuleneda mikrokannelite piiratud mahu mahust (st ~ 4 uL võib-olla ülemise kanaliga võrreldakse pärast algse soolestiku disainilahendust.
Pehme litograafia protsess tuleks läbi viia puhtas ruumis.Kiibi iga kihi (ülemine ja alumine kiht ja membraanid) ja hübriidkiipide jaoks kasutati erinevaid fotomaske, mis valmistati eraldi räniplaatidele, kuna mikrokanalite kõrgused olid erinevad. Kiibil oleva soolestiku ülemise ja alumise mikrokanali sihtkõrgus, hübriidkiibi sihtkõrgus on 500 µm2000 ja kanali kõrgus 20 µm. µm.
Asetage 3-tolline ränivahv atsetooniga tassi. Keerake plaati õrnalt 30 sekundit, seejärel kuivatage vahvel õhu käes. Viige vahvel IPA-ga plaadile, seejärel tsentrifuugige plaati puhastamiseks 30 sekundit.
Valikuliselt võib kasutada piraaja lahust (vesinikperoksiidi ja kontsentreeritud väävelhappe segu, 1:3 (maht/maht)), et maksimeerida orgaaniliste jääkide eemaldamist räniplaadi pinnalt.
Piranha lahus on äärmiselt söövitav ja tekitab kuumust.Vajalikud on täiendavad ettevaatusabinõud.Jäätmete kõrvaldamiseks laske lahusel jahtuda ja viia puhtasse kuiva jäätmemahutisse.Kasutage teisese mahuteid ja märgistage jäätmemahutid korralikult. Üksikasjalikumate toimingute tegemiseks järgige rajatise ohutusjuhiseid.
Dehüdreerige vahvlid, asetades need 10 minutiks 200 °C kuumutusplaadile. Pärast dehüdratsiooni loksutati vahvlit viis korda õhu käes, et jahtuda.
Valage puhastatud ränivahvli keskele ~10 g fotoresisti SU-8 2100. Kasutage pintsette, et fotoresisti ühtlaselt vahvlile jaotada. Asetage vahvel aeg-ajalt 65°C kuumutusplaadile, et fotoresist oleks vähem kleepuv ja kergemini leviv.Ära aseta vahvlit otse kuumale plaadile.
SU-8 jaotati ühtlaselt vahvlile, kasutades pöörlevat katmist.Programmeerige SU-8 sissetulev pöörlemine 5–10 sekundiks, et see leviks kiirusel 500 pööret minutis kiirendusega 100 pööret minutis. Seadke põhitsentrifuugimiseks 200 µm paksusmuster (paksus 1500 µm, 500 mm paksusega 500 mm). kiibil oleva soolestiku ülemise kihi jaoks; vt allpool jaotist „Kriitilised sammud“) seatud kiirendusele 300 p/min 30 sekundit kiirusel 1200 p/min.
Põhitsentrifuugimise kiirust saab reguleerida vastavalt räniplaadil oleva SU-8 mustri sihtpaksusele.
500 µm kõrguste SU-8 mustrite valmistamiseks kiibil oleva soolestiku ülemise kihi jaoks korrati järjestikku selle karbi tsentrifuugimise ja pehme küpsetamise etappe (sammud 7 ja 8), et saada kaks kihti 250 µm Paks kiht SU-8, mida saab kihistada 2 µm kõrge UV-kihiga ja 0 0 kihiga. .
Küpsetage SU-8 kattega vahvleid pehmeks, asetades vahvlid ettevaatlikult 5 minutiks kuumutusplaadile temperatuuril 65 °C, seejärel lülitage seade 95 °C peale ja inkubeerige veel 40 minutit.
SU-8 mustri 500 μm kõrguse saavutamiseks ülemises mikrokanalis korrake samme 7 ja 8, et luua kaks 250 μm paksust SU-8 kihti.
Kasutades UV-maski joondusseadet, teostage lambi test vastavalt tootja juhistele, et arvutada vahvli kokkupuuteaeg. (säritusaeg, ms) = (säritusannus, mJ/cm2)/(lambi võimsus, mW/cm2).
Pärast säriaja määramist asetage fotomask UV-maski joondaja maskihoidjale ja asetage fotomask SU-8 kaetud vahvlile.
UV-kiirguse hajumise minimeerimiseks asetage fotomaski prinditud pind otse räniplaadi SU-8-ga kaetud küljele.
Säritage SU-8-ga kaetud vahvel ja fotomask vertikaalselt UV-valgusega 260 mJ/cm2 etteantud särituse ajaks (vt selle kasti 10. sammu).
Pärast UV-kiirgusega kokkupuudet küpsetati SU-8-ga kaetud ränivahvleid 65 °C juures 5 minutit ja 95 °C juures 15 minutit igal pliidiplaadil, et valmistada mustreid kõrgusega 200 µm. Pikendage järelküpsetusaega 95 °C juures 30 minutini, et valmistada mustreid kõrgusega 500 µm.
Ilmuti valatakse klaasnõusse ja küpsetatud vahvel asetatakse nõusse. SU-8 ilmuti maht võib varieeruda olenevalt klaasplaadi suurusest.Veenduge, et kasutate piisavalt SU-8 ilmutit, et täielikult eemaldada valgustamata SU-8. Näiteks kui kasutate 150 mm läbimõõduga klaasnõu, mille maht on 1 L, kasutage umbes 300-58 minutit ilmutit. pöörlemine.
Loputage ilmutatud vormi ~10 ml värske ilmutiga, seejärel IPA-ga, pihustades lahust pipetiga.
Asetage vahvel plasmapuhastisse ja jätke 1,5 minutiks kokku hapniku plasmaga (atmosfäärigaas, sihtrõhk 1 × 10-5 Torr, võimsus 125 W).
Asetage vahvel vaakummeksikaatorisse, mille sees on klaasklaas.Vahvlid ja objektiklaasid saab asetada kõrvuti.Kui vaakummeksikaator on plaadiga jagatud mitmeks kihiks, asetage alusklaasid alumisse kambrisse ja vahvlid ülemisse kambrisse.Tilgake 100 μL trikloro-, fluoro-klaasi-, fluoro- ja fluoroklaasile rakendage silaanimiseks vaakumit.
Sulatage külmutatud Caco-2 rakkude viaal 37 °C veevannis, seejärel viige sulatatud rakud T75 kolbi, mis sisaldab 15 ml 37 °C eelsoojendatud Caco-2 söödet.
Caco-2 rakkude läbimiseks ~90% konfluentsusega soojendage esmalt Caco-2 söödet, PBS-i ja 0,25% trüpsiini/1 mM EDTA-d 37 °C veevannis.
Aspireerige sööde vaakum-aspiratsiooniga. Peske rakke kaks korda 5 ml sooja PBS-ga, korrates vaakum-aspiratsiooni ja lisades värsket PBS-i.
Postitusaeg: 16. juuli 2022