Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Mikroobsete parasiitide evolutsioon hõlmab vastutoimet loodusliku valiku, mis põhjustab parasiitide täiustumist, ja geneetilise triivi vahel, mis põhjustab parasiitide geenide kaotamist ja kahjulike mutatsioonide akumuleerumist. Selleks, et mõista, kuidas see vastutoime ühe makromolekuli skaalal toimub, kirjeldame Encephalitozoon cuniculi ribosoomi krüo-EM struktuuri. See eukarüootne organism, millel on üks looduse väikseimaid genoome, on eukarüootne. rRNA äärmusliku vähenemisega E. cuniculi ribosoomides kaasnevad enneolematud struktuurimuutused, näiteks varem tundmatute kondenseerunud rRNA linkerite ja muhkudeta rRNA evolutsioon. Lisaks elas E. cuniculi ribosoom üle rRNA fragmentide ja valkude kadumise, arendades võimet kasutada väikeseid molekule degradeerunud rRNA fragmentide ja valkude struktuuriliste jäljendajatena. Üldiselt näitame, et molekulaarstruktuuridel, mida pikka aega peeti redutseeritud, degenereerunud ja kurnavatele mutatsioonidele alluvaks, on mitmeid kompenseerivaid mehhanisme, mis hoiavad neid aktiivsena hoolimata äärmuslikest molekulaarsetest kokkutõmbumistest.
Kuna enamikul mikroobsete parasiitide rühmadel on oma peremeesorganismide ärakasutamiseks ainulaadsed molekulaarsed vahendid, peame sageli välja töötama erinevaid ravimeid erinevate parasiidirühmade jaoks1,2. Uued tõendid näitavad aga, et mõned parasiidi evolutsiooni aspektid on koonduvad ja suures osas prognoositavad, mis viitab potentsiaalsele alusele laialdastele terapeutilistele sekkumistele mikroobsete parasiitide puhul3,4,5,6,7,8,9.
Varasemad tööd on tuvastanud mikroobsete parasiitide puhul levinud evolutsioonilise suundumuse, mida nimetatakse genoomi redutseerimiseks või genoomi lagunemiseks10,11,12,13. Praegused uuringud näitavad, et kui mikroorganismid loobuvad oma vabalt elavast eluviisist ja muutuvad rakusisesteks parasiitideks (või endosümbiontideks), läbivad nende genoomid miljonite aastate jooksul aeglase, kuid hämmastava metamorfoosi9,11. Protsessis, mida tuntakse genoomi lagunemisena, akumuleerivad mikroobsed parasiidid kahjulikke mutatsioone, mis muudavad paljud varem olulised geenid pseudogeenideks, mis viib järkjärgulise geenikao ja mutatsioonilise kokkuvarisemiseni14,15. See kokkuvarisemine võib hävitada kuni 95% geenidest vanimates rakusisestes organismides võrreldes lähedaste vabalt elavate liikidega. Seega on rakusiseste parasiitide evolutsioon kahe vastandliku jõu vaheline võitlus: darvinistlik looduslik valik, mis viib parasiitide paranemiseni, ja genoomi kokkuvarisemine, mis paiskab parasiidid unustusehõlma. Kuidas parasiidil õnnestus sellest võitlusest välja tulla ja säilitada oma molekulaarstruktuuri aktiivsus, jääb ebaselgeks.
Kuigi genoomi lagunemise mehhanism ei ole täielikult mõistetav, näib see toimuvat peamiselt sagedase geneetilise triivi tõttu. Kuna parasiidid elavad väikestes, aseksuaalsetes ja geneetiliselt piiratud populatsioonides, ei suuda nad DNA replikatsiooni ajal mõnikord esinevaid kahjulikke mutatsioone tõhusalt kõrvaldada. See viib kahjulike mutatsioonide pöördumatu akumuleerumiseni ja parasiidi genoomi vähenemiseni. Selle tulemusena kaotab parasiit mitte ainult geene, mis pole enam rakusiseses keskkonnas ellujäämiseks vajalikud. Just parasiidipopulatsioonide suutmatus sporaadilisi kahjulikke mutatsioone tõhusalt kõrvaldada põhjustab nende mutatsioonide akumuleerumist kogu genoomis, sealhulgas nende kõige olulisemates geenides.
Suur osa meie praegusest arusaamast genoomi redutseerimisest põhineb üksnes genoomijärjestuste võrdlemisel, pöörates vähem tähelepanu muutustele tegelikes molekulides, mis täidavad majapidamisfunktsioone ja toimivad potentsiaalsete ravimisihtmärkidena. Võrdlevad uuringud on näidanud, et kahjulike rakusiseste mikroobimutatsioonide koormus näib soodustavat valkude ja nukleiinhapete valestivoltumist ja agregatsiooni, muutes need šaperonist sõltuvamaks ja kuumuse suhtes ülitundlikumaks19,20,21,22,23. Lisaks kogesid mitmesugused parasiidid – kelle sõltumatu evolutsioon toimus mõnikord kuni 2,5 miljardi aasta võrra – sarnast kvaliteedikontrolli keskuste kadu oma valgusünteesis5,6 ja DNA parandusmehhanismides24. Siiski on vähe teada rakusisese elustiili mõjust kõigile teistele rakuliste makromolekulide omadustele, sealhulgas molekulaarsele kohanemisele kahjulike mutatsioonide kasvava koormusega.
Selles töös, et paremini mõista rakusiseste mikroorganismide valkude ja nukleiinhapete evolutsiooni, määrasime rakusisese parasiidi Encephalitozoon cuniculi ribosoomide struktuuri. E. cuniculi on seenelaadne organism, mis kuulub parasiitsete mikrosporiidide rühma, millel on ebatavaliselt väikesed eukarüootsed genoomid ja mida seetõttu kasutatakse mudelorganismidena genoomi lagunemise uurimiseks25,26,27,28,29,30. Hiljuti määrati krüo-EM ribosoomi struktuur Microsporiidide, Paranosema locustae ja Vairimorpha necatrixi31,32 mõõdukalt redutseeritud genoomide jaoks (~3,2 Mb genoomi). Need struktuurid viitavad sellele, et osa rRNA amplifikatsiooni kadu kompenseeritakse uute kontaktide tekkega naaberribosoomi valkude vahel või uute msL131,32 ribosoomi valkude omandamisega. Liigid Encephalitozoon (genoom ~2,5 miljonit bp) ja nende lähim sugulane Ordospora näitavad eukarüootide seas genoomi reduktsiooni ülimat astet – neil on vähem kui 2000 valku kodeerivat geeni ja eeldatakse, et nende ribosoomides mitte ainult puuduvad rRNA laiendusfragmendid (rRNA fragmendid, mis eristavad eukarüootseid ribosoome bakteriaalsetest ribosoomidest), vaid neil on ka neli ribosomaalset valku, kuna neil puuduvad homoloogid E. cuniculi genoomis26,27,28. Seetõttu jõudsime järeldusele, et E. cuniculi ribosoom võib paljastada seni tundmatud strateegiad molekulaarseks kohanemiseks genoomi lagunemisega.
Meie krüo-EM struktuur esindab väikseimat eukarüootset tsütoplasmaatilist ribosoomi, mida on iseloomustatud, ja annab ülevaate sellest, kuidas genoomi redutseerimise lõplik aste mõjutab raku lahutamatu osa molekulaarse aparaadi struktuuri, kokkupanekut ja evolutsiooni. Leidsime, et E. cuniculi ribosoom rikub paljusid RNA voltimise ja ribosoomi kokkupanemise laialdaselt säilinud põhimõtteid ning avastasime uue, seni tundmatu ribosomaalse valgu. Üsna ootamatult näitame, et mikrosporiidide ribosoomid on arendanud võime siduda väikeseid molekule, ning püstitame hüpoteesi, et rRNA ja valkude kärpimine käivitab evolutsioonilisi uuendusi, mis võivad lõppkokkuvõttes anda ribosoomile kasulikke omadusi.
Et paremini mõista valkude ja nukleiinhapete evolutsiooni rakusisestes organismides, otsustasime isoleerida nakatunud imetajarakkude kultuuridest E. cuniculi eosed, et puhastada nende ribosoome ja määrata nende ribosoomide struktuur. Parasiitsete mikrosporiidide suure hulga saamine on keeruline, kuna mikrosporiide ei saa toitainekeskkonnas kultiveerida. Selle asemel kasvavad ja paljunevad nad ainult peremeesrakus. Seetõttu nakatasime ribosoomi puhastamiseks E. cuniculi biomassi saamiseks imetaja neerurakkude liini RK13 E. cuniculi eostega ja kultiveerisime neid nakatunud rakke mitu nädalat, et võimaldada E. cuniculi kasvada ja paljuneda. Kasutades umbes poole ruutmeetri suurust nakatunud rakkude monokihi, suutsime puhastada umbes 300 mg Microsporidia eoseid ja kasutada neid ribosoomide isoleerimiseks. Seejärel lõhkusime puhastatud eosed klaashelmestega ja isoleerisime toorribosoomid, kasutades lüsaatide järkjärgulist polüetüleenglükooli fraktsioneerimist. See võimaldas meil saada struktuurianalüüsiks ligikaudu 300 µg toor-E. cuniculi ribosoome.
Seejärel kogusime saadud ribosoomiproove kasutades krüo-EM-pilte ja töödeldi neid pilte maskide abil, mis vastavad suurele ribosoomi allüksusele, väikese allüksuse peale ja väikesele allüksusele. Selle protsessi käigus kogusime umbes 108 000 ribosoomi osakese pilte ja arvutasime krüo-EM-pilte resolutsiooniga 2,7 Å (lisajoonised 1-3). Seejärel kasutasime krüo-EM-pilte E. cuniculi ribosoomidega seotud rRNA, ribosoomi valgu ja talveunefaktori Mdf1 modelleerimiseks (joonis 1a, b).
a E. cuniculi ribosoomi struktuur kompleksis talveunefaktoriga Mdf1 (pdb id 7QEP). b E. cuniculi ribosoomiga seotud talveunefaktori Mdf1 kaart. c Sekundaarse struktuuri kaart, mis võrdleb mikrosporidiaanide liikides taastatud rRNA-d teadaolevate ribosoomi struktuuridega. Paneelid näitavad amplifitseeritud rRNA fragmentide (ES) ja ribosoomi aktiivsete kohtade asukohta, sealhulgas dekodeerimiskohta (DC), sarcinitsiini silmust (SRL) ja peptidüültransferaasi tsentrit (PTC). d E. cuniculi ribosoomi peptidüültransferaasi tsentrile vastav elektrontihedus viitab sellele, et sellel katalüütilisel saidil on sama struktuur nii E. cuniculi parasiidil kui ka selle peremeesorganismidel, sealhulgas H. sapiensil. e, f Dekodeerimiskeskuse vastav elektrontihedus (e) ja dekodeerimiskeskuse skemaatiline struktuur (f) näitavad, et E. cuniculil on paljudes teistes eukarüootides jäägid U1491 A1491 asemel (E. coli numeratsioon). See muutus viitab sellele, et E. cuniculi võib olla tundlik antibiootikumide suhtes, mis on suunatud sellele aktiivsele kohale.
Erinevalt varem kindlaks tehtud V. necatrixi ja P. locustae ribosoomide struktuuridest (mõlemad struktuurid esindavad sama mikrosporiidide perekonda Nosematidae ja on üksteisega väga sarnased),31,32 läbivad E. cuniculi ribosoomid arvukalt rRNA ja valgu fragmentatsiooni protsesse. Edasine denaturatsioon (lisajoonised 4-6). rRNA-s olid kõige silmatorkavamad muutused amplifitseeritud 25S rRNA fragmendi ES12L täielik kadumine ja h39, h41 ja H18 heeliksite osaline degeneratsioon (joonis 1c, lisajoonis 4). Ribosomaalsete valkude hulgas olid kõige silmatorkavamad muutused eS30 valgu täielik kadumine ja eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 ja eS7 valkude lühenemine (lisajoonised 4, 5).
Seega peegeldub Encephalotozoon/Ordospora liikide genoomide äärmuslik vähenemine nende ribosoomi struktuuris: E. cuniculi ribosoomid kogevad struktuurilisele iseloomustamisele allutatud eukarüootsete tsütoplasmaatiliste ribosoomide seas kõige dramaatilisemat valgusisalduse kadu ning neil puuduvad isegi need rRNA ja valgufragmendid, mis on laialdaselt konserveerunud mitte ainult eukarüootides, vaid ka elu kolmes domeenis. E. cuniculi ribosoomi struktuur pakub nende muutuste esimest molekulaarset mudelit ja paljastab evolutsioonilised sündmused, mida on nii võrdlev genoomika kui ka rakusisese biomolekulaarse struktuuri uuringud tähelepanuta jätnud (lisajoonis 7). Allpool kirjeldame kõiki neid sündmusi koos nende tõenäolise evolutsioonilise päritolu ja potentsiaalse mõjuga ribosoomi funktsioonile.
Seejärel leidsime, et lisaks suurtele rRNA kärpimistele on E. cuniculi ribosoomidel rRNA variatsioonid ühes oma aktiivses kohas. Kuigi E. cuniculi ribosoomi peptidüültransferaasi keskusel on sama struktuur kui teistel eukarüootsetel ribosoomidel (joonis 1d), erineb dekodeerimiskeskus nukleotiidi 1491 järjestuse varieeruvuse tõttu (E. coli numeratsioon, joonis 1e, f). See tähelepanek on oluline, sest eukarüootsete ribosoomide dekodeerimissait sisaldab tavaliselt jääke G1408 ja A1491 võrreldes bakteriaalse tüüpi jääkidega A1408 ja G1491. See varieeruvus on aluseks bakteriaalsete ja eukarüootsete ribosoomide erinevale tundlikkusele ribosomaalsete antibiootikumide aminoglükosiidide perekonna ja teiste väikeste molekulide suhtes, mis on suunatud dekodeerimissaidi poole. E. cuniculi ribosoomi dekodeerimissaidil asendati jääk A1491 jääkiga U1491, mis potentsiaalselt loob ainulaadse sidumisliidese väikestele molekulidele, mis on suunatud sellele aktiivsele saidile. Sama A14901 variant esineb ka teistes mikrosporiidiates, näiteks P. locustae ja V. necatrix, mis viitab selle laialdasele esinemisele mikrosporiidia liikide seas (joonis 1f).
Kuna meie E. cuniculi ribosoomi proovid isoleeriti metaboolselt inaktiivsetest spooridest, testisime E. cuniculi krüo-EM kaarti eelnevalt kirjeldatud ribosoomi sidumise suhtes stressi- või näljatingimustes. Talvitumisfaktorid 31, 32, 36, 37, 38. Me sobitasime eelnevalt kindlaks tehtud talvituva ribosoomi struktuuri E. cuniculi ribosoomi krüo-EM kaardiga. Dokkimiseks kasutati S. cerevisiae ribosoome kompleksis talvetumisfaktoriga Stm138, jaanileivapuu ribosoome kompleksis Lso232 faktoriga ning V. necatrix ribosoome kompleksis Mdf1 ja Mdf231 faktoritega. Samal ajal leidsime krüo-EM tiheduse, mis vastab puhkefaktorile Mdf1. Sarnaselt Mdf1 seondumisele V. necatrix ribosoomiga seondub Mdf1 ka E. cuniculi ribosoomiga, kus see blokeerib ribosoomi E-tsooni, aidates potentsiaalselt ribosoomidel kättesaadavaks muutuda, kui parasiidi eosed muutuvad keha inaktiveerimise tagajärjel metaboolselt inaktiivseks (joonis 2).
Mdf1 blokeerib ribosoomi E-tsooni, mis näib aitavat ribosoomi inaktiveerida, kui parasiidi eosed muutuvad metaboolselt inaktiivseks. E. cuniculi ribosoomi struktuuris leidsime, et Mdf1 moodustab seni tundmatu kontakti L1 ribosoomi varrega, ribosoomi osaga, mis hõlbustab deatsüülitud tRNA vabanemist ribosoomist valgusünteesi ajal. Need kontaktid viitavad sellele, et Mdf1 dissotsieerub ribosoomist sama mehhanismi abil kui deatsetüülitud tRNA, mis annab võimaliku seletuse sellele, kuidas ribosoom eemaldab Mdf1 valgusünteesi taasaktiveerimiseks.
Meie struktuur näitas aga tundmatut kontakti Mdf1 ja L1 ribosoomi jala (ribosoomi osa, mis aitab valgusünteesi ajal ribosoomist deatsüülitud tRNA-d vabastada) vahel. Täpsemalt, Mdf1 kasutab samu kontakte kui deatsüülitud tRNA molekuli küünarnuki segment (joonis 2). See varem tundmatu molekulaarne modelleerimine näitas, et Mdf1 dissotsieerub ribosoomist sama mehhanismi abil nagu deatsüülitud tRNA, mis selgitab, kuidas ribosoom eemaldab selle talveunefaktori, et valgusünteesi taasaktiveerida.
rRNA mudeli konstrueerimisel leidsime, et E. cuniculi ribosoomis on ebanormaalselt volditud rRNA fragmendid, mida nimetasime sulatatud rRNA-ks (joonis 3). Ribosoomides, mis hõlmavad kolme eludomeeni, voldub rRNA struktuurideks, kus enamik rRNA aluseid kas paardub ja voldub omavahel või interakteerub ribosomaalsete valkudega38,39,40. E. cuniculi ribosoomides näivad rRNA-d aga seda voltimispõhimõtet rikkuvat, muutes mõned oma heeliksid voltimata rRNA piirkondadeks.
H18 25S rRNA heeliksi struktuur bakterites S. cerevisiae, V. necatrix ja E. cuniculi. Tavaliselt keerdub see linker ribosoomides, mis hõlmavad kolme eludomeeni, RNA heeliksiks, mis sisaldab 24 kuni 34 jääki. Seevastu mikrosporiidiates redutseerub see rRNA linker järk-järgult kaheks üheahelaliseks uridiinirikkaks linkeriks, mis sisaldavad ainult 12 jääki. Enamik neist jääkidest puutub kokku lahustitega. Joonisel on näidatud, et parasiitsed mikrosporiidid näivad rikkuvat rRNA voltimise üldpõhimõtteid, kus rRNA alused on tavaliselt seotud teiste alustega või osalevad rRNA-valgu interaktsioonides. Mikrosporiidiates võtavad mõned rRNA fragmendid ebasoodsa voltimise, kus endine rRNA heeliks muutub peaaegu sirgjooneliselt pikenenud üheahelaliseks fragmendiks. Nende ebatavaliste piirkondade olemasolu võimaldab mikrosporiidide rRNA-l siduda kaugete rRNA fragmentidega, kasutades minimaalset arvu RNA aluseid.
Selle evolutsioonilise ülemineku kõige silmatorkavam näide on H18 25S rRNA heeliks (joonis 3). Liikides alates E. colist kuni inimesteni sisaldavad selle rRNA heeliksi alused 24–32 nukleotiidi, moodustades kergelt ebakorrapärase heeliksi. Varem tuvastatud ribosomaalsetes struktuurides V. necatrixist ja P. locustae'st31,32 on H18 heeliksi alused osaliselt lahti keritud, kuid nukleotiidide aluste paardumine on säilinud. E. cuniculis saab sellest rRNA fragmendist aga lühimad linkerid 228UUUGU232 ja 301UUUUUUUUUU307. Erinevalt tüüpilistest rRNA fragmentidest ei keru need uridiinirikkad linkerid ega puutu ulatuslikult kokku ribosomaalsete valkudega. Selle asemel võtavad nad omaks lahustis avatud ja täielikult lahti keritud struktuurid, milles rRNA ahelad on peaaegu sirged. See venitatud konformatsioon selgitab, kuidas E. cuniculi kasutab H16 ja H18 rRNA heeliksite vahelise 33 Å tühimiku täitmiseks ainult 12 RNA alust, samas kui teised liigid vajavad tühimiku täitmiseks vähemalt kaks korda rohkem rRNA aluseid.
Seega saame näidata, et energeetiliselt ebasoodsa voltimise kaudu on parasiitsed mikrosporiidid välja töötanud strateegia isegi nende rRNA segmentide kokkutõmbamiseks, mis on elu kolmes domeenis liikide lõikes üldiselt konserveerunud. Ilmselt suudab E. cuniculi rRNA heeliksite lühikesteks polü-U linkeriteks muutvate mutatsioonide akumuleerimise kaudu moodustada ebatavalisi rRNA fragmente, mis sisaldavad võimalikult vähe nukleotiide distaalsete rRNA fragmentide ligeerimiseks. See aitab selgitada, kuidas mikrosporiidid saavutasid oma põhimolekulaarstruktuuri dramaatilise vähenemise, kaotamata seejuures oma struktuurilist ja funktsionaalset terviklikkust.
E. cuniculi rRNA teine ​​ebatavaline omadus on rRNA välimus ilma paksenemisteta (joonis 4). Muhud on aluspaarideta nukleotiidid, mis keerduvad RNA heeliksist välja, selle asemel, et selles peituda. Enamik rRNA eendeid toimivad molekulaarsete adhesiividena, aidates siduda külgnevaid ribosoomi valke või teisi rRNA fragmente. Mõned muhud toimivad hingedena, võimaldades rRNA heeliksil optimaalselt painduda ja voltida produktiivse valgusünteesi jaoks 41.
a E. cuniculi ribosoomi struktuuris puudub rRNA eend (S. cerevisiae numeratsioon), kuid see esineb enamikus teistes eukarüootides. b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens ja E. cuniculi sisemised ribosoomid. Parasiitidel puuduvad paljud iidsed, kõrgelt konserveerunud rRNA muhud. Need paksendused stabiliseerivad ribosoomi struktuuri; seetõttu näitab nende puudumine mikrosporiidides rRNA voltimise vähenenud stabiilsust mikrosporiidiaparasiitides. Võrdlus P-tüvedega (bakterite L7/L12 varred) näitab, et rRNA muhkude kadumine langeb mõnikord kokku uute muhkude ilmumisega kadunud muhkude kõrvale. 23S/28S rRNA H42 heeliksil on iidne muhk (U1206 Saccharomyces cerevisiae's), mille vanus on hinnanguliselt vähemalt 3,5 miljardit aastat tänu selle kaitsele kolmes eluvaldkonnas. Mikrosporiidides on see muhk elimineeritud. Kadunud muhu kõrvale ilmus aga uus muhk (A1306 E. cuniculis).
Rabavalt leidsime, et E. cuniculi ribosoomidel puudub enamik teistel liikidel leiduvatest rRNA kühmudest, sealhulgas enam kui 30 kühmu, mis on säilinud teistes eukarüootides (joonis 4a). See kaotus kõrvaldab paljud kontaktid ribosoomi subühikute ja külgnevate rRNA heeliksite vahel, tekitades mõnikord ribosoomi sees suuri õõnsusi, muutes E. cuniculi ribosoomi traditsioonilisemate ribosoomidega võrreldes poorsemaks (joonis 4b). Tähelepanuväärselt leidsime, et enamik neist kühmudest kadus ka varem tuvastatud V. necatrix ja P. locustae ribosoomi struktuurides, mis varasemates struktuurianalüüsides tähelepanuta jäeti31,32.
Mõnikord kaasneb rRNA muhkude kadumisega uute muhkude teke kadunud muhkude kõrvale. Näiteks ribosoomi P-vars sisaldab U1208 muhku (Saccharomyces cerevisiae'l), mis elas E. colist inimesteni ja on seetõttu hinnanguliselt 3,5 miljardit aastat vana. Valgusünteesi ajal aitab see muhk P-tüvel liikuda avatud ja suletud konformatsioonide vahel, nii et ribosoom saab värvata translatsioonifaktoreid ja toimetada need aktiivsesse kohta. E. cuniculi ribosoomides see paksenemine puudub; aga uus paksenemine (G883), mis paikneb ainult kolmes aluspaaris, võib aidata kaasa P-tüve optimaalse paindlikkuse taastamisele (joonis 4c).
Meie andmed rRNA kohta ilma punnideta viitavad sellele, et rRNA minimeerimine ei piirdu ainult rRNA elementide kadumisega ribosoomi pinnal, vaid võib hõlmata ka ribosoomi tuuma, luues parasiidispetsiifilise molekulaarse defekti, mida vabalt elavates rakkudes pole kirjeldatud. Täheldatakse elavaid liike.
Pärast kanooniliste ribosomaalsete valkude ja rRNA modelleerimist leidsime, et tavapärased ribosomaalsed komponendid ei suuda krüo-EM-pildi kolme osa seletada. Kaks neist fragmentidest on väikese molekuli suurusega (joonis 5, lisajoonis 8). Esimene segment paikneb ribosomaalsete valkude uL15 ja eL18 vahel positsioonil, kus tavaliselt asub eL18 C-ots, mis on E. cuniculis lühenenud. Kuigi me ei saa selle molekuli identiteeti kindlaks teha, on selle tihedussaare suurus ja kuju hästi seletatav spermidiini molekulide olemasoluga. Selle seondumist ribosoomiga stabiliseerivad mikrosporiidide-spetsiifilised mutatsioonid uL15 valkudes (Asp51 ja Arg56), mis näivad suurendavat ribosoomi afiinsust selle väikese molekuli suhtes, kuna need võimaldavad uL15-l mähkida väikese molekuli ribosomaalsesse struktuuri. Lisajoonis 2). 8, lisaandmed 1, 2).
Krüo-EM-kuvamine, mis näitab nukleotiidide olemasolu väljaspool riboosi, mis on seotud E. cuniculi ribosoomiga. E. cuniculi ribosoomis asub see nukleotiid enamikus teistes eukarüootsetes ribosoomides samal kohal kui 25S rRNA A3186 nukleotiid (Saccharomyces cerevisiae numeratsioon). b E. cuniculi ribosoomi struktuuris asub see nukleotiid ribosoomi valkude uL9 ja eL20 vahel, stabiliseerides seeläbi kahe valgu vahelist kontakti. cd eL20 järjestuse konserveerumise analüüs mikrosporiidide liikide seas. Microsporiidide liikide fülogeneetiline puu (c) ja eL20 valgu mitmekordne järjestuse joondamine (d) näitavad, et nukleotiidi siduvad jäägid F170 ja K172 on konserveerunud enamikus tüüpilistes mikrosporiidiates, välja arvatud S. lophii, välja arvatud varakult hargnevad mikrosporiidid, mis säilitasid ES39L rRNA pikenduse. e See joonis näitab, et nukleotiididega seonduvad jäägid F170 ja K172 esinevad ainult tugevalt redutseeritud mikrosporiidide genoomi eL20-s, kuid mitte teistes eukarüootides. Üldiselt viitavad need andmed sellele, et mikrosporiidide ribosoomides on tekkinud nukleotiididega seondumiskoht, mis näib seonduvat AMP molekulidega ja kasutavat neid ribosoomi struktuuris valk-valk interaktsioonide stabiliseerimiseks. Selle seondumiskoha kõrge konserveerumine mikrosporiidides ja selle puudumine teistes eukarüootides viitab sellele, et see koht võib pakkuda mikrosporiididele selektiivset ellujäämise eelist. Seega ei tundu mikrosporiidide ribosoomi nukleotiididega seondumise tasku olevat rRNA lagunemise degenereerunud omadus või lõppvorm, nagu eelnevalt kirjeldatud, vaid pigem kasulik evolutsiooniline innovatsioon, mis võimaldab mikrosporiidide ribosoomil otse siduda väikeseid molekule, kasutades neid ribosoomide molekulaarsete ehitusplokkidena. See avastus teeb mikrosporiidide ribosoomist ainsaks ribosoomiks, mis teadaolevalt kasutab oma struktuurilise ehitusplokina ühte nukleotiidi. f Hüpoteetiline evolutsiooniline rada, mis on tuletatud nukleotiidide sidumisest.
Teine madala molekulmassiga tihedus asub ribosomaalsete valkude uL9 ja eL30 vahelisel piirpinnal (joonis 5a). Seda piirpinda on varem kirjeldatud Saccharomyces cerevisiae ribosoomi struktuuris kui rRNA A3186 25S nukleotiidi (osa ES39L rRNA pikendusest)38 seondumiskohta. On näidatud, et degenereerunud P. locustae ES39L ribosoomides seob see piirpind tundmatu ühe nukleotiidi 31 ja eeldatakse, et see nukleotiid on rRNA redutseeritud lõppvorm, milles rRNA pikkus on ~130–230 alust. ES39L on redutseeritud üheks nukleotiidiks 32,43. Meie krüo-EM-pildid toetavad ideed, et tihedust saab seletada nukleotiididega. Meie struktuuri kõrgem lahutusvõime näitas aga, et see nukleotiid on ekstraribosomaalne molekul, võimalik, et AMP (joonis 5a, b).
Seejärel küsisime, kas nukleotiidi sidumissait esines E. cuniculi ribosoomis või oli see varem olemas. Kuna nukleotiidi sidumist vahendavad peamiselt eL30 ribosoomi valgu Phe170 ja Lys172 jäägid, hindasime nende jääkide konserveerumist 4396 representatiivses eukarüootis. Nagu ülaltoodud uL15 puhul, leidsime, et Phe170 ja Lys172 jäägid on väga konserveerunud ainult tüüpilistes Microsporidia'des, kuid puuduvad teistes eukarüootides, sealhulgas atüüpilistes Microsporidia'des Mitosporidium'is ja Amphiamblys'es, milles ES39L rRNA fragment ei ole redutseeritud (44, 45, 46) (joonis 5c). -e).
Kokkuvõttes toetavad need andmed ideed, et E. cuniculi ja võimalik, et ka teised kanoonilised mikrosporiidid on arendanud võime ribosoomi struktuuris tõhusalt püüda kinni suurt hulka väikeseid metaboliite, et kompenseerida rRNA ja valgu taseme langust. Seda tehes on nad arendanud välja ainulaadse võime siduda ribosoomi väliseid nukleotiide, mis näitab, et parasiitsed molekulaarstruktuurid kompenseerivad seda, püüdes kinni arvukalt väikeseid metaboliite ja kasutades neid lagundatud RNA ja valgufragmentide struktuuriliste jäljendajatena.
Meie krüo-EM-kaardi kolmas simuleerimata osa asub ribosoomi suures subühikus. Meie kaardi suhteliselt kõrge lahutusvõime (2,6 Å) viitab sellele, et see tihedus kuulub valkudele, millel on unikaalsed suurte külgahela jääkide kombinatsioonid, mis võimaldas meil tuvastada selle tiheduse varem tundmatu ribosoomi valguna, mille me identifitseerisime kui msL2 (Microsporidia-spetsiifiline valk L2) (meetodid, joonis 6). Meie homoloogiaotsing näitas, et msL2 on konserveerunud perekondade Encephaliter ja Orosporidium Microsporidia klaadis, kuid puudub teistes liikides, sealhulgas teistes Microsporidia'des. Ribosoomi struktuuris hõivab msL2 tühimiku, mis on tekkinud pikendatud ES31L rRNA kadumisest. Selles tühimikus aitab msL2 stabiliseerida rRNA voltimist ja kompenseerida ES31L kadu (joonis 6).
a E. cuniculi ribosoomides leiduva Microsporidia-spetsiifilise ribosomaalse valgu msL2 elektrontihedus ja mudel. b Enamikul eukarüootsetel ribosoomidel, sealhulgas Saccharomyces cerevisiae 80S ribosoomil, on ES19L rRNA amplifikatsioon enamikus Microsporidia liikides kadunud. Varem kindlaks tehtud V. necatrix microsporidia ribosoomi struktuur viitab sellele, et ES19L kadu nendes parasiitides kompenseeritakse uue msL1 ribosomaalse valgu evolutsiooniga. Selles uuringus leidsime, et E. cuniculi ribosoom arendas välja ka täiendava ribosomaalse RNA-d matkiva valgu, mis näib kompenseerivat ES19L kadu. Siiski on msL2-l (praegu tähistatud kui hüpoteetiline ECU06_1135 valk) ja msL1-l erinev struktuuriline ja evolutsiooniline päritolu. c See evolutsiooniliselt mitteseotud msL1 ja msL2 ribosomaalsete valkude tekkimise avastus viitab sellele, et kui ribosoomid akumuleerivad oma rRNA-s kahjulikke mutatsioone, võivad nad saavutada enneolematu kompositsioonilise mitmekesisuse isegi väikeses lähedalt seotud liikide alamhulgas. See avastus aitaks selgitada mitokondriaalse ribosoomi päritolu ja evolutsiooni, mis on tuntud oma rRNA väga vähenenud taseme ja valgu koostise ebanormaalse varieeruvuse poolest liikide lõikes.
Seejärel võrdlesime msL2 valku varem kirjeldatud msL1 valguga, mis on ainus teadaolev mikrosporiidide-spetsiifiline ribosomaalne valk, mida leidub V. necatrix ribosoomis. Tahtsime testida, kas msL1 ja msL2 on evolutsiooniliselt seotud. Meie analüüs näitas, et msL1 ja msL2 hõivavad ribosoomi struktuuris sama õõnsuse, kuid neil on erinevad primaarsed ja tertsiaarsed struktuurid, mis viitab nende sõltumatule evolutsioonilisele päritolule (joonis 6). Seega annab meie msL2 avastamine tõendeid selle kohta, et kompaktsete eukarüootsete liikide rühmad saavad rRNA fragmentide kadu kompenseerimiseks iseseisvalt arendada struktuurilt erinevaid ribosomaalseid valke. See leid on tähelepanuväärne selle poolest, et enamik tsütoplasmaatilisi eukarüootseid ribosoome sisaldab invariantset valku, sealhulgas sama 81 ribosomaalse valgu perekonda. msL1 ja msL2 ilmumine erinevates mikrosporiidide klaadides vastusena pikendatud rRNA segmentide kadumisele viitab sellele, et parasiidi molekulaarse arhitektuuri lagunemine põhjustab parasiitide kompenseerivate mutatsioonide otsimist, mis võib lõpuks viia nende omandamiseni erinevates parasiidipopulatsioonides.
Lõpuks, kui meie mudel oli valmis, võrdlesime E. cuniculi ribosoomi koostist genoomi järjestuse põhjal ennustatuga. Varem arvati, et mitmed ribosomaalsed valgud, sealhulgas eL14, eL38, eL41 ja eS30, puuduvad E. cuniculi genoomist, kuna nende homoloogid E. cuniculi genoomis ilmselgelt puuduvad. Paljude ribosomaalsete valkude kadu ennustatakse ka enamiku teiste väga redutseeritud rakusiseste parasiitide ja endosümbiontide puhul. Näiteks, kuigi enamik vabalt elavaid baktereid sisaldab sama 54 ribosomaalse valgu perekonda, on ainult 11-l neist valguperekondadest tuvastatavad homoloogid igas analüüsitud peremeesorganismi piiratud bakterite genoomis. Selle idee toetuseks on ribosomaalsete valkude kadu eksperimentaalselt täheldatud V. necatrix ja P. locustae mikrosporiidides, millel puuduvad valgud eL38 ja eL4131,32.
Meie struktuurid näitavad aga, et E. cuniculi ribosoomis on tegelikult kadunud ainult eL38, eL41 ja eS30. eL14 valk oli konserveerunud ja meie struktuur näitas, miks seda valku homoloogiaotsingus ei leitud (joonis 7). E. cuniculi ribosoomides on suurem osa eL14 seondumiskohast kadunud rRNA-ga amplifitseeritud ES39L lagunemise tõttu. ES39L puudumisel kaotas eL14 suurema osa oma sekundaarstruktuurist ja ainult 18% eL14 järjestusest oli E. cuniculis ja S. cerevisiaes identne. See halb järjestuse säilivus on tähelepanuväärne, sest isegi Saccharomyces cerevisiae ja Homo sapiens – organismid, mis arenesid 1,5 miljardi aasta tagant – jagavad eL14-s enam kui 51% samu jääke. See anomaalne konservatsiooni kadu selgitab, miks E. cuniculi eL14 on praegu märgitud oletatava M970_061160 valguna, mitte ribosomaalse valguna eL1427.
ja Microsporidia ribosoom kaotas ES39L rRNA pikenduse, mis osaliselt elimineeris eL14 ribosoomi valgu seondumiskoha. ES39L puudumisel kaotab eL14 mikrospoori valk sekundaarstruktuuri, mille käigus endine rRNA-d siduv α-heeliks degenereerub minimaalse pikkusega silmuseks. b Mitmekordne järjestuse joondamine näitab, et eL14 valk on eukarüootsetes liikides väga konserveerunud (57% järjestuse identsus pärmi ja inimese homoloogide vahel), kuid mikrosporiidides halvasti konserveerunud ja erinev (kus mitte rohkem kui 24% jääkidest on identsed eL14 homoloogiga). S. cerevisiae'st või H. sapiensist). See halb järjestuse konserveerumine ja sekundaarstruktuuri varieeruvus selgitavad, miks eL14 homoloogi pole kunagi leitud E. cuniculis ja miks arvatakse, et see valk on E. cuniculis kadunud. Seevastu E. cuniculi eL14 oli varem annoteeritud kui oletatav M970_061160 valk. See tähelepanek viitab sellele, et mikrosporiidide genoomi mitmekesisust hinnatakse praegu üle: mõned geenid, mida praegu peetakse mikrosporiidides kadunuks, on tegelikult säilinud, ehkki väga diferentseerunud kujul; selle asemel arvatakse, et mõned neist kodeerivad ussidele omaste valkude mikrosporiidide geene (nt hüpoteetiline valk M970_061160 kodeerib tegelikult väga mitmekesiseid valke, mida leidub teistes eukarüootides.
See leid viitab sellele, et rRNA denaturatsioon võib viia järjestuse konserveerumise dramaatilise kadumiseni külgnevates ribosomaalsetes valkudes, muutes need valgud homoloogiaotsinguteks tuvastamatuks. Seega võime väikese genoomiga organismides molekulaarse lagunemise tegelikku astet üle hinnata, kuna mõned kadunuks peetavad valgud tegelikult püsivad, ehkki tugevalt muutunud kujul.
Kuidas saavad parasiidid säilitada oma molekulaarmasinate funktsiooni äärmusliku genoomi redutseerimise tingimustes? Meie uuring vastab sellele küsimusele, kirjeldades E. cuniculi keerukat molekulaarstruktuuri (ribosoomi), mis on organism, millel on üks väikseimaid eukarüootseid genoome.
Peaaegu kaks aastakümmet on teada, et mikroobsete parasiitide valgu- ja RNA-molekulid erinevad sageli vabalt elavate liikide homoloogsetest molekulidest, kuna neil puuduvad kvaliteedikontrolli keskused, nad on vabalt elavatel mikroobidel vähenenud 50%-ni oma suurusest jne. Esineb palju nõrgestavaid mutatsioone, mis kahjustavad voltimist ja funktsiooni. Näiteks eeldatakse, et väikeste genoomiga organismide, sealhulgas paljude rakusiseste parasiitide ja endosümbiontide ribosoomidel puuduvad mitu ribosomaalset valku ja kuni kolmandik rRNA nukleotiididest võrreldes vabalt elavate liikidega 27, 29, 30, 49. Nende molekulide toimimine parasiidis jääb aga suuresti saladuseks, mida uuritakse peamiselt võrdleva genoomika abil.
Meie uuring näitab, et makromolekulide struktuur võib paljastada paljusid evolutsiooni aspekte, mida on raske rakusiseste parasiitide ja teiste peremeesorganismi piiratud organismide traditsioonilistest võrdlevatest genoomilistest uuringutest eraldada (lisajoonis 7). Näiteks eL14 valgu näide näitab, et parasiitide liikide molekulaarse aparaadi tegelikku lagunemisastet on võimalik üle hinnata. Arvatakse, et entsefaliitilistel parasiitidel on nüüd sadu mikrosporiidide-spetsiifilisi geene. Meie tulemused näitavad aga, et mõned neist pealtnäha spetsiifilistest geenidest on tegelikult lihtsalt väga erinevad geenide variandid, mis on levinud teistes eukarüootides. Lisaks näitab msL2 valgu näide, kuidas me jätame tähelepanuta uued ribosomaalsed valgud ja alahindame parasiitide molekulaarmasinate sisu. Väikeste molekulide näide näitab, kuidas me saame jätta tähelepanuta parasiitide molekulaarstruktuuride kõige leidlikumad uuendused, mis võivad neile anda uue bioloogilise aktiivsuse.
Kokkuvõttes parandavad need tulemused meie arusaama peremeesorganismi piiratud organismide ja vabalt elavate organismide molekulaarstruktuuride erinevustest. Me näitame, et molekulaarmasinatel, mida pikka aega peeti redutseeritud, degenereerunud ja mitmesugustele kurnavatele mutatsioonidele vastuvõtlikeks, on hoopis süstemaatiliselt tähelepanuta jäetud ebatavaliste struktuuriliste tunnuste kogum.
Teisest küljest viitavad E. cuniculi ribosoomidest leitud mittemahukad rRNA fragmendid ja sulanud fragmendid sellele, et genoomi redutseerimine võib muuta isegi neid põhilise molekulaarse masina osi, mis on säilinud elu kolmes domeenis – pärast peaaegu 3,5 miljardit aastat kestnud liikide iseseisvat evolutsiooni.
E. cuniculi ribosoomide punnideta ja sulanud rRNA fragmendid pakuvad erilist huvi varasemate endosümbiootiliste bakterite RNA molekulide uuringute valguses. Näiteks lehetäide endosümbiontil Buchnera aphidicola on näidatud, et rRNA ja tRNA molekulidel on temperatuuritundlikud struktuurid A+T koostise kallutatuse ja mittekanooniliste aluspaaride suure osakaalu tõttu20,50. Arvatakse, et need RNA muutused, aga ka valgumolekulide muutused vastutavad endosümbiontide ülemäärase sõltuvuse partneritest ja endosümbiontide võimetuse eest soojust üle kanda21,23. Kuigi parasiitsete mikrosporiidide rRNA-l on struktuurilt erinevad muutused, viitab nende muutuste olemus sellele, et vähenenud termiline stabiilsus ja suurem sõltuvus šaperonvalkudest võivad olla RNA molekulide ühised tunnused redutseeritud genoomiga organismides.
Teisest küljest näitavad meie struktuurid, et parasiitide mikrosporiidiatel on arenenud ainulaadne võime seista vastu laialdaselt konserveerunud rRNA ja valgufragmentidele, arendades võimet kasutada rikkalikke ja kergesti kättesaadavaid väikeseid metaboliite degenereerunud rRNA ja valgufragmentide struktuuriliste jäljendajatena. Molekulaarstruktuuri lagunemine. . Seda arvamust toetab asjaolu, et väikesed molekulid, mis kompenseerivad E. cuniculi rRNA ja ribosoomide valgufragmentide kadu, seonduvad mikrosporiidia-spetsiifiliste jääkidega uL15 ja eL30 valkudes. See viitab sellele, et väikeste molekulide seondumine ribosoomidega võib olla positiivse selektsiooni produkt, mille puhul ribosoomi valkudes esinevad mikrosporiidia-spetsiifilised mutatsioonid on selekteeritud nende võime tõttu suurendada ribosoomide afiinsust väikeste molekulide suhtes, mis võib viia tõhusamate ribosomaalsete organismide tekkeni. Avastus näitab nutikat innovatsiooni mikroobsete parasiitide molekulaarstruktuuris ja annab meile parema arusaama sellest, kuidas parasiitide molekulaarstruktuurid säilitavad oma funktsiooni vaatamata redutseerivale evolutsioonile.
Praegu on nende väikeste molekulide identifitseerimine ebaselge. Pole selge, miks nende väikeste molekulide esinemine ribosoomi struktuuris mikrosporiidide liikide vahel erineb. Eelkõige pole selge, miks nukleotiidide sidumist täheldatakse E. cuniculi ja P. locustae ribosoomides, kuid mitte V. necatrixi ribosoomides, hoolimata F170 jäägi olemasolust V. necatrixi eL20 ja K172 valkudes. Selle deletsiooni võib põhjustada jääk 43 uL6 (mis asub nukleotiidide sidumistasku kõrval), mis on V. necatrixis türosiin, mitte E. cuniculis ja P. locustae's treoniin. Tyr43 mahukas aromaatne külgahel võib steerilise kattumise tõttu häirida nukleotiidide sidumist. Teise võimalusena võib ilmne nukleotiidide deletsioon olla tingitud krüo-EM-kuvamise madalast lahutusvõimest, mis takistab V. necatrixi ribosoomi fragmentide modelleerimist.
Teisest küljest viitab meie töö sellele, et genoomi lagunemise protsess võib olla leidlik jõud. Eelkõige viitab E. cuniculi ribosoomi struktuur sellele, et rRNA ja valgufragmentide kadumine mikrosporiidide ribosoomis tekitab evolutsioonilise surve, mis soodustab muutusi ribosoomi struktuuris. Need variandid esinevad ribosoomi aktiivsest kohast kaugel ja näivad aitavat säilitada (või taastada) optimaalset ribosoomi kokkupanekut, mis muidu redutseeritud rRNA poolt häiritaks. See viitab sellele, et mikrosporiidide ribosoomi oluline uuendus näib olevat arenenud vajaduseks puhverdada geenitriivi.
Võib-olla illustreerib seda kõige paremini nukleotiidide sidumine, mida pole teistes organismides seni kunagi täheldatud. Asjaolu, et nukleotiidide siduvad jäägid esinevad tüüpilistes mikrosporiidiates, kuid mitte teistes eukarüootides, viitab sellele, et nukleotiidide siduvad saidid ei ole lihtsalt kadumist ootavad jäänused ega rRNA lõplik koht üksikute nukleotiidide kujul taastamiseks. Selle asemel tundub see sait olevat kasulik omadus, mis võis areneda mitme positiivse selektsiooni vooru jooksul. Nukleotiidide siduvad saidid võivad olla loodusliku valiku kõrvalsaadus: kui ES39L on lagunenud, on mikrosporiidid sunnitud otsima kompensatsiooni, et taastada optimaalne ribosoomi biogenees ES39L puudumisel. Kuna see nukleotiid suudab jäljendada A3186 nukleotiidi molekulaarseid kontakte ES39L-s, saab nukleotiidi molekulist ribosoomi ehitusplokk, mille sidumist parandab veelgi eL30 järjestuse mutatsioon.
Seoses rakusiseste parasiitide molekulaarse evolutsiooniga näitab meie uuring, et Darwini loodusliku valiku ja genoomi lagunemise geneetilise triivi jõud ei toimi paralleelselt, vaid võnkuvad. Esiteks kõrvaldab geneetiline triiv biomolekulide olulisi omadusi, muutes kompensatsiooni hädasti vajalikuks. Alles siis, kui parasiidid rahuldavad selle vajaduse Darwini loodusliku valiku kaudu, on nende makromolekulidel võimalus arendada oma kõige muljetavaldavamaid ja uuenduslikumaid omadusi. Oluline on see, et E. cuniculi ribosoomi nukleotiidide sidumissaitide evolutsioon viitab sellele, et see molekulaarse evolutsiooni kaotusest võitmiseks muster mitte ainult ei amortiseeri kahjulikke mutatsioone, vaid annab mõnikord parasiitsetele makromolekulidele täiesti uusi funktsioone.
See idee on kooskõlas Sewell Wrighti liikuva tasakaalu teooriaga, mis väidab, et range loodusliku valiku süsteem piirab organismide võimet uuendusi teha51,52,53. Kui aga geneetiline triiv häirib looduslikku valikut, võivad need triivid põhjustada muutusi, mis iseenesest ei ole adaptiivsed (ega isegi kahjulikud), vaid viivad edasiste muutusteni, mis pakuvad suuremat sobivust või uut bioloogilist aktiivsust. Meie raamistik toetab seda ideed, illustreerides, et sama tüüpi mutatsioon, mis vähendab biomolekuli voltimist ja funktsiooni, näib olevat selle paranemise peamine käivitaja. Kooskõlas kõigile kasuliku evolutsioonimudeliga näitab meie uuring, et genoomi lagunemine, mida traditsiooniliselt peetakse degeneratiivseks protsessiks, on samuti innovatsiooni peamine edasiviiv jõud, võimaldades mõnikord ja võib-olla isegi sageli makromolekulidel omandada uusi parasiitseid tegevusi.