Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Mikroobsete parasiitide evolutsioon hõlmab loodusliku valiku, mis põhjustab parasiitide paranemist, ja geneetilise triivi vahel, mis põhjustab parasiitide geenide kaotamise ja kahjulike mutatsioonide kogunemise.Selleks, et mõista, kuidas see vastutegevus ühe makromolekuli skaalal toimub, kirjeldame looduses ühe väikseima genoomiga eukarüootse organismi Encephalitozoon cuniculi ribosoomi krüo-EM struktuuri.rRNA äärmise vähenemisega E. cuniculi ribosoomides kaasnevad enneolematud struktuurimuutused, nagu varem tundmatute liitunud rRNA linkerite ja punnideta rRNA areng.Lisaks elas E. cuniculi ribosoom üle rRNA fragmentide ja valkude kadumise, arendades välja võime kasutada väikeseid molekule degradeerunud rRNA fragmentide ja valkude struktuursete jäljendajatena.Üldiselt näitame, et molekulaarstruktuuridel, mida pikka aega arvatakse olevat redutseeritud, degenereerunud ja nõrgestavatele mutatsioonidele allutatud, on mitmeid kompenseerivaid mehhanisme, mis hoiavad neid aktiivsena hoolimata äärmuslikest molekulaarsetest kontraktsioonidest.
Kuna enamikul mikroobsete parasiitide rühmadel on unikaalsed molekulaarsed tööriistad nende peremeesorganismide ärakasutamiseks, peame sageli erinevate parasiitide rühmade jaoks välja töötama erinevaid ravimeid1, 2.Uued tõendid viitavad aga sellele, et mõned parasiitide evolutsiooni aspektid on ühtlustuvad ja suures osas prognoositavad, mis näitab potentsiaalset alust laiaulatuslikele terapeutilistele sekkumistele mikroobsete parasiitide vastu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Eelnev töö on tuvastanud mikroobsete parasiitide ühise evolutsioonilise suundumuse, mida nimetatakse genoomi vähendamiseks või genoomi lagunemiseks 10, 11, 12, 13.Praegused uuringud näitavad, et kui mikroorganismid loobuvad oma vabast elustiilist ja muutuvad rakusiseseks parasiidiks (või endosümbiontideks), läbivad nende genoomid aeglased, kuid hämmastavad metamorfoosid miljonite aastate jooksul9,11.Genoomi lagunemisena tuntud protsessis akumuleerivad mikroobsed parasiidid kahjulikke mutatsioone, mis muudavad paljud varem olulised geenid pseudogeenideks, põhjustades järkjärgulist geenikadu ja mutatsiooni kokkuvarisemist14, 15.See kokkuvarisemine võib hävitada kuni 95% vanimate rakusiseste organismide geenidest võrreldes lähedaste vabalt elavate liikidega.Seega on rakusiseste parasiitide evolutsioon kahe vastandliku jõu vahel tõmblus: Darwini looduslik valik, mis viib parasiitide paranemiseni, ja genoomi kokkuvarisemine, mis paiskab parasiidid unustuse hõlma.Kuidas parasiit sellest köievedudest välja pääses ja oma molekulaarstruktuuri aktiivsust säilitas, jääb ebaselgeks.
Kuigi genoomi lagunemise mehhanism pole täielikult mõistetav, näib see juhtuvat peamiselt sagedase geneetilise triivi tõttu.Kuna parasiidid elavad väikestes, aseksuaalsetes ja geneetiliselt piiratud populatsioonides, ei saa nad tõhusalt kõrvaldada kahjulikke mutatsioone, mis mõnikord tekivad DNA replikatsiooni ajal.See toob kaasa kahjulike mutatsioonide pöördumatu kuhjumise ja parasiidi genoomi vähenemise.Selle tulemusena ei kaota parasiit mitte ainult geene, mis pole tema ellujäämiseks rakusiseses keskkonnas enam vajalikud.Just parasiitide populatsioonide võimetus sporaadilisi kahjulikke mutatsioone tõhusalt kõrvaldada põhjustab nende mutatsioonide kogunemise kogu genoomis, sealhulgas nende kõige olulisemates geenides.
Suur osa meie praegusest arusaamast genoomi vähendamisest põhineb ainult genoomijärjestuste võrdlusel, pöörates vähem tähelepanu muutustele tegelikes molekulides, mis täidavad majapidamisfunktsioone ja toimivad potentsiaalsete ravimite sihtmärkidena.Võrdlevad uuringud on näidanud, et kahjulike rakusiseste mikroobsete mutatsioonide koormus näib soodustavat valkude ja nukleiinhapete valesti voltimist ja agregeerumist, muutes need rohkem chaperoonist sõltuvaks ja kuumuse suhtes ülitundlikuks19, 20, 21, 22, 23.Lisaks kogesid mitmesugused parasiidid – sõltumatut evolutsiooni, mida mõnikord eraldas koguni 2,5 miljardit aastat – oma valgusünteesis5,6 ja DNA parandamise mehhanismides24 samalaadset kvaliteedikontrolli keskuste kaotust.Siiski on vähe teada intratsellulaarse elustiili mõjust raku makromolekulide kõigile teistele omadustele, sealhulgas molekulaarsele kohanemisele kahjulike mutatsioonide suureneva koormusega.
Selles töös määrasime rakusiseste mikroorganismide valkude ja nukleiinhapete evolutsiooni paremaks mõistmiseks kindlaks rakusisese parasiidi Encephalitozoon cuniculi ribosoomide struktuuri.E. cuniculi on seenelaadne organism, mis kuulub parasiitide mikrosporiidide rühma, millel on ebatavaliselt väikesed eukarüootsed genoomid ja mida kasutatakse seetõttu mudelorganismidena genoomi lagunemise uurimiseks25,26,27,28,29,30.Hiljuti määrati krüo-EM ribosoomi struktuur Microsporidia, Paranosema locustae ja Vairimorpha necatrix31, 32 (~ 3, 2 Mb genoom) mõõdukalt vähenenud genoomide jaoks.Need struktuurid viitavad sellele, et rRNA amplifikatsiooni mõningast kaotust kompenseerib uute kontaktide tekkimine naaberribosomaalsete valkude vahel või uute msL131, 32 ribosomaalsete valkude omandamine.Liigid entsefalitoosoon (genoom ~2,5 miljonit aluspaari) koos oma lähima sugulase ordosporaga demonstreerivad eukarüootide genoomi lõplikku vähenemist – neil on vähem kui 2000 valku kodeerivat geeni ja eeldatakse, et nende ribosoomid ei sisalda mitte ainult rRNA ekspansioonifragmente (rRNA ribosoomi fragmente, mis eristavad ka ribosootilisi baktereid). mal valke, kuna neil puuduvad homoloogid E. cuniculi genoomis26,27,28.Seetõttu jõudsime järeldusele, et E. cuniculi ribosoom võib paljastada varem tundmatuid strateegiaid molekulaarseks kohanemiseks genoomi lagunemisega.
Meie krüo-EM-struktuur kujutab endast väikseimat iseloomustatavat eukarüootset tsütoplasmaatilist ribosoomi ja annab ülevaate sellest, kuidas genoomi redutseerimise lõplik aste mõjutab raku lahutamatu osa molekulaarmasinate struktuuri, kokkupanekut ja arengut.Leidsime, et E. cuniculi ribosoom rikub paljusid RNA voltimise ja ribosoomide kokkupanemise laialdaselt konserveerunud põhimõtteid ning avastasime uue, varem tundmatu ribosoomivalgu.Üsna ootamatult näitame, et mikrosporiidia ribosoomidel on arenenud võime siduda väikeseid molekule, ja oletame, et rRNA ja valkude kärpimine käivitab evolutsioonilisi uuendusi, mis võivad lõpuks anda ribosoomile kasulikke omadusi.
Et parandada oma arusaamist valkude ja nukleiinhapete evolutsioonist rakusisestes organismides, otsustasime isoleerida E. cuniculi eosed nakatunud imetajarakkude kultuuridest, et puhastada nende ribosoomid ja määrata nende ribosoomide struktuur.Suure hulga parasiitide mikrosporiidide saamine on keeruline, kuna mikrosporiidiaid ei saa toitekeskkonnas kasvatada.Selle asemel kasvavad ja paljunevad nad ainult peremeesraku sees.Seetõttu nakatasime E. cuniculi biomassi saamiseks ribosoomide puhastamiseks imetajate neeru rakuliini RK13 E. cuniculi eostega ja kultiveerisime neid nakatunud rakke mitu nädalat, et võimaldada E. cuniculil kasvada ja paljuneda.Kasutades umbes poole ruutmeetri suurust nakatunud raku monokihti, suutsime puhastada umbes 300 mg Microsporidia eoseid ja kasutada neid ribosoomide isoleerimiseks.Seejärel purustasime puhastatud eosed klaashelmestega ja eraldasime töötlemata ribosoomid, kasutades lüsaatide astmelist polüetüleenglükooli fraktsioneerimist.See võimaldas meil saada ligikaudu 300 µg tooreid E. cuniculi ribosoome struktuurianalüüsiks.
Seejärel kogusime saadud ribosoomiproovide abil krüo-EM-kujutised ja töödeldi neid pilte, kasutades maske, mis vastavad suurele ribosoomi subühikule, väikesele subühiku peale ja väikesele subühikule.Selle protsessi käigus kogusime umbes 108 000 ribosomaalse osakese pilte ja arvutasime krüo-EM-kujutisi eraldusvõimega 2, 7 Å (täiendavad joonised 1-3).Seejärel kasutasime E. cuniculi ribosoomidega seotud rRNA, ribosomaalse valgu ja talveunefaktori Mdf1 modelleerimiseks krüoEM-pilte (joonis 1a, b).
a E. cuniculi ribosoomi struktuur kompleksis talveunefaktoriga Mdf1 (pdb id 7QEP).b E. cuniculi ribosoomiga seotud talveunefaktori Mdf1 kaart.c Sekundaarse struktuuri kaart, mis võrdleb Microsporidian liikide taastatud rRNA-d teadaolevate ribosomaalsete struktuuridega.Paneelid näitavad amplifitseeritud rRNA fragmentide (ES) ja ribosoomi aktiivsete saitide asukohta, sealhulgas dekodeerivat saiti (DC), sarksinitsiini silmust (SRL) ja peptidüültransferaasi tsentrit (PTC).d E. cuniculi ribosoomi peptidüültransferaasi tsentrile vastav elektrontihedus viitab sellele, et sellel katalüütilisel saidil on sama struktuur parasiidis E. cuniculi ja selle peremeesorganismides, sealhulgas H. sapiensis.e, f Dekodeerimiskeskuse vastav elektrontihedus (e) ja dekodeerimiskeskuse skemaatiline struktuur (f) näitavad, et E. cuniculi on paljudes teistes eukarüootides A1491 (E. coli numeratsioon) asemel jäägid U1491.See muutus viitab sellele, et E. cuniculi võib olla tundlik antibiootikumide suhtes, mis on suunatud sellele aktiivsele kohale.
Erinevalt V. necatrixi ja P. locustae ribosoomide varem väljakujunenud struktuuridest (mõlemad struktuurid esindavad sama microsporidia perekonda Nosematidae ja on üksteisega väga sarnased) läbivad 31,32 E. cuniculi ribosoomid arvukalt rRNA ja valgu fragmenteerumise protsesse.Edasine denatureerimine (täiendavad joonised 4-6).rRNA-s olid kõige silmatorkavamad muutused amplifitseeritud 25S rRNA fragmendi ES12L täielik kadumine ja h39, h41 ja H18 heeliksite osaline degeneratsioon (joonis 1c, täiendav joonis 4).Ribosomaalsete valkude seas olid kõige silmatorkavamad muutused eS30 valgu täielik kadumine ja eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 ja eS7 lisavalkude lühenemine (Su4, uS17 ja eS7 5).
Seega peegeldub Encephalotozoon/Ordospora liikide genoomide äärmuslik vähenemine nende ribosoomistruktuuris: E. cuniculi ribosoomid kogevad kõige dramaatilisemat valgusisalduse kaotust eukarüootsetes tsütoplasmaatilistes ribosoomides, mille struktuuris iseloomustatakse, ja neil pole isegi neid rRNA-d ja valgufragmente, mis on kolmes domeenis laialdaselt konserveerunud, mitte ainult.E. cuniculi ribosoomi struktuur on nende muutuste jaoks esimene molekulaarne mudel ja näitab evolutsioonilisi sündmusi, mis on tähelepanuta jäetud nii võrdlevas genoomikas kui ka rakusisese biomolekulaarse struktuuri uuringutes (täiendav joonis 7).Allpool kirjeldame kõiki neid sündmusi koos nende tõenäolise evolutsioonilise päritolu ja nende võimaliku mõjuga ribosoomi funktsioonile.
Seejärel avastasime, et lisaks suurtele rRNA kärpimistele on E. cuniculi ribosoomidel ühes aktiivses kohas rRNA variatsioonid.Kuigi E. cuniculi ribosoomi peptidüültransferaasi tsentril on sama struktuur kui teistel eukarüootsetel ribosoomidel (joonis 1d), erineb dekodeerimiskeskus järjestuse varieerumise tõttu nukleotiidil 1491 (E. coli nummerdamine, joonis 1e, f).See tähelepanek on oluline, kuna eukarüootsete ribosoomide dekodeerimiskoht sisaldab tavaliselt jääke G1408 ja A1491 võrreldes bakteritüüpi jääkidega A1408 ja G1491.See variatsioon on aluseks bakteriaalsete ja eukarüootsete ribosoomide erinevale tundlikkusele ribosomaalsete antibiootikumide aminoglükosiidide perekonna ja muude väikeste molekulide suhtes, mis on suunatud dekodeerimiskohale.E. cuniculi ribosoomi dekodeerimiskohas asendati jääk A1491 U1491-ga, luues potentsiaalselt ainulaadse sidumisliidese seda aktiivset kohta sihtivate väikeste molekulide jaoks.Sama A14901 variant esineb ka teistes mikrosporiidides, nagu P. locustae ja V. necatrix, mis viitab sellele, et see on mikrosporiidide liikide seas laialt levinud (joonis 1f).
Kuna meie E. cuniculi ribosoomi proovid eraldati metaboolselt inaktiivsetest eostest, testisime E. cuniculi krüo-EM kaarti eelnevalt kirjeldatud ribosoomide seondumise suhtes stressi või nälja tingimustes.Talveunetegurid 31, 32, 36, 37, 38. Me sobitasime talvituva ribosoomi varem väljakujunenud struktuuri E. cuniculi ribosoomi krüo-EM kaardiga.Dokkimiseks kasutati S. cerevisiae ribosoome kompleksis talveunefaktoriga Stm138, jaanileiva ribosoome kompleksis Lso232 faktoriga ja V. necatrixi ribosoome kompleksis faktoritega Mdf1 ja Mdf231.Samal ajal leidsime krüo-EM tiheduse, mis vastab puhketegurile Mdf1.Sarnaselt Mdf1 seondumisele V. necatrixi ribosoomiga, seondub Mdf1 ka E. cuniculi ribosoomiga, kus see blokeerib ribosoomi E saidi, aidates kaasa ribosoomide kättesaadavusele, kui parasiidieosed muutuvad keha inaktiveerimisel metaboolselt inaktiivseks (joonis 2).).
Mdf1 blokeerib ribosoomi E saidi, mis näib aitavat ribosoomi inaktiveerida, kui parasiidieosed muutuvad metaboolselt inaktiivseks.E. cuniculi ribosoomi struktuuris leidsime, et Mdf1 moodustab seni tundmatu kontakti L1 ribosoomi varrega, ribosoomi selle osaga, mis hõlbustab valgusünteesi käigus deatsüülitud tRNA vabanemist ribosoomist.Need kontaktid viitavad sellele, et Mdf1 dissotsieerub ribosoomist, kasutades sama mehhanismi nagu deatsetüülitud tRNA, andes võimaliku selgituse selle kohta, kuidas ribosoom eemaldab Mdf1, et taasaktiveerida valgusünteesi.
Kuid meie struktuur näitas tundmatut kontakti Mdf1 ja L1 ribosoomi jala vahel (ribosoomi osa, mis aitab vabastada deatsüülitud tRNA ribosoomist valgusünteesi käigus).Eelkõige kasutab Mdf1 samu kontakte kui deatsüülitud tRNA molekuli küünarnuki segment (joonis 2).See varem tundmatu molekulaarne modelleerimine näitas, et Mdf1 dissotsieerub ribosoomist, kasutades sama mehhanismi nagu deatsetüülitud tRNA, mis selgitab, kuidas ribosoom eemaldab selle talveunefaktori, et taasaktiveerida valgusünteesi.
rRNA mudeli koostamisel leidsime, et E. cuniculi ribosoomil on ebanormaalselt volditud rRNA fragmendid, mida nimetasime liit-rRNA-ks (joonis 3).Ribosoomides, mis hõlmavad kolme eludomeeni, voldib rRNA struktuurideks, milles enamik rRNA aluseid kas aluspaarideks ja voldivad üksteisega kokku või interakteeruvad ribosomaalsete valkudega38, 39, 40.Siiski näib, et E. cuniculi ribosoomides rikuvad rRNA-d seda voltimispõhimõtet, muutes mõned nende heeliksid voltimata rRNA piirkondadeks.
S. cerevisiae, V. necatrix ja E. cuniculi H18 25S rRNA heeliksi struktuur.Tavaliselt keerdub see linker kolme eludomeeni hõlmavates ribosoomides RNA heeliksiks, mis sisaldab 24 kuni 34 jääki.Seevastu Microsporidia puhul redutseeritakse see rRNA linker järk-järgult kaheks üheahelaliseks uridiinirikkaks linkeriks, mis sisaldavad ainult 12 jääki.Enamik neist jääkidest puutub kokku lahustitega.Joonisel on näha, et parasiitsed mikrosporiidid näivad rikkuvat rRNA voltimise üldpõhimõtteid, kus rRNA alused on tavaliselt seotud teiste alustega või osalevad rRNA-valgu interaktsioonides.Mikrosporiidias omandavad mõned rRNA fragmendid ebasoodsa volti, mille käigus endisest rRNA heeliksist saab peaaegu sirgjooneliselt pikenenud üheahelaline fragment.Nende ebatavaliste piirkondade olemasolu võimaldab microsporidia rRNA-l siduda kaugeid rRNA fragmente, kasutades minimaalset arvu RNA aluseid.
Selle evolutsioonilise ülemineku kõige silmatorkavam näide on H18 25S rRNA heeliksis (joonis 3).Liikides E. coli-st inimeseni sisaldavad selle rRNA spiraali alused 24-32 nukleotiidi, moodustades veidi ebakorrapärase spiraali.Varem tuvastatud V. necatrixi ja P. locustae31,32 ribosomaalsetes struktuurides on H18 spiraali alused osaliselt lahti keeratud, kuid nukleotiidse aluste paardumine on säilinud.Kuid E. cuniculi puhul muutub see rRNA fragment lühimateks linkeriteks 228UUUGU232 ja 301UUUUUUUUUU307.Erinevalt tüüpilistest rRNA fragmentidest ei keerdu need uridiinirikkad linkerid kokku ega võta nendega ulatuslikku kontakti ribosomaalsete valkudega.Selle asemel kasutavad nad lahustiga avatud ja täielikult lahti volditud struktuure, milles rRNA ahelad on peaaegu sirged.See venitatud konformatsioon selgitab, kuidas E. cuniculi kasutab ainult 12 RNA alust, et täita 33 Å tühimikku H16 ja H18 rRNA heeliksite vahel, samas kui teised liigid vajavad tühimiku täitmiseks vähemalt kaks korda rohkem rRNA aluseid.
Seega saame näidata, et energeetiliselt ebasoodsa voltimise kaudu on parasiitsed mikrosporiidid välja töötanud strateegia isegi nende rRNA segmentide kokkutõmbamiseks, mis jäävad kolmes eluvaldkonnas liikide lõikes üldiselt konserveerituks.Ilmselt võib E. cuniculi akumuleerides mutatsioone, mis muudavad rRNA heliksid lühikesteks polü-U linkeriteks, moodustada ebatavalisi rRNA fragmente, mis sisaldavad võimalikult vähe nukleotiide distaalsete rRNA fragmentide ligeerimiseks.See aitab selgitada, kuidas mikrosporiidid saavutasid oma põhimolekulaarse struktuuri dramaatilise vähenemise, kaotamata oma struktuurset ja funktsionaalset terviklikkust.
E. cuniculi rRNA teine ​​ebatavaline omadus on rRNA ilmumine ilma paksendusteta (joonis 4).Mõhkmed on aluspaarideta nukleotiidid, mis keerduvad RNA heeliksist välja, selle asemel, et sinna peituda.Enamik rRNA eendeid toimivad molekulaarsete liimainetena, aidates siduda külgnevaid ribosomaalseid valke või muid rRNA fragmente.Mõned punnid toimivad hingedena, võimaldades rRNA heeliksil produktiivseks valgusünteesiks optimaalselt painduda ja voltida 41 .
a rRNA eend (S. cerevisiae nummerdamine) puudub E. cuniculi ribosoomi struktuuris, kuid esineb enamikus teistes eukarüootides b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens ja E. cuniculi sisemistes ribosoomides.parasiitidel puuduvad paljud iidsed, väga konserveerunud rRNA punnid.Need paksenemised stabiliseerivad ribosoomi struktuuri;seetõttu näitab nende puudumine mikrosporiidides rRNA voltimise stabiilsuse vähenemist mikrosporiidiaparasiitides.Võrdlus P-tüvedega (bakterites L7/L12 varred) näitab, et rRNA punnide kadumine langeb mõnikord kokku uute punnide ilmumisega kadunud punnide kõrvale.23S/28S rRNA H42 heeliksil on iidne kühm (U1206 Saccharomyces cerevisiae's), mis on hinnanguliselt vähemalt 3,5 miljardit aastat vana, kuna see on kaitstud kolmes eluvaldkonnas.Mikrosporiidias on see kühm elimineeritud.Kaotatud punni kõrvale tekkis aga uus kühm (E. cuniculi puhul A1306).
Üllatavalt avastasime, et E. cuniculi ribosoomidel puudub enamik teistes liikides leiduvatest rRNA punnidest, sealhulgas rohkem kui 30 teistes eukarüootides säilinud kühmudest (joonis 4a).See kadu kõrvaldab paljud kontaktid ribosomaalsete subühikute ja külgnevate rRNA heeliksite vahel, tekitades mõnikord ribosoomi sees suuri õõnsaid tühimikke, muutes E. cuniculi ribosoomi traditsioonilisemate ribosoomidega võrreldes poorsemaks (joonis 4b).Märkimisväärselt avastasime, et enamik neist punnidest kadus ka varem tuvastatud V. necatrixi ja P. locustae ribosoomistruktuurides, mis jäid varasemates struktuurianalüüsides tähelepanuta31,32.
Mõnikord kaasneb rRNA punnide kadumisega kadunud punni kõrvale uute punnide teke.Näiteks sisaldab ribosomaalne P-tüvi U1208 kühmu (Saccharomyces cerevisiae's), mis jäi E. coli-st inimesteni ja on seetõttu hinnanguliselt 3,5 miljardit aastat vana.Valgusünteesi ajal aitab see kühm P-tüvel liikuda avatud ja suletud konformatsioonide vahel, nii et ribosoom saab värvata translatsioonifaktoreid ja toimetada need aktiivsesse kohta.E. cuniculi ribosoomides see paksenemine puudub;uus, vaid kolme aluspaari kaupa paiknev paksenemine (G883) võib aga kaasa aidata P-tüve optimaalse painduvuse taastamisele (joonis 4c).
Meie andmed rRNA kohta ilma punnideta viitavad sellele, et rRNA minimeerimine ei piirdu ainult rRNA elementide kadumisega ribosoomi pinnal, vaid võib hõlmata ka ribosoomi tuuma, luues parasiidispetsiifilise molekulaardefekti, mida pole vabalt elavates rakkudes kirjeldatud.vaadeldakse elavaid liike.
Pärast kanooniliste ribosomaalsete valkude ja rRNA modelleerimist leidsime, et tavapärased ribosomaalsed komponendid ei suuda seletada krüo-EM-kujutise kolme osa.Kaks neist fragmentidest on väikese suurusega molekulid (joonis 5, täiendav joonis 8).Esimene segment asetseb ribosomaalsete valkude uL15 ja eL18 vahele asendis, mille tavaliselt hõivab eL18 C-ots, mis on E. cuniculi puhul lühendatud.Kuigi me ei saa selle molekuli identiteeti kindlaks teha, on selle tihedussaare suurus ja kuju hästi seletatav spermidiini molekulide olemasoluga.Selle seondumist ribosoomiga stabiliseerivad mikrosporiidispetsiifilised mutatsioonid uL15 valkudes (Asp51 ja Arg56), mis näivad suurendavat ribosoomi afiinsust selle väikese molekuli suhtes, kuna võimaldavad uL15-l mähkida väike molekul ribosomaalsesse struktuuri.Täiendav joonis 2).8, lisaandmed 1, 2).
Krüo-EM kujutis, mis näitab nukleotiidide olemasolu väljaspool riboosi, mis on seotud E. cuniculi ribosoomiga.E. cuniculi ribosoomis on see nukleotiid enamikus teistes eukarüootsetes ribosoomides sama koha peal kui 25S rRNA A3186 nukleotiid (Saccharomyces cerevisiae nummerdamine).b E. cuniculi ribosomaalses struktuuris paikneb see nukleotiid ribosomaalsete valkude uL9 ja eL20 vahel, stabiliseerides seeläbi kontakti kahe valgu vahel.cd eL20 järjestuse säilitamise analüüs mikrosporiidide liikide seas.Microsporidia liikide (c) fülogeneetiline puu ja eL20 valgu (d) mitme järjestuse joondamine näitavad, et nukleotiidisiduvad jäägid F170 ja K172 on konserveerunud kõige tüüpilisemates Microsporidia'des, välja arvatud S. lophii, välja arvatud varakult hargnev Microsporidia, mis säilitas ES39L-i laiendi.e See joonis näitab, et nukleotiidi siduvad jäägid F170 ja K172 esinevad ainult väga redutseeritud mikrosporiidide genoomi eL20-s, kuid mitte teistes eukarüootides.Üldiselt näitavad need andmed, et Microsporidian ribosoomid on välja töötanud nukleotiidi sidumissaidi, mis näib seovat AMP molekule ja kasutab neid valgu-valgu interaktsioonide stabiliseerimiseks ribosoomi struktuuris.Selle seondumiskoha kõrge säilivus Microsporidia's ja selle puudumine teistes eukarüootides viitab sellele, et see sait võib anda Microsporidia jaoks selektiivse ellujäämise eelise.Seega ei tundu mikrosporiidia ribosoomi nukleotiide siduv tasku olevat rRNA lagunemise degenereerunud tunnus või lõppvorm, nagu eelnevalt kirjeldatud, vaid pigem kasulik evolutsiooniline uuendus, mis võimaldab mikrosporiidia ribosoomil väikeste molekulidega vahetult siduda, kasutades neid molekulaarsete ehitusplokkidena.ribosoomide ehitusplokid.See avastus teeb mikrosporiidia ribosoomist ainsa ribosoomi, mis teadaolevalt kasutab oma struktuurse ehitusplokina ühte nukleotiidi.f Hüpoteetiline evolutsiooni rada, mis tuleneb nukleotiidide sidumisest.
Teine madala molekulmassiga tihedus asub ribosomaalsete valkude uL9 ja eL30 vahelisel liidesel (joonis 5a).Seda liidest kirjeldati varem Saccharomyces cerevisiae ribosoomi struktuuris kui rRNA A3186 25S nukleotiidi sidumissaiti (osa ES39L rRNA laiendist)38.Näidati, et degenereerunud P. locustae ES39L ribosoomides seob see liides tundmatu üksiku nukleotiidiga 31 ja eeldatakse, et see nukleotiid on rRNA redutseeritud lõppvorm, milles rRNA pikkus on ~130-230 alust.ES39L redutseeritakse üheks nukleotiidiks 32.43.Meie krüo-EM-pildid toetavad ideed, et tihedust saab seletada nukleotiididega.Kuid meie struktuuri kõrgem eraldusvõime näitas, et see nukleotiid on ekstraribosomaalne molekul, võib-olla AMP (joonis 5a, b).
Seejärel küsisime, kas nukleotiidi sidumissait ilmus E. cuniculi ribosoomi või oli see varem olemas.Kuna nukleotiidide seondumist vahendavad peamiselt eL30 ribosoomivalgus olevad Phe170 ja Lys172 jäägid, hindasime nende jääkide säilimist 4396 tüüpilises eukarüootis.Nagu ülaltoodud uL15 puhul, leidsime, et Phe170 ja Lys172 jäägid on väga konserveerunud ainult tüüpilistes Microsporidiades, kuid puuduvad teistes eukarüootides, sealhulgas ebatüüpilistes Microsporidia Mitosporidium ja Amphiamblys, milles ES39L rRNA fragment ei ole redutseeritud (4F5,45c).-e).
Kokkuvõttes toetavad need andmed ideed, et E. cuniculi ja võib-olla ka teised kanoonilised mikrosporiidid on välja arendanud võime tõhusalt hõivata suurel hulgal väikeseid metaboliite ribosoomi struktuuris, et kompenseerida rRNA ja valgu taseme langust.Seda tehes on nad välja arendanud ainulaadse võime siduda nukleotiide väljaspool ribosoomi, näidates, et parasiitmolekulaarsed struktuurid kompenseerivad seda, püüdes kinni rohkelt väikeseid metaboliite ja kasutades neid lagunenud RNA ja valgufragmentide struktuursete jäljendajatena..
Meie krüo-EM kaardi kolmas simuleerimata osa, mis asub suures ribosomaalses subühikus.Meie kaardi suhteliselt kõrge eraldusvõime (2, 6 Å) viitab sellele, et see tihedus kuulub valkudele, millel on ainulaadsed suurte kõrvalahelate jääkide kombinatsioonid, mis võimaldas meil tuvastada selle tiheduse kui varem tundmatu ribosomaalse valgu, mille identifitseerisime kui msL2 (Microsporidia-spetsiifiline valk L2) (meetodid, joonis 6).Meie homoloogiaotsing näitas, et msL2 on konserveerunud perekonna Encephaliter ja Orosporidium Microsporidia kladis, kuid puudub teistes liikides, sealhulgas teistes Microsporidia.Ribosomaalses struktuuris hõivab msL2 tühimiku, mis on tekkinud laiendatud ES31L rRNA kadumisest.Selles tühimikus aitab msL2 stabiliseerida rRNA voltimist ja võib kompenseerida ES31L kadu (joonis 6).
a E. cuniculi ribosoomides leiduva Microsporidia-spetsiifilise ribosomaalse valgu msL2 elektrontihedus ja mudel.b Enamikul eukarüootsetel ribosoomidel, sealhulgas Saccharomyces cerevisiae 80S ribosoomil, on ES19L rRNA amplifikatsioon enamikus Microsporidian liikides kadunud.Varem väljakujunenud V. necatrix microsporidia ribosoomi struktuur viitab sellele, et ES19L kadu nendes parasiitides kompenseeritakse uue msL1 ribosomaalse valgu evolutsiooniga.Selles uuringus leidsime, et E. cuniculi ribosoom arendas välja ka täiendava ribosomaalse RNA jäljendava valgu, mis näiliselt kompenseeris ES19L kadumise.Siiski on msL2-l (praegu hüpoteetiliseks ECU06_1135 valguks) ja msL1-l erinev struktuurne ja evolutsiooniline päritolu.c See evolutsiooniliselt mitteseotud msL1 ja msL2 ribosomaalsete valkude tekke avastus viitab sellele, et kui ribosoomid koguvad oma rRNA-sse kahjulikke mutatsioone, võivad nad saavutada enneolematu koostise mitmekesisuse isegi väikeses lähedalt seotud liikide alamhulgas.See avastus võib aidata selgitada mitokondriaalse ribosoomi päritolu ja evolutsiooni, mis on tuntud oma väga vähenenud rRNA ja valgu koostise ebanormaalse varieeruvuse poolest liikide lõikes.
Seejärel võrdlesime msL2 valku eelnevalt kirjeldatud msL1 valguga, mis on ainus teadaolev mikrosporiidia-spetsiifiline ribosoomivalk, mida leidub V. necatrixi ribosoomis.Tahtsime testida, kas msL1 ja msL2 on evolutsiooniliselt seotud.Meie analüüs näitas, et msL1 ja msL2 hõivavad ribosoomi struktuuris sama õõnsuse, kuid neil on erinevad primaarsed ja tertsiaarsed struktuurid, mis näitab nende sõltumatut evolutsioonilist päritolu (joonis 6).Seega annab meie msL2 avastus tõendeid selle kohta, et kompaktsete eukarüootsete liikide rühmad võivad rRNA fragmentide kadumise kompenseerimiseks iseseisvalt välja arendada struktuurselt erinevad ribosomaalsed valgud.See leid on märkimisväärne selle poolest, et enamik tsütoplasmaatilisi eukarüootseid ribosoome sisaldab muutumatut valku, sealhulgas sama 81 ribosoomi valgu perekonda.MSL1 ja msL2 ilmumine erinevatesse mikrosporiidide kladedesse vastusena laiendatud rRNA segmentide kadumisele viitab sellele, et parasiidi molekulaararhitektuuri lagunemine põhjustab parasiitide kompenseerivate mutatsioonide otsimist, mis võib lõpuks viia nende omandamiseni erinevates parasiitide populatsioonides.struktuurid.
Lõpuks, kui meie mudel oli valmis, võrdlesime E. cuniculi ribosoomi koostist genoomi järjestusest ennustatuga.Varem arvati, et mitmed ribosomaalsed valgud, sealhulgas eL14, eL38, eL41 ja eS30, puuduvad E. cuniculi genoomist nende homoloogide ilmse puudumise tõttu E. cuniculi genoomist.Paljude ribosomaalsete valkude kadu ennustatakse ka enamikus teistes väga vähenenud intratsellulaarsetes parasiitides ja endosümbiontides.Näiteks kuigi enamik vabalt elavaid baktereid sisaldab sama 54 ribosomaalse valgu perekonda, on ainult 11 nendest valguperekondadest tuvastatavad homoloogid igas peremeesorganismipiiranguga bakterite analüüsitud genoomis.Selle arusaama toetuseks on eksperimentaalselt täheldatud ribosomaalsete valkude kadu V. necatrix ja P. locustae microsporidia puhul, millel puuduvad eL38 ja eL4131,32 valgud.
Kuid meie struktuurid näitavad, et ainult eL38, eL41 ja eS30 on tegelikult kadunud E. cuniculi ribosoomi.eL14 valk oli konserveeritud ja meie struktuur näitas, miks seda valku homoloogiaotsinguga ei leitud (joonis 7).E. cuniculi ribosoomides kaob suurem osa eL14 seondumiskohast rRNA-ga amplifitseeritud ES39L lagunemise tõttu.ES39L puudumisel kaotas eL14 suurema osa oma sekundaarsest struktuurist ja ainult 18% eL14 järjestusest oli E. cuniculi ja S. cerevisiae puhul identne.See kehv järjestuse säilimine on tähelepanuväärne, sest isegi Saccharomyces cerevisiae ja Homo sapiens - organismid, mis arenesid 1,5 miljardi aastase vahega - jagavad enam kui 51% samadest jääkidest eL14-s.See ebanormaalne säilivuse vähenemine selgitab, miks E. cuniculi eL14 on praegu märgitud kui oletatav M970_061160 valk, mitte eL1427 ribosomaalne valk.
ja Microsporidia ribosoom kaotas ES39L rRNA laienduse, mis elimineeris osaliselt eL14 ribosomaalse valgu sidumissaidi.ES39L puudumisel kaotab eL14 mikrospoorvalk sekundaarse struktuuri, mille käigus endine rRNA-d siduv α-heeliks degenereerub minimaalse pikkusega ahelaks.b Mitme järjestuse joondamine näitab, et eL14 valk on eukarüootsetes liikides väga konserveerunud (57% järjestuse identsus pärmi ja inimese homoloogide vahel), kuid halvasti konserveerunud ja lahknev mikrosporiidides (milles ei ole rohkem kui 24% jääkidest identsed eL14 homoloogiga).S. cerevisiae või H. sapiens).See kehv järjestuse säilivus ja sekundaarse struktuuri varieeruvus selgitab, miks eL14 homoloogi ei ole kunagi leitud E. cuniculi puhul ja miks arvatakse, et see valk on E. cuniculi puhul kadunud.Seevastu E. cuniculi eL14 oli varem märgitud kui oletatav M970_061160 valk.See tähelepanek viitab sellele, et mikrosporiidide genoomi mitmekesisus on praegu ülehinnatud: mõned geenid, mis praegu arvatakse olevat mikrosporiidides kadunud, on tegelikult säilinud, kuigi väga diferentseeritud vormides;selle asemel arvatakse, et mõned kodeerivad ussispetsiifiliste valkude mikrosporiidide geene (nt hüpoteetiline valk M970_061160) tegelikult kodeerib väga erinevaid valke, mida leidub teistes eukarüootides.
See leid viitab sellele, et rRNA denaturatsioon võib põhjustada järjestuse säilimise dramaatilist kaotust külgnevates ribosomaalsetes valkudes, muutes need valgud homoloogiaotsingute jaoks tuvastamatuks.Seega võime ülehinnata tegelikku molekulaarse lagunemise astet väikestes genoomiorganismides, kuna mõned kadunud valgud säilivad tegelikult, ehkki väga muudetud kujul.
Kuidas saavad parasiidid säilitada oma molekulaarmasinate funktsiooni äärmusliku genoomi vähenemise tingimustes?Meie uuring vastab sellele küsimusele, kirjeldades ühe väikseima eukarüootse genoomiga organismi E. cuniculi keerulist molekulaarstruktuuri (ribosoomi).
Peaaegu kaks aastakümmet on teada, et mikroobsete parasiitide valgu- ja RNA molekulid erinevad sageli oma homoloogsetest molekulidest vabalt elavates liikides, kuna neil puuduvad kvaliteedikontrolli keskused, nad on vabalt elavates mikroobides vähendatud 50% -ni jne.palju kurnavaid mutatsioone, mis kahjustavad voltimist ja funktsiooni.Näiteks väikeste genoomiorganismide, sealhulgas paljude rakusiseste parasiitide ja endosümbiontide ribosoomides puuduvad mitmed ribosomaalsed valgud ja kuni kolmandik rRNA nukleotiididest võrreldes vabalt elavate liikidega 27, 29, 30, 49. Nende molekulide funktsioneerimise viis, mida uuriti peamiselt parasiitide kaudu, jääb siiski suures osas para-siidi kaudu.
Meie uuring näitab, et makromolekulide struktuur võib paljastada paljusid evolutsiooni aspekte, mida on raske ekstraheerida traditsioonilistest võrdlevatest rakusiseste parasiitide ja muude peremeesorganismi piirangutega organismide genoomuuringutest (täiendav joonis 7).Näiteks eL14 valgu näide näitab, et võime parasiitliikide molekulaaraparaadi tegelikku lagunemisastet üle hinnata.Entsefaliitilistel parasiitidel arvatakse nüüd olevat sadu mikrosporiididele spetsiifilisi geene.Kuid meie tulemused näitavad, et mõned neist näiliselt spetsiifilistest geenidest on tegelikult lihtsalt väga erinevad geenide variandid, mis on levinud teistes eukarüootides.Veelgi enam, msL2 valgu näide näitab, kuidas me jätame tähelepanuta uued ribosomaalsed valgud ja alahindame parasiitide molekulaarmasinate sisaldust.Väikeste molekulide näide näitab, kuidas saame kahe silma vahele jätta kõige geniaalsemad uuendused parasiitmolekulaarsetes struktuurides, mis võivad anda neile uue bioloogilise aktiivsuse.
Kokkuvõttes parandavad need tulemused meie arusaamist peremeespiiranguga organismide molekulaarstruktuuride erinevustest ja nende analoogidest vabalt elavates organismides.Näitame, et molekulaarmasinatel, mida pikka aega arvati olevat redutseeritud, degenereerunud ja allutatud mitmesugustele nõrgestavatele mutatsioonidele, on selle asemel hulk süstemaatiliselt tähelepanuta jäetud ebatavalisi struktuurseid tunnuseid.
Teisest küljest viitavad E. cuniculi ribosoomidest leitud mittemahukad rRNA fragmendid ja sulandunud fragmendid sellele, et genoomi redutseerimine võib peaaegu 3,5 miljardi aasta pärast muuta isegi neid põhimolekulaarse masina osi, mis on säilinud kolmes eluvaldkonnas.liikide iseseisev areng.
Endosümbiootiliste bakterite RNA molekulide varasemate uuringute valguses pakuvad erilist huvi E. cuniculi ribosoomides olevad punnivabad ja sulandunud rRNA fragmendid.Näiteks lehetäide endosümbionti Buchnera aphidicola puhul on näidatud, et rRNA ja tRNA molekulidel on temperatuuritundlikud struktuurid, mis on tingitud A + T koostise nihkest ja mittekanooniliste aluspaaride suurest osakaalust 20, 50.Arvatakse, et need muutused RNA-s ja ka valgumolekulides toimuvad muutused põhjustavad endosümbiontide liigset sõltuvust partneritest ja endosümbiontide võimetust soojust üle kanda 21, 23 .Kuigi parasiitide mikrosporiidide rRNA-l on struktuurselt erinevad muutused, viitab nende muutuste olemus sellele, et vähenenud genoomidega organismides võivad RNA molekulide ühised tunnused olla termilise stabiilsuse vähenemine ja suurem sõltuvus chaperone valkudest.
Teisest küljest näitavad meie struktuurid, et parasiitide mikrosporiididel on välja kujunenud ainulaadne võime seista vastu laialdaselt konserveerunud rRNA- ja valgufragmentidele, arendades võimet kasutada rikkalikke ja kergesti kättesaadavaid väikeseid metaboliite degenereerunud rRNA ja valgufragmentide struktuursete jäljendajatena.Molekulaarstruktuuri lagunemine..Seda arvamust toetab tõsiasi, et väikesed molekulid, mis kompenseerivad valgufragmentide kadu rRNA-s ja E. cuniculi ribosoomides, seonduvad uL15 ja eL30 valkude mikrosporiidispetsiifiliste jääkidega.See viitab sellele, et väikeste molekulide seondumine ribosoomidega võib olla positiivse selektsiooni produkt, mille puhul on valitud Microsporidia-spetsiifilised mutatsioonid ribosoomivalkudes nende võime järgi suurendada ribosoomide afiinsust väikeste molekulide suhtes, mis võib viia efektiivsemate ribosoomiorganismide tekkeni.Avastus paljastab nutika uuenduse mikroobsete parasiitide molekulaarstruktuuris ja annab meile parema ülevaate sellest, kuidas parasiitide molekulaarstruktuurid säilitavad oma funktsiooni vaatamata redutseerivale evolutsioonile.
Praegu on nende väikeste molekulide identifitseerimine ebaselge.Ei ole selge, miks nende väikeste molekulide välimus ribosoomi struktuuris erineb mikrosporiidide liikide lõikes.Eelkõige ei ole selge, miks nukleotiidide seondumist täheldatakse E. cuniculi ja P. locustae ribosoomides, mitte aga V. necatrixi ribosoomides, hoolimata F170 jäägi olemasolust V. necatrixi eL20 ja K172 valkudes.Selle deletsiooni võib põhjustada jääk 43 uL6 (asub nukleotiidi siduva tasku kõrval), mis on türosiin V. necatrixis ja mitte treoniin E. cuniculi ja P. locustae puhul.Tyr43 mahukas aromaatne kõrvalahel võib steerilise kattumise tõttu häirida nukleotiidide seondumist.Alternatiivina võib näiv nukleotiidide deletsioon olla tingitud krüo-EM-kujutise madalast eraldusvõimest, mis takistab V. necatrixi ribosomaalsete fragmentide modelleerimist.
Teisest küljest viitab meie töö sellele, et genoomi lagunemise protsess võib olla leidlik jõud.Eelkõige viitab E. cuniculi ribosoomi struktuur sellele, et rRNA ja valgufragmentide kadumine mikrosporiidia ribosoomis tekitab evolutsioonilist survet, mis soodustab muutusi ribosoomi struktuuris.Need variandid esinevad ribosoomi aktiivsest kohast kaugel ja näivad aitavat säilitada (või taastada) optimaalset ribosoomikoostu, mida vähendatud rRNA muidu häiriks.See viitab sellele, et mikrosporiidia ribosoomi peamine uuendus näib olevat kujunenud vajaduseks puhverdada geenitriivi.
Võib-olla illustreerib seda kõige paremini nukleotiidide sidumine, mida pole seni teistes organismides täheldatud.Asjaolu, et nukleotiide siduvad jäägid esinevad tüüpilistes mikrosporiidides, kuid mitte teistes eukarüootides, viitab sellele, et nukleotiidide sidumissaidid ei ole lihtsalt kadumist ootavad säilmed või rRNA lõplik koht, mis taastatakse üksikute nukleotiidide kujul.Selle asemel näib see sait olevat kasulik funktsioon, mis oleks võinud areneda mitme positiivse valiku vooru jooksul.Nukleotiidide sidumissaidid võivad olla loodusliku valiku kõrvalsaadus: kui ES39L on lagunenud, on mikrosporiidid sunnitud otsima kompensatsiooni, et taastada optimaalne ribosoomi biogenees ES39L puudumisel.Kuna see nukleotiid võib jäljendada ES39L-s oleva A3186 nukleotiidi molekulaarseid kontakte, saab nukleotiidi molekulist ribosoomi ehitusplokk, mille seondumist parandab veelgi eL30 järjestuse mutatsioon.
Mis puutub rakusiseste parasiitide molekulaarsesse evolutsiooni, siis meie uuring näitab, et Darwini loodusliku valiku ja genoomi lagunemise geneetilise triivi jõud ei tööta paralleelselt, vaid võnguvad.Esiteks kõrvaldab geneetiline triiv biomolekulide olulised omadused, mistõttu on hüvitist hädasti vaja.Ainult siis, kui parasiidid rahuldavad selle vajaduse Darwini loodusliku valiku kaudu, on nende makromolekulidel võimalus arendada välja oma muljetavaldavamad ja uuenduslikumad tunnused.Oluline on see, et nukleotiidide sidumissaitide evolutsioon E. cuniculi ribosoomides viitab sellele, et selline molekulaarse evolutsiooni kadu-võitu muster mitte ainult ei amortiseeri kahjulikke mutatsioone, vaid annab mõnikord parasiitmakromolekulidele täiesti uued funktsioonid.
See idee on kooskõlas Sewell Wrighti liikuva tasakaalu teooriaga, mis väidab, et range loodusliku valiku süsteem piirab organismide uuendusvõimet51,52,53.Kui aga geneetiline triiv häirib looduslikku valikut, võivad need triivid esile kutsuda muutusi, mis ei ole iseenesest kohanemisvõimelised (või isegi kahjulikud), kuid toovad kaasa edasisi muutusi, mis tagavad parema sobivuse või uue bioloogilise aktiivsuse.Meie raamistik toetab seda ideed, näidates, et sama tüüpi mutatsioon, mis vähendab biomolekuli volti ja funktsiooni, näib olevat selle parandamise peamine käivitaja.Kooskõlas win-win evolutsioonimudeliga näitab meie uuring, et genoomi lagunemine, mida traditsiooniliselt peetakse degeneratiivseks protsessiks, on ka peamine innovatsiooni tõukejõud, mis mõnikord ja võib-olla isegi sageli võimaldab makromolekulidel omandada uusi parasiitilisi tegevusi.saab neid kasutada.