Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Hiljuti töötati välja nanotehnoloogial põhinev kemikaalivaba antimikroobne platvorm, mis kasutab kunstlikke vee nanostruktuure (EWNS). EWNS-idel on kõrge pinnalaeng ja need on küllastunud reaktiivsete hapnikuühenditega (ROS), mis võivad suhelda paljude mikroorganismidega, sealhulgas toidust levivate patogeenidega, ja neid inaktiveerida. Siin näidatakse, et nende omadusi sünteesi ajal saab peenhäälestada ja optimeerida, et veelgi suurendada nende antibakteriaalset potentsiaali. EWNS-i laboriplatvorm loodi EWNS-i omaduste peenhäälestamiseks sünteesiparameetrite muutmise teel. EWNS-i omaduste (laeng, suurus ja ROS-i sisaldus) iseloomustamine kaasaegsete analüütiliste meetodite abil. Lisaks hinnati nende mikroobse inaktiveerimise potentsiaali toidust levivate mikroorganismide, näiteks Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum ja Saccharomyces cerevisiae, vastu. Siin esitatud tulemused näitavad, et EWNS-i omadusi saab sünteesi ajal peenhäälestada, mille tulemuseks on inaktiveerimise efektiivsuse eksponentsiaalne suurenemine. Eelkõige suurenes pinnalaeng neljakordselt ja reaktiivsete hapnikuühendite hulk suurenes. Mikroobide eemaldamise kiirus oli mikroobidest sõltuv ja jäi vahemikku 1,0–3,8 log10 pärast 45-minutilist kokkupuudet aerosooli annusega 40 000 #/cc EWNS.
Mikroobne saastumine on peamine toidust põhjustatud haiguste põhjus, mis on põhjustatud patogeenide või nende toksiinide allaneelamisest. Ainuüksi Ameerika Ühendriikides põhjustavad toidust põhjustatud haigused igal aastal umbes 76 miljonit haigestumist, 325 000 haiglaravi ja 5000 surmajuhtumit1. Lisaks hindab Ameerika Ühendriikide Põllumajandusministeerium (USDA), et värskete toodete suurenenud tarbimine põhjustab 48% kõigist Ameerika Ühendriikides teatatud toidust põhjustatud haigustest2. Toidust põhjustatud patogeenide põhjustatud haiguste ja surmajuhtumite maksumus Ameerika Ühendriikides on väga kõrge, hinnates haiguste tõrje ja ennetamise keskuste (CDC) hinnangul üle 15,6 miljardi USA dollari aastas3.
Praegu viiakse toiduohutuse tagamiseks vajalikke keemilisi,4 kiirgus-5 ja termilisi6 antimikroobseid sekkumisi enamasti läbi piiratud kriitilistes kontrollpunktides (KKP-des) tootmisahelas (tavaliselt pärast saagikoristust ja/või pakendamise ajal), mitte pidevalt. Seega on need altid ristsaastumisele. 7. Toidust põhjustatud haiguste ja toidu riknemise parem kontroll nõuab antimikroobseid sekkumisi, mida saab potentsiaalselt rakendada kogu farmist lauale protsessis, vähendades samal ajal keskkonnamõju ja kulusid.
Hiljuti töötati välja kemikaalivaba, nanotehnoloogial põhinev antimikroobne platvorm, mis suudab kunstlike vee nanostruktuuride (EWNS) abil inaktiveerida pinna- ja õhus levivaid baktereid. EWNS sünteesiti kahe paralleelse protsessi, elektropihustamise ja veeionisatsiooni abil (joonis 1a). Varasemad uuringud on näidanud, et EWNS-idel on ainulaadne füüsikaliste ja bioloogiliste omaduste kogum8,9,10. EWNS-idel on keskmiselt 10 elektroni struktuuri kohta ja keskmine nanoskaala suurus on 25 nm (joonis 1b, c)8,9,10. Lisaks näitas elektronide spinnresonants (ESR), et EWNS sisaldab suures koguses reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS), peamiselt hüdroksüül- (OH•) ja superoksiidi (O2-) radikaale (joonis 1c)8. EVNS on õhus pikka aega ja võib põrkuda õhus hõljuvate ja pinnal esinevate mikroorganismidega, toimetades kohale oma ROS-i kasuliku koormuse ja põhjustades mikroorganismide inaktiveerimist (joonis 1d). Need varased uuringud näitasid ka, et EWNS suudab interakteeruda erinevate gramnegatiivsete ja grampositiivsete bakteritega, sealhulgas mükobakteritega, pindadel ja õhus ning neid inaktiveerida. Transmissioon-elektronmikroskoopia näitas, et inaktiveerimise põhjustas rakumembraani kahjustumine. Lisaks on ägeda sissehingamise uuringud näidanud, et EWNS-i suured annused ei põhjusta kopsukahjustusi ega põletikku8.
(a) Elektropihustus tekib siis, kui vedelikuga kapillaartoru ja vastaselektroodi vahele rakendatakse kõrgepinge. (b) Kõrgsurve rakendamine põhjustab kahte erinevat nähtust: (i) vee elektropihustamine ja (ii) reaktiivsete hapnikuühendite (ioonide) moodustumine, mis jäävad EWNS-i kinni. (c) EWNS-i ainulaadne struktuur. (d) Oma nanoskaala olemuse tõttu on EWNS-id väga liikuvad ja võivad suhelda õhus levivate patogeenidega.
Hiljuti on tõestatud ka EWNS-i antimikroobse platvormi võimet inaktiveerida värske toidu pinnal toidust pärinevaid mikroorganisme. Samuti on näidatud, et EWNS-i pinnalaengut koos elektriväljaga saab kasutada sihipärase manustamise saavutamiseks. Lisaks olid mahetomatite esialgsed tulemused pärast 90-minutilist kokkupuudet umbes 50 000 #/cm3 EWNS-iga julgustavad, kusjuures täheldati mitmesuguseid toidust pärinevaid mikroorganisme, nagu E. coli ja Listeria 11. Lisaks ei näidanud esialgsed organoleptilised testid kontrolltomatitega võrreldes mingeid sensoorseid toimeid. Kuigi need esialgsed inaktiveerimise tulemused on toiduohutuse rakenduste jaoks julgustavad isegi väga madalate EWNS-i annuste (50 000 #/cc) korral, on selge, et suurem inaktiveerimispotentsiaal oleks kasulikum nakkuse ja riknemise ohu edasiseks vähendamiseks.
Siin keskendume oma uurimistöös EWNS-i genereerimisplatvormi arendamisele, et võimaldada sünteesiparameetrite peenhäälestamist ja EWNS-i füüsikalis-keemiliste omaduste optimeerimist, et suurendada nende antibakteriaalset potentsiaali. Eelkõige on optimeerimine keskendunud nende pinnalaengu (sihipärase kohaletoimetamise parandamiseks) ja ROS-i sisalduse (inaktiveerimise efektiivsuse parandamiseks) suurendamisele. Iseloomustame optimeeritud füüsikalis-keemilisi omadusi (suurus, laeng ja ROS-i sisaldus), kasutades kaasaegseid analüütilisi meetodeid ja kasutades tavalisi toidumikroorganisme, näiteks E.
EVNS sünteesiti kõrge puhtusastmega vee (18 MΩ cm–1) samaaegse elektropihustamise ja ioniseerimise teel. Elektrilist nebulisaatorit 12 kasutatakse tavaliselt vedelike pihustamiseks ja kontrollitud suurusega polümeer- ja keraamiliste osakeste 13 ning kiudude 14 sünteesimiseks.
Nagu varasemates publikatsioonides 8, 9, 10, 11 üksikasjalikult kirjeldatud, rakendati tüüpilises katses metallkapillaari ja maandatud vastaselektroodi vahele kõrgepinge. Selle protsessi käigus toimub kaks erinevat nähtust: i) elektropihustus ja ii) vee ionisatsioon. Kahe elektroodi vaheline tugev elektriväli põhjustab kondenseerunud vee pinnale negatiivsete laengute kogunemise, mille tulemuseks on Taylori koonuste moodustumine. Selle tulemusena tekivad tugevalt laetud veepiisad, mis lagunevad jätkuvalt väiksemateks osakesteks, nagu Rayleighi teoorias16. Samal ajal põhjustavad tugevad elektriväljad mõnede veemolekulide lõhustumist ja elektronide eraldamist (ioniseerumist), mis viib suure hulga reaktiivsete hapnikuühendite (ROS)17 moodustumiseni. Samaaegselt tekkinud ROS18 kapseldati EWNS-i (joonis 1c).
Joonisel 2a on näidatud käesolevas uuringus EWNS-i sünteesis välja töötatud ja kasutatud EWNS-i genereerimissüsteem. Suletud pudelis hoitud puhastatud vesi juhiti läbi teflontoru (siseläbimõõt 2 mm) 30G roostevabast terasest nõela (metallist kapillaar). Vee voolu reguleeritakse pudeli sees oleva õhurõhu abil, nagu on näidatud joonisel 2b. Nõel on paigaldatud teflonkonsoolile ja seda saab käsitsi reguleerida teatud kaugusele vastaselektroodist. Vastaselektrood on poleeritud alumiiniumketas, mille keskel on auk proovi võtmiseks. Vastaselektroodi all on alumiiniumist proovivõtulehter, mis on ühendatud ülejäänud eksperimentaalse seadistusega proovivõtupordi kaudu (joonis 2b). Laengu kogunemise vältimiseks, mis võiks proovivõtja tööd häirida, on kõik proovivõtja komponendid elektriliselt maandatud.
(a) Tehnoloogiliselt loodud vee nanostruktuuride genereerimise süsteem (EWNS). (b) Proovivõtja ja elektropihusti ristlõige, mis näitab kõige olulisemaid parameetreid. (c) Bakterite inaktiveerimise eksperimentaalne seadistus.
Ülalkirjeldatud EWNS-i genereerimissüsteem on võimeline muutma peamisi tööparameetreid, et hõlbustada EWNS-i omaduste peenhäälestamist. EWNS-i omaduste peenhäälestamiseks reguleerige rakendatavat pinget (V), nõela ja vastaselektroodi vahelist kaugust (L) ning veevoolu (φ) läbi kapillaari. Erinevate kombinatsioonide tähistamiseks kasutatud sümbol: [V (kV), L (cm)]. Reguleerige veevoolu, et saada stabiilne teatud komplektiga Taylori koonus [V, L]. Selle uuringu eesmärgil hoiti vastaselektroodi ava läbimõõtu (D) 0,5 tolli (1,29 cm) juures.
Piiratud geomeetria ja asümmeetria tõttu ei saa elektrivälja tugevust arvutada esimeste põhimõtete põhjal. Selle asemel kasutati elektrivälja arvutamiseks QuickField™ tarkvara (Svendborg, Taani)19. Elektriväli ei ole ühtlane, seega kasutati kapillaari otsas olevat elektrivälja väärtust erinevate konfiguratsioonide võrdlusväärtusena.
Uuringu käigus hinnati nõela ja vastaselektroodi vahelise pinge ja kauguse mitmeid kombinatsioone Taylori koonuse moodustumise, Taylori koonuse stabiilsuse, EWNS-i tootmise stabiilsuse ja reprodutseeritavuse seisukohast. Erinevad kombinatsioonid on toodud lisatabelis S1.
EWNS-i genereerimissüsteemi väljund ühendati otse skaneeriva liikuvuse osakeste suuruse analüsaatoriga (SMPS, mudel 3936, TSI, Shoreview, MN) osakeste arvu kontsentratsiooni mõõtmiseks ja samuti aerosool Faraday elektromeetriga (TSI, mudel 3068B, Shoreview, MN). ) aerosoolvoolude mõõtmiseks mõõdeti nagu on kirjeldatud meie eelmises publikatsioonis. Nii SMPS-i kui ka aerosoolelektromeetri proovid võeti voolukiirusel 0,5 l/min (proovi koguvool 1 l/min). Osakeste arvu kontsentratsiooni ja aerosooli voolu mõõdeti 120 sekundi jooksul. Mõõtmist korratakse 30 korda. Voolumõõtmiste põhjal arvutatakse aerosooli kogulaeng ja hinnatakse keskmist EWNS-i laengut antud valitud EWNS-i osakeste koguarvu kohta. EWNS-i keskmist maksumust saab arvutada võrrandi (1) abil:
kus IEl on mõõdetud voolutugevus, NSMPS on SMPS-iga mõõdetud digitaalne kontsentratsioon ja φEl on voolukiirus elektromeetri kohta.
Kuna suhteline õhuniiskus (RH) mõjutab pinnalaengut, hoiti temperatuuri ja (RH) katse ajal konstantsena vastavalt 21 °C ja 45% juures.
EWNS-i suuruse ja eluea mõõtmiseks kasutati aatomjõumikroskoopiat (AFM), Asylum MFP-3D-d (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ja AC260T-sondi (Olympus, Tokyo, Jaapan). AFM-i skaneerimissagedus oli 1 Hz, skaneerimisala oli 5 μm × 5 μm ja 256 skaneerimisjoont. Kõikidele piltidele tehti esimese järgu piltide joondamine Asylum tarkvara abil (maski ulatus 100 nm, lävi 100 pm).
Katselehter eemaldati ja vilgupind asetati vastaselektroodist 2,0 cm kaugusele keskmiseks ajaks 120 sekundit, et vältida osakeste aglomeratsiooni ja ebakorrapäraste tilkade teket vilgupinnal. EWNS pihustati otse värskelt lõigatud vilgupinnale (Ted Pella, Redding, CA). Vilgupinna pilt vahetult pärast AFM-pihustamist. Värskelt lõigatud modifitseerimata vilgupinna kontaktnurk on lähedane 0°-le, seega on EVNS jaotunud vilgupinnale kupli kujul. Difundeeruvate tilkade läbimõõt (a) ja kõrgus (h) mõõdeti otse AFM-topograafiast ja neid kasutati EWNS-i kuplikujulise difusioonimahu arvutamiseks, kasutades meie eelnevalt valideeritud meetodit. Eeldades, et sisseehitatud EWNS-idel on sama maht, saab ekvivalentläbimõõdu arvutada võrrandi (2) abil:
Meie eelnevalt väljatöötatud meetodi põhjal kasutati lühiealiste radikaalide vaheühendite tuvastamiseks EWNS-is elektronspinresonantsi (ESR) spinnlõksu. Aerosoolid juhiti läbi 650 μm Midget-pihustiga (Ace Glass, Vineland, NJ), mis sisaldas 235 mM DEPMPO(5-(dietoksüfosforüül)-5-metüül-1-pürroliin-N-oksiidi) (Oxis International Inc.) lahust. Portland, Oregon). Kõik ESR-mõõtmised viidi läbi Bruker EMX spektromeetri (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ja lameekraankambri abil. Andmete kogumiseks ja analüüsimiseks kasutati Acquisiti tarkvara (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). ROS-i omaduste määramine viidi läbi ainult teatud töötingimuste [-6,5 kV, 4,0 cm] korral. EWNS-i kontsentratsioonid mõõdeti SMPS-i abil, võttes arvesse EWNS-i kadusid impaktoris.
Osoonitaset jälgiti seadmega 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Kõigi EWNS-i omaduste puhul kasutatakse mõõtmisväärtusena keskmist väärtust ja mõõtmisveana standardhälvet. Optimeeritud EWNS-i atribuutide väärtuste võrdlemiseks baas-EWNS-i vastavate väärtustega viidi läbi T-testid.
Joonis 2c näitab varem väljatöötatud ja iseloomustatud elektrostaatilise sadestamise (EPES) „tõmbesüsteemi“, mida saab kasutada EWNS-i sihipäraseks kohaletoimetamiseks pinnale. EPES kasutab EVNS-laenguid, mida saab tugeva elektrivälja mõjul otse sihtmärgi pinnale „suunata“. EPES-süsteemi üksikasjad on esitatud Pyrgiotakis jt hiljutises publikatsioonis 11. Seega koosneb EPES 3D-prinditud PVC-kambrist, millel on koonilised otsad ja mis sisaldab kahte paralleelset roostevabast terasest (304 roostevaba teras, peegelkattega) metallplaati keskel 15,24 cm kaugusel teineteisest. Plaadid ühendati välise kõrgepingeallikaga (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), alumine plaat oli alati ühendatud positiivse pingega ja ülemine plaat oli alati ühendatud maandusega (ujuv maandus). Kambri seinad on kaetud alumiiniumfooliumiga, mis on elektriliselt maandatud, et vältida osakeste kadu. Kambril on suletud esilaadimisuks, mis võimaldab asetada testpinnad plastmassist alustele, mis tõstavad need alumisest metallplaadist kõrgemale, et vältida kõrgepinge interferentsi.
EWNS-i sadestamise efektiivsus EPES-is arvutati eelnevalt väljatöötatud protokolli kohaselt, mida on üksikasjalikult kirjeldatud lisajoonisel S111.
Juhtkambrina ühendati EPES-süsteemiga järjestikku teine ​​silindriline voolukamber, milles kasutati EWNS-i eemaldamiseks vahepealset HEPA-filtrit. Nagu joonisel 2c näidatud, pumbati EWNS-i aerosool läbi kahe sisseehitatud kambri. Juhtimisruumi ja EPES-i vaheline filter eemaldab kõik ülejäänud EWNS-id, mille tulemuseks on sama temperatuur (T), suhteline õhuniiskus (RH) ja osoonitase.
On leitud, et olulised toidust pärinevad mikroorganismid saastavad värskeid toiduaineid, näiteks E. coli (ATCC #27325), fekaalne indikaator, Salmonella enterica (ATCC #53647), toidust pärinev patogeen Listeria harmless (ATCC #33090), patogeense Listeria monocytogenes'i surrogaat, mis on saadud ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae'st (ATCC #4098), riknemispärmide asendaja, ja resistentsem inaktiveeritud bakter Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Ostke kohalikult turult suvalisi kaste orgaanilisi viinamarjatomateid ja hoidke neid kuni kasutamiseni (kuni 3 päeva) külmkapis temperatuuril 4 °C. Katsetomatid olid kõik ühesuurused, umbes 1,25 cm läbimõõduga.
Kultiveerimise, inokuleerimise, eksponeerimise ja kolooniate loendamise protokollid on üksikasjalikult kirjeldatud meie eelmises publikatsioonis ja lisaandmetes. EWNS-i efektiivsust hinnati, eksponeerides inokuleeritud tomateid 45 minuti jooksul 40 000 #/cm3 kontsentratsioonile. Lühidalt, ellujäänud mikroorganismide hindamiseks ajahetkel t = 0 min kasutati kolme tomatit. Kolm tomatit pandi EPES-i ja eksponeeriti EWNS-ile kontsentratsioonil 40 000 #/cc (EWNS-iga eksponeeritud tomatid) ning ülejäänud kolm pandi kontrollkambrisse (kontrolltomatid). Kummagi rühma tomatite täiendavat töötlemist ei teostatud. EWNS-iga eksponeeritud tomatid ja kontrolltomatid eemaldati 45 minuti pärast, et hinnata EWNS-i mõju.
Iga katse viidi läbi kolmes korduses. Andmete analüüs viidi läbi vastavalt lisaandmetes kirjeldatud protokollile.
Inaktiveerimismehhanisme hinnati kiiritamata EWNS-proovide settimise teel (45 minutit 40 000 #/cm3 EWNS-aerosooli kontsentratsioonil) ja ohutute bakterite E. coli, Salmonella enterica ja Lactobacillus proovide settimise teel. Osakesed fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdis, 1,25% paraformaldehüüdis ja 0,03% pikriinhappes 0,1 M naatriumkakodülaatpuhvris (pH 7,4) 2 tundi toatemperatuuril. Pärast pesemist fikseeriti osakesed 2 tundi 1% osmiumtetroksiidi (OsO4)/1,5% kaaliumferrotsüaniidiga (KFeCN6), pesti 3 korda veega ja inkubeeriti 1% uranüülatsetaadis 1 tund, seejärel pesti kaks korda veega ja dehüdreeriti 10 minutit 50%, 70%, 90% ja 100% alkoholis. Seejärel asetati proovid üheks tunniks propüleenoksiidi ja immutati propüleenoksiidi ja TAAP Eponi 1:1 seguga (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Proovid paigutati TAAB Eponi ja polümeriseeriti temperatuuril 60 °C 48 tundi. Kõvenenud granuleeritud vaiku lõigati ja visualiseeriti TEM-iga, kasutades tavapärast transmissioon-elektronmikroskoopi JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Jaapan), mis oli varustatud AMT 2k CCD-kaameraga (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Kõik katsed viidi läbi kolmes korduses. Iga ajapunkti kohta külvati bakteriaalsed pesud kolmes korduses, saades kokku üheksa andmepunkti punkti kohta, mille keskmist kasutati selle konkreetse mikroorganismi bakterite kontsentratsioonina. Mõõtmisveana kasutati standardhälvet. Kõik punktid loevad.
Bakterite kontsentratsiooni vähenemise logaritm võrreldes t = 0 min-ga arvutati järgmise valemi abil:
kus C0 on bakterite kontsentratsioon kontrollproovis ajahetkel 0 (st pärast pinna kuivamist, kuid enne kambrisse asetamist) ja Cn on bakterite kontsentratsioon pinnal pärast n minutit kestnud kokkupuudet.
Bakterite loomuliku lagunemise arvessevõtmiseks 45-minutilise kokkupuute ajal arvutati logaritmiline vähenemine võrreldes kontrollrühmaga 45 minuti pärast järgmiselt:
kus Cn on bakterite kontsentratsioon kontrollproovis ajahetkel n ja Cn-Control on kontrollbakterite kontsentratsioon ajahetkel n. Andmed on esitatud logaritmilise vähenemisena võrreldes kontrollprooviga (ilma EWNS-iga kokkupuuteta).
Uuringu käigus hinnati Taylori koonuse moodustumise, Taylori koonuse stabiilsuse, EWNS-i tekke stabiilsuse ja reprodutseeritavuse osas mitmeid pinge ja nõela ning vastaselektroodi vahelise kauguse kombinatsioone. Erinevad kombinatsioonid on toodud lisatabelis S1. Põhjalikuks uuringuks valiti kaks juhtumit, mis näitasid stabiilseid ja reprodutseeritavaid omadusi (Taylori koonus, EWNS-i teke ja stabiilsus aja jooksul). Joonisel 3 on näidatud ROS-i laengu, suuruse ja sisalduse tulemused mõlemal juhul. Tulemused on kokku võetud ka tabelis 1. Võrdluseks, nii joonis 3 kui ka tabel 1 sisaldavad eelnevalt sünteesitud optimeerimata EWNS-ide 8, 9, 10, 11 (lähtetaseme EWNS) omadusi. Kahepoolse t-testi abil tehtud statistilise olulisuse arvutused on uuesti avaldatud lisatabelis S2. Lisaks hõlmavad lisaandmed uuringuid vastaselektroodi proovivõtuava läbimõõdu (D) ja maanduselektroodi ning otsa vahelise kauguse (L) mõju kohta (lisajoonised S2 ja S3).
(ac) AFM-iga mõõdetud suurusjaotus. (df) Pindlaengu karakteristik. (g) EPR-i ROS-i iseloomustus.
Samuti on oluline märkida, et kõigil ülaltoodud tingimustel oli mõõdetud ionisatsioonivool vahemikus 2 kuni 6 μA ja pinge vahemikus -3,8 kuni -6,5 kV, mille tulemuseks oli selle ühe EWNS-i genereerimise kontaktmooduli energiatarve alla 50 mW. Kuigi EWNS-i sünteesiti kõrge rõhu all, oli osoonitase väga madal, ei ületanud kunagi 60 ppb.
Lisajoonis S4 näitab simuleeritud elektrivälju vastavalt stsenaariumide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral. Stsenaariumide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral on väljaarvutused vastavalt 2 × 105 V/m ja 4,7 × 105 V/m. See on ootuspärane, kuna teisel juhul on pinge ja vahemaa suhe palju suurem.
Joonisel 3a, b on näidatud AFM8 abil mõõdetud EWNS-i läbimõõt. Arvutatud keskmised EWNS-i läbimõõdud olid vastavalt 27 nm ja 19 nm skeemide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral. Stsenaariumide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral on jaotuste geomeetrilised standardhälbed vastavalt 1,41 ja 1,45, mis näitab kitsast suurusjaotust. Nii keskmine suurus kui ka geomeetriline standardhälve on väga lähedased baas-EWNS-ile, vastavalt 25 nm ja 1,41 juures. Joonisel 3c on näidatud baas-EWNS-i suurusjaotus, mis on mõõdetud sama meetodi abil samades tingimustes.
Joonisel 3d,e on näidatud laengu iseloomustamise tulemused. Andmed on 30 samaaegse kontsentratsiooni (#/cm3) ja voolutugevuse (I) mõõtmise keskmised mõõtmised. Analüüs näitab, et EWNS-i keskmine laeng on vastavalt 22 ± 6 e- ja 44 ± 6 e- [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral. Neil on oluliselt suuremad pinnalaengud võrreldes baas-EWNS-iga (10 ± 2 e-), kaks korda suuremad kui [-6,5 kV, 4,0 cm] stsenaariumi korral ja neli korda suuremad kui [-3,8 kV, 0,5 cm]. Joonis 3f näitab baas-EWNS-i laenguandmeid.
EWNS-i arvu kontsentratsioonikaartidelt (lisajoonised S5 ja S6) on näha, et stsenaariumis [-6,5 kV, 4,0 cm] on oluliselt rohkem osakesi kui stsenaariumis [-3,8 kV, 0,5 cm]. Samuti väärib märkimist, et EWNS-i arvu kontsentratsiooni jälgiti kuni 4 tundi (lisajoonised S5 ja S6), kus EWNS-i genereerimise stabiilsus näitas mõlemal juhul sama osakeste arvu kontsentratsiooni taset.
Joonisel 3g on näidatud EPR-spekter pärast optimeeritud EWNS-i kontrolli (taust) lahutamist lainepikkusel [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS-spektreid võrreldi ka varem avaldatud töös kirjeldatud baasjoone-EWNS-i stsenaariumiga. Spinnilõksudega reageerivate EWNS-ide arvuks arvutati 7,5 × 104 EWNS/s, mis on sarnane varem avaldatud baasjoone-EWNS8-ga. EPR-spektrid näitasid selgelt kahte tüüpi ROS-i olemasolu, kusjuures O2- oli domineeriv liik ja OH• oli vähem levinud. Lisaks näitas tippude intensiivsuste otsene võrdlus, et optimeeritud EWNS-il oli oluliselt kõrgem ROS-i sisaldus võrreldes baasjoone-EWNS-iga.
Joonisel 4 on näidatud EWNS-i sadestamise efektiivsus EPES-is. Andmed on kokku võetud ka tabelis I ja võrreldud EWNS-i algsete andmetega. Mõlema EUNS-i puhul on sadestamine peaaegu 100% isegi madala 3,0 kV pinge juures. Tavaliselt piisab 3,0 kV-st 100% sadestamiseks, olenemata pinnalaengu muutusest. Samades tingimustes oli Baseline-EWNS-i sadestamise efektiivsus vaid 56% tänu nende madalamale laengule (keskmiselt 10 elektroni EWNS-i kohta).
Joonisel 5 ja tabelis 2 on kokku võetud tomatite pinnale inokuleeritud mikroorganismide inaktiveerimisväärtus pärast kokkupuudet umbes 40 000 #/cm3 EWNS-iga 45 minuti jooksul optimaalses režiimis [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokuleeritud E. coli ja Lactobacillus innocuous näitasid 45-minutilise kokkupuute jooksul olulist 3,8 logaritmilist vähenemist. Samades tingimustes oli S. enterica langus 2,2 logaritmi, samas kui S. cerevisiae ja M. parafortutum'i langus oli 1,0 logaritmi.
Elektronmikroskoobi fotod (joonis 6) kujutavad EWNS-i poolt kahjututel Escherichia coli, Streptococcus ja Lactobacillus rakkudel esile kutsutud füüsikalisi muutusi, mis viivad nende inaktiveerimiseni. Kontrollbakteritel olid terved rakumembraanid, samas kui avatud bakteritel olid kahjustatud välismembraanid.
Kontroll- ja eksponeeritud bakterite elektronmikroskoopiline pildistamine näitas membraanikahjustusi.
Optimeeritud EWNS-i füüsikalis-keemiliste omaduste andmed näitavad kokkuvõttes, et EWNS-i omadused (pinnalaeng ja ROS-i sisaldus) paranesid oluliselt võrreldes varem avaldatud EWNS-i baasandmetega8,9,10,11. Teisest küljest jäi nende suurus nanomeetri vahemikku, mis on väga sarnane varem teatatud tulemustega, võimaldades neil õhus pikka aega püsida. Täheldatud polüdisperssust saab seletada pinnalaengu muutustega, mis määravad EWNS-i suuruse, Rayleigh' efekti juhuslikkuse ja võimaliku koalestsentsi. Nagu Nielsen jt.22 on aga üksikasjalikult kirjeldanud, vähendab suur pinnalaeng aurustumist, suurendades tõhusalt veepiisa pinnaenergiat/pinevust. Meie eelmises publikatsioonis8 kinnitati seda teooriat eksperimentaalselt mikropiiskade22 ja EWNS-i puhul. Laengu kadu aja jooksul võib samuti mõjutada suurust ja panustada täheldatud suurusjaotusse.
Lisaks on struktuuri laeng umbes 22–44 e-, olenevalt olukorrast, mis on oluliselt kõrgem võrreldes põhilise EWNS-iga, mille keskmine laeng on 10 ± 2 elektroni struktuuri kohta. Siiski tuleb märkida, et see on EWNS-i keskmine laeng. Seto jt. On näidatud, et laeng on mittehomogeenne ja järgib log-normaaljaotust21. Võrreldes meie varasema tööga kahekordistab pinnalaengu kahekordistamine EPES-süsteemis sadestamise efektiivsust peaaegu 100%-ni11.