Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Kuvab korraga kolmest slaidist koosneva karusselli.Korraga kolme slaidi vahel liikumiseks kasutage nuppe Eelmine ja Järgmine või kolme slaidi vahel liikumiseks kasutage lõpus olevaid liuguri nuppe.
Hematoentsefaalbarjäär ja hematoentsefaalbarjäär takistavad bioterapeutiliste ainete jõudmist kesknärvisüsteemi sihtmärkideni, takistades seeläbi neuroloogiliste haiguste tõhusat ravi.Uute ajutransporterite avastamiseks in vivo võtsime kasutusele T7 faagi peptiidide raamatukogu ja kogusime seeriaviisiliselt verd ja tserebrospinaalvedelikku (CSF), kasutades kanüülitud teadvusel olevate rottide suure basseini mudelit.Spetsiifilised faagikloonid olid pärast nelja selektsioonivooru CSF-s väga rikastatud.Üksikute kandidaatpeptiidide testimine näitas CSF-i enam kui 1000-kordset rikastumist.Peptiidide vahendatud ajju toimetamise bioaktiivsust kinnitas amüloid-β taseme langus 40% tserebrospinaalvedelikus, kasutades tuvastatud uudse transiitpeptiidiga seotud BACE1 peptiidi inhibiitorit.Need tulemused viitavad sellele, et in vivo faagi selektsioonimeetoditega tuvastatud peptiidid võivad olla kasulikud kandjad makromolekulide süsteemseks toimetamiseks ajju, millel on terapeutiline toime.
Kesknärvisüsteemi (KNS) suunatud raviuuringud on suures osas keskendunud optimeeritud ravimite ja ainete väljaselgitamisele, millel on kesknärvisüsteemile suunatud omadused, kusjuures vähem jõupingutusi on tehtud mehhanismide avastamiseks, mis juhivad aktiivset ravimi manustamist ajju.See hakkab nüüd muutuma, kuna ravimite kohaletoimetamine, eriti suured molekulid, on kaasaegse neuroteaduse ravimite väljatöötamise lahutamatu osa.Kesknärvisüsteemi keskkonda kaitseb hästi tserebrovaskulaarne barjäärisüsteem, mis koosneb hematoentsefaalbarjäärist (BBB) ​​ja hematoentsefaalbarjäärist (BCBB)1, mistõttu on ravimite ajju toimetamine keeruline1,2.Arvatakse, et peaaegu kõik suure molekuliga ravimid ja üle 98% väikese molekuliga ravimitest elimineeritakse ajust3.Seetõttu on väga oluline tuvastada uued aju transpordisüsteemid, mis tagavad terapeutiliste ravimite tõhusa ja spetsiifilise kohaletoimetamise kesknärvisüsteemi 4,5.Kuid BBB ja BCSFB pakuvad ka suurepärast võimalust ravimite kohaletoimetamiseks, kuna need tungivad läbi ulatusliku veresoonkonna aju kõikidesse struktuuridesse.Seega põhinevad praegused jõupingutused mitteinvasiivsete ajju kohaletoimetamise meetodite kasutamiseks suuresti endogeenset BBB6 retseptorit kasutava retseptori vahendatud transpordi (PMT) mehhanismil.Vaatamata viimastele olulistele edusammudele transferriini retseptori raja7, 8 kasutamisel, on vaja edasi arendada uusi paremate omadustega kohaletoimetamissüsteeme.Sel eesmärgil oli meie eesmärk tuvastada peptiidid, mis on võimelised vahendama CSF-i transporti, kuna neid saaks põhimõtteliselt kasutada makromolekulide toimetamiseks kesknärvisüsteemi või uute retseptorite avamiseks.Eelkõige võivad tserebrovaskulaarsüsteemi spetsiifilised retseptorid ja transporterid (BBB ja BSCFB) olla potentsiaalsed sihtmärgid bioterapeutiliste ravimite aktiivseks ja spetsiifiliseks kohaletoimetamiseks.Tserebrospinaalvedelik (CSF) on koroidpõimiku (CS) sekretoorne saadus ja on subarahnoidaalse ruumi ja vatsakeste ruumi kaudu otseses kontaktis aju interstitsiaalse vedelikuga4.Hiljuti on näidatud, et subarahnoidne tserebrospinaalvedelik hajub liigselt aju interstitsiumi9.Loodame pääseda parenhüümiruumi, kasutades seda subarahnoidset sissevoolutrakti või otse läbi BBB.Selle saavutamiseks rakendasime tugeva in vivo faagi selektsioonistrateegia, mis ideaalis identifitseerib peptiidid, mida transporditakse kummagi kahe erineva raja kaudu.
Nüüd kirjeldame järjestikust in vivo faagide kuvamise sõelumismeetodit koos CSF-i proovivõtmisega koos suure läbilaskevõimega järjestamisega (HTS), et jälgida esialgseid valikuvoore suurima raamatukogu mitmekesisusega.Sõelumine viidi läbi teadvusel rottidel, kellel oli püsivalt implanteeritud suur tsisterna (CM) kanüül, et vältida vere saastumist.Oluline on see, et see lähenemisviis valib nii aju-sihtimise kui ka peptiidid, millel on transpordi aktiivsus läbi ajuveresoonkonna barjääri.Kasutasime T7 faage nende väiksuse tõttu (~ 60 nm)10 ja tegime ettepaneku, et need sobivad vesiikulite transportimiseks, mis võimaldavad endoteeli ja/või epiteeli-medulla barjääri transtsellulaarset ületamist.Pärast nelja panoraamimist eraldati faagipopulatsioonid, mis näitasid tugevat in vivo CSF ​​rikastumist ja aju mikroveresoonte seost.Oluline on see, et suutsime oma tulemusi kinnitada, näidates, et eelistatud ja keemiliselt sünteesitud parimad peptiidid on võimelised transportima valgu lasti tserebrospinaalvedelikku.Esiteks määrati kesknärvisüsteemi farmakodünaamilised toimed juhtiva transiitpeptiidi kombineerimisel BACE1 peptiidi inhibiitoriga.Lisaks demonstreerimisele, et in vivo funktsionaalsed sõeluuringustrateegiad võivad tuvastada uudseid aju transpordipeptiide kui tõhusaid valgu lasti kandjaid, eeldame, et sarnased funktsionaalse valiku lähenemisviisid muutuvad oluliseks ka uute aju transpordiradade tuvastamisel.
Naastu moodustavate ühikute (PFU) põhjal kavandati ja loodi pärast faagi pakkimisetappi juhuslike 12-meeriliste lineaarsete T7 faagipeptiidide raamatukogu, mille mitmekesisus oli ligikaudu 109 (vt Materjalid ja meetodid).Oluline on märkida, et enne in vivo panoraamimist analüüsisime seda raamatukogu hoolikalt.Faagiraamatukogu proovide PCR-i amplifikatsioon modifitseeritud praimerite abil genereeris amplikonid, mis olid otseselt rakendatavad HTS-ile (täiendav joonis 1a).A) HTS11 sekveneerimisvigade, b) praimerite (NNK) 1-12 kvaliteedi ja c) metsiktüüpi (wt) faagi (skeleti insertide) olemasolu tõttu ooterežiimi raamatukogus rakendati järjestuste filtreerimise protseduur, et eraldada ainult kontrollitud järjestusteave (täiendav joonis 1b).Need filtrietapid kehtivad kõigi HTS-i järjestusteekide puhul.Standardse raamatukogu jaoks saadi kokku 233 868 lugemist, millest 39% läbis filtrikriteeriumid ja mida kasutati raamatukogu analüüsiks ja järgmiste voorude valimiseks (täiendav joonis 1c – e).Lugemised olid valdavalt 3 aluspaari pikkused, mille piik oli 36 nukleotiidi juures (täiendav joonis 1c), kinnitades raamatukogu kujundust (NNK) 1-12.Nimelt sisaldas ligikaudu 11% raamatukogu liikmetest 12-mõõtmelist metsiktüüpi (wt) karkassi PAGISRELVDKL inserti ja peaaegu pooled järjestustest (49%) sisaldasid insertsioone või deletsioone.Raamatukogu raamatukogu HTS kinnitas peptiidide suurt mitmekesisust raamatukogus: rohkem kui 81% peptiidijärjestustest leiti ainult üks kord ja ainult 1, 5% esines ≥4 koopias (täiendav joonis 2a).Aminohapete (aa) sagedused repertuaari kõigis 12 positsioonis korreleerusid hästi degenereerunud NKK repertuaari poolt genereeritud koodonite arvu eeldatavate sagedustega (täiendav joonis 2b).Nende lisade poolt kodeeritud aa-jääkide täheldatud sagedus korreleerus hästi arvutatud sagedusega (r = 0, 893) (täiendav joonis 2c).Faagiraamatukogude ettevalmistamine süstimiseks hõlmab endotoksiini amplifikatsiooni ja eemaldamise etappe.Varem on näidatud, et see võib potentsiaalselt vähendada faagiraamatukogude mitmekesisust 12, 13.Seetõttu sekveneerisime plaadilt amplifitseeritud faagi raamatukogu, mis oli läbinud endotoksiinide eemaldamise, ja võrdlesime seda algse raamatukoguga, et hinnata AA sagedust.Täheldati tugevat korrelatsiooni (r = 0, 995) algse kogumi ning amplifitseeritud ja puhastatud kogumi vahel (täiendav joonis 2d), mis näitab, et konkurents kloonide vahel, mida amplifitseeriti plaatidel, kasutades T7 faagi, ei põhjustanud suurt kõrvalekallet.See võrdlus põhineb tripeptiidmotiivide sagedusel igas raamatukogus, kuna raamatukogude mitmekesisust (~ 109) ei saa isegi HTS-iga täielikult tabada.Aa sagedusanalüüs igas positsioonis näitas väikest positsioonist sõltuvat eelarvamust sisestatud repertuaari kolmes viimases positsioonis (täiendav joonis 2e).Kokkuvõtteks järeldasime, et raamatukogu kvaliteet ja mitmekesisus olid vastuvõetavad ning mitmete valikuvoorude vahel täheldati faagiraamatukogude amplifitseerimise ja ettevalmistamise tõttu vaid väikseid muutusi mitmekesisuses.
Tserebrospinaalvedeliku seeriaproovide võtmist saab teostada kanüüli kirurgilise implanteerimisega teadvusel olevate rottide CM-i, et hõlbustada BBB ja/või BCSFB kaudu intravenoosselt (iv) süstitud T7 faagi tuvastamist (joonis 1a-b).In vivo valiku esimeses kolmes voorus kasutasime kahte sõltumatut selektsiooniharu (haru A ja B) (joonis 1c).Suurendasime järk-järgult valiku rangust, vähendades esimeses kolmes valikuvoorus sisestatud faagi koguhulka.Neljanda panoraamimise vooru jaoks ühendasime A- ja B-haru proovid ning teostasime kolm täiendavat sõltumatut valikut.Selles mudelis T7 faagiosakeste in vivo omaduste uurimiseks süstiti rottidele sabaveeni kaudu metsiktüüpi faag (PAGISRELVDKL master insert).Faagide taastumine tserebrospinaalvedelikust ja verest erinevatel ajahetkedel näitas, et suhteliselt väikestel T7 ikosaeedrilistel faagidel oli verekambrist kiire esialgne kliirensi faas (täiendav joonis 3).Manustatud tiitrite ja rottide veremahu põhjal arvutasime, et ainult ligikaudu 1% massist.Faag manustatud annusest tuvastati veres 10 minutit pärast intravenoosset süstimist.Pärast seda esialgset kiiret langust mõõdeti aeglasem esmane kliirens poolväärtusajaga 27,7 minutit.Oluline on see, et CSF-i sektsioonist saadi välja vaid väga vähesed faagid, mis viitab madalale taustale metsiktüüpi faagide migreerumisel CSF-kambrisse (täiendav joonis 3).Kogu proovivõtuperioodi jooksul (0-250 min) tuvastati tserebrospinaalvedelikus keskmiselt ainult umbes 1 x 10-3% T7 faagi tiitreid veres ja 4 x 10-8% algselt infundeeritud faagidest.Nimelt oli metsiktüüpi faagi poolväärtusaeg (25,7 min) tserebrospinaalvedelikus sarnane veres täheldatuga.Need andmed näitavad, et CSF-i sektsiooni verest eraldav barjäär on CM-kanüüliga rottidel puutumatu, võimaldades in vivo selekteerida faagiraamatukogusid, et tuvastada kloone, mis transporditakse kergesti verest CSF-kambrisse.
a) Meetodi loomine tserebrospinaalvedeliku (CSF) uuesti proovide võtmiseks suurest kogumist.(b) Diagramm, mis näitab kesknärvisüsteemi (KNS) barjääri rakulist asukohta ja selektsioonistrateegiat, mida kasutatakse hematoentsefaalbarjääri (BBB) ​​ja hematoentsefaalbarjääri läbivate peptiidide tuvastamiseks.(c) In vivo faagi kuvamise sõelumise vooskeem.Igas valikuvoorus süstiti intravenoosselt faagid (loomade identifikaatorid noolte sees).Kaks sõltumatut alternatiivset haru (A, B) hoitakse eraldi kuni 4. valikuvooruni.Valikuvoorude 3 ja 4 jaoks sekveneeriti iga CSF-st ekstraheeritud faagikloon käsitsi.(d) Verest (punased ringid) ja tserebrospinaalvedelikust (rohelised kolmnurgad) eraldatud faagi kineetika esimeses selektsioonivoorus kahel kanüüliga rotil pärast T7 peptiidi raamatukogu intravenoosset süstimist (2 x 1012 faagi looma kohta).Sinised ruudud näitavad faagi keskmist algkontsentratsiooni veres, mis on arvutatud süstitud faagi koguse põhjal, võttes arvesse kogu veremahtu.Mustad ruudud näitavad y-joone lõikepunkti, mis on ekstrapoleeritud vere faagide kontsentratsioonidest.(e, f) Esitage peptiidis leiduvate kõigi võimalike kattuvate tripeptiidi motiivide suhteline sagedus ja jaotus.Näidatud on 1000 lugemisel leitud motiivide arv.Oluliselt (p < 0,001) rikastatud motiivid on tähistatud punaste täppidega.(e) Korrelatsiooni hajuvusdiagramm, mis võrdleb süstitud raamatukogu tripeptiidmotiivi suhtelist sagedust loomade #1.1 ja #1.2 verest pärineva faagiga.(f) Korrelatsiooni hajuvusdiagramm, mis võrdleb veres ja tserebrospinaalvedelikus eraldatud loomafaagi tripeptiidi motiivide #1.1 ja #1.2 suhtelisi sagedusi.(g, h) Verega rikastatud faagi (g) järjestuse ID esitus võrreldes süstitud raamatukogudega ja CSF-ga rikastatud faagiga (h) versus veri pärast in vivo selektsiooni mõlemal loomal.Ühetähelise koodi suurus näitab, kui sageli see aminohape selles asendis esineb.Roheline = polaarne, lilla = neutraalne, sinine = aluseline, punane = happeline ja must = hüdrofoobsed aminohapped.Joonise 1a, b kujundas ja valmistas Eduard Urich.
Süstisime faagipeptiidi raamatukogu kahte CM-i instrumentaalrotti (klaad A ja B) ja eraldasime faagi tserebrospinaalvedelikust ja verest (joonis 1d).Raamatukogu esialgne kiire kliirens oli metsikut tüüpi faagiga võrreldes vähem väljendunud.Süstitud raamatukogu keskmine poolväärtusaeg mõlemal loomal oli 24,8 minutit veres, sarnaselt metsiktüüpi faagiga, ja 38,5 minutit CSF-is.Iga looma vere- ja tserebrospinaalvedeliku faagiproovid allutati HTS-ile ja kõiki tuvastatud peptiide analüüsiti lühikese tripeptiidmotiivi olemasolu suhtes.Tripeptiidi motiivid valiti, kuna need annavad minimaalse aluse struktuuri moodustamiseks ja peptiidi-valgu interaktsioonideks 14, 15.Leidsime hea korrelatsiooni motiivide jaotuses süstitud faagi raamatukogu ja mõlema looma verest ekstraheeritud kloonide vahel (joonis 1e).Andmed näitavad, et raamatukogu koostis on veresektsioonis vaid vähesel määral rikastatud.Aminohapete sagedusi ja konsensusjärjestusi analüüsiti igas positsioonis täiendavalt, kasutades Weblogo16 tarkvara kohandamist.Huvitaval kombel leidsime vere glütsiini jääkide tugevat rikastamist (joonis 1g).Kui võrreldi verd CSF-st valitud kloonidega, täheldati tugevat selektsiooni ja motiivide mõningast deselektsiooni (joonis 1f) ning teatud aminohapped olid eelistatult 12-liikmelises eelnevalt kindlaksmääratud positsioonides (joonis 1h).Eelkõige erinesid üksikud loomad tserebrospinaalvedelikus oluliselt, samas kui mõlemal loomal täheldati vere glütsiini rikastamist (täiendav joonis 4a–j).Pärast järjestuste andmete ranget filtreerimist loomade nr 1.1 ja nr 1.2 tserebrospinaalvedelikus saadi kokku 964 ja 420 ainulaadset 12-meerset peptiidi (täiendav joonis 1d–e).Eraldatud faagikloonid amplifitseeriti ja allutati teisele in vivo selektsioonivoorule.Teisest selektsioonivoorust ekstraheeritud faagid allutati igal loomal HTS-ile ja kõiki tuvastatud peptiide kasutati motiivituvastusprogrammi sisendina, et analüüsida tripeptiidmotiivide esinemist (joonised 2a, b, ef).Võrreldes CSF-st taastunud faagi esimese tsükliga, täheldasime harudes A ja B paljude CSF-i motiivide edasist selektsiooni ja deselektsiooni (joonis 2).Kasutati võrgu tuvastamise algoritmi, et teha kindlaks, kas need esindavad järjekindla järjestuse erinevaid mustreid.Täheldati selget sarnasust 12-dimensiooniliste järjestuste vahel, mis CSF-i abil taastati alternatiivses kladis A (joonis 2c, d) ja kladis B (joonis 2g, h).Iga haru koondanalüüs näitas 12-meersete peptiidide erinevaid selektsiooniprofiile (täiendav joonis 5c, d) ja CSF / vere tiitri suhte suurenemist aja jooksul ühendatud kloonide puhul pärast teist selektsioonivooru võrreldes esimese selektsioonivooruga (täiendav joonis 5e).).
Motiivide ja peptiidide rikastamine tserebrospinaalvedelikus kahe järjestikuse in vivo funktsionaalse faagikuvari valimise vooruga.
Kõik tserebrospinaalvedeliku faagid, mis saadi iga looma esimesest ringist (loomad #1.1 ja #1.2), ühendati, amplifitseeriti, HT-sekveneeriti ja süstiti uuesti kokku (2 x 1010 faagi looma kohta) 2 SM-kanüüliga rotti (#1.1 → #).2.1 ja 2.2, 1.2 → 2.3 ja 2.4).(a, b, e, f) Korrelatsiooni hajuvusdiagrammid, mis võrdlevad kõigi CSF-st pärinevate faagide tripeptiidmotiivide suhtelist sagedust esimeses ja teises selektsioonivoorus.Motiivide suhteline sagedus ja jaotus, mis esindavad kõiki võimalikke kattuvaid tripeptiide, mida leidub mõlemas orientatsioonis peptiidides.Näidatud on 1000 lugemisel leitud motiivide arv.Motiivid, mis olid ühes võrreldud teegis oluliselt (p < 0,001) valitud või välistatud, on esile tõstetud punaste täppidega.(c, d, g, h) Kõigi CSF-rikaste 12 aminohappe pikkuste järjestuste järjestuse logo, mis põhineb in vivo selektsiooni 2. ja 1. ringil.Ühetähelise koodi suurus näitab, kui sageli see aminohape selles asendis esineb.Logo kujutamiseks võrreldakse üksikutelt loomadelt eraldatud CSF-järjestuste sagedust kahe valikuvooru vahel ja näidatakse teise vooru rikastatud järjestusi: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ja (h) #1.2–#2.4.Enim rikastatud aminohapped antud positsioonis loomadel (c, d) nr.2.1 ja nr.2.2 või (g, h) loomadel nr.2.3 ja nr.2.4 on näidatud värviliselt.Roheline = polaarne, lilla = neutraalne, sinine = aluseline, punane = happeline ja must = hüdrofoobsed aminohapped.
Pärast kolmandat valikuvooru tuvastasime 124 unikaalset peptiidjärjestust (#3.1 ja #3.2) 332 CSF-ga taastatud faagikloonist, mis olid eraldatud kahelt loomalt (täiendav joonis 6a).Suurim suhteline osakaal oli järjestusel LGSVS (18,7%), millele järgnesid metsikut tüüpi insertid PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) ja SARGSWREIVSLS (2,2%).Viimases neljandas voorus ühendasime kaks sõltumatult valitud haru kolmest eraldi loomast (joonis 1c).925 sekveneeritud faagikloonist, mis saadi CSF-st, leidsime neljandas voorus 64 ainulaadset peptiidjärjestust (täiendav joonis 6b), mille hulgas metsikut tüüpi faagide suhteline osakaal langes 0, 8% -ni.Kõige tavalisemad CSF kloonid neljandas voorus olid LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) ja RLSSVDSDLSGC (3, 6%).%)).Valitud peptiidide pikkusvahemik on tingitud nukleotiidide insertsioonidest/deletsioonidest või enneaegsetest stoppkoodonitest raamatukogu praimerites, kui kasutatakse NNK raamatukogu kujundamisel degenereerunud koodoneid.Enneaegsed stoppkoodonid genereerivad lühemaid peptiide ja valitakse välja, kuna need sisaldavad soodsat aa-motiivi.Pikemad peptiidid võivad tuleneda sünteetiliste raamatukogude praimerite insertsioonidest/deletsioonidest.See asetab kavandatud stoppkoodoni kaadrist väljapoole ja loeb seda seni, kuni allavoolu ilmub uus stoppkoodon.Üldiselt arvutasime rikastustegurid kõigi nelja valikuvooru jaoks, võrreldes sisendandmeid proovi väljundandmetega.Esimeses sõelumisvoorus kasutasime mittespetsiifilise taustaviitena metsiktüüpi faagitiitreid.Huvitaval kombel oli negatiivne faagivalik esimeses CSF-i tsüklis väga tugev, kuid mitte veres (joonis 3a), mis võib olla tingitud enamiku peptiidide raamatukogu liikmete passiivse difusiooni vähesest tõenäosusest CSF-i sektsiooni või suhtelised faagid kipuvad olema tõhusamalt kinni või eemaldatud vereringest kui bakteriofaagid.Siiski täheldati teises panoraamimises mõlemas kladis faagide tugevat selektsiooni CSF-is, mis viitab sellele, et eelmine voor oli rikastatud faagidega, millel olid CSF-i omastamist soodustavad peptiidid (joonis 3a).Jällegi ilma olulise vere rikastamiseta.Ka kolmandas ja neljandas voorus rikastati faagi kloonid oluliselt CSF-ga.Võrreldes iga ainulaadse peptiidjärjestuse suhtelist sagedust kahe viimase selektsioonivooru vahel, leidsime, et järjestused olid neljandas selektsioonivoorus veelgi rikastatud (joonis 3b).Kõigist 64 ainulaadsest peptiidjärjestusest ekstraheeriti mõlemat peptiidi orientatsiooni kasutades kokku 931 tripeptiidmotiivi.Neljanda vooru enim rikastatud motiive uuriti lähemalt nende rikastusprofiilide osas kõigis voorudes võrreldes süstitud raamatukoguga (läbiviik: 10% rikastus) (täiendav joonis 6c).Üldised valikumustrid näitasid, et enamik uuritud motiive rikastati mõlema valikuharu kõigis varasemates voorudes.Mõned motiivid (nt SGL, VSG, LGS GSV) pärinesid aga valdavalt alternatiivsest klaadist A, teised (nt FGW, RTN, WGF, NTR) aga rikastati alternatiivses kladis B.
Streptavidiini kasulike koormustega konjugeeritud CSF-ga rikastatud faagiga kuvatavate peptiidide ja biotinüülitud liiderpeptiidide CSF-i transpordi valideerimine.
(a) Rikastussuhted, mis on arvutatud kõigis neljas voorus (R1-R4), mis põhinevad süstitud (sisend = I) faagi (PFU) tiitritel ja määratud CSF faagitiitritel (väljund = O).Viimase kolme vooru rikastustegurid (R2-R4) arvutati eelmise vooru ja esimese vooruga (R1) võrreldes kaaluandmetega.Avatud tulbad on tserebrospinaalvedelik, varjutatud tulbad plasma.(***p<0,001, Studenti t-testi põhjal).(b) Kõige arvukamate faagipeptiidide loend, mis on järjestatud vastavalt nende suhtelisele osakaalule kõigis faagides, mis koguti pärast 4. valikuvooru CSF-is.Kuus enimlevinud faagiklooni on 3. ja 4. selektsioonivoorude (sisestuste) vahel värviliselt esile tõstetud, nummerdatud ja nende rikastustegurid.( c, d ) Kuut kõige rikastatud faagi klooni, tühja faagi ja vanemfaagi peptiidi raamatukogusid 4. voorust analüüsiti individuaalselt CSF proovivõtumudelis.CSF ja vereproovid koguti näidatud ajahetkedel.(c) Võrdsed kogused 6 faagi kandidaatklooni (2 x 1010 faagi/looma), tühje faagi (nr 1779) (2 x 1010 faagi/looma) ja faagi peptiidide varuraamatukogu (2 x 1012 faagi/looma). Süstige vähemalt 3 CM veeni manustatud looma kaudu.Näidatud on iga süstitud faagi klooni ja faagi peptiidi raamatukogu CSF-i farmakokineetika aja jooksul.(d) näitab keskmist CSF/vere suhet kõigi taaskasutatud faagide/ml kohta proovivõtuaja jooksul.(e) Neli sünteetilist liiderpeptiidi ja üks segatud kontroll ühendati biotiiniga streptavidiiniga nende N-otsa kaudu (tetrameeri kuvamine), millele järgnes süstimine (sabaveeni iv, 10 mg streptavidiini / kg).Vähemalt kolm intubeeritud rotti (N = 3).).CSF-proovid koguti näidatud ajahetkedel ja streptavidiini kontsentratsioone mõõdeti CSF-i streptavidiinivastase ELISA-ga (nd = ei tuvastatud).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, põhineb ANOVA testil).(f) Kõige rikastatud faagi peptiidi klooni #2002 (lilla) aminohappejärjestuse võrdlus teiste 4. selektsioonivoorust valitud faagipeptiidi kloonidega.Identsed ja sarnased aminohappefragmendid on värvikoodiga.
Kõigist neljanda vooru rikastatud faagidest (joonis 3b) valiti CSF proovivõtumudelis edasiseks individuaalseks analüüsiks kuus kandidaatklooni.Kolmele kanüüliga kanüülitud CM-loomale süstiti võrdses koguses kuut kandidaatfaagi, tühja faagi (inserdita) ja profaagi peptiidi raamatukogu ning farmakokineetika määrati CSF (joonis 3c) ja vere (täiendav joonis 7) analüüsides.Kõik testitud faagikloonid olid suunatud CSF-i sektsiooni tasemele, mis oli 10-1000 korda kõrgem kui tühja kontrollfaagi oma (#1779).Näiteks kloonidel #2020 ja #2077 olid CSF-i tiitrid ligikaudu 1000 korda kõrgemad kui kontrollfaagil.Iga valitud peptiidi farmakokineetiline profiil on erinev, kuid kõigil neil on kõrge CSF-i kodunemisvõime.Kloonide #1903 ja #2011 puhul täheldasime aja jooksul pidevat langust, samas kui kloonide #2077, #2002 ja #2009 puhul võib tõus esimese 10 minuti jooksul viidata aktiivsele transpordile, kuid seda tuleb kontrollida.Kloonid #2020, #2002 ja #2077 stabiliseerusid kõrgel tasemel, samas kui klooni #2009 CSF-i kontsentratsioon vähenes aeglaselt pärast esialgset tõusu.Seejärel võrdlesime iga CSF kandidaadi suhtelist sagedust selle kontsentratsiooniga veres (joonis 3d).Iga CSF kandidaadi keskmise tiitri korrelatsioon tema veretiitriga kõigil proovivõtuaegadel näitas, et kuuest kandidaadist kolm olid vere CSF-ga oluliselt rikastatud.Huvitaval kombel näitas kloon # 2077 suuremat vere stabiilsust (täiendav joonis 7).Kinnitamaks, et peptiidid ise on võimelised CSF-i sektsiooni aktiivselt transportima ka muid lasti peale faagiosakeste, sünteesisime neli liiderpeptiidi, mis olid derivatiseeritud biotiiniga N-otsas, kus peptiidid kinnituvad faagiosakese külge.Biotinüülitud peptiidid (nr 2002, 2009, 2020 ja 2077) konjugeeriti streptavidiiniga (SA), et saada faagi geomeetriat mõnevõrra jäljendavaid multimeerseid vorme.See formaat võimaldas meil mõõta ka SA ekspositsiooni veres ja tserebrospinaalvedelikus lasti transportivate valkude peptiididena.Oluline on see, et faagiandmeid saab sageli reprodutseerida, kui sünteetilisi peptiide manustati selles SA-konjugeeritud vormingus (joonis 3e).Segatud peptiididel oli väiksem algne kokkupuude ja kiirem CSF-i kliirens, mille tase oli 48 tunni jooksul tuvastamatu.Et saada ülevaade nende peptiidfaagi kloonide CSF-i kohaletoimetamise radadest, analüüsisime üksikute faagipeptiidi tabamuste lokaliseerimist immunohistokeemia (IHC) abil, et tuvastada faagiosakesed vahetult 1 tund pärast intravenoosset süstimist in vivo.Eelkõige võis kloone #2002, #2077 ja #2009 tuvastada tugeva värvumise teel ajukapillaarides, samas kui kontrollfaagi (#1779) ja klooni #2020 ei tuvastatud (täiendav joonis 8).See viitab sellele, et need peptiidid aitavad ajule mõju avaldada just BBB ületamise kaudu.Selle hüpoteesi kontrollimiseks on vaja täiendavat üksikasjalikku analüüsi, kuna kaasatud võib olla ka BSCFB marsruut.Kui võrrelda enim rikastatud klooni (#2002) aminohappejärjestust teiste valitud peptiididega, märgiti, et mõnel neist on sarnased aminohappepikendused, mis võib viidata sarnasele transpordimehhanismile (joonis 3f).
Tänu oma ainulaadsele plasmaprofiilile ja CSF-i olulisele suurenemisele aja jooksul, uuriti faagi displei klooni #2077 pikema 48-tunnise perioodi jooksul ja see suutis reprodutseerida CSF-i kiiret suurenemist, mida täheldati seoses püsiva SA tasemega (joonis 4a).Seoses teiste tuvastatud faagikloonidega värvus # 2077 tugevalt aju kapillaaride suhtes ja näitas kõrgema eraldusvõimega vaadates olulist kolokaliseerumist kapillaarmarker-lektiiniga ja võib-olla mõningast värvimist parenhüümiruumis (joonis 4b).Et uurida, kas kesknärvisüsteemis on võimalik saada peptiidide vahendatud farmakoloogilisi toimeid, viisime läbi katse, milles i) transiitpeptiidi #2077 ja ii) BACE1 inhibiitorpeptiidi biotinüülitud versioonid segati SA-ga kahes erinevas vahekorras.Ühe kombinatsiooni puhul kasutasime ainult BACE1 peptiidi inhibiitorit ja teise jaoks kasutasime BACE1 peptiidi inhibiitori ja #2077 peptiidi suhet 1:3.Mõlemat proovi manustati intravenoosselt ning aja jooksul mõõdeti beeta-amüloidpeptiidi 40 (Abeta40) taset veres ja tserebrospinaalvedelikus.Abeta40 mõõdeti CSF-is, kuna see peegeldab BACE1 inhibeerimist aju parenhüümis.Nagu oodatud, vähendasid mõlemad kompleksid oluliselt Abeta40 taset veres (joonis 4c, d).Kuid ainult proovid, mis sisaldavad peptiidi nr.2077 ja SA-ga konjugeeritud BACE1 peptiidi inhibiitor põhjustasid Abeta40 olulise vähenemise tserebrospinaalvedelikus (joonis 4c).Andmed näitavad, et peptiid nr.2077 on võimeline transportima 60 kDa SA-valku kesknärvisüsteemi ja indutseerib ka farmakoloogilisi toimeid BACE1 peptiidi SA-konjugeeritud inhibiitoritega.
(a) T7 faagi klonaalne süstimine (2 × 10 faagi looma kohta), millel on CSF peptiidi #2077 (RLSSVDSDLSGC) ja süstimata kontrollfaagi (#1779) pikaajaline farmakokineetiline profiil vähemalt kolmele CM-intubeeritud rotile.(b) Konfokaalne mikroskoopiline kujutis tüüpilistest kortikaalsetest mikroveresoontest faagiga süstitud rottidel (2 × 1010 faagi looma kohta), mis näitab peptiidi #2077 ja veresoonte (lektiini) vastandvärvimist.Neid faagikloone manustati 3 rotile ja lasti ringelda 1 tund enne perfusiooni.Ajud lõigati ja värviti polüklonaalsete FITC-märgistatud antikehadega T7 faagi kapsiidi vastu.Kümme minutit enne perfusiooni ja sellele järgnevat fikseerimist manustati intravenoosselt DyLight594-ga märgistatud lektiini.Fluorestseeruvad kujutised, mis näitavad kapillaaride ja perivaskulaarse ajukoe luumenis olevate mikroveresoonte ja faagide (roheliste) luminaalse külje lektiini värvimist (punane).Skaalariba vastab 10 µm-le.(c, d) Biotinüülitud BACE1 inhibeeriv peptiid üksi või kombinatsioonis biotinüülitud transiitpeptiidiga #2077 ühendati streptavidiiniga, millele järgnes intravenoosne süstimine vähemalt kolmele kanüüliga CM-rotile (10 mg streptavidiini/kg).BACE1 peptiidi inhibiitori poolt vahendatud Aβ40 vähenemist mõõdeti Aβ1-40 ELISA abil veres (punane) ja tserebrospinaalvedelikus (oranž) näidatud ajahetkedel.Parema selguse huvides tõmmatakse graafikule punktiirjoon skaalal 100%.(c) Aβ40 protsentuaalne vähenemine veres (punased kolmnurgad) ja tserebrospinaalvedelikus (oranžid kolmnurgad) rottidel, keda raviti streptavidiiniga, mis on konjugeeritud transiitpeptiidiga #2077 ja BACE1 inhibeeriva peptiidiga vahekorras 3:1.(d) Vere Aβ40 (punased ringid) ja tserebrospinaalvedeliku (oranžid ringid) protsentuaalne vähenemine rottidel, keda raviti streptavidiiniga, mis on seotud ainult BACE1 inhibeeriva peptiidiga.Aβ kontsentratsioon kontrollis oli 420 pg/ml (standardhälve = 101 pg/ml).
Faagiekraani on edukalt rakendatud mitmes biomeditsiinilise uurimistöö valdkonnas17.Seda meetodit on kasutatud in vivo veresoonte mitmekesisuse uuringutes18,19, aga ka ajuveresoontele suunatud uuringutes 20,21,22,23,24,25,26.Selles uuringus laiendasime selle valikumeetodi rakendamist mitte ainult ajuveresoontele suunatud peptiidide otsesele tuvastamisele, vaid ka hematoentsefaalbarjääri läbimiseks aktiivsete transpordiomadustega kandidaatide avastamisele.Nüüd kirjeldame in vivo selektsiooniprotseduuri väljatöötamist CM-i intubeeritud rottidel ja demonstreerime selle potentsiaali tuvastada CSF-i kodustamisomadustega peptiide.Kasutades 12-meeriliste juhuslike peptiidide raamatukogu kuvavat T7 faagi, suutsime näidata, et T7 faag on piisavalt väike (läbimõõduga ligikaudu 60 nm)10, et kohanduda hematoentsefaalbarjääriga, ületades seeläbi otse hematoentsefaalbarjääri või koroidpõimiku.Me täheldasime, et CSF-i kogumine kanüülitud CM-rottidest oli hästi kontrollitud in vivo funktsionaalne skriinimismeetod ja et ekstraheeritud faag ei ​​seondunud mitte ainult veresoonkonnaga, vaid toimis ka transporterina läbi hematoentsefaalbarjääri.Lisaks, kogudes samaaegselt verd ja rakendades HTS-i CSF-ile ja verest pärinevatele faagidele, kinnitasime, et meie CSF-i valikut ei mõjutanud vere rikastamine ega sobivus valikuvoorude vaheliseks laiendamiseks.Vere sektsioon on aga osa selektsiooniprotseduurist, kuna faagid, mis on võimelised CSF-i sektsiooni jõudma, peavad ellu jääma ja vereringes ringlema piisavalt kaua, et end ajus rikastada.HTS-i töötlemata andmetest usaldusväärse jadateabe saamiseks rakendasime analüüsi töövoos platvormipõhistele järjestusvigadele kohandatud filtrid.Kineetiliste parameetrite kaasamisega sõelumismeetodisse kinnitasime metsiktüüpi T7 faagide kiiret farmakokineetikat (t½ ~ 28 min) veres24, 27, 28 ja määrasime ka nende poolväärtusaja tserebrospinaalvedelikus (t½ ~ 26 min) minutis).Vaatamata sarnastele farmakokineetilistele profiilidele veres ja CSF-s, suudeti CSF-s tuvastada ainult 0, 001% faagi kontsentratsioonist veres, mis viitab metsiktüüpi T7 faagi madalale taustliikumisele läbi hematoentsefaalbarjääri.See töö rõhutab esimese valiku vooru tähtsust in vivo panoraamimise strateegiate kasutamisel, eriti nende faagisüsteemide puhul, mis eemaldatakse kiiresti vereringest, kuna vähesed kloonid suudavad jõuda kesknärvisüsteemi sektsiooni.Seega oli raamatukogu mitmekesisuse vähenemine esimeses voorus väga suur, kuna lõpuks koguti selles väga ranges CSF-mudelis vaid piiratud arv kloone.See in vivo panoraamimise strateegia hõlmas mitmeid valikuetappe, nagu aktiivne akumuleerumine CSF sektsioonis, kloonide ellujäämine veresektsioonis ja T7 faagi kloonide kiire eemaldamine verest esimese 10 minuti jooksul (joonis 1d ja täiendav joonis 4M).).Seega tuvastati pärast esimest vooru CSF-s erinevad faagikloonid, kuigi üksikute loomade jaoks kasutati sama esialgset kogumit.See viitab sellele, et suure arvu raamatukoguliikmetega lähteteekide mitme range valikuetapi tulemuseks on mitmekesisuse oluline vähenemine.Seetõttu muutuvad juhuslikud sündmused esialgse valikuprotsessi lahutamatuks osaks, mõjutades oluliselt tulemust.On tõenäoline, et paljudel algse raamatukogu kloonidel oli CSF-i rikastamise kalduvus väga sarnane.Kuid isegi samades katsetingimustes võivad selektsiooni tulemused erineda iga konkreetse klooni väikese arvu tõttu esialgses kogumis.
CSF-is rikastatud motiivid erinevad veres leiduvatest.Huvitaval kombel märkisime üksikute loomade veres esimest nihet glütsiinirikaste peptiidide suunas.(joonis 1g, täiendavad joonised 4e, 4f).Glütsiini peptiide sisaldavad faagid võivad olla stabiilsemad ja väiksema tõenäosusega ringlusest välja võtta.Neid glütsiinirikkaid peptiide aga tserebrospinaalvedeliku proovides ei tuvastatud, mis viitab sellele, et kureeritud raamatukogud läbisid kaks erinevat valikuetappi: üks veres ja teine ​​lasi tserebrospinaalvedelikus koguneda.Neljanda selektsioonivooru tulemusena saadud CSF-ga rikastatud kloone on põhjalikult testitud.Peaaegu kõik individuaalselt testitud kloonid olid rikastatud CSF-ga võrreldes tühja katsefaagiga.Üks peptiidi tabamus (#2077) uuriti üksikasjalikumalt.See näitas teiste tabamustega võrreldes pikemat plasma poolväärtusaega (joonis 3d ja täiendav joonis 7) ning huvitaval kombel sisaldas see peptiid C-otsas tsüsteiinijääki.Hiljuti on näidatud, et tsüsteiini lisamine peptiididele võib parandada nende farmakokineetilisi omadusi, seondudes albumiiniga 29.See on praegu peptiidi #2077 puhul teadmata ja vajab täiendavat uurimist.Mõned peptiidid näitasid CSF-i rikastamise valentssõltuvust (andmeid pole näidatud), mis võib olla seotud T7 kapsiidi kuvatava pinnageomeetriaga.Meie kasutatud T7 süsteem näitas iga peptiidi 5–15 koopiat faagiosakese kohta.IHC viidi läbi juhtfaagi kandidaatkloonidega, mis süstiti intravenoosselt rottide ajukooresse (täiendav joonis 8).Andmed näitasid, et vähemalt kolm klooni (nr 2002, nr 2009 ja nr 2077) interakteerusid BBB-ga.Jääb veel kindlaks teha, kas see BBB interaktsioon põhjustab CSF-i akumuleerumist või nende kloonide liikumist otse BCSFB-sse.Oluline on see, et näitame, et valitud peptiidid säilitavad sünteesimisel ja valgulastiga seondumisel oma CSF-i transpordivõime.N-terminaalsete biotinüülitud peptiidide seondumine SA-ga kordab sisuliselt tulemusi, mis saadi nende vastavate faagikloonidega veres ja tserebrospinaalvedelikus (joonis 3e).Lõpuks näitame, et pliipeptiid #2077 on võimeline soodustama SA-ga konjugeeritud BACE1 biotinüülitud peptiidi inhibiitori ajutegevust, põhjustades kesknärvisüsteemis väljendunud farmakodünaamilisi toimeid, vähendades oluliselt Abeta40 taset tserebrospinaalvedelikus (joonis 4).Kõigi tabamuste peptiidjärjestuse homoloogiaotsinguga ei õnnestunud andmebaasis ühtegi homoloogi tuvastada.Oluline on märkida, et T7 raamatukogu suurus on ligikaudu 109, samas kui teoreetiline raamatukogu suurus 12-meeride puhul on 4 x 1015. Seetõttu valisime 12-meerilise peptiidi raamatukogu mitmekesisusruumist vaid väikese osa, mis võib tähendada, et optimeeritud peptiide saab tuvastada, hinnates nende külgnevate tabamusjärjestuste ruumi.Hüpoteetiliselt võib üks põhjusi, miks me pole leidnud nende peptiidide looduslikke homolooge, olla evolutsiooni käigus toimunud deselektsioon, et vältida teatud peptiidide motiivide kontrollimatut sisenemist ajju.
Kokkuvõttes annavad meie tulemused aluse edaspidiseks tööks ajuveresoonkonna barjääri transpordisüsteemide in vivo üksikasjalikumaks tuvastamiseks ja iseloomustamiseks.Selle meetodi põhiseade põhineb funktsionaalsel selektsioonistrateegial, mis mitte ainult ei tuvasta ajuveresoonte sidumisomadustega kloone, vaid hõlmab ka kriitilist etappi, mille käigus edukatel kloonidel on sisemine aktiivsus bioloogiliste barjääride ületamiseks in vivo kesknärvisüsteemi sektsiooni.on selgitada nende peptiidide transpordimehhanismi ja nende eelistamist seonduda ajupiirkonna spetsiifilise mikroveresoonkonnaga.See võib viia uute BBB ja retseptorite transporditeede avastamiseni.Eeldame, et tuvastatud peptiidid võivad otseselt seostuda tserebrovaskulaarsete retseptoritega või tsirkuleerivate ligandidega, mida transporditakse läbi BBB või BCSFB.Selles töös avastatud CSF-i transpordiaktiivsusega peptiidvektoreid uuritakse täiendavalt.Praegu uurime nende peptiidide ajuspetsiifilisust nende võime osas läbida BBB ja/või BCSFB.Need uued peptiidid on äärmiselt väärtuslikud vahendid uute retseptorite või radade potentsiaalseks avastamiseks ja uute ülitõhusate platvormide väljatöötamiseks makromolekulide, näiteks bioloogiliste ainete ajju toimetamiseks.
Kanüülida suur tsisterna (CM), kasutades eelnevalt kirjeldatud meetodi modifikatsiooni.Anesteseeritud Wistari rotid (200–350 g) paigaldati stereotaksilisele seadmele ning raseeritud ja aseptiliselt ettevalmistatud peanahale tehti keskmine sisselõige, et kolju paljastada.Puurige ülemise aknatiiva piirkonda kaks auku ja kinnitage kinnituskruvid aukudesse.Roostevabast terasest kanüüli stereotaktiliseks juhtimiseks CM-i puuriti külgmisse kuklaharjasse lisaauk.Kandke kanüüli ümber hambatsementi ja kinnitage kruvidega.Pärast fotokõvastumist ja tsemendikõvenemist suleti nahahaav 4/0 supramidõmblusega.Kanüüli õiget asetust kinnitab tserebrospinaalvedeliku (CSF) spontaanne leke.Eemaldage rott stereotaksia aparaadist, rakendage asjakohast operatsioonijärgset hooldust ja valu leevendamist ning laske tal taastuda vähemalt üks nädal, kuni tserebrospinaalvedelikus on täheldatud vere märke.Wistari rotid (Crl:WI/Han) saadi Charles Riverist (Prantsusmaa).Kõiki rotte hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes.Kõik loomkatsed kiitis heaks Šveitsi Baseli linna veterinaariaamet ja need viidi läbi vastavalt loomalitsentsile nr 2474 (Aktiivse ajutranspordi hindamine tserebrospinaalvedeliku ja roti aju terapeutiliste kandidaatide taseme mõõtmise teel).
Hoidke rotti ettevaatlikult teadvusel, CM-kanüül käes.Eemaldage Datura kanüülist ja koguge 10 µl spontaanselt voolavat tserebrospinaalvedelikku.Kuna kanüüli läbitavus oli lõpuks kahjustatud, kaasati sellesse uuringusse ainult selged tserebrospinaalvedeliku proovid, millel ei olnud vere saastumist ega värvimuutust.Paralleelselt võeti sabaotsa väikesest sisselõikest hepariiniga (Sigma-Aldrich) tuubidesse ligikaudu 10–20 μl verd.CSF ja veri koguti erinevatel ajahetkedel pärast T7 faagi intravenoosset süstimist.Enne iga CSF-i proovi kogumist visati ära ligikaudu 5–10 μl vedelikku, mis vastab kateetri surnud mahule.
Teegid genereeriti, kasutades T7Select 10-3b vektorit, nagu on kirjeldatud süsteemi T7Select käsiraamatus (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Lühidalt, juhuslik 12-meeriline DNA insert sünteesiti järgmises vormingus:
NNK koodonit kasutati topeltstoppkoodonite ja aminohapete üleekspressiooni vältimiseks insertis.N on iga nukleotiidi käsitsi segatud ekvimolaarne suhe ja K on adeniini ja tsütosiini nukleotiidide käsitsi segatud ekvimolaarne suhe.Üheahelalised piirkonnad muudeti kaheahelaliseks DNA-ks, inkubeerides täiendavalt dNTP (Novagen) ja Klenowi ensüümiga (New England Biolabs) Klenowi puhvris (New England Biolabs) 3 tundi temperatuuril 37 °C.Pärast reaktsiooni saadi kaheahelaline DNA EtOH-sadestamise teel.Saadud DNA lõigati restriktsiooniensüümidega EcoRI ja HindIII (mõlemad firmalt Roche).Lõhustatud ja puhastatud (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligaas, New England Biolabs) ligeeriti seejärel 10B kapsiidi geeni aminohappe 348 järel eelnevalt lõhustatud T7 vektorisse.Ligeerimisreaktsioone inkubeeriti 16 °C juures 18 tundi enne in vitro pakkimist.Faagi pakendamine in vitro viidi läbi vastavalt T7Select 10-3b kloonimiskomplektiga (Novagen) kaasasolevatele juhistele ja pakkelahust amplifitseeriti üks kord lüüsimiseks, kasutades Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lüsaadid tsentrifuugiti, tiitriti ja külmutati -80 °C juures glütserooli põhilahusena.
Puljongis või plaadis amplifitseeritud faagi varieeruvate piirkondade otsene PCR-amplifikatsioon, kasutades patenteeritud 454/Roche-amplikoni liitpraimereid.Edasine fusioonipraimer sisaldab järjestusi, mis külgnevad muutuva piirkonnaga (NNK) 12 (mallispetsiifiline), GS FLX titaanadapterit A ja nelja alusega raamatukogu võtmejärjestust (TCAG) (täiendav joonis 1a):
Pöördfusioonipraimer sisaldab ka biotiini, mis on kinnitatud püüdmishelmeste külge, ja GS FLX titaanadapterit B, mis on vajalik klooni amplifikatsiooniks emulsioon-PCR ajal:
Seejärel viidi amplikonid läbi 454/Roche pürosekveneerimisega vastavalt 454 GS-FLX Titanium protokollile.Manuaalseks Sangeri sekveneerimiseks (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) amplifitseeriti T7 faagi DNA PCR abil ja sekveneeriti järgmiste praimeripaaridega:
Individuaalsetelt naastudelt saadud inserdid allutati PCR-i amplifikatsioonile, kasutades Roche Fast Start DNA polümeraasi komplekti (vastavalt tootja juhistele).Tehke kuumkäivitus (10 min 95 °C juures) ja 35 võimendustsüklit (50 s 95 °C juures, 1 min 50 °C juures ja 1 min 72 °C juures).
Raamatukogudest pärit faagi, metsiktüüpi faagi, CSF-st ja verest päästetud faage või üksikuid kloone amplifitseeriti Escherichia coli BL5615-s TB puljongis (Sigma Aldrich) või 500 cm2 tassides (Thermo Scientific) 4 tundi temperatuuril 37 °C.Faagid ekstraheeriti plaatidelt, loputades plaate Tris-EDTA puhvriga (Fluka Analytical) või kogudes naastud steriilsete pipetiotstega.Faag eraldati kultuuri supernatandist või ekstraheerimispuhvrist ühe polüetüleenglükooli (PEG 8000) sadestamise tsükliga (Promega) ja resuspendeeriti Tris-EDTA puhvris.
Enne intravenoosset (IV) süstimist (500 μl looma kohta) eemaldati amplifitseeritud faagiga 2–3 endotoksiini eemaldamise ringi, kasutades endotoksiini eemaldamise helmeid (Miltenyi Biotec).Esimeses voorus tutvustati 2×1012 faagi;teises 2×1010 faagi;kolmandas ja neljandas valikuvoorus 2×109 faagi looma kohta.Faagisisaldus CSF-is ja näidatud ajahetkedel kogutud vereproovid määrati naastude loendamisega vastavalt tootja juhistele (T7Selecti süsteemi käsiraamat).Faagide valik viidi läbi puhastatud raamatukogude intravenoosse süstimisega sabaveeni või eelmisest selektsioonivoorust CSF-st ekstraheeritud faagi uuesti süstimisega ning järgnevad kogumised viidi läbi vastavalt 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min ja 240 min CSF ja vereproovidega.Kokku viidi läbi neli in vivo panoraamimise vooru, kus kahte valitud haru säilitati ja analüüsiti esimese kolme valikuvooru jooksul eraldi.Kõik faagiinsertid, mis ekstraheeriti CSF-st kahest esimesest selektsioonivoorust, allutati 454/Roche pürosekveneerimisele, samal ajal kui kõik kloonid, mis ekstraheeriti CSF-st kahest viimasest selektsioonivoorust, sekveneeriti käsitsi.Kõik esimesest valikuvoorust pärit verefaagid allutati ka 454/Roche pürosekveneerimisele.Faagikloonide süstimiseks amplifitseeriti valitud faagid E. coli-s (BL5615) 500 cm2 plaatidel temperatuuril 37 °C 4 tundi.Individuaalselt valitud ja käsitsi sekveneeritud kloonid paljundati TB söötmes.Pärast faagi ekstraheerimist, puhastamist ja endotoksiini eemaldamist (nagu ülalpool kirjeldatud) süstiti intravenoosselt ühte sabaveeni 2 × 1010 faagi looma kohta 300 μl-s.
Järjestuste andmete eeltöötlus ja kvalitatiivne filtreerimine.454/Roche töötlemata andmed teisendati binaarsest standardsest vookaardivormingust (sff) Pearsoni inimloetavasse vormingusse (fasta), kasutades müüja tarkvara.Nukleotiidjärjestuse edasine töötlemine viidi läbi patenteeritud C-programmide ja skriptide (avaldamata tarkvarapakett) abil, nagu allpool kirjeldatud.Esmaste andmete analüüs hõlmab rangeid mitmeastmelisi filtreerimisprotseduure.Et välja filtreerida lugemid, mis ei sisaldanud kehtivat 12-liikmelist insertsiooni DNA järjestust, joondati näidud järjestikku algusmärgise (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoppmärgise (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ja taustalisa (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC-W) abil, kasutades globaalset testimistesti Wunsch.joondus, mis võimaldab kuni 2 ebakõla joonduse kohta31.Seetõttu eemaldati teegist ilma algus- ja lõppmärgenditeta lugemised ning taustalisandeid ehk joondusi, mis ületavad lubatud mittevastavuste arvu.Ülejäänud lugemite osas lõigati algsest lugemisjärjestusest välja N-mer DNA järjestus, mis ulatus algusmärgist ja lõppes enne lõppmärki ja seda töödeldi edasi (edaspidi "sisestamine").Pärast inserti translatsiooni eemaldatakse praimeri 5'-otsas oleva esimese stoppkoodoni järgne osa insertist.Lisaks eemaldati ka nukleotiidid, mis viisid praimeri 3'-otsa mittetäielike koodoniteni.Ainult taustjärjestusi sisaldavate insertide välistamiseks eemaldati ka transleeritud insertid, mis algavad aminohappemustriga "PAG".Peptiidid, mille translatsioonijärgne pikkus oli alla 3 aminohappe, eemaldati raamatukogust.Lõpuks eemaldage liiasus ja määrake iga kordumatu lisamise sagedus.Selle analüüsi tulemused sisaldasid nukleotiidjärjestuste (insertide) ja nende (lugemissageduste) loendit (täiendavad joonised 1c ja 2).
Rühmitage N-meerne DNA inserdid järjestuse sarnasuse järgi: 454/Roche-spetsiifiliste sekveneerimisvigade (nt homopolümeeri laienduste sekveneerimisega seotud probleemid) kõrvaldamiseks ja vähem oluliste redundantsuste eemaldamiseks sorteeritakse eelnevalt filtreeritud N-meerse DNA järjestuse inserdid (inserdid) sarnasuse alusel.sisestusi (lubatud on kuni 2 mittevastavat alust), kasutades iteratiivset algoritmi, mis on määratletud järgmiselt: sisestused sorteeritakse esmalt nende sageduse järgi (kõrgeimast madalaimani) ja kui need on samad, siis teisejärgulise sortimise järgi pikkuse järgi (pikimast lühemani) ).Seega määratlevad kõige sagedasemad ja pikemad sisestused esimese "rühma".Rühma sagedus on seatud võtmesagedusele.Seejärel prooviti iga sorteeritud loendisse jäänud sisestust lisada rühma paarikaupa Needleman-Wunschi joondusega.Kui joonduse mittevastavuste, sisestuste või kustutamiste arv ei ületa läve 2, lisatakse rühmale sisestus ja grupi üldist sagedust suurendatakse selle võrra, kui sageli sisestus lisati.Rühma lisatud sisestused märgitakse kasutatuks ja jäetakse edasisest töötlemisest välja.Kui lisamisjärjestust ei saa lisada juba olemasolevasse rühma, luuakse sisestusjärjestuse abil uus rühm sobiva lisamissagedusega ja märgitakse kasutatud.Iteratsioon lõpeb, kui iga sisestusjärjestust on kasutatud uue rühma moodustamiseks või seda saab lisada juba olemasolevasse rühma.Lõppude lõpuks transleeritakse nukleotiididest koosnevad rühmitatud insertid lõpuks peptiidjärjestusteks (peptiidiraamatukogudeks).Selle analüüsi tulemus on sisestuste komplekt ja nende vastavad sagedused, mis moodustavad järjestikuste lugemiste arvu (täiendav joonis 2).
Motiivide genereerimine: ainulaadsete peptiidide loendi põhjal loodi raamatukogu, mis sisaldab kõiki võimalikke aminohapete mustreid (aa), nagu allpool näidatud.Iga võimalik muster pikkusega 3 ekstraheeriti peptiidist ja selle pöördmuster lisati koos ühise motiivi raamatukoguga, mis sisaldas kõiki mustreid (tripeptiidid).Väga korduvate motiivide raamatukogud järjestati ja liiasus eemaldati.Seejärel kontrollisime iga motiiviraamatukogu tripeptiidi puhul arvutustööriistade abil selle olemasolu raamatukogus.Sel juhul lisatakse leitud motiivi tripeptiidi sisaldava peptiidi sagedus ja omistatakse motiivi raamatukogus olevale motiivile (“motiivide arv”).Motiivide genereerimise tulemuseks on kahemõõtmeline massiiv, mis sisaldab kõiki tripeptiidide (motiivide) esinemisi ja nende vastavaid väärtusi, mis on järjestuslugemiste arv, mille tulemuseks on vastav motiiv lugemite filtreerimisel, rühmitamisel ja tõlkimisel.Mõõdikud, nagu eespool üksikasjalikult kirjeldatud.
Motiivide arvu ja vastavate hajuvusdiagrammide normaliseerimine: iga proovi motiivide arv normaliseeriti kasutades
kus ni on teemat i sisaldavate lugemiste arv.Seega vi tähistab motiivi i sisaldavate lugemiste (või peptiidide) protsenti proovis.Normaliseerimata motiivide arvu P-väärtused arvutati Fisheri täpse testi abil.Motiivide arvu korrelogrammide osas arvutati Spearmani korrelatsioonid, kasutades normaliseeritud motiivide arvu R-ga.
Aminohapete sisalduse visualiseerimiseks peptiiditeegi igas positsioonis loodi veebilogogrammid 32, 33 (//weblogo.threeplusone.com).Esiteks säilitatakse aminohapete sisaldus 12-meerilise peptiidi igas positsioonis 20 × 12 maatriksis.Seejärel genereeritakse 1000 peptiidi komplekt, mis sisaldavad igas positsioonis sama suhtelist aminohappesisaldust, fasta-järjestuse vormingus ja sisestatakse veebilogo 3 sisendiks, mis genereerib igas positsioonis suhtelise aminohappesisalduse graafilise esituse.antud peptiidi raamatukogu jaoks.Mitmemõõtmeliste andmekogumite visualiseerimiseks loodi soojuskaardid, kasutades R-i sisemiselt välja töötatud tööriista (biosHeatmap, veel avaldamata R-pakett).Soojuskaartidel esitatud dendrogrammid arvutati Wardi hierarhilise klastrite meetodi abil eukleidilise kauguse meetrikaga.Motiivide hindamisandmete statistilise analüüsi jaoks arvutati P väärtused normaliseerimata skoori jaoks Fisheri täpse testi abil.Teiste andmekogumite P-väärtused arvutati R-s Studenti t-testi või ANOVA abil.
Valitud faagikloonid ja ilma vahetükkideta faagid süstiti intravenoosselt sabaveeni kaudu (2 × 1010 faagi looma kohta 300 μl PBS-is).Kümme minutit enne perfusiooni ja sellele järgnevat fikseerimist süstiti samadele loomadele intravenoosselt 100 μl DyLight594-ga märgistatud lektiini (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutit pärast faagi süstimist perfuseeriti rottidele südame kaudu 50 ml PBS-i, millele järgnes 50 ml 4% PFA/PBS.Ajuproovid fikseeriti täiendavalt üleöö 4% PFA/PBS-is ja leotati 30% sahharoosis üleöö temperatuuril 4 °C.Proovid kiirkülmutatakse ÜMT segus.Külmutatud proovide immunohistokeemiline analüüs viidi läbi toatemperatuuril 30 µm krüosektsioonidel, mis olid blokeeritud 1% BSA-ga ja inkubeeritud polüklonaalsete FITC-märgistatud antikehadega T7 faagi vastu (Novus NB 600-376A) temperatuuril 4 °C.Inkubeerige üleöö.Lõpuks pesti sektsioone 3 korda PBS-ga ja uuriti konfokaalse lasermikroskoobiga (Leica TCS SP5).
Kõik peptiidid minimaalse puhtusega 98% sünteesiti GenScript USA abil, biotinüüliti ja lüofiliseeriti.Biotiin on seotud täiendava kolmekordse glütsiini speisseriga N-otsas.Kontrollige kõiki peptiide massispektromeetria abil.
Streptavidiin (Sigma S0677) segati 5-kordse ekvimolaarse liiaga biotinüülitud peptiidi, biotinüülitud BACE1 inhibeeriva peptiidi või biotinüülitud BACE1 inhibeeriva peptiidi ja BACE1 inhibeeriva peptiidi kombinatsiooniga (suhtes 3:1) 5–10% DMSO-s / inkubeeriti PBS-is.1 tund enne süstimist toatemperatuuril.Streptavidiiniga konjugeeritud peptiide süstiti intravenoosselt annuses 10 mg/kg ajuõõnsusega rottide ühte sabaveeni.
Streptavidiini-peptiidi komplekside kontsentratsiooni hinnati ELISA abil.Nunc Maxisorp mikrotiiterplaadid (Sigma) kaeti üleöö temperatuuril 4 °C 1,5 μg/ml hiire streptavidiinivastase antikehaga (Thermo, MA1-20011).Pärast blokeerimist (blokeeriv puhver: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatiin, 1% BSA) toatemperatuuril 2 tundi, peske plaati 0,05% Tween-20/PBS-ga (pesupuhver) 3 sekundit. 000, CSF 1:115).Seejärel inkubeeriti plaati öö läbi 4 °C juures detekteerimisantikehaga (1 μg/ml, anti-streptavidiin-HRP, Novus NB120-7239).Pärast kolme pesemisetappi tuvastati streptavidiin TMB substraadi lahuses (Roche) kuni 20 minuti jooksul inkubeerimisega.Pärast värvi väljatöötamise peatamist 1 M H2SO4-ga mõõtke neelduvus lainepikkusel 450 nm.
Streptavidiin-peptiid-BACE1 inhibiitori kompleksi funktsiooni hinnati Aβ(1-40) ELISA meetodil vastavalt tootja protokollile (Wako, 294-64701).Lühidalt, CSF-proovid lahjendati standardlahjendis (1:23) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C 96-augulistel plaatidel, mis olid kaetud BNT77 püüdmisantikehaga.Pärast viit pesemisetappi lisati HRP-ga konjugeeritud BA27 antikeha ja inkubeeriti 2 tundi temperatuuril 4 °C, millele järgnes viis pesemisetappi.Aβ (1–40) tuvastati inkubeerimisel TMB lahuses 30 minutit toatemperatuuril.Pärast värvi kujunemise peatamist stopplahusega mõõdetakse neelduvus lainepikkusel 450 nm.Enne Aβ(1–40) ELISA-d ekstraheeriti plasmaproovid tahke faasiga.Plasma lisati 0,2% DEA-le (Sigma) 96-süvendilistel plaatidel ja inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit.Pärast SPE-plaatide (Oasis, 186000679) järjestikust pesemist vee ja 100% metanooliga lisati SPE-plaatidele plasmaproovid ja kogu vedelik eemaldati.Proove pesti (kõigepealt 5% metanooliga, seejärel 30% metanooliga) ja elueeriti 2% NH4OH/90% metanooliga.Pärast eluaadi kuivatamist temperatuuril 55 °C 99 minutit konstantse N2 voolu juures redutseeriti proove standardsetes lahjendites ja Aβ (1–40) mõõdeti ülalkirjeldatud viisil.
Kuidas seda artiklit tsiteerida: Urich, E. et al.Kauba kohaletoimetamine ajju, kasutades in vivo tuvastatud transiidipeptiide.teadus.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ja Moos T. Makromolekulaarsete ravimite kohaletoimetamine ajju, kasutades sihtravi.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ja Martinez-Martinez, P. Peptiid- ja valguravimite kohaletoimetamine läbi vere-aju barjääri.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hematoentsefaalbarjäär: kitsaskoht aju ravimite väljatöötamisel.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ja Byrd, A. Väljavaated ravimite paremaks kohaletoimetamiseks ja ajusse suunamiseks koroidpõimiku-CSF raja kaudu.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmatseutiliste ravimite moderniseerimine molekulaarsete Trooja hobustega aju kohaletoimetamiseks.Bioconjug Chem. 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM retseptori vahendatud peptiidi transport läbi hematoentsefaalbarjääri.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Suurendage terapeutiliste antikehade läbitungimist ajusse ja efektiivsust, kasutades monovalentseid molekulaarseid süstikuid.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferriini retseptori (TfR) transport määrab TfR antikehade afiinsusvariantide ajju omastamise.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).