Mõned LC tõrkeotsingu teemad ei ole kunagi aegunud, kuna LC-praktikas esineb probleeme isegi siis, kui instrumenditehnoloogia aja jooksul paraneb. LC-süsteemis võivad probleemid tekkida mitmel viisil ja lõppeda piigi kehva kujuga. Kui ilmnevad piigi kujuga seotud probleemid, aitab nende tulemuste võimalike põhjuste lühike loend meie tõrkeotsingu kogemust lihtsustada.
Seda veergu “LC tõrkeotsing” on olnud lõbus kirjutada ja iga kuu teemadele mõelda, sest mõned teemad ei lähe kunagi moest välja. Kui kromatograafiauuringute valdkonnas vananevad teatud teemad või ideed, kuna need asenduvad uuemate ja paremate ideedega, siis tõrkeotsingu valdkonnas ilmus esimene tõrkeotsingu artikkel selles ajakirjas (möödunud aastad on LC Journal19 ikka veel)3. Olen keskendunud mitmele LC tõrkeotsingu jaotisele vedelikkromatograafiat (LC) mõjutavatele kaasaegsetele suundumustele (näiteks meie arusaamade suhteline võrdlus rõhu mõjust retentsioonile [2] Uued edusammud) Meie LC tulemuste tõlgendus ja tõrkeotsing tänapäevaste LC-instrumentidega.Selle kuu osas jätkan ma oma teemal "21. aasta detsembris, mis alustas surmaga" (3). LC tõrkeotsing – elemendid, mis sobivad suurepäraselt iga tõrkeotsija jaoks, on olulised, olenemata kasutatava süsteemi vanusest.Selle seeria põhiteema on väga asjakohane paljudes laborites rippuva LCGC kuulsa „LC tõrkeotsingu juhendi“ seinatabeli (4) jaoks.Selle seeria kolmanda osa jaoks otsustasin keskenduda probleemidele, mis on seotud tipptaseme, võimaliku seina halva kuju või peakdib põhjustega. Me ei saa kõiki neid probleeme ühes artiklis üksikasjalikult käsitleda, seega keskendun selle teema esimeses osas mõnele neist, mida ma kõige sagedamini näen. Loodan, et noored ja vanad LC-kasutajad leiavad selle olulise teema kohta kasulikke näpunäiteid ja meeldetuletusi.
Avastan end üha enam vastamas tõrkeotsingu küsimustele sõnadega „kõik on võimalik”. See vastus võib tunduda lihtne, kui arvestada tähelepanekuid, mida on raske tõlgendada, kuid leian, et see on sageli asjakohane. Kuna tippude kehva kuju võimalikud põhjused on paljud, on oluline hoida avatud meelt, kui mõelda, milles võib probleem olla, ning seada prioriteediks võimalikud põhjused, et alustada meie tõrkeotsingut, keskendudes kõige levinumatele võimalustele.
Mis tahes tõrkeotsingu põhisamm – kuid minu arvates on see alahinnatud – on teadvustada, et on probleem, mis vajab lahendamist. Probleemi mõistmine tähendab sageli teadvustamist, et tööriistaga toimuv erineb meie ootustest, mida kujundavad teooria, empiirilised teadmised ja kogemused (5). "Tipukuju" (sujuv, asümmeetriline, mitte ainult siin viidatud asümmeetria serva, saba jne), aga ka laiuse suhtes.Meie ootused tipu tegeliku kuju suhtes on lihtsad.Teooria (6) toetab hästi õpiku ootust, et enamikul juhtudel peaksid kromatograafilised piigid olema sümmeetrilised ja vastama Gaussi jaotuse kujule, nagu on näidatud joonisel 1a. Mida me piikide laiustelt ootame, on keerulisem probleem. Teisel teemal võiksime käsitleda seda artiklit, mida võiks tulevikus käsitleda. — teisisõnu, mõned viisid, kuidas asjad võivad valesti minna. Selle osa ülejäänud osas veedame aega, et arutada konkreetseid näiteid olukordadest, mis võivad viia nende kujutüüpideni.
Mõnikord ei täheldata kromatogrammil piike üldse, kus need eeldatavasti elueeruvad. Ülaltoodud seinadiagramm näitab, et piigi puudumine (eeldusel, et proov sisaldab tegelikult sihtanalüüti kontsentratsioonis, mis peaks muutma detektori reaktsiooni piisavaks, et seda mürast kõrgemal näha) on tavaliselt seotud mõne instrumendi probleemiga või ebaõigete liikuva faasi tingimustega (kui seda üldse täheldati).tipud, tavaliselt liiga "nõrgad"). Selle kategooria võimalike probleemide ja lahenduste lühinimekirja leiate tabelist I.
Nagu ülalpool mainitud, on küsimus, kui palju piigi laienemist tuleks enne tähelepanu pööramist ja parandamist taluda, keeruline teema, mida käsitlen ühes tulevases artiklis. Minu kogemus on, et märkimisväärse piigi laienemisega kaasneb sageli oluline muutus piigi kujus ja piigi sabastumine on tavalisem kui piigi eelnev või lõhenemine. Kuid nominaalselt võivad piigid laieneda ka sümmeetriliste põhjuste tõttu, mis võivad olla erinevad.
Kõiki neid probleeme on üksikasjalikult käsitletud LC tõrkeotsingu eelmistes numbrites ja nendest teemadest huvitatud lugejad võivad nende probleemide algpõhjuste ja võimalike lahenduste kohta teabe saamiseks vaadata neid eelmisi artikleid.Rohkem detaile.
Piikide sabad, piikide esiosa ja lõhenemine võivad kõik olla põhjustatud keemilistest või füüsikalistest nähtustest ning nende probleemide võimalike lahenduste loend on väga erinev, olenevalt sellest, kas tegemist on keemilise või füüsikalise probleemiga. Sageli saate kromatogrammi erinevate piikide võrdlemisel leida olulisi vihjeid selle kohta, milline on süüdlane. piigid on mõjutatud, kuid ülejäänud näevad head välja, põhjus on tõenäoliselt keemiline.
Piigi jäämise keemilised põhjused on liiga keerulised, et siin lühidalt arutada. Huvitatud lugejale viidatakse põhjalikumaks aruteluks hiljuti ilmunud ajakirja „LC Troubleshooting” (10) väljaandele (10). Lihtne on aga proovida süstitava analüüdi massi vähendamist ja vaadata, kas piigi kuju paraneb. Kui jah, siis on see hea vihje, et probleemi massi ülekoormamine peab olema väike. es või kromatograafilisi tingimusi tuleb muuta nii, et ka suuremate süstitavate masside korral saaks head piikide kuju.
Samuti on tippude sabastumisel palju võimalikke füüsilisi põhjuseid. Lugejad, kes on huvitatud võimaluste üksikasjalikust arutelust, on viidatud ajakirja „LC Troubleshooting” (11) teisele hiljutisele numbrile. Üks levinumaid füüsilisi põhjuseid, miks sabatippude tippu tekib, on halb ühendus pihusti ja detektori vahel (12). Äärmuslik näide on näidatud joonisel 1d, mis on saadud minu laboris, kus oli paar nädalat tagasi paigaldatud uus sissepritsesüsteem, millesse paigaldasime väikese sissepritsesüsteemi. p ümbrisega, mis oli vormitud roostevabast terasest kapillaarile.Pärast mõningaid esialgseid tõrkeotsingu katseid saime aru, et sissepritseklapi staatori pordi sügavus oli palju sügavam, kui olime harjunud, mille tulemuseks on suur tühimaht pordi allosas. Seda probleemi saab hõlpsasti lahendada, asendades sissepritseaasa teise toruga, saame reguleerida pordi õiget asendit, et eemaldada pordi maht.
Joonisel 1e kujutatuga sarnaseid piikide frondeid võivad põhjustada ka füüsikalised või keemilised probleemid. Esiserva tavaline füüsiline põhjus on see, et kolonni osakestekiht ei ole hästi pakitud või osakesed on aja jooksul ümber organiseerunud. Nagu ka sellest füüsikalisest nähtusest põhjustatud tippude sabastumise korral, on parim viis selle parandamiseks kolonn välja vahetada ja jätkata. (lineaarsetes) tingimustes on statsionaarses faasis peetava analüüdi kogus (seega retentsioonitegur) lineaarses seoses analüüdi kontsentratsiooniga kolonnis. Kromatograafiliselt tähendab see, et kolonni süstitava analüüdi massi suurenedes piik muutub kõrgemaks, kuid mitte laiemaks. See seos katkeb, kui retentsioonikäitumine muutub mitte ainult laiemaks, vaid ka mitte ainult massi suurenedes. Lisaks määravad mittelineaarsed kujundid kromatograafiliste piikide kuju, mille tulemuseks on esi- või lõppservad.Nagu massi ülekoormuse korral, mis põhjustab piigi sabade moodustumist (10), saab ka mittelineaarsest peetusest põhjustatud piigi esiletõstmist diagnoosida, vähendades süstitud analüüdi massi. Kui piigi kuju paraneb, tuleb meetodit muuta nii, et see ei ületaks süstimise kvaliteeti, või tuleb muuta kromatograafilist käitumist, mis põhjustab selle esiserva minimeerimise.
Mõnikord vaatleme seda, mis näib olevat "lõhenenud" piik, nagu on näidatud joonisel 1f. Selle probleemi lahendamise esimene samm on kindlaks teha, kas piigi kuju on tingitud osalisest kooselueerimisest (st kahe erineva, kuid tihedalt elueeruva ühendi olemasolust). Kui tegelikult elueeruvad kaks erinevat analüüti, siis on vaja parandada nende eraldusvõimet ja selektsioonivõimet, suurendades plaadi füüsikalist valgustust (näiteks suurendades selektiivsust, suurendades plaadi valgustust). vormingul pole midagi pistmist veeru endaga. Sageli on selle otsuse kõige olulisem vihje see, kas kromatogrammi kõik piigid on lõhenenud või ainult ühel või kahel. Kui see on ainult üks või kaks, on see tõenäoliselt kaaselueerimise probleem;kui kõik tipud on jagatud, on see tõenäoliselt füüsiline probleem, mis on tõenäoliselt seotud veeru endaga.
Kolonni enda füüsikaliste omadustega seotud lõhenenud piigid on tavaliselt tingitud osaliselt blokeeritud sisse- või väljalaskefrittidest või kolonnis olevate osakeste ümberkorraldamisest, mis võimaldab liikuval faasil voolata kiiremini kui liikuv faas kolonni kanali moodustumise teatud piirkondades .teistes piirkondades (11).Osaliselt ummistunud fritti saab mõnikord puhastada kolonni läbiva voolu pööramisega;kuid minu kogemuse kohaselt on see tavaliselt pigem lühiajaline kui pikaajaline lahendus. Kaasaegsete kolonnide puhul on see sageli saatuslik, kui osakesed kolonnis rekombineeruvad.Sel hetkel on kõige parem kolonn välja vahetada ja jätkata.
Joonisel 1g olev tipp, mis pärineb ka hiljutisest juhtumist minu enda laboris, näitab tavaliselt, et signaal on nii kõrge, et on jõudnud reaktsioonivahemiku kõrgeima piirini. Optiliste neeldumisdetektorite (antud juhul UV-vis) puhul, kui analüüdi kontsentratsioon on väga kõrge, neelab analüüt suurema osa detektori voolukambrit läbivast valgusest, jättes nendest valgusallikatest väga vähe valgust, mida fotonäitaja ei tuvasta. , nagu hajuv valgus ja "tume vool", muutes signaali välimuselt väga "häguseks" ja analüüdi kontsentratsioonist sõltumatuks.Kui see juhtub, saab probleemi sageli hõlpsasti lahendada, vähendades analüüdi süstimismahtu – vähendades süstimismahtu, lahjendades proovi või mõlemat.
Kromatograafiakoolis kasutame detektori signaali (st kromatogrammi y-telge) analüüdi kontsentratsiooni indikaatorina proovis. Seega tundub veider näha kromatogrammi, mille signaal on alla nulli, kuna lihtsa tõlgenduse kohaselt näitab see analüüdi negatiivset kontsentratsiooni – mis pole loomulikult füüsiliselt võimalik. Minu kogemuse kohaselt on ultraviolettkiirguse detektorite puhul kõige sagedamini täheldatud optilise neeldumise piike.
Antud juhul tähendab negatiivne piik lihtsalt seda, et kolonnist elueeruvad molekulid neelavad vahetult enne ja pärast piiki vähem valgust kui liikuv faas ise. See võib juhtuda näiteks suhteliselt madalate tuvastuslainepikkuste (<230 nm) ja liikuva faasi lisandite kasutamisel, mis tegelikult neelavad suurema osa valgusest nendel lainepikkustel.Selliseid lisandeid saab kasutada näiteks liikuva faasi puhver- või kantsaadikomponentidena. negatiivsed piigid kalibreerimiskõvera koostamiseks ja täpse kvantitatiivse teabe saamiseks, seega pole põhimõttelist põhjust neid iseenesest vältida (seda meetodit nimetatakse mõnikord ka "kaudseks UV-tuvastuseks") (13). Kui aga me tõesti tahame negatiivseid piike üldse vältida, on neeldumise tuvastamise puhul parim lahendus kasutada erinevat tuvastamise lainepikkust kui mobiilne faas, nii et liikuva faasi valguse koostis muutuks nii palju, et neeldumisfaas muutuks nii palju, et neeldumisfaas muutuks nii palju kui analine. lüüdid.
Negatiivsed piigid võivad ilmneda ka murdumisnäitaja (RI) tuvastamise kasutamisel, kui proovis olevate muude komponentide kui analüüdi, näiteks lahustimaatriksi murdumisnäitaja erineb liikuva faasi murdumisnäitaja omast. See juhtub ka UV-viske tuvastamisel, kuid see efekt kipub RI tuvastamisega võrreldes nõrgenema. Mõlemal juhul saab mobiilse faasi maatriksi piikide täpsemini sobitamise abil minimeerida.
Kolmandas osas, mis käsitles LC tõrkeotsingu põhiteemat, käsitlesin olukordi, kus vaadeldav piigi kuju erineb eeldatavast või tavalisest piigi kujust. Selliste probleemide tõhus tõrkeotsing algab eeldatavate piikide kuju tundmisest (teooria või olemasolevate meetodite varasemate kogemuste põhjal), nii et kõrvalekalded nendest ootustest on ilmsed. Tipukuju probleemidel on palju erinevaid võimalikke põhjuseid (selles paigalduses käsitlen sageli esiserva,, jne). .Nende üksikasjade tundmine on hea koht tõrkeotsingu alustamiseks, kuid ei hõlma kõiki võimalusi. Lugejad, kes on huvitatud põhjuste ja lahenduste põhjalikumast loendist, võivad vaadata LCGC „LC tõrkeotsingu juhendi“ seinakaarti.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” seinatabel.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), lk 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ja Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.