Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Vedelbiopsia (LB) on kontseptsioon, mis kogub biomeditsiini valdkonnas kiiresti populaarsust.Kontseptsioon põhineb peamiselt tsirkuleeriva ekstratsellulaarse DNA (ccfDNA) fragmentide tuvastamisel, mis vabanevad peamiselt väikeste fragmentidena pärast rakusurma erinevates kudedes.Väike osa neist fragmentidest pärineb võõrastest (võõrastest) kudedest või organismidest.Praeguses töös oleme seda kontseptsiooni rakendanud rannakarpide puhul, mis on sentinell-liik, mis on tuntud oma suure merevee filtreerimisvõime poolest.Me kasutame rannakarpide võimet toimida looduslike filtritena, et püüda kinni erinevatest allikatest pärit keskkonna DNA fragmente, et anda teavet mere rannikuökosüsteemide bioloogilise mitmekesisuse kohta.Meie tulemused näitavad, et rannakarbi hemolümf sisaldab DNA fragmente, mille suurus on väga erinev, vahemikus 1 kuni 5 kb.Haavlipüssi järjestamine näitas, et suur hulk DNA fragmente on võõrmikroobse päritoluga.Nende hulgas leidsime DNA fragmente bakteritest, arheidest ja viirustest, sealhulgas viirustest, mis teadaolevalt nakatavad mitmesuguseid rannikumere ökosüsteemides tavaliselt leiduvaid peremehi.Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring näitab, et rannakarpidele rakendatud LB kontseptsioon on rikkalik, kuid veel uurimata teadmiste allikas mere ranniku ökosüsteemide mikroobide mitmekesisuse kohta.
Kliimamuutuste (CC) mõju mere ökosüsteemide bioloogilisele mitmekesisusele on kiiresti kasvav uurimisvaldkond.Globaalne soojenemine ei põhjusta mitte ainult olulisi füsioloogilisi pingeid, vaid nihutab ka mereorganismide termilise stabiilsuse evolutsioonilisi piire, mõjutades mitmete liikide elupaiku, ajendades neid otsima soodsamaid tingimusi [1, 2].Lisaks metazoanide bioloogilise mitmekesisuse mõjutamisele häirib CC peremees-mikroobide interaktsioonide õrna tasakaalu.See mikroobne düsbakterioos kujutab tõsist ohtu mere ökosüsteemidele, kuna muudab mereorganismid nakkuslike patogeenide suhtes vastuvõtlikumaks [3, 4].Arvatakse, et SS mängib olulist rolli massilistes surmades, mis on tõsine probleem ülemaailmsete mereökosüsteemide haldamisel [5, 6].See on oluline küsimus, arvestades paljude mereliikide majanduslikku, ökoloogilist ja toitumisalast mõju.See kehtib eriti polaaraladel elavate kahepoolmeliste kohta, kus CK mõju on vahetum ja raskem [6, 7].Tegelikult on kahepoolmelised nagu Mytilus spp.kasutatakse laialdaselt CC mõju jälgimiseks mere ökosüsteemidele.Pole üllatav, et nende tervise jälgimiseks on välja töötatud suhteliselt palju biomarkereid, kasutades sageli kahetasandilist lähenemisviisi, mis hõlmab funktsionaalseid biomarkereid, mis põhinevad ensümaatilisel aktiivsusel või rakufunktsioonidel, nagu rakkude elujõulisus ja fagotsüütiline aktiivsus [8].Need meetodid hõlmavad ka spetsiifiliste rõhuindikaatorite kontsentratsiooni mõõtmist, mis kogunevad pehmetesse kudedesse pärast suure hulga merevee imendumist.Kahepoolmeliste suur filtreerimisvõime ja poolavatud vereringesüsteem annavad aga võimaluse välja töötada uusi hemolümfi biomarkereid, kasutades vedela biopsia (LB) kontseptsiooni, mis on lihtne ja minimaalselt invasiivne lähenemine patsiendi juhtimisele.vereproovid [9, 10].Kuigi inimese LB-s võib leida mitut tüüpi ringlevaid molekule, põhineb see kontseptsioon peamiselt plasmas ringlevate ekstratsellulaarse DNA (ccfDNA) fragmentide DNA sekveneerimise analüüsil.Tegelikult on tsirkuleeriva DNA olemasolu inimese plasmas teada juba 20. sajandi keskpaigast [11], kuid alles viimastel aastatel on suure läbilaskevõimega sekveneerimismeetodite tulek viinud ccfDNA-l põhineva kliinilise diagnoosini.Nende ringlevate DNA fragmentide olemasolu on osaliselt tingitud genoomse DNA (tuuma ja mitokondriaalse) passiivsest vabanemisest pärast rakusurma. Tervetel inimestel on ccfDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/mL), kuid erinevate patoloogiate või stressi all kannatavatel patsientidel võib ccfDNA kontsentratsioon suureneda 5–10 korda, põhjustades koekahjustusi. Tervetel inimestel on ccfDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/mL), kuid erinevate patoloogiate või stressi all kannatavatel patsientidel võib ccfDNA kontsentratsioon suureneda 5–10 korda, põhjustades koekahjustusi. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатьлуся в 5–10 разнычия разнычы огией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Tervetel inimestel on cccDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/mL), kuid erinevate patoloogiatega või koekahjustust põhjustava stressiga patsientidel võib see suureneda 5–10 korda.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承傞病理或承加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承 壎 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5.-10. працинынто патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Tervetel inimestel on ccfDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/ml), kuid erinevate patoloogiate või stressiga patsientidel võib seda suurendada 5-10 korda, mille tulemuseks on koekahjustus.ccfDNA fragmentide suurus on väga erinev, kuid tavaliselt jääb see vahemikku 150 kuni 200 aluspaari.[12].Ise toodetud ccfDNA, st normaalsetest või transformeeritud peremeesrakkudest pärineva ccfDNA analüüsi saab kasutada tuuma- ja/või mitokondriaalses genoomis esinevate geneetiliste ja epigeneetiliste muutuste tuvastamiseks, aidates seeläbi arstidel valida spetsiifilisi molekulaarsele sihtmärgiga ravimeetodeid [13].Siiski võib ccfDNA-d saada välismaistest allikatest, nagu ccfDNA looterakkudest raseduse ajal või siirdatud elunditest [14,15,16,17].ccfDNA on ka oluline teabeallikas nakkustekitaja (võõra) nukleiinhapete olemasolu tuvastamiseks, mis võimaldab mitteinvasiivselt tuvastada laialt levinud nakkusi, mida verekultuurid ei tuvasta, vältides nakatunud koe invasiivset biopsiat [18].Hiljutised uuringud on tõepoolest näidanud, et inimveri sisaldab rikkalikku teabeallikat, mida saab kasutada viiruslike ja bakteriaalsete patogeenide tuvastamiseks, ning et ligikaudu 1% inimese plasmas leiduvast ccfDNA-st on võõra päritoluga [19].Need uuringud näitavad, et organismis ringleva mikrobiomi bioloogilist mitmekesisust saab hinnata ccfDNA analüüsi abil.Kuid kuni viimase ajani kasutati seda kontseptsiooni ainult inimestel ja vähemal määral ka teistel selgroogsetel [20, 21].
Käesolevas artiklis kasutame LB potentsiaali, et analüüsida Aulacomya atra ccfDNA-d, mis on lõunapoolsed liigid, mida tavaliselt leidub subantarktika Kergueleni saartel, saarte rühmas suure platoo tipus, mis tekkis 35 miljonit aastat tagasi.vulkaanipurse.Kasutades in vitro katsesüsteemi, leidsime, et merevees olevad DNA fragmendid võtavad rannakarbid kiiresti endasse ja sisenevad hemolümfi sektsiooni.Haavlipüssi järjestamine on näidanud, et rannakarbi hemolümfi ccfDNA sisaldab enda ja mitteisepäritolu DNA fragmente, sealhulgas sümbiootilisi baktereid ja DNA fragmente bioomidest, mis on tüüpilised külmade vulkaaniliste mere rannikuökosüsteemide jaoks.Hemolümfi ccfDNA sisaldab ka viirusjärjestusi, mis on tuletatud erineva peremeesorganismiga viirustest.Samuti leidsime DNA fragmente mitmerakulistest loomadest, nagu luukalad, mereanemoonid, vetikad ja putukad.Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring näitab, et LB kontseptsiooni saab edukalt rakendada mere selgrootutele, et luua mere ökosüsteemides rikkalik genoomne repertuaar.
Täiskasvanud (55-70 mm pikkused) Mytilus platensis (M. platensis) ja Aulacomya atra (A. atra) koguti Port-au-France'i (049°21.235 S, 070°13.490 E .) vahelduvalt kivistelt kaldalt.Kergueleni saared detsembris 2018. Teised täiskasvanud sinimerekarbid (Mytilus spp.) saadi kaubanduslikult tarnijalt (PEI Mussel King Inc., Prince Edwardi saar, Kanada) ja pandi kontrollitud temperatuuriga (4°C) gaseeritud paaki, mis sisaldas 10–20 liitrit 32‰ kunstlikku soolvett.(kunstlik meresool Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Iga katse jaoks mõõdeti üksikute kestade pikkus ja kaal.
Selle programmi tasuta avatud juurdepääsu protokoll on veebis saadaval (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Lühidalt, LB hemolümf koguti röövimislihastest, nagu kirjeldatud [22].Hemolümf selgitati tsentrifuugimisega kiirusel 1200 x g 3 minutit, supernatant külmutati (-20 °C) kuni kasutamiseni.CfDNA eraldamiseks ja puhastamiseks sulatati proovid (1,5-2,0 ml) ja töödeldi NucleoSnap cfDNA komplekti (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) vastavalt tootja juhistele.ccfDNA-d säilitati kuni edasise analüüsini -80 °C juures.Mõnes katses eraldati ja puhastati ccfDNA, kasutades QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Puhastatud DNA kvantifitseeriti standardse PicoGreeni testiga.Eraldatud ccfDNA fragmentide jaotust analüüsiti kapillaarelektroforeesiga, kasutades bioanalüsaatorit Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA), kasutades kõrge tundlikkusega DNA komplekti.Analüüs viidi läbi, kasutades 1 µl ccfDNA proovi vastavalt tootja juhistele.
Hemolümfi ccfDNA fragmentide sekveneerimiseks valmistas Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) haavlipüssi raamatukogud, kasutades Illumina MiSeq PE75 komplekti Illumina DNA Mix komplekti.Kasutati standardset adapterit (BioO).Toorandmete failid on saadaval NCBI järjestuste lugemise arhiivist (SRR8924808 ja SRR8924809).Põhilist lugemiskvaliteeti hinnati FastQC [23] abil.Trimmomaticu [24] on kasutatud adapterite lõikamiseks ja halva kvaliteediga lugemiseks.Paarisotstega haavlilugemised liideti FLASH-iga pikemateks üksikuteks lugemisteks minimaalse kattumisega 20 bp, et vältida mittevastavust [25]. Ühendatud lugemised märgiti BLASTN-iga, kasutades kahepoolmelist NCBI taksonoomia andmebaasi (e väärtus < 1e-3 ja 90% homoloogia) ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi kasutades DUST [26]. Ühendatud lugemised märgiti BLASTN-iga, kasutades kahepoolmelist NCBI taksonoomia andmebaasi (e väärtus < 1e-3 ja 90% homoloogia) ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi kasutades DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двусты таксономии двусты чение e < 1e-3 ja 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использо с использо. Ühendatud lugemised märgiti BLASTN-iga, kasutades NCBI kahepoolmeliste taksonoomia andmebaasi (e väärtus < 1e-3 ja 90% homoloogia) ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi kasutades DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数]低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6 ]（复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данскотлорхчосты дануных BI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испо Ühendatud lugemised märgiti BLASTN-iga, kasutades NCBI kahepoolmeliste taksonoomilist andmebaasi (e väärtus <1e-3 ja 90% homoloogia) ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi kasutades DUST [26].Lugemised jagati kahte rühma: kahepoolmeliste järjestustega seotud (siin nimetatakse iselugemisteks) ja mitteseotud (mitte-iselugemised).Kaks rühma pandi eraldi kokku MEGAHITi abil, et luua kontiigid [27].Vahepeal klassifitseeriti tulnukate mikrobioomide lugemite taksonoomiline jaotus Kraken2 [28] abil ja seda esitati graafiliselt galaktika Krona sektordiagrammiga [29, 30].Meie esialgsete katsete põhjal määrati optimaalseks kmersiks kmers-59. Seejärel tuvastati lõpliku annotatsiooni jaoks isekontiigid BLASTN-iga (kahepoolmeline NCBI andmebaas, e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia) joondamise teel. Seejärel tuvastati lõpliku annotatsiooni jaoks isekontiigid BLASTN-iga (kahepoolmeline NCBI andmebaas, e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia) joondamise teel. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных, двуствоникомолхлхлчатыNC e <1e-10 ja гомология 60%) для окончательной аннотации. Seejärel tuvastati enesekontiigid, sobitades lõpliku annotatsiooni jaoks BLASTN-i (NCBI kahepoolmeliste loomade andmebaas, e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia).然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来性）对齐来自諆别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления сопоставления сопоставления с BLASTNыставставления с BLASTN ворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Seejärel tuvastati lõplikuks annotatsiooniks enesekontiigid, sobitades need BLASTN-iga (NCBI kahepoolmeliste loomade andmebaas, e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia). Paralleelselt märgiti mitteomarühmade kontiigid BLASTN-iga (nt NCBI andmebaas, e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia). Paralleelselt märgiti mitteomarühmade kontiigid BLASTN-iga (nt NCBI andmebaas, e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia). Паралелно черодные груоые контигиги ыи аинотиoos с с с с сомощщ blastn (база да даных nt ncBi, зече зчч лчч лчч л зччч лчч лччччччччч лчз 1чччччччччччччччччччччччччччччччччччччч л-1зччччччччччччччччччччччччччччччччччччччч. Paralleelselt märgiti võõrrühmade kontiigid BLASTN-iga (NT NCBI andmebaas, e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннч1,-е1 зntнач1хе1 гомология 60%). Paralleelselt märgiti mitteomarühma kontiigid BLASTN-iga (nt NCBI andmebaas, e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia). BLASTX viidi läbi ka mitteself-kontiigidel, kasutades nr ja RefSeq valgu NCBI andmebaase (e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia). BLASTX viidi läbi ka mitteself-kontiigidel, kasutades nr ja RefSeq valgu NCBI andmebaase (e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr ja RefSeq NCBI (знаeч06e) %). BLASTX viidi läbi ka mitteisekontiigidel, kasutades nr ja RefSeq NCBI valgu andmebaase (e väärtus < 1e-10 ja 60% homoloogia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 悌挧ﺐ 傌源 倧ﺐ还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 悌挧ﺐ 傌源 倧ﺐ BLASTX таже ы ыолняи на на на носоостостелных контитах с и иоловованяан баз даз даз дел бел бела иеа ио e зч зчч зччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччч г. . BLASTX viidi läbi ka mitteisekontiigidel, kasutades nr ja RefSeq NCBI valgu andmebaase (e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia).Mitte-ise-kontiigide BLASTN ja BLASTX kogumid esindavad lõplikke ühendusi (vt lisafaili).
PCR jaoks kasutatud praimerid on loetletud tabelis S1.Taq DNA polümeraasi (Bio Basic Canada, Markham, ON) kasutati ccfDNA sihtgeenide amplifitseerimiseks.Kasutati järgmisi reaktsioonitingimusi: denatureerimine 95 °C juures 3 minutit, 95 °C 1 minut, reguleeritud lõõmutamistemperatuur 1 minutiks, pikendamine 72 °C juures 1 minut, 35 tsüklit ja lõpuks 72 °C 10 minuti jooksul..PCR tooted eraldati elektroforeesiga agaroosgeelides (1,5%), mis sisaldasid SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pingel 95 V.
Rannakarbid (Mytilus spp.) aklimatiseeriti 500 ml hapnikuga küllastunud merevees (32 PSU) 24 tundi temperatuuril 4 °C.Plasmiidne DNA, mis sisaldas inimese galektiin-7 cDNA järjestust kodeerivat inserti (NCBI registreerimisnumber L07769), lisati viaali lõppkontsentratsioonis 190 μg/μl.Kontrolliks olid rannakarbid, mida inkubeeriti samades tingimustes ilma DNA lisamiseta.Kolmas kontrollpaak sisaldas DNA-d ilma rannakarpideta.Merevees oleva DNA kvaliteedi jälgimiseks võeti igast paagist näidatud ajal merevee proovid (20 μl; kolm kordust).Plasmiidse DNA jälgitavuse jaoks koguti LB rannakarbid näidatud aegadel ja analüüsiti qPCR ja ddPCR abil.Merevee suure soolasisalduse tõttu lahjendati alikvoodid enne kõiki PCR-analüüse PCR-kvaliteediga vees (1:10).
Digitaalne tilk-PCR (ddPCR) viidi läbi, kasutades BioRad QX200 protokolli (Mississauga, Ontario, Kanada).Optimaalse temperatuuri määramiseks kasutage temperatuuriprofiili (tabel S1).Tilgad genereeriti QX200 tilgageneraatori (BioRad) abil.ddPCR viidi läbi järgmiselt: 95 °C 5 minutit, 50 tsüklit 95 °C juures 30 sekundit ja antud anniilimistemperatuur 1 min ja 72 °C 30 sekundit, 4 °C 5 minutit ja 90 °C 5 minuti jooksul.Tilkade arv ja positiivsed reaktsioonid (koopiate arv/µl) mõõdeti QX200 tilgalugeja (BioRad) abil.Proovid, milles oli vähem kui 10 000 tilka, lükati tagasi.Mustri kontrolli ei tehtud iga kord, kui ddPCR käivitati.
qPCR viidi läbi, kasutades Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austraalia) ja LGALS7 spetsiifilisi praimereid.Kõik kvantitatiivsed PCR-id viidi läbi 20 µl-s, kasutades QuantiFast SYBR Green PCR komplekti (QIAGEN).qPCR alustati 15-minutilise inkubeerimisega 95 °C juures, millele järgnes 40 tsüklit 95 °C juures 10 sekundit ja 60 °C juures 60 sekundit ühe andmekogumiga.Sulamiskõverad genereeriti, kasutades järjestikuseid mõõtmisi 95 °C juures 5 sekundit, 65 °C juures 60 sekundit ja 97 °C juures qPCR lõpus.Iga qPCR viidi läbi kolmes eksemplaris, välja arvatud kontrollproovid.
Kuna rannakarbid on tuntud oma kõrge filtreerimiskiiruse poolest, uurisime esmalt, kas nad suudavad filtreerida ja säilitada merevees olevaid DNA fragmente.Samuti huvitas meid, kas need killud kogunevad nende poolavatud lümfisüsteemi.Lahendasime selle probleemi eksperimentaalselt, jälgides sinikarbi mahutitesse lisatud lahustuvate DNA fragmentide saatust.DNA fragmentide jälgimise hõlbustamiseks kasutasime inimese galektiin-7 geeni sisaldavat võõrast (mitte oma) plasmiidset DNA-d.ddPCR jälgib plasmiidse DNA fragmente merevees ja rannakarpides.Meie tulemused näitavad, et kui rannakarpide puudumisel püsis DNA fragmentide hulk merevees aja jooksul (kuni 7 päeva) suhteliselt konstantsena, siis rannakarpide juuresolekul kadus see tase peaaegu täielikult 8 tunni jooksul (joonis 1a,b).Eksogeense DNA fragmendid tuvastati kergesti 15 minuti jooksul intravalvulaarses vedelikus ja hemolümfis (joonis 1c).Neid fragmente oli võimalik tuvastada veel kuni 4 tundi pärast kokkupuudet.See filtreerimisaktiivsus DNA fragmentide suhtes on võrreldav bakterite ja vetikate filtreerimisaktiivsusega [31].Need tulemused viitavad sellele, et rannakarbid võivad oma vedelikukambritesse filtreerida ja koguda võõr-DNA-d.
Plasmiidse DNA suhtelised kontsentratsioonid merevees rannakarpide juuresolekul (A) või ilma (B), mõõdetuna ddPCR-ga.A-s on tulemused väljendatud protsentides, kus kastide äärised tähistavad 75. ja 25. protsentiili.Paigaldatud logaritmiline kõver on näidatud punaselt ja halliga varjutatud ala tähistab 95% usaldusvahemikku.B-s tähistab punane joon keskmist ja sinine kontsentratsiooni 95% usaldusvahemikku.C Plasmiidse DNA akumuleerumine rannakarpide hemolümfis ja klapivedelikus erinevatel aegadel pärast plasmiidse DNA lisamist.Tulemused on esitatud tuvastatud absoluutsete koopiatena ml kohta (± SE).
Järgmisena uurisime ccfDNA päritolu rannakarpides, mis on kogutud Kergueleni saarte rannakarpide peenardest, mis on piiratud inimtekkelise mõjuga saarte rühm.Sel eesmärgil eraldati rannakarpide hemolümfidest pärit cccDNA ja puhastati meetoditega, mida tavaliselt kasutatakse inimese cccDNA puhastamiseks [32, 33].Leidsime, et keskmine hemolümfi ccfDNA kontsentratsioon rannakarpides on madalas mikrogrammides hemolümfi kohta ml kohta (vt tabel S2, lisateave).See kontsentratsioonide vahemik on palju suurem kui tervetel inimestel (madalad nanogrammid milliliitri kohta), kuid harvadel juhtudel võib vähihaigetel ccfDNA tase ulatuda mitme mikrogrammini milliliitri kohta [34, 35].Hemolümfi ccfDNA suurusjaotuse analüüs näitas, et nende fragmentide suurus on väga erinev, ulatudes 1000 aluspaarist kuni 1000 aluspaani.kuni 5000 bp (joonis 2).Sarnased tulemused saadi kasutades ränidioksiidil põhinevat QIAamp Investigator Kit'i – meetodit, mida tavaliselt kasutatakse kohtuekspertiisis madala kontsentratsiooniga DNA proovidest, sealhulgas ccfDNA-st, genoomse DNA kiireks eraldamiseks ja puhastamiseks [36].
Rannakarbi hemolümfi tüüpiline ccfDNA elektroforegramm.Ekstraheeritud NucleoSnap Plasma Kitiga (ülemine) ja QIAamp DNA Investigator Kitiga.B Viiuli graafik, mis näitab hemolümfi ccfDNA kontsentratsioonide (± SE) jaotust rannakarpides.Must ja punane joon tähistavad vastavalt mediaani ning esimest ja kolmandat kvartiili.
Ligikaudu 1% inimeste ja primaatide ccfDNA-st on võõrallikas [21, 37].Arvestades kahepoolmeliste poolavatud vereringesüsteemi, mikroobirikast merevett ja rannakarbi ccfDNA suurusjaotust, oletasime, et rannakarpide hemolümf ccfDNA võib sisaldada rikkalikku ja mitmekesist mikroobse DNA kogumit.Selle hüpoteesi testimiseks sekveneerisime Kergueleni saartelt kogutud Aulacomya atra proovidest hemolümfi ccfDNA, saades üle 10 miljoni lugemise, millest 97, 6% läbis kvaliteedikontrolli.Näidud klassifitseeriti seejärel vastavalt füüsilisest isikust ja mitte-ise allikatest, kasutades BLASTN ja NCBI kahepoolmeliste andmebaase (joonis S1, täiendav teave).
Inimestel võib vereringesse vabaneda nii tuuma- kui ka mitokondriaalne DNA [38].Käesolevas uuringus ei olnud aga võimalik rannakarpide tuumagenoomset DNA-d üksikasjalikult kirjeldada, kuna A. atra genoomi ei ole sekveneeritud ega kirjeldatud.Siiski suutsime kahepoolmelise raamatukogu abil tuvastada mitmeid meie enda päritolu ccfDNA fragmente (joonis S2, täiendav teave).Samuti kinnitasime oma päritolu DNA fragmentide olemasolu nende A. atra geenide suunatud PCR amplifikatsiooniga, mis järjestati (joonis 3).Samamoodi, arvestades, et A. atra mitokondriaalne genoom on kättesaadav avalikes andmebaasides, võib leida tõendeid mitokondriaalsete ccfDNA fragmentide olemasolu kohta A. atra hemolümfis.Mitokondriaalse DNA fragmentide olemasolu kinnitati PCR amplifikatsiooniga (joonis 3).
A. atra (punased täpid – laonumber: SRX5705969) ja M. platensise (sinised täpid – laonumber: SRX5705968) hemolümfis esinesid PCR-ga amplifitseeritud erinevad mitokondriaalsed geenid.Joonis on kohandatud Bretoni jt, 2011 B põhjal. A. atra hemolümfi supernatandi amplifitseerimine Säilitatud FTA paberil.Kasutage 3 mm stantsi, et lisada otse PCR-i segu sisaldavasse PCR-tuubi.
Arvestades merevee rikkalikku mikroobide sisaldust, keskendusime algselt hemolümfi mikroobsete DNA järjestuste iseloomustamisele.Selleks kasutame kahte erinevat strateegiat.Esimeses strateegias kasutati Kraken2, algoritmipõhist järjestuste klassifitseerimisprogrammi, mis suudab tuvastada mikroobijärjestusi täpsusega, mis on võrreldav BLAST-i ja muude tööriistadega [28].Rohkem kui 6719 lugemist leiti olevat bakteriaalse päritoluga, samas kui 124 ja 64 olid vastavalt arheatest ja viirustest (joonis 4).Kõige sagedamini esines bakterite DNA fragmente Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) ja Bacteroidetes (17%) (joonis 4a).See jaotus on kooskõlas varasemate merekarbi mikrobioomi uuringutega [39, 40].Gammaproteobakterid olid peamine proteobakterite klass (44%), sealhulgas paljud Vibrionales (joonis 4b).DdPCR meetod kinnitas Vibrio DNA fragmentide olemasolu A. atra hemolümfi ccfDNA-s (joonis 4c) [41].ccfDNA bakteriaalse päritolu kohta lisateabe saamiseks kasutati täiendavat lähenemisviisi (joonis S2, täiendav teave). Sel juhul koostati kattunud lugemised paarisotsa lugemisteks ja klassifitseeriti iseseisvateks (kahepoolmelisteks) või mitteiseloomulisteks, kasutades BLASTN-i ja e-väärtust 1e-3 ja piiri, mille homoloogia oli> 90%. Sel juhul koostati kattunud lugemised paarisotsa lugemisteks ja klassifitseeriti iseseisvateks (kahepoolmelisteks) või mitteiseloomulisteks, kasutades BLASTN-i ja e-väärtust 1e-3 ja piiri, mille homoloogia oli> 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классировафиц орчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечемия>90миолсгомейолсгеом. Sel juhul koguti kattuvad lugemised paarisotsaga lugemistena ja klassifitseeriti natiivseteks (kahepoolmelisteks) või mitteoriginaalseteks, kasutades BLASTN-i ja e väärtust 1e-3 ja piirväärtust > 90% homoloogiaga.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 梐和愚暄 姐 暄 倀 值值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使缍 用 使用 使用 使用 使用 使用 使用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицивстокдуны тые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гом>9 гомолога гом>9%. Sel juhul koguti kattuvad lugemised paarisotsaga lugemistena ja klassifitseeriti omadeks (kahepoolmelisteks) või mitteoriginaalseteks, kasutades e BLASTN ja 1e-3 väärtusi ning homoloogialäve> 90%.Kuna A. atra genoomi ei ole veel sekveneeritud, kasutasime MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) komplekteerija de novo kokkupanekustrateegiat.Kokku on 147 188 kontiigi identifitseeritud kui sõltuvad (kahepoolmelised) päritolu.Seejärel laiendati need kontiigid e-väärtustega 1e-10, kasutades BLASTN-i ja BLASTX-i.See strateegia võimaldas meil tuvastada A. atra ccfDNA-s 482 mittekahepoolmelist fragmenti.Üle poole (57%) neist DNA fragmentidest saadi bakteritelt, peamiselt lõpusesümbiontidelt, sealhulgas sulfotroofsetelt sümbiontidelt, ja lõpusümbiontidelt Solemya velum (joonis 5).
Suhteline arvukus tüübi tasandil.B Kahe peamise sugukonna (Firmicutes ja Proteobacteria) mikroobide mitmekesisus.ddPCR C Vibrio spp. tüüpiline amplifikatsioon.A. 16S rRNA geeni fragmendid (sinine) kolmes atra hemolümfis.
Kokku analüüsiti 482 kogutud kontiigi.Metagenoomsete kontig annotatsioonide (prokarüootid ja eukarüootid) taksonoomilise jaotuse üldprofiil.B BLASTN ja BLASTX poolt tuvastatud bakteriaalsete DNA fragmentide üksikasjalik jaotus.
Kraken2 analüüs näitas ka, et rannakarbi ccfDNA sisaldas arheaalseid DNA fragmente, sealhulgas Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ja Thaurmarcheota (11%) DNA fragmente (joonis 6a).Euryarchaeota ja Crenarchaeota päritolu DNA fragmentide olemasolu, mida varem leiti California rannakarpide mikroobikoosluses, ei tohiks olla üllatus [42].Kuigi Euryarchaeota seostatakse sageli äärmuslike tingimustega, on nüüdseks tunnistatud, et nii Euryarchaeota kui ka Crenarcheota on mere krüogeenses keskkonnas levinumate prokarüootide hulgas [43, 44].Metanogeensete mikroorganismide esinemine rannakarpides ei ole üllatav, arvestades hiljutisi teateid ulatuslikest metaanileketest Kergueleni platool [45] ja Kergueleni saarte ranniku lähedal täheldatud võimalikku mikroobse metaani tootmist [46].
Seejärel nihkus meie tähelepanu DNA viiruste näidudele.Meile teadaolevalt on see esimene sihtrühmaväline uuring rannakarpide viirusesisalduse kohta.Nagu oodatud, leidsime bakteriofaagide (Caudovirales) DNA fragmente (joonis 6b).Kõige tavalisem viiruse DNA pärineb aga nukleotsütoviiruste rühmast, mida tuntakse ka tuumatsütoplasmaatilise suure DNA viirusena (NCLDV), millel on kõigist viirustest suurim genoom.Selles varjupaigas kuulub enamik DNA järjestusi perekondadesse Mimimidoviridae (58%) ja Poxviridae (21%), mille looduslikud peremehed hõlmavad selgroogseid ja lülijalgseid, samas kui väike osa neist DNA järjestustest kuulub teadaolevatele viroloogilistele vetikatele.Nakatab mere eukarüootseid vetikaid.Järjestused saadi ka Pandora viirusest, mis on teadaolevatest viirusperekondadest suurima genoomi suurusega hiiglaslik viirus.Huvitav on see, et teadaolevalt viirusega nakatunud peremeesorganismide hulk, mis määrati hemolümfi ccfDNA sekveneerimisega, oli suhteliselt suur (joonis S3, täiendav teave).See hõlmab viirusi, mis nakatavad putukaid nagu Baculoviridae ja Iridoviridae, aga ka viirusi, mis nakatavad amööbe, vetikaid ja selgroogseid.Samuti leidsime järjestused, mis vastavad Pithovirus sibericumi genoomile.Pitoviirused (tuntud ka kui zombiviirused) eraldati esmakordselt 30 000 aasta vanusest igikeltsast Siberis [47].Seega on meie tulemused kooskõlas varasemate aruannetega, mis näitavad, et mitte kõik nende viiruste kaasaegsed liigid pole välja surnud [48] ja et need viirused võivad esineda kaugetes subarktilistes mereökosüsteemides.
Lõpuks katsetasime, kas leiame DNA fragmente teistelt mitmerakulistelt loomadelt.BLASTN ja BLASTX tuvastasid kokku 482 võõrkontiigi nt, nr ja RefSeq raamatukogudega (genoomne ja valk).Meie tulemused näitavad, et mitmerakuliste loomade ccfDNA võõrfragmentide hulgas on ülekaalus luude DNA (joonis 5).Samuti on leitud putukate ja teiste liikide DNA fragmente.Suhteliselt suur osa DNA fragmentidest on identifitseerimata, mis võib olla tingitud suure hulga mereliikide alaesindatusest genoomi andmebaasides võrreldes maismaaliikidega [49].
Käesolevas artiklis rakendame LB kontseptsiooni rannakarpide suhtes, väites, et hemolümfi ccfDNA võtete järjestamine võib anda ülevaate mere ranniku ökosüsteemide koostisest.Täpsemalt avastasime, et 1) rannakarbi hemolümf sisaldab suhteliselt suuri kontsentratsioone (mikrogrammitasemeid) suhteliselt suuri (~1-5 kb) ringlevaid DNA fragmente;2) need DNA fragmendid on nii sõltumatud kui ka mittesõltumatud 3) Nende DNA fragmentide võõrallikate hulgast leidsime bakteriaalset, arheaalset ja viiruslikku DNA-d, aga ka teiste hulkraksete loomade DNA-d;4) Nende võõraste ccfDNA fragmentide kuhjumine hemolümfis toimub kiiresti ja aitab kaasa rannakarpide sisemisele filtreerimisaktiivsusele.Kokkuvõttes näitab meie uuring, et LB kontseptsioon, mida seni on kasutatud peamiselt biomeditsiini valdkonnas, kodeerib rikkalikku, kuid seni uurimata teadmiste allikat, mida saab kasutada valvuriliikide ja nende keskkonna vastastikuse mõju paremaks mõistmiseks.
Lisaks primaatidele on ccfDNA isoleerimist täheldatud ka imetajatel, sealhulgas hiirtel, koertel, kassidel ja hobustel [50, 51, 52].Kuid meile teadaolevalt on meie uuring esimene, mis teatab ccfDNA tuvastamisest ja sekveneerimisest avatud ringlussüsteemiga mereliikides.See rannakarpide anatoomiline omadus ja filtreerimisvõime võivad vähemalt osaliselt selgitada ringlevate DNA fragmentide erinevat suurust võrreldes teiste liikidega.Inimestel on enamik veres ringlevaid DNA fragmente väikesed fragmendid, mille suurus on vahemikus 150 kuni 200 aluspaari.maksimaalse tipuga 167 aluspaari [34, 53].Väike, kuid oluline osa DNA fragmentidest on vahemikus 300 kuni 500 aluspaari ja umbes 5% on pikemad kui 900 aluspaari.[54].Sellise suurusjaotuse põhjuseks on asjaolu, et ccfDNA peamine allikas plasmas tekib rakusurma tagajärjel, kas rakusurma või ringlevate vereloomerakkude nekroosi tõttu tervetel inimestel või kasvajarakkude apoptoosi tõttu vähihaigetel (tuntud kui ringleva kasvaja DNA)., ctDNA).Rannakarpides leitud hemolümfi ccfDNA suurusjaotus oli vahemikus 1000 kuni 5000 aluspaari, mis viitab sellele, et rannakarpide ccfDNA-l on erinev päritolu.See on loogiline hüpotees, kuna rannakarpidel on poolavatud veresoonkond ja nad elavad mereveekeskkonnas, mis sisaldab suures kontsentratsioonis mikroobset genoomset DNA-d.Tegelikult on meie eksogeenset DNA-d kasutanud laboratoorsed katsed näidanud, et rannakarbid koguvad merevees DNA fragmente, vähemalt mõne tunni pärast lagunevad need pärast rakkude omastamist ja/või vabanevad ja/või säilitatakse erinevates organisatsioonides.Arvestades rakkude (nii prokarüootsed kui ka eukarüootsed) haruldust, vähendab intravalvulaarsete sektsioonide kasutamine nii omaallikatest kui ka välisallikatest pärineva ccfDNA kogust.Arvestades kahepoolmeliste kaasasündinud immuunsuse tähtsust ja tsirkuleerivate fagotsüütide suurt arvu, oletasime veel, et isegi võõras ccfDNA on rikastatud ringlevate fagotsüütidega, mis akumuleerivad võõr-DNA-d mikroorganismide ja/või rakujäätmete allaneelamisel.Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et kahepoolmeline hemolümf ccfDNA on ainulaadne molekulaarse teabe hoidla ja tugevdab nende staatust valvuri liigina.
Meie andmed näitavad, et bakteritest pärinevate hemolümfi ccfDNA fragmentide järjestamine ja analüüs võib anda võtmeteavet peremeesbakteriaalse taimestiku ja ümbritsevas mereökosüsteemis esinevate bakterite kohta.Sekveneerimismeetodid on paljastanud kommensaalsete bakterite A. atra gill järjestused, mis oleksid jäänud vahele, kui oleks kasutatud tavapäraseid 16S rRNA identifitseerimismeetodeid, mis on osaliselt tingitud võrdlusraamatukogu nihkest.Tegelikult näitas meie Kerguelenis samas rannakarbi kihis M. platensis kogutud LB andmete kasutamine, et lõpustega seotud bakterite sümbiontide koostis oli mõlema rannakarbi liigi puhul sama (joonis S4, täiendav teave).See kahe geneetiliselt erineva rannakarbi sarnasus võib peegeldada Kergueleni külma, väävlisisaldusega ja vulkaaniliste lademete bakterikoosluste koostist [55, 56, 57, 58].Väävlisisaldust redutseerivate mikroorganismide kõrgemat taset on hästi kirjeldatud rannakarpide korjamisel bioturbeeritud rannikualadelt [59], näiteks Port-au-France'i rannikult.Teine võimalus on, et horisontaalne ülekanne võib mõjutada rannakarpide taimestikku [60, 61].Merekeskkonna, merepõhja pinna ja rannakarpide sümbiootiliste bakterite koostise vahelise seose kindlakstegemiseks on vaja rohkem uuringuid.Need uuringud on praegu käimas.
Hemolümfi ccfDNA pikkus ja kontsentratsioon, selle puhastamise lihtsus ja kõrge kvaliteet, mis võimaldab kiiret haavliga järjestamist, on mõned rannakarbi ccfDNA kasutamise paljudest eelistest mere rannikuökosüsteemide bioloogilise mitmekesisuse hindamisel.See lähenemine on eriti tõhus viiruskoosluste (viroomide) iseloomustamiseks antud ökosüsteemis [62, 63].Erinevalt bakteritest, arheadest ja eukarüootidest ei sisalda viiruse genoomid fülogeneetiliselt konserveerunud geene, näiteks 16S järjestusi.Meie tulemused näitavad, et indikaatorliikide, nagu rannakarbid, vedelaid biopsiaid saab kasutada suhteliselt suure hulga ccfDNA viiruse fragmentide tuvastamiseks, mis teadaolevalt nakatavad peremeesorganisme, kes tavaliselt elavad rannikumere ökosüsteemides.See hõlmab viiruseid, mis teadaolevalt nakatavad algloomi, lülijalgseid, putukaid, taimi ja bakteriaalseid viiruseid (nt bakteriofaage).Sarnane jaotus leiti ka siis, kui uurisime Kerguelenis samasse rannakarbi kihti kogutud sinikarpide (M. platensis) hemolümfi ccfDNA viroomi (tabel S2, lisateave).ccfDNA haavliga järjestamine on tõepoolest uus lähenemisviis, mis kogub hoogu inimeste või teiste liikide viroomi uurimisel [21, 37, 64].See lähenemisviis on eriti kasulik kaheahelaliste DNA viiruste uurimiseks, kuna kõigi kaheahelaliste DNA viiruste hulgas ei ole säilinud ühtegi geeni, mis esindab Baltimore'i kõige mitmekesisemat ja laiemat viiruste klassi [65].Kuigi enamik neist viirustest jääb klassifitseerimata ja võivad sisaldada viiruseid viirusmaailma täiesti tundmatust osast [66], leidsime, et rannakarpide A. atra ja M. platensis viroomid ja peremeesorganismide levila jäävad kahe liigi vahele.sarnaselt (vt joonis S3, lisateave).See sarnasus ei ole üllatav, kuna see võib kajastada selektiivsuse puudumist keskkonnas oleva DNA omastamisel.RNA viroomi iseloomustamiseks on praegu vaja tulevasi uuringuid puhastatud RNA-ga.
Oma uuringus kasutasime Kowarski ja kolleegide [37] töö põhjal kohandatud väga ranget torujuhet, kes kasutasid ühendatud lugemiste ja kontiigide kaheastmelist kustutamist enne ja pärast natiivse ccfDNA kokkupanekut, mille tulemuseks oli suur osa kaardistamata lugemisi.Seetõttu ei saa me välistada, et mõnel neist kaardistamata lugemistest võib siiski olla oma päritolu, peamiselt seetõttu, et meil pole selle rannakarbi liigi võrdlusgenoomi.Kasutasime seda torujuhet ka seetõttu, et tundsime muret oma- ja mitteiselugemise vaheliste kimääride ja Illumina MiSeq PE75 loodud lugemispikkuste pärast.Enamiku kaardistamata näitude teine ​​põhjus on see, et suur osa meremikroobidest, eriti kaugetes piirkondades, nagu Kerguelen, on märkimata.Kasutasime Illumina MiSeq PE75, eeldades, et ccfDNA fragmendi pikkused on sarnased inimese ccfDNA-ga.Arvestades meie tulemusi, mis näitavad, et hemolümfi ccfDNA-l on pikem lugemine kui inimestel ja/või imetajatel, soovitame tulevaste uuringute jaoks kasutada pikemate ccfDNA fragmentide jaoks sobivamat sekveneerimisplatvormi.See tava muudab sügavama analüüsi jaoks rohkemate näidustuste leidmise palju lihtsamaks.Hetkel kättesaamatu täieliku A. atra tuumagenoomi järjestuse saamine hõlbustaks oluliselt ka ccfDNA eristamist oma- ja mitteomaallikatest.Arvestades, et meie uurimistöö on keskendunud vedela biopsia kontseptsiooni rakendamise võimalusele rannakarpide puhul, loodame, et kuna seda kontseptsiooni kasutatakse edaspidistes uuringutes, töötatakse välja uued vahendid ja torujuhtmed, et suurendada selle meetodi potentsiaali rannakarpide mikroobide mitmekesisuse uurimiseks.mere ökosüsteem.
Mitteinvasiivse kliinilise biomarkerina seostatakse ccfDNA kõrgenenud taset inimese plasmas erinevate haiguste, koekahjustuste ja stressitingimustega [67,68,69].See tõus on seotud oma päritolu DNA fragmentide vabanemisega pärast koekahjustust.Me käsitlesime seda probleemi ägeda kuumastressi abil, kus rannakarbid puutusid lühiajaliselt kokku 30 °C temperatuuriga.Tegime selle analüüsi kolme erinevat tüüpi rannakarpidega kolmes sõltumatus katses.Kuid me ei leidnud pärast ägedat kuumastressi ccfDNA tasemetes mingeid muutusi (vt joonis S5, lisateave).See avastus võib vähemalt osaliselt seletada tõsiasja, et rannakarpidel on poolavatud vereringesüsteem ja nende kõrge filtreerimisaktiivsuse tõttu akumuleeruvad suured kogused võõr-DNA-d.Teisest küljest võivad rannakarbid, nagu paljud selgrootud, olla stressist põhjustatud koekahjustuste suhtes vastupidavamad, piirates seeläbi ccfDNA vabanemist nende hemolümfis [70, 71].
Seni on veeökosüsteemide bioloogilise mitmekesisuse DNA analüüs keskendunud peamiselt keskkonna DNA (eDNA) metabarkodeerimisele.Kuid praimerite kasutamisel on see meetod bioloogilise mitmekesisuse analüüsis tavaliselt piiratud.Püssi järjestuse kasutamine väldib PCR-i piiranguid ja praimerite komplektide kallutatud valikut.Seega on meie meetod mõnes mõttes lähemal hiljuti kasutusel olnud suure läbilaskevõimega eDNA Shotgun sekveneerimismeetodile, mis suudab fragmenteeritud DNA-d vahetult järjestada ja analüüsida peaaegu kõiki organisme [72, 73].Siiski on mitmeid põhiprobleeme, mis eristavad LB-d standardsetest eDNA-meetoditest.Loomulikult on peamine erinevus eDNA ja LB vahel looduslike filtri hostide kasutamine.On teatatud mereliikide, nagu käsnad ja kahepoolmelised (Dresseina spp.) kasutamisest loodusliku filtrina eDNA uurimiseks [74, 75].Dreissena uuringus kasutati aga koebiopsiaid, millest eraldati DNA.LB-st pärineva ccfDNA analüüs ei nõua koe biopsiat, spetsiaalset ja mõnikord kallist varustust ja eDNA või koe biopsiaga seotud logistikat.Tegelikult teatasime hiljuti, et LB-st pärit ccfDNA-d saab FTA toega salvestada ja analüüsida ilma külmaahelat säilitamata, mis on kaugemates piirkondades tehtava uurimistöö jaoks suur väljakutse [76].Ka ccfDNA ekstraheerimine vedelatest biopsiatest on lihtne ja annab kvaliteetse DNA haavli järjestamiseks ja PCR analüüsiks.See on suur eelis, arvestades mõningaid eDNA analüüsiga seotud tehnilisi piiranguid [77].Proovivõtumeetodi lihtsus ja odav hind sobib eriti hästi ka pikaajaliste seireprogrammide jaoks.Lisaks kõrgele filtreerimisvõimele on kahepoolmeliste teine ​​hästi tuntud omadus nende lima keemiline mukopolüsahhariidne koostis, mis soodustab viiruste imendumist [78, 79].See muudab kahepoolmelised ideaalseks looduslikuks filtriks bioloogilise mitmekesisuse ja kliimamuutuste mõju iseloomustamiseks antud veeökosüsteemis.Kuigi peremeesorganismist pärinevate DNA fragmentide olemasolu võib vaadelda meetodi piiranguna võrreldes eDNA-ga, on sellise natiivse ccfDNA omamisega seotud kulud võrreldes eDNA-ga samaaegselt arusaadavad terviseuuringute jaoks saadaoleva suure hulga teabe jaoks.offset host.See hõlmab peremeesorganismi genoomi integreeritud viirusjärjestuste olemasolu.See on eriti oluline rannakarpide puhul, arvestades horisontaalselt levivate leukeemiliste retroviiruste esinemist kahepoolmelistel [80, 81].LB teine ​​eelis eDNA ees on see, et see kasutab ära hemolümfis ringlevate vererakkude fagotsüütilist aktiivsust, mis neelab mikroorganisme (ja nende genoome).Kahepoolmeliste vererakkude peamine funktsioon on fagotsütoos [82].Lõpuks kasutab meetod ära rannakarpide suurt filtreerimisvõimet (keskmiselt 1,5 l/h merevett) ja kahepäevast tsirkulatsiooni, mis suurendavad erinevate mereveekihtide segunemist, võimaldades püüda kinni heteroloogse eDNA.[83, 84].Seega on rannakarpide ccfDNA analüüs huvitav viis, arvestades rannakarpide toitumis-, majandus- ja keskkonnamõjusid.Sarnaselt inimestelt kogutud LB analüüsiga avab see meetod ka võimaluse mõõta peremees-DNA geneetilisi ja epigeneetilisi muutusi vastusena eksogeensetele ainetele.Näiteks võib ette näha kolmanda põlvkonna sekveneerimistehnoloogiad, mis viivad läbi genoomi hõlmava metüülimise analüüsi natiivses ccfDNA-s, kasutades nanopooride sekveneerimist.Seda protsessi peaks hõlbustama asjaolu, et rannakarbi ccfDNA fragmentide pikkus ühildub ideaalselt kaualoetavate sekveneerimisplatvormidega, mis võimaldavad kogu genoomi hõlmavat DNA metüülimise analüüsi ühest sekveneerimisest ilma keemiliste transformatsioonideta.85,86] See on huvitav võimalus, kuna on näidatud, et DNA metüülimise mustrid peegeldavad vastust paljudele keskkonnastressidele.Seetõttu võib see anda väärtusliku ülevaate aluseks olevatest mehhanismidest, mis reguleerivad reageerimist pärast kokkupuudet kliimamuutuste või saasteainetega [87].LB kasutamine ei ole aga piiranguteta.Ütlematagi selge, et see eeldab indikaatorliikide olemasolu ökosüsteemis.Nagu eespool mainitud, nõuab LB kasutamine antud ökosüsteemi bioloogilise mitmekesisuse hindamiseks ka ranget bioinformaatika torustikku, mis võtab arvesse allikast pärit DNA fragmentide olemasolu.Teine suur probleem on mereliikide võrdlusgenoomide kättesaadavus.Loodetakse, et sellised algatused nagu Marine Mammal Genomes Project ja hiljuti loodud Fish10k projekt [88] hõlbustavad sellist analüüsi tulevikus.LB kontseptsiooni rakendamine merefiltritest toituvatele organismidele ühildub ka järjestustehnoloogia uusimate edusammudega, mistõttu sobib see hästi mitmeoomiliste biomarkerite väljatöötamiseks, et pakkuda olulist teavet mereelupaikade tervise kohta vastuseks keskkonnastressile.
Genoomi sekveneerimise andmed on talletatud NCBI järjestuste lugemise arhiivi https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 jaotises Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Kliimamuutuste mõju mereelustikule ja ökosüsteemidele.Cole'i ​​bioloogia.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S jt.Mõelge kliimamuutuste ja muude kohalike stressitegurite koosmõjule merekeskkonnale.üldine teaduskeskkond.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P jt.).Esimese märtsi teadus.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Vähendatud kuumataluvus korduva kuumastressi tingimustes seletab sinikarplaste suurt suvist suremust.Teaduslik aruanne 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER jt.Hiljutised muutused loomade surmade sageduses, põhjustes ja ulatuses.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S jt.Pinna nobilise massilist suremust võisid põhjustada mitmed mitteliigispetsiifilised patogeenid.Elu.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Kliimamuutuste võimalik mõju Arktika zoonootilistele haigustele.Int J Circumpolaarne tervis.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. jt.Sinikarbid (Mytilus edulis spp.) signaalorganismidena rannikureostuse seires: ülevaade.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Vedeliku biopsia integreerimine vähiravis.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C jt.Vedela biopsia küpsemine: võimaldab kasvaja DNA-l ringelda.Nat Rev Vähk.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleiinhapped inimese plasmas.Soc Biol tütarettevõtete koosolekute protokollid.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rakuvaba DNA uus roll vähiravi molekulaarse markerina.Biomolaarse analüüsi kvantifitseerimine.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vedelbiopsia siseneb kliinikusse – juurutamise probleemid ja tulevikuväljakutsed.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW jt.Loote DNA esineb ema plasmas ja seerumis.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Raseduse kulgemise ja selle tüsistuste uuring, kasutades tsirkuleerivat rakuvälist RNA-d naiste veres raseduse ajal.Dopediaatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J jt.Vedel biopsia: doonorrakuvaba DNA-d kasutatakse allogeensete kahjustuste tuvastamiseks neerutransplantaadis.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Uuendused sünnieelses diagnostikas: ema plasma genoomi järjestamine.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D jt.Kiire patogeeni tuvastamine nakatunud kehavedelike järgmise põlvkonna metagenoomilise järjestamisega.Nat Meditsiin.2021;27:115-24.