Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Lindude viljakus sõltub nende võimest säilitada spermatosoidide säilitustorukestes (SST) pikema aja jooksul piisavalt elujõulisi spermatosoide. Täpne mehhanism, mille abil spermatosoidid SST-sse sisenevad, seal viibivad ja sealt lahkuvad, on endiselt vaieldav. Sharkasi kanade sperma näitas suurt kalduvust aglutinatsioonile, moodustades liikuvaid niitjaid kimpe, mis sisaldasid palju rakke. Kuna spermatosoidide liikuvust ja käitumist on läbipaistmatus munajuhas keeruline jälgida, kasutasime spermatosoidide aglutinatsiooni ja liikuvuse uurimiseks mikrofluidilist seadet, mille mikrokanali ristlõige on sarnane spermatosoidide omaga. Käesolevas uuringus käsitletakse, kuidas spermatosoidide kimbud moodustuvad, kuidas nad liiguvad ja kuidas nad võivad osaleda spermatosoidide viibimise pikendamisel SST-s. Uurisime sperma kiirust ja reoloogilist käitumist, kui vedelikuvool tekitati mikrofluidilise kanali sees hüdrostaatilise rõhu abil (voolukiirus = 33 µm/s). Spermatosoidid kipuvad ujuma voolu vastu (positiivne reoloogia) ja spermatosoidide kimbu kiirus on oluliselt väiksem võrreldes üksikute spermatosoididega. On täheldatud, et spermatosoidide kimbud liiguvad spiraalselt ning nende pikkus ja paksus suurenevad, kui värbatakse rohkem üksikuid spermatosoide. Täheldati spermatosoidide kimpude lähenemist ja kleepumist mikrofluidkanalite külgseintele, et vältida vedeliku voolukiiruse > 33 µm/s läbitungimist. Täheldati spermatosoidide kimpude lähenemist ja kleepumist mikrofluidkanalite külgseintele, et vältida vedeliku voolukiiruse > 33 µm/s läbitungimist. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюиканачтов, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. On täheldatud, et spermatosoidide kimbud lähenevad ja kleepuvad mikrofluidkanalite külgseintele, et vältida vedeliku voolukiirusel >33 µm/s minema uhtumist.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 流µm/s> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкатостного, избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. On täheldatud, et spermatosoidide kimbud lähenevad mikrofluidkanali külgseintele ja kleepuvad nende külge, et vältida vedelikuvoolu poolt kiirusel >33 µm/s minema pühkimist.Skaneeriv ja transmissioon-elektronmikroskoopia näitas, et spermatosoidide kimbud olid kaetud rohke tiheda materjaliga. Saadud andmed näitavad Sharkazi kanade spermatosoidide ainulaadset liikuvust, samuti spermatosoidide võimet aglutineerida ja moodustada liikuvaid kimpe, mis aitab paremini mõista spermatosoidide pikaajalist säilitamist SMT-s.
Inimeste ja enamiku loomade viljastumiseks peavad sperma ja munarakud jõudma viljastumiskohta õigel ajal. Seetõttu peab paaritumine toimuma enne ovulatsiooni või selle ajal. Teisest küljest säilitavad mõned imetajad, näiteks koerad, aga ka mitteimetajatest liigid, näiteks putukad, kalad, roomajad ja linnud spermat oma suguelundites pikema aja jooksul, kuni nende munarakud on viljastamiseks valmis (asünkroonne viljastumine1). Linnud suudavad säilitada munarakke viljastavate spermatosoidide elujõulisust 2–10 nädalat2.
See on ainulaadne omadus, mis eristab linde teistest loomadest, kuna see tagab suure viljastumise tõenäosuse pärast ühekordset seemendamist mitme nädala jooksul ilma samaaegse paaritumise ja ovulatsioonita. Peamine sperma säilitamise organ, mida nimetatakse spermatosoidide säilitustuubuliks (SST), asub emaka ja tupe ühenduskoha sisemistes limaskesta voldides. Praeguseks ei ole täielikult mõistetud mehhanisme, mille abil spermatosoidid spermapanka sisenevad, seal viibivad ja sealt väljuvad. Varasemate uuringute põhjal on esitatud palju hüpoteese, kuid ükski neist pole kinnitust leidnud.
Forman4 püstitas hüpoteesi, et spermatosoidid säilitavad oma viibimise SST õõnsuses pideva võnkuva liikumise kaudu vedeliku voolu suuna vastu SST epiteelirakkudel asuvate valgukanalite kaudu (reoloogia). ATP ammendub pideva flagellaarse aktiivsuse tõttu, mis on vajalik spermatosoidide SST valendikus hoidmiseks, ja liikuvus lõpuks väheneb, kuni spermatosoidid viiakse spermapangast välja vedelikuvoolu abil ja alustavad uut teekonda mööda ülestõusvat munajuha spermatosoidide viljastamiseks. Munarakk (Forman4). Seda sperma säilitamise mudelit toetab SST epiteelirakkudes esinevate akvaporiinide 2, 3 ja 9 tuvastamine immunotsütokeemia abil. Praeguseks puuduvad uuringud kanade sperma reoloogia ja selle rolli kohta SST säilitamisel, vaginaalse sperma valikul ja sperma konkurentsis. Kanadel siseneb sperma tuppe pärast loomulikku paaritumist, kuid üle 80% spermatosoididest väljutatakse tupest varsti pärast paaritumist. See viitab sellele, et tupp on lindude sperma valiku peamine koht. Lisaks on teatatud, et vähem kui 1% tupes viljastatud spermatosoididest satub SST-desse2. Tibude kunstlikul seemendamisel tupes kipub SST-sse jõudvate spermatosoidide arv 24 tundi pärast seemendamist suurenema. Seni on spermatosoidide valiku mehhanism selle protsessi ajal ebaselge ja spermatosoidide liikuvus võib mängida olulist rolli SST spermatosoidide omastamisel. Munajuhade paksude ja läbipaistmatute seinte tõttu on lindude munajuhades spermatosoidide liikuvust keeruline otseselt jälgida. Seetõttu puuduvad meil põhiteadmised sellest, kuidas spermatosoidid pärast viljastamist SST-sse lähevad.
Reoloogiat on hiljuti tunnustatud kui olulist tegurit, mis kontrollib sperma transporti imetajate suguelundites. Lähtudes liikuvate spermatosoidide võimest migreeruda vastuvoolu, kasutasid Zaferani jt8 Corra mikrofluidilist süsteemi liikuvate spermatosoidide passiivseks isoleerimiseks aedikutest spermaproovidest. Seda tüüpi sperma sorteerimine on oluline meditsiinilise viljatuse ravi ja kliiniliste uuringute jaoks ning seda eelistatakse traditsioonilistele meetoditele, mis on aja- ja töömahukad ning võivad kahjustada sperma morfoloogiat ja struktuuri terviklikkust. Siiski pole seni läbi viidud uuringuid kanade suguelundite eritiste mõju kohta sperma liikuvusele.
Olenemata mehhanismist, mis hoiab spermatosoidid SST-s säilinud, on paljud uurijad täheldanud, et residentsed spermatosoidid aglutineeruvad kanade 9, 10, vuttide 2 ja kalkunite 11 SST-s pea-pea vastu, moodustades aglutineeritud spermatosoidide kimpe. Autorid pakuvad välja seose selle aglutinatsiooni ja spermatosoidide pikaajalise SST-s säilitamise vahel.
Tingari ja Lake12 teatasid tugevast seosest kana spermatosoidide vastuvõtunäärmes olevate spermatosoidide vahel ning seadsid kahtluse alla, kas lindude spermatosoidid aglutineeruvad samamoodi nagu imetajate spermatosoidid. Nad usuvad, et sügavad ühendused spermatosoidide vahel seemnejuhas võivad olla tingitud stressist, mis on põhjustatud suure hulga spermatosoidide olemasolust väikeses ruumis.
Spermatosoidide käitumise hindamisel värsketel rippuvatel klaasplaatidel võib näha mööduvaid aglutinatsiooni märke, eriti spermatilkade servades. Aglutinatsiooni häiris aga sageli pideva liikumisega seotud pöörlemine, mis selgitab selle nähtuse mööduvat olemust. Teadlased märkasid ka, et lahjendi lisamisel spermale tekkisid piklikud „niiditaolised“ rakkude agregaadid.
Varased katsed spermatosoidi imiteerida tehti rippuvast tilgast õhukese traadi eemaldamisega, mille tulemusel tekkis spermatilgast väljaulatuv piklik spermataoline vesiikul. Spermatosoidid rivistusid koheselt vesiikulis paralleelselt, kuid 3D-piirangu tõttu kadus kogu üksus kiiresti. Seetõttu on spermatosoidide aglutinatsiooni uurimiseks vaja jälgida spermatosoidide liikuvust ja käitumist otse isoleeritud spermatosoidide säilitustuubulites, mida on raske saavutada. Seetõttu on vaja välja töötada instrument, mis jäljendab spermatosoide, et toetada spermatosoidide liikuvuse ja aglutinatsioonikäitumise uuringuid. Brillard jt13 teatasid, et täiskasvanud tibude spermatosoidide säilitustuubulite keskmine pikkus on 400–600 µm, kuid mõned SST-d võivad olla kuni 2000 µm pikad. Mero ja Ogasawara14 jagasid seemnenäärmed suurenenud ja mittesuurenenud spermatosoidide säilitustuubuliteks, mis mõlemad olid sama pikkuse (~500 µm) ja kaela laiuse (~38 µm) poolest, kuid tuubulite keskmine valendiku läbimõõt oli vastavalt 56,6 ja 56,6 µm, st 11,2 μm. Käesolevas uuringus kasutasime mikrofluidilist seadet kanali suurusega 200 µm × 20 µm (L × K), mille ristlõige on mõnevõrra lähedane amplifitseeritud SST omale. Lisaks uurisime spermatosoidide liikuvust ja aglutinatsioonikäitumist voolavas vedelikus, mis on kooskõlas Foremani hüpoteesiga, et SST epiteelirakkude poolt toodetud vedelik hoiab spermatosoide valendikus vastuvoolu (reoloogilises) suunas.
Selle uuringu eesmärk oli ületada munajuhas spermatosoidide liikuvuse jälgimise probleemid ning vältida raskusi spermatosoidide reoloogia ja käitumise uurimisel dünaamilises keskkonnas. Kasutati mikrofluidilist seadet, mis loob hüdrostaatilise rõhu, et simuleerida spermatosoidide liikuvust kana suguelundites.
Kui mikrokanaliseadmesse laaditi tilk lahjendatud spermaproovi (1:40), oli võimalik tuvastada kahte tüüpi spermatosoidide liikuvust (isoleeritud spermatosoidid ja seotud spermatosoidid). Lisaks kaldusid spermatosoidid voolu vastu ujuma (positiivne reoloogia; video 1, 2). Kuigi spermatosoidide kimpude kiirus oli madalam kui üksikute spermatosoidide oma (p < 0,001), suurendasid need positiivse reotaksisega spermatosoidide protsenti (p < 0,001; tabel 2). Kuigi spermatosoidide kimpude kiirus oli madalam kui üksikute spermatosoidide oma (p < 0,001), suurendasid need positiivse reotaksisega spermatosoidide protsenti (p < 0,001; tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,0001), ловичув процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Kuigi spermatosoidide kimpude kiirus oli madalam kui üksikute spermatosoidide oma (p < 0,001), suurendasid need positiivse reotaksisega spermatosoidide protsenti (p < 0,001; tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 浵 吟 昧 显珧 阳 速度 （p <0,001）百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они уверматозоидов сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Kuigi spermatosoidide kimpude liikumiskiirus oli madalam kui üksikutel spermatosoididel (p < 0,001), suurendasid need positiivse reoloogiaga spermatosoidide osakaalu (p < 0,001; tabel 2).Üksikute spermatosoidide ja tupsude positiivne reoloogia on hinnanguliselt vastavalt ligikaudu 53% ja 85%.
On täheldatud, et sharkasi kanade spermatosoidid moodustavad kohe pärast ejakulatsiooni lineaarseid kimpe, mis koosnevad kümnetest isenditest. Need tupsud aja jooksul pikkuse ja paksuse poolest suurenevad ning võivad in vitro püsida mitu tundi enne hajumist (video 3). Need niitjad kimbud on ehhidna spermatosoidide kujuga, mis moodustuvad munandimanuse lõpus. Sharkashi kanade spermal on leitud suur kalduvus aglutineeruda ja moodustada võrgustikuline kimp vähem kui minuti jooksul pärast kogumist. Need kiired on dünaamilised ja suudavad kleepuda lähedalasuvate seinte või staatiliste objektide külge. Kuigi spermatosoidide kimbud vähendavad spermatosoidide kiirust, on selge, et makroskoopiliselt suurendavad nad nende lineaarsust. Kimpide pikkus varieerub sõltuvalt kimpudesse kogutud spermatosoidide arvust. Isoleeriti kaks kimbu osa: algosa, mis hõlmas aglutineerunud sperma vaba pead, ja terminaalne osa, mis hõlmas saba ja kogu sperma distaalset otsa. Kiire kaamera (950 kaadrit sekundis) abil täheldati kimbu algosas aglutineerunud spermatosoidide vabu päid, mis vastutavad kimbu liikumise eest oma võnkuva liikumise tõttu, lohistades ülejäänud päid spiraalse liikumisega kimbu sisse (Video 4). Pikkade tupsude puhul on aga täheldatud, et mõned vabad spermatosoidide pead on kleepunud keha külge ja tupsu otsmine osa toimib labadena, mis aitavad tupsu edasi liikuda.
Aeglases vedelikuvoolus liiguvad seemnerakkude kimbud üksteisega paralleelselt, kuid hakkavad siiski kattuma ja kleepuma kõige paigalseisva külge, et voolukiiruse suurenedes vool neid minema ei uhuks. Kimbud tekivad siis, kui peotäis seemnerakke läheneb teineteisele, hakkab sünkroonselt liikuma ja mässib end üksteise ümber ning seejärel kleepuva aine külge kleepuma. Joonistel 1 ja 2 on näidatud, kuidas seemnerakud lähenevad teineteisele, moodustades sabade üksteise ümber mässimisel ühenduskoha.
Teadlased rakendasid sperma reoloogia uurimiseks mikrokanalis vedelikuvoolu tekitamiseks hüdrostaatilist rõhku. Kasutati mikrokanalit, mille mõõtmed olid 200 µm × 20 µm (L × K) ja pikkus 3,6 µm. Kasutati mikrokanaleid anumate vahel, mille otstesse olid kinnitatud süstlad. Kanalite nähtavamaks muutmiseks kasutati toiduvärvi.
Kinnitage ühenduskaablid ja tarvikud seina külge. Video filmiti faasikontrastmikroskoobiga. Iga pildiga on näha faasikontrastmikroskoopia ja kaardistuspildid. (A) Kahe voolu vaheline ühendus takistab voolu spiraalse liikumise tõttu (punane nool). (B) Torukimbu ja kanali seina vaheline ühendus (punased nooled), samal ajal kui need on ühendatud kahe teise kimbuga (kollased nooled). (C) Mikrofluidikanalis olevad spermatosoidide kimbud hakkavad üksteisega ühenduma (punased nooled), moodustades spermatosoidide kimpude võrgustiku. (D) Spermatozoonide kimpude võrgustiku moodustumine.
Kui mikrofluidseadmesse laaditi lahjendatud sperma tilk ja tekitati vool, täheldati, et spermakiir liigub voolu suunale vastupidises suunas. Kimbud sobivad tihedalt mikrokanalite seinte vastu ja kimpude algosa vabad pead sobivad tihedalt nende vastu (video 5). Samuti kleepuvad nad oma teel olevate paigalseisvate osakeste, näiteks prahi külge, et voolu poolt minema pühkimine takistada. Aja jooksul muutuvad need tupsud pikkadeks niitideks, mis püüavad kinni teisi üksikuid spermatosoide ja lühemaid tupsusid (video 6). Kui vool hakkab aeglustuma, hakkavad pikad spermaread moodustama spermaliinide võrgustikku (video 7; joonis 2).
Suure voolukiiruse (V > 33 µm/s) korral suureneb niitide spiraalne liikumine, et püüda kinni paljusid üksikuid spermatosoidide kimpe, mis moodustavad paremini vastupanu voolu triivimisjõule. Suure voolukiiruse (V > 33 µm/s) korral suureneb niitide spiraalne liikumine, et püüda kinni paljusid üksikuid spermatosoidide kimpe, mis moodustavad paremini vastupanu voolu triivimisjõule. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Suure voolukiiruse korral (V > 33 µm/s) suureneb kiudude spiraalne liikumine, kuna nad püüavad kinni püüda paljusid üksikuid spermatosoide, moodustades kimpe, mis suudavad paremini vastu seista voolu triivimisjõule.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 箭多 形成 束 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить мононыжесть захватить сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Suure voolukiiruse korral (V > 33 µm/s) suureneb filamentide spiraalne liikumine, püüdes püüda kinni paljusid üksikuid spermatosoide, moodustades kimpe, et paremini vastu seista voolu triivijõududele.Samuti proovisid nad külgseintele mikrokanaleid kinnitada.
Valgusmikroskoopia (LM) abil identifitseeriti spermatosoidide kimbud spermatosoidide peade ja kõverdunud sabade kobaratena. Erinevate agregaatidega spermatosoidide kimpe on identifitseeritud ka keerdunud peadena ja flagellaarsete agregaatidena, mitmete sulandunud spermatosoidide sabadena, saba külge kinnitunud spermatosoidide peadena ja mitmete sulandunud tuumadega paindunud tuumadega spermatosoidide peadena. Läbilaskev elektronmikroskoopia (TEM). Skanneeriv elektronmikroskoopia (SEM) näitas, et spermatosoidide kimbud olid spermatosoidide peade kattega agregaadid ja spermatosoidide agregaatidel oli näha kinnitunud keerdunud sabade võrgustik.
Spermatosoidide morfoloogiat ja ultrastruktuuri, spermatosoidide kimpude moodustumist uuriti valgusmikroskoopia (poollõige), skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) ja transmissioon-elektronmikroskoopia (TEM) abil, spermatosoidide määrdproovid värviti akridiinoranžiga ja uuriti epifluorestsentsmikroskoopia abil.
Spermaäige värvimine akridiinoranžiga (joonis 3B) näitas, et seemnerakkude pead olid kokku kleepunud ja kaetud sekretoorse materjaliga, mis viis suurte tupsude moodustumiseni (joonis 3D). Spermakimbud koosnesid seemnerakkude agregaatidest, millel oli kinnitunud sabade võrgustik (joonis 4A-C). Spermakimbud koosnevad paljude seemnerakkude kokkukleepunud sabadest (joonis 4D). Spermakimpude päid katsid eritised (joonis 4E, F).
Spermatosoidide kimbu moodustumine Faasikontrastmikroskoopia ja akridiinoranžiga värvitud spermatosoidide määrdumise abil selgus, et spermatosoidide pead kleepuvad kokku. (A) Varajane spermatosoidide tupsude moodustumine algab ühest seemnerakust (valge ring) ja kolmest seemnerakust (kollane ring), spiraal algab sabast ja lõpeb peas. (B) Akridinoranžiga värvitud spermatosoidide määrdumise mikrofoto, mis näitab kleepunud seemnerakkude päid (nooled). Eritis katab pead/päid. Suurendus × 1000. (C) Mikrofluidikanalis vooluga transporditava suure kiire teke (kasutades kiirkaamerat kiirusel 950 kaadrit sekundis). (D) Akridinoranžiga värvitud spermatosoidide määrdumise mikrofoto, mis näitab suuri tupsusid (nooled). Suurendus: × 200.
Sperma kiire ja akridiinoranžiga värvitud sperma määrdumise skaneeriv elektronmikroskooppilt. (A, B, D, E) on spermatosoidide digitaalsed värvilised skaneerivad elektronmikroskoobi pildid ning C ja F on akridiinoranžiga värvitud sperma määrdumise mikrofotod, mis näitavad mitme spermatosoidi kinnitumist saba ümber. (AC) Sperma agregaadid on näidatud kinnitunud sabade võrgustikuna (nooled). (D) Mitme spermatosoidi (kleepuva ainega, roosa kontuur, nool) adhesioon saba ümber. (E ja F) Sperma pea agregaadid (osutajad), mis on kaetud kleepuva materjaliga (osutajad). Spermatosoidid moodustasid kimpe mitme keerisesarnase struktuuriga (F). (C) ×400 ja (F) ×200 suurendused.
Transmissioon-elektronmikroskoopia abil leidsime, et seemnerakkude kimpudel olid kinnitunud sabad (joonis 6A, C), sabade külge kinnitatud pead (joonis 6B) või sabade külge kinnitatud pead (joonis 6D). Kimbus olevate spermatosoidide pead on kõverad, lõikel on näha kaks tuumapiirkonda (joonis 6D). Sisselõikekimpus oli spermatosoididel keerdunud pea kahe tuumapiirkonna ja mitme flagellaarse piirkonnaga (joonis 5A).
Digitaalne värviline elektronmikroskooppilt, mis näitab seemneraku kimbu ühendussabasid ja seemnerakupäid ühendavat aglutineerivat materjali. (A) Suure hulga seemneraku kinnitunud saba. Pange tähele, kuidas saba näeb välja nii portree- (nool) kui ka horisontaalprojektsioonis (nool). (B) Sperma pea (nool) on sabaga ühendatud (nool). (C) Mitmed seemneraku sabad (nooled) on kinnitunud. (D) Aglutineeriv materjal (AS, sinine) ühendab nelja seemnerakupead (lilla).
Spermapeade tuvastamiseks eritiste või membraanidega kaetud spermakimpudes kasutati skaneerivat elektronmikroskoopiat (joonis 6B), mis näitas, et spermakimbud olid ankurdatud rakuvälise materjaliga. Aglutineerunud materjal oli kontsentreerunud spermapeasse (meduusapea-taoline kooslus; joonis 5B) ja laienes distaalselt, andes akridiinoranžiga värvimisel fluorestsentsmikroskoopia all erkkollase välimuse (joonis 6C). See aine on skaneeriva mikroskoobi all selgelt nähtav ja seda peetakse sideaineks. Poolõhukesed lõigud (joonis 5C) ja akridiinoranžiga värvitud spermaäieproovid näitasid spermakimpe, mis sisaldasid tihedalt pakitud päid ja kõverdunud sabasid (joonis 5D).
Erinevad mikrofotod, mis kujutavad spermapeade ja volditud sabade agregatsiooni, kasutades erinevaid meetodeid. (A) Spermakimbu ristlõige digitaalselt värvilise elektronmikroskoobiga, mis näitab keerdunud spermapead kaheosalise tuumaga (sinine) ja mitme flagellaarse osaga (roheline). (B) Digitaalne värvilise skaneeriva elektronmikroskoobiga pilt, mis näitab meduusitaoliste spermapeade kobaraid (nooled), mis näivad olevat kaetud. (C) Poolõhuke lõik, mis näitab agregeerunud spermapead (nooled) ja kõverdunud sabasid (nooled). (D) Akridiinoranžiga värvitud spermaäige mikrofoto, mis näitab spermapeade agregaate (nooled) ja kõverdunud kleepuvaid sabasid (nooled). Pange tähele, et spermatosoidi pead katab kleepuv aine (S). (D) × 1000 suurendus.
Transmissioon-elektronmikroskoopia (joonis 7A) abil märgati ka, et spermatosoidide pead olid keerdunud ja tuumad spiraalse kujuga, mida kinnitasid akridiinoranžiga värvitud ja fluorestsentsmikroskoopia abil uuritud spermatosoidide määrdproovid (joonis 7B).
(A) Digitaalne värvitransmissioon-elektronmikroskoop ja (B) akridiinoranžiga värvitud spermatosoidide määrdumine, mis näitab keerdunud päid ning spermatosoidide peade ja sabade kinnitumist (nooled). (B) × 1000 suurendus.
Huvitav leid on see, et Sharkazi sperma agregeerub, moodustades liikuvaid niitjaid kimpe. Nende kimpude omadused võimaldavad meil mõista nende võimalikku rolli spermatosoidide imendumisel ja säilitamisel SST-s.
Pärast paaritumist sisenevad spermatosoidid tuppe ja läbivad intensiivse selektsiooniprotsessi, mille tulemusel siseneb tupeõõnde vaid piiratud arv spermatosoide15,16. Praeguseks on mehhanismid, mille abil spermatosoidid tupeõõnde sisenevad ja sealt väljuvad, ebaselged. Kodulindudel säilitatakse spermatosoide tupeõõnes pikema aja jooksul, 2 kuni 10 nädalat, olenevalt liigist6. Sperma seisundi kohta tupeõõnes säilitamise ajal on endiselt lahkarvamusi. Kas need on liikumises või puhkeolekus? Teisisõnu, kuidas spermatosoidid säilitavad oma positsiooni tupeõõnes nii kaua?
Forman4 pakkus välja, et follikulaarse rakuvälise vedelikku (ST) saab pidada follikulaarse rakuvälise vedeliku püsimise ja väljutamise põhjuseks spermatosoidide liikuvust. Autorid püstitavad hüpoteesi, et spermatosoidid säilitavad oma positsiooni, ujudes vastuvoolu SST epiteeli tekitatud vedelikule, ning et spermatosoidid väljutatakse SST-st, kui nende kiirus langeb alla punkti, kus nad hakkavad energiapuuduse tõttu tagasi liikuma. Zaniboni5 kinnitas akvaporiinide 2, 3 ja 9 olemasolu SST epiteelirakkude apikaalses osas, mis võib kaudselt toetada Foremani spermatosoidide säilitamise mudelit. Käesolevas uuringus leidsime, et peaaegu pooled Sharkashi spermatosoididest näitavad voolavas vedelikus positiivset reoloogiat ja et aglutineerunud spermatosoidide kimbud suurendavad positiivse reoloogiaga spermatosoidide arvu, kuigi aglutinatsioon aeglustab neid. Kuidas spermatosoidid linnu munajuhasid mööda viljastumiskohta liiguvad, ei ole täielikult teada. Imetajatel tõmbab follikulaarne vedelik spermatosoidid kemoatraktsiooni teel ligi. Siiski arvatakse, et kemoatraktandid suunavad spermatosoidid pikkade vahemaade lähenemisele7. Seetõttu vastutavad spermatosoidide transpordi eest teised mehhanismid. Sperma võime orienteeruda ja voolata munajuhade vedeliku suhtes, mis vabaneb pärast paaritumist, on teatatud kui peamine tegur sperma sihtimisel hiirtel. Parker 17 pakkus välja, et spermatosoidid läbivad munajuhasid lindudel ja roomajatel ripsvoolu vastassuunas ujudes. Kuigi seda pole lindudel eksperimentaalselt tõestatud, oli Adolphi 18 esimene, kes avastas, et lindude sperma annab positiivseid tulemusi, kui filterpaberi riba abil luuakse katteklaasi ja slaidi vahele õhuke vedelikukiht. Reoloogia. Hino ja Yanagimachi [19] asetasid hiire munasarja-munajuha-emaka kompleksi perfusioonirõngasse ja süstisid 1 µl tinti istmikusse, et visualiseerida vedeliku voolu munajuhades. Nad märkasid munajuhas väga aktiivset kokkutõmbumise ja lõdvestumise liikumist, kus kõik tindipallid liikusid pidevalt munajuha ampulla suunas. Autorid rõhutavad munajuhade vedeliku voolu olulisust alumistest munajuhadest ülemistesse spermatosoidide tõusuks ja viljastumiseks. Brillard20 teatas, et kanadel ja kalkunitel migreeruvad spermatosoidid aktiivse liikumise teel tupe sissepääsust, kus neid säilitatakse, emaka-tupe ühenduskohta, kus neid säilitatakse. See liikumine emaka-tupe ühenduskoha ja infundibulumi vahel ei ole aga vajalik, kuna spermatosoidid transporditakse passiivse nihke teel. Teades neid varasemaid soovitusi ja käesolevas uuringus saadud tulemusi, võib eeldada, et spermatosoidide võime liikuda ülesvoolu (reoloogia) on üks omadustest, millel valikuprotsess põhineb. See määrab spermatosoidide läbimise läbi tupe ja nende sisenemise CCT-sse säilitamiseks. Nagu Forman4 soovitas, võib see hõlbustada ka spermatosoidide sisenemist SST-sse ja selle elupaika teatud ajaks ning seejärel väljumist, kui nende kiirus hakkab aeglustuma.
Teisest küljest pakkusid Matsuzaki ja Sasanami21 välja, et lindude spermatosoidid läbivad isas- ja emasloomade suguelundites liikuvuse muutusi puhkeseisundist liikuvusseisundisse. Residentsete spermatosoidide liikuvuse pärssimist SST-s on pakutud selgitamaks sperma pikka säilitusaega ja seejärel uuenemist pärast SST-st lahkumist. Hüpoksilistes tingimustes teatasid Matsuzaki jt1 SST-s laktaadi suurest tootmisest ja vabanemisest, mis võib viia residentsete spermatosoidide liikuvuse pärssimiseni. Sellisel juhul peegeldub sperma reoloogia olulisus spermatosoidide valikus ja imendumises, mitte nende säilitamises.
Sperma aglutinatsiooni mustrit peetakse usutavaks selgituseks sperma pika säilitusaja kohta munajuhade luumenis (SST), kuna see on kodulindudel sperma peetumise tavaline muster2,22,23. Bakst jt2 täheldasid, et enamik spermatosoide kleepus üksteise külge, moodustades fastsikulaarseid agregaate, ja üksikuid spermatosoide leiti vuttide CCM-is harva. Teisest küljest täheldasid Wen jt24 kanade SST valendikus rohkem hajutatud spermatosoide ja vähem spermatosoidide tupsusid. Nende tähelepanekute põhjal võib eeldada, et sperma aglutinatsiooni kalduvus erineb lindude ja samas ejakulaadis olevate spermatosoidide vahel. Lisaks pakkusid Van Krey jt9 välja, et aglutineerunud spermatosoidide juhuslik dissotsiatsioon põhjustab spermatosoidide järkjärgulist tungimist munajuhade luumenisse. Selle hüpoteesi kohaselt tuleks SST-st kõigepealt väljutada madalama aglutinatsioonivõimega spermatosoidid. Selles kontekstis võib spermatosoidide aglutinatsioonivõime olla tegur, mis mõjutab spermatosoidide konkurentsi tulemust määrdunud lindudel. Lisaks, mida kauem aglutineerunud sperma dissotsieerub, seda kauem säilib viljakus.
Kuigi spermatosoidide agregatsiooni ja agregatsiooni kimpudeks on täheldatud mitmetes uuringutes2,22,24, pole neid SST-s teostatava kinemaatilise vaatluse keerukuse tõttu üksikasjalikult kirjeldatud. Sperma aglutinatsiooni in vitro uurimiseks on tehtud mitmeid katseid. Ulatuslikku, kuid mööduvat agregatsiooni täheldati, kui õhuke traat rippuvast seemnetilgast eemaldati. See viib selleni, et tilgast ulatub välja piklik mull, mis imiteerib seemnenääret. 3D-piirangute ja lühikese tilgutamiskuivatamise aja tõttu lagunes kogu plokk kiiresti. Käesolevas uuringus, kasutades Sharkashi kanu ja mikrofluidikiipe, suutsime kirjeldada, kuidas need tupsud moodustuvad ja kuidas nad liiguvad. Spermakimbud moodustusid kohe pärast sperma kogumist ja leiti, et need liiguvad spiraalselt, näidates voolus olles positiivset reoloogiat. Lisaks on makroskoopiliselt vaatlemisel täheldatud, et spermatosoidide kimbud suurendavad liikuvuse lineaarsust võrreldes isoleeritud spermatosoididega. See viitab sellele, et spermatosoidide aglutinatsioon võib toimuda enne SST penetratsiooni ning et spermatosoidide tootmine ei piirdu stressi tõttu väikese alaga, nagu varem oletatud (Tingari ja Lake12). Tupsude moodustumise ajal ujuvad spermatosoidid sünkroonselt, kuni nad moodustavad ühenduskoha, seejärel keerduvad nende sabad üksteise ümber ja spermatosoidi pea jääb vabaks, kuid spermatosoidi saba ja distaalne osa kleepuva ainega kokku kleepuva osa abil. Seega vastutab liikumise eest sideme vaba pea, lohistades ülejäänud sidet. Spermatosoidide kimpude skaneeriv elektronmikroskoopia näitas kinnitunud spermapead, mis olid kaetud rohke kleepuva materjaliga, mis viitab sellele, et spermapead olid kinnitunud puhkekimpudesse, mis võis toimuda pärast säilituskohta (SST) jõudmist.
Kui spermatosoidide äigepreparaadi värvimine toimub akridiinoranžiga, on fluorestsentsmikroskoobi all näha spermatosoidide ümber olevat rakuvälist adhesiivmaterjali. See aine võimaldab spermatosoidide kimpudel kleepuda ümbritsevatele pindadele või osakestele, nii et need ei triivi ümbritseva vooluga kaasa. Seega näitavad meie tähelepanekud spermatosoidide adhesiooni rolli liikuvate kimpude kujul. Nende võime ujuda vastuvoolu ja kleepuda lähedalasuvatele pindadele võimaldab spermatosoididel SST-s kauem püsida.
Rothschild25 kasutas hemotsütomeetriakaamerat, et uurida veise sperma ujuvat jaotumist suspensioonitilgas, tehes mikrofotosid kaamera kaudu, millel oli nii vertikaalne kui ka horisontaalne mikroskoobi optiline telg. Tulemused näitasid, et spermatosoidid tõmbusid kambri pinna poole. Autorid pakuvad välja, et sperma ja pinna vahel võib esineda hüdrodünaamilisi interaktsioone. Võttes arvesse seda ja Sharkashi tibu sperma võimet moodustada kleepuvaid tupsusid, võib see suurendada tõenäosust, et sperma kleepub SST seinale ja seda säilitatakse pikka aega.
Bccetti ja Afzeliu26 teatasid, et sperma glükokalüks on vajalik sugurakkude äratundmiseks ja aglutinatsiooniks. Forman10 täheldas, et glükoproteiini-glükolipiidkatte α-glükosiidsidemete hüdrolüüs lindude sperma töötlemisel neuraminidaasiga vähendas viljakust ilma sperma liikuvust mõjutamata. Autorid väidavad, et neuraminidaasi mõju glükokalüksile kahjustab sperma sekvestreerimist emaka-tupe ühenduskohas, vähendades seeläbi viljakust. Nende tähelepanekutes ei saa eirata võimalust, et neuraminidaasravi võib vähendada sperma ja munarakkude äratundmist. Forman ja Engel10 leidsid, et viljakus vähenes, kui kanu seemendati intravaginaalselt neuraminidaasiga töödeldud spermaga. Neuraminidaasiga töödeldud spermaga IVF ei mõjutanud aga viljakust võrreldes kontrollkanadega. Autorid jõudsid järeldusele, et muutused sperma membraani ümbritsevas glükoproteiini-glükolipiidkattes vähendasid sperma viljastumisvõimet, kahjustades sperma sekvestreerimist emaka-tupe ühenduskohas, mis omakorda suurendas sperma kadu emaka-tupe ühenduskoha kiiruse tõttu, kuid ei mõjuta sperma ja munarakkude äratundmist.
Kalkunite puhul leidsid Bakst ja Bauchan 11 SST valendikus väikesi vesiikuleid ja membraanifragmente ning täheldasid, et mõned neist graanulitest olid sulandunud seemneraku membraaniga. Autorid pakuvad välja, et need seosed võivad aidata kaasa spermatosoidide pikaajalisele säilitamisele SST-s. Teadlased ei täpsustanud aga nende osakeste allikat, kas neid sekreteerivad CCT epiteelirakud, toodavad ja sekreteerivad isasloomad või sperma ise. Samuti vastutavad need osakesed aglutinatsiooni eest. Grützner jt 27 teatasid, et munandimanuse epiteelirakud toodavad ja sekreteerivad spetsiifilist valku, mis on vajalik ühepooriliste seemnejuhade moodustamiseks. Autorid teatavad ka, et nende kimpude hajumine sõltub munandimanuse valkude interaktsioonist. Nixon jt 28 leidsid, et manused sekreteerivad valku, happelist tsüsteiinirikast osteonektiini; SPARC osaleb spermatupsude moodustamises lühikese nokaga ehhidnadel ja nokkloomadel. Nende kiirte hajumine on seotud selle valgu kadumisega.
Käesolevas uuringus näitas elektronmikroskoopia abil tehtud ultrastruktuuri analüüs, et spermatosoidid kleepusid suure hulga tiheda materjali külge. Arvatakse, et need ained vastutavad aglutinatsiooni eest, mis kondenseerub kleepuvate peade vahel ja ümber, kuid saba piirkonnas on kontsentratsioon madalam. Eeldame, et see aglutineeriv aine eritub isaslooma reproduktiivsüsteemist (munandimandikest või seemnejuhast) koos spermaga, kuna ejakulatsiooni ajal täheldame sageli sperma eraldumist lümfist ja seemneplasmast. On teatatud, et lindude spermatosoidid läbivad munandimandikest ja seemnejuhast ning läbivad küpsemisega seotud muutusi, mis toetavad nende võimet siduda valke ja omandada plasma lemmaga seotud glükoproteiine. Nende valkude püsivus spermatosoidide membraanidel SST-s viitab sellele, et need valgud võivad mõjutada spermatosoidide membraanide stabiilsuse omandamist30 ja määrata nende viljakust31. Ahammad jt32 teatasid, et isasloomade reproduktiivsüsteemi erinevatest osadest (munanditest kuni distaalse seemnejuhani) saadud spermatosoidide elujõulisus suurenes vedelates tingimustes, olenemata säilitustemperatuurist, ning kanade elujõulisus suureneb ka munajuhades pärast kunstlikku seemendamist.
Sharkashi kana spermatupsudel on erinevad omadused ja funktsioonid kui teistel liikidel, näiteks ehhidnadel, nokkloomadel, puiduhiirtel, hirverottidel ja merisigadel. Sharkasi kanadel vähendas spermatosoidide kimpude moodustumine nende ujumiskiirust võrreldes üksikute spermatosoididega. Need kimbud suurendasid aga reoloogiliselt positiivsete spermatosoidide protsenti ja suurendasid spermatosoidide võimet dünaamilises keskkonnas stabiliseerida. Seega kinnitavad meie tulemused varasemat oletust, et sperma aglutinatsioon SST-s on seotud sperma pikaajalise säilimisega. Samuti püstitame hüpoteesi, et spermatosoidide kalduvus moodustada tupsusid võib kontrollida spermatosoidide kadumise kiirust SST-s, mis võib muuta spermatosoidide konkurentsi tulemust. Selle oletuse kohaselt vabastavad madala aglutinatsioonivõimega spermatosoidid SST-d esimesena, samas kui kõrge aglutinatsioonivõimega spermatosoidid toodavad enamiku järglastest. Ühepooriliste spermatosoidide kimpude moodustumine on kasulik ja mõjutab vanema-lapse suhet, kuid kasutab erinevat mehhanismi. Ehidnadel ja platypustel on spermatosoidid paigutatud üksteisega paralleelselt, et suurendada kiire edasiliikumise kiirust. Ehidnade kimbud liiguvad umbes kolm korda kiiremini kui üksikud spermatosoidid. Arvatakse, et selliste spermatupsude moodustumine evolutsiooniline kohanemine evolutsiooniline kohanemine domineerimise säilitamiseks, kuna emased on valimatud ja paarituvad tavaliselt mitme isasega. Seetõttu konkureerivad erinevate ejakulaatide spermatosoidid munaraku viljastamise pärast ägedalt.
Sharkasi-kanade aglutineerunud spermatosoide on faasikontrastmikroskoopia abil lihtne visualiseerida, mida peetakse eeliseks, kuna see võimaldab spermatosoidide käitumist in vitro hõlpsalt uurida. Mehhanism, mille abil spermatupsude moodustumine soodustab sharkasi-kanade paljunemist, erineb samuti mõnede platsenta-imetajate, näiteks puuhiirte, puhul täheldatust, kes esindavad koostööl põhinevat spermatosoidide käitumist, kus mõned spermatosoidid jõuavad munadeni, aidates teistel suguluses olevatel isenditel oma mune jõuda ja neid kahjustada. ennast tõestama. altruistlik käitumine. eneseviljastamine 34. Teine näide spermatosoidide koostööl põhinevast käitumisest leiti hirvehiirtelt, kus spermatosoidid suutsid identifitseerida ja kombineeruda geneetiliselt kõige sugulasemate spermatosoididega ning moodustada koostööl põhinevaid rühmi, et suurendada oma kiirust võrreldes mitteseotud spermatosoididega 35.
Käesolevas uuringus saadud tulemused ei ole vastuolus Fomani teooriaga spermatosoidide pikaajalisest säilitamisest SWS-is. Teadlased teatavad, et spermatosoidid liiguvad SST-d vooderdavate epiteelirakkude voolus pikema aja jooksul ning teatud aja möödudes spermatosoidide energiavarud ammenduvad, mille tulemuseks on kiiruse vähenemine, mis võimaldab väikese molekulmassiga aineid väljutada. Käesolevas uuringus täheldasime, et pooled üksikutest spermatosoididest näitasid võimet ujuda voolava vedeliku vastu ja nende adhesioon kimbus suurendas nende võimet näidata positiivset reoloogiat. Lisaks on meie andmed kooskõlas Matsuzaki jt andmetega, kes teatasid, et suurenenud laktaadi sekretsioon SST-s võib pärssida spermatosoidide liikuvust. Siiski kirjeldavad meie tulemused spermatosoidide liikuvate sidemete moodustumist ja nende reoloogilist käitumist dünaamilises keskkonnas mikrokanalis, püüdes selgitada nende käitumist SST-s. Edasised uuringud võivad keskenduda aglutineeriva aine keemilise koostise ja päritolu kindlaksmääramisele, mis kahtlemata aitab teadlastel välja töötada uusi viise vedela sperma säilitamiseks ja viljakuse kestuse suurendamiseks.
Uuringus valiti spermadoonoriteks viisteist 30-nädalast paljakaelalist isast sharkasi (homosügootne dominant; Na Na). Linde kasvatati Egiptuse Ashiti kubermangus Ashiti ülikooli põllumajandusteaduskonna uurimislinnukasvatuses. Linnud peeti individuaalsetes puurides (30 x 40 x 40 cm), neile rakendati valgusprogrammi (16 tundi valgust ja 8 tundi pimedust) ning neile söödeti toitu, mis sisaldas 160 g toorvalku, 2800 kcal metaboliseeritavat energiat ja 35 g kaltsiumi. 5 grammi omastatavat fosforit toidu kilogrammi kohta.
Andmete 36, 37 kohaselt koguti isasloomadelt spermat kõhumassaaži teel. Kokku koguti 15 mehelt 3 päeva jooksul 45 spermaproovi. Sperma (n = 15/päevas) lahjendati koheselt vahekorras 1:1 (v:v) Belsville'i kodulindude sperma lahjendiga, mis sisaldab kaaliumdifosfaati (1,27 g), naatriumglutamaadi monohüdraati (0,867 g), fruktoosi (0,5 d), veevaba naatriumatsetaati (0,43 g), tris(hüdroksümetüül)aminometaani (0,195 g), kaaliumtsitraatmonohüdraati (0,064 g), kaaliummonofosfaati (0,065 g), magneesiumkloriidi (0,034 g) ja H2O-d (100 ml), pH = 7,5, osmolaarsus 333 mOsm/kg38. Lahjendatud spermaproove uuriti esmalt valgusmikroskoobi all, et tagada sperma hea kvaliteet (niiskus), ja seejärel säilitati veevannis temperatuuril 37 °C kuni kasutamiseni poole tunni jooksul pärast kogumist.
Spermatosoidide kinemaatikat ja reoloogiat kirjeldatakse mikrofluidikaseadmete süsteemi abil. Spermaproovid lahjendati edasi Beltsville'i lindude sperma lahjendiga suhtega 1:40, laaditi mikrofluidikaseadmesse (vt allpool) ja kineetilised parameetrid määrati arvutipõhise sperma analüüsi (CASA) süsteemi abil, mis on varem välja töötatud mikrofluidika iseloomustamiseks. spermatosoidide liikuvuse kohta vedelkeskkonnas (masinaehituse osakond, inseneriteaduskond, Assiut'i ülikool, Egiptus). Plugin on allalaaditav aadressilt: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Mõõdeti kõvera kiirust (VCL, μm/s), lineaarkiirust (VSL, μm/s) ja keskmist trajektoori kiirust (VAP, μm/s). Spermatosoidide videod salvestati inverteeritud Optika XDS-3 faasikontrastmikroskoobiga (40x objektiiviga), mis oli ühendatud Tucson ISH1000 kaameraga kiirusel 30 kaadrit sekundis 3 sekundi jooksul. Kasutage CASA tarkvara, et uurida vähemalt kolme piirkonda ja 500 spermatosoidi trajektoori proovi kohta. Salvestatud videot töödeldi omatehtud CASA abil. CASA plugina liikuvuse definitsioon põhineb spermatosoidide ujumiskiirusel võrreldes voolukiirusega ega hõlma muid parameetreid, näiteks küljelt küljele liikumist, kuna see on osutunud vedeliku voolu korral usaldusväärsemaks. Reoloogilist liikumist kirjeldatakse kui spermatosoidide liikumist vedeliku voolu suuna vastassuunas. Reoloogiliste omadustega spermatosoidid jagati liikuvate spermatosoidide arvuga; puhkeolekus ja konvektiivselt liikuvad spermatosoidid jäeti loendamisest välja.
Kõik kasutatud kemikaalid saadi firmalt Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egiptus), kui pole teisiti märgitud. Seade valmistati El-sherry jt.40 kirjeldatud viisil, mõningate muudatustega. Mikrokanalite valmistamiseks kasutatud materjalide hulka kuulusid klaasplaadid (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatiivne resist (MicroChem, Newton, CA), diatsetoonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Saksamaa) ja polüatsetoon-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalid valmistatakse pehme litograafia abil. Esmalt trükiti soovitud mikrokanali kujundusega läbipaistev kaitsev näomask kõrglahutusega printeril (Prismatic, Kairo, Egiptus ja Pacific Arts and Design, Markham, ON). Kujutised valmistati, kasutades alusmaterjalina klaasplaate. Plaadid puhastati atsetoonis, isopropanoolis ja deioniseeritud vees ning seejärel kaeti tsentrifuugkatmise teel (3000 p/min, 1 minut) 20 µm SU8-25 kihiga. Seejärel kuivatati SU-8 kihte õrnalt (65 °C, 2 minutit ja 95 °C, 10 minutit) ning kiiritati 50 sekundit UV-kiirgusega. Pärast kiiritamist küpsetati SU-8 kihte ristseostamiseks temperatuuril 65 °C ja 95 °C 1 minut ja 4 minutit, millele järgnes ilmutamine diatsetoonalkoholis 6,5 minutit. Küpseta vahvleid kõvasti (200 °C 15 minutit), et SU-8 kihti veelgi tahkestada.
PDMS valmistati monomeeri ja kõvendi segamise teel kaaluvahekorras 10:1, seejärel degaseeriti vaakumeksikaatoris ja valati SU-8 põhiraamile. PDMS kõvendati ahjus (120 °C, 30 min), seejärel lõigati kanalid välja, eraldati põhimaterjalist ja perforeeriti, et võimaldada torude kinnitamist mikrokanali sisse- ja väljalaskeavadele. Lõpuks kinnitati PDMS-mikrokanalid püsivalt mikroskoobi slaididele, kasutades kaasaskantavat koroonaprotsessorit (Electro-Technic Products, Chicago, IL), nagu on kirjeldatud mujal. Selles uuringus kasutatud mikrokanali mõõtmed on 200 µm × 20 µm (L × K) ja pikkus 3,6 cm.
Mikrokanali sees oleva hüdrostaatilise rõhu poolt esile kutsutud vedelikuvool saavutatakse vedeliku taseme hoidmisega sisselaskereservuaaris kõrgemal kui väljundreservuaari kõrguste vahe Δh39 (joonis 1).
kus f on hõõrdetegur, mis on defineeritud kui f = C/Re laminaarse voolu korral ristkülikukujulises kanalis, kus C on konstant, mis sõltub kanali külgsuhtest, L on mikrokanali pikkus, Vav on keskmine kiirus mikrokanalis, Dh on kanali hüdrauliline läbimõõt ja g on raskuskiirendus. Selle võrrandi abil saab keskmise kanali kiiruse arvutada järgmise võrrandi abil: