Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com. Kasutataval brauseri versioonil on CSS-i tugi piiratud. Parima kasutuskogemuse tagamiseks soovitame teil kasutada uuendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame jätkuva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Poorsed ränidioksiidi osakesed valmistati sool-geelmeetodil koos mõningate modifikatsioonidega, et saada makropoorseid osakesi. Need osakesed derivatiseeriti pöörduva liitmise fragmentatsiooniahela ülekande (RAFT) polümerisatsiooni teel N-fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadi (PMI) ja stüreeniga, et valmistada N-fenüülmaleimiidi kolonni interkalatsioon (PMP-reavaba terasevaba faasi) 00 × 1,8 mm id) pakiti lobri pakkimisega. Viiest peptiidist koosneva peptiidisegu (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiini kromatiini albumiini optimaalse elueerimise tingimused HA) ja leutsiinkromatiini albumiini optimaalse toimega HA) hinnatud PMP kolonnis. , on peptiidisegu teoreetiline plaatide arv koguni 280 000 plaati/m². Võrreldes väljatöötatud kolonni eraldusvõimet kaubandusliku Ascentis Express RP-Amide kolonniga, täheldati, et PMP kolonni eraldusvõime oli eraldusefektiivsuse ja eraldusvõime poolest parem kui kaubanduslikul kolonnil.
Viimastel aastatel on biofarmaatsiatööstusest saanud laienev ülemaailmne turg, mille turuosa on oluliselt suurenenud. Biofarmatseutilise tööstuse1,2,3 plahvatusliku kasvuga on väga soovitav peptiidide ja valkude analüüs. Lisaks sihtpeptiidile tekib peptiidi sünteesi käigus mitmeid lisandeid, mistõttu on vaja peptiidide kromatograafilist puhastamist ja puhastamist. kudede ja rakkude uurimine on äärmiselt keeruline ülesanne, kuna ühes proovis on palju potentsiaalselt tuvastatavaid liike. Kuigi massispektromeetria on tõhus vahend peptiidide ja valkude järjestamiseks, ei ole eraldumine ideaalne, kui sellised proovid süstitakse massispektromeetrisse ühe käiguga. Seda probleemi saab leevendada vedelikkromatograafia (LC) analüüsi abil, mis vähendab massieralduste arvu eelnevalt, vähendades MS-i arvu. antud aja järgi4,5,6.Lisaks saab vedelfaasi eraldamise ajal analüüte fokuseerida kitsastesse piirkondadesse, kontsentreerides seeläbi neid analüüte ja parandades MS tuvastamise tundlikkust. Vedelikkromatograafia (LC) on viimase kümnendi jooksul oluliselt edasi arenenud ja muutunud populaarseks proteoomianalüüsi tehnikaks7,8,9,10.
Pöördfaasiline vedelikkromatograafia (RP-LC) on laialdaselt kasutusel peptiidisegude puhastamiseks ja eraldamiseks, kasutades statsionaarse faasina oktadetsüülmodifitseeritud ränidioksiidi (ODS). Kuid RP statsionaarsed faasid ei taga nende peptiidide ja valkude rahuldavat eraldamist nende konstrueeritud statsionaarse faasi,5 ja amfifilise faasi erilise struktuuri tõttu. on vaja analüüsida polaarsete ja mittepolaarsete osadega peptiide ja valke, et suhelda nende analüütidega ja säilitada neid16.Multimodaalseid interaktsioone pakkuv segarežiimi kromatograafia võib olla alternatiiv RP-LC-le peptiidide, valkude ja muude komplekssete segude eraldamisel. Mitmed segarežiimis statsionaarsed faasid on valmistatud nende faaside eraldamiseks1 ja faaside jaoks1 on kasutatud1 ja ,20,21.Segarežiimilised statsionaarsed faasid (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaarne interkalatsioon/RPLC) sobivad peptiidide ja valkude eraldamiseks nii polaarsete kui ka mittepolaarsete rühmade22,23,24,25,26,27,28 tõttu. -polaarsed analüüdid, kuna eraldamine sõltub analüüdi ja statsionaarse faasi vastastikmõjust.Multimodaalsed interaktsioonid 29, 30, 31, 32. Hiljuti on Zhang et al.30 valmistas dodetsüülotsaga polüamiini statsionaarne faas ja eraldas edukalt süsivesinikud, antidepressandid, flavonoidid, nukleosiidid, östrogeenid ja mitmed teised analüüdid. Polaarses interkalaatoris on nii polaarseid kui ka mittepolaarseid rühmi, seega saab seda kasutada peptiidide ja valkude eraldamiseks, millel on nii hüdrofoobsed kui ka hüdrofiilsed kolonnid, mis sisaldavad kolonni. on kaubanduslikult saadaval kaubanime Ascentis Express RP-Amide all, kuid neid veerge kasutatakse ainult amiini 33 analüüsimiseks.
Käesolevas uuringus valmistati polaarselt põimitud statsionaarne faas (N-fenüülmaleimiidiga manustatud polüstüreen) ja hinnati HSA peptiidide ja trüpsiini lõhustuste eraldamist. Statsionaarne faas valmistati, kasutades järgmist strateegiat. Poorsed ränidioksiidi osakesed valmistati meie eelmises väljaandes esitatud protseduuri kohaselt, koos mõningate modifikatsioonidega preparaadis glüküleenP, TMOS-i suhe. äädikhapet reguleeriti, et valmistada suure poori suurusega ränidioksiidi osakesi.Teiseks sünteesiti uus ligand, fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaat, mida kasutati ränidioksiidi osakeste derivatiseerimiseks, et valmistada polaarne põimitud statsionaarne faas. Saadud statsionaarne faas pakiti mehaanilise skeemi abil pakkimisskeemi abil, kasutades roostevabast terasest kolonni. kolonnis moodustub homogeenne kihti. Hinnake viiest peptiidist koosnevate peptiidisegude pakendatud kolonni eraldumist;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiini enkefaliin) ja inimese seerumi albumiini (HAS) trüpsiini eraldumine. Täheldati, et HSA peptiidisegu ja trüpsiini eraldusvõime eraldus hea lahutusvõime ja efektiivsusega. Eraldusvõimet võrreldi kolonni PMP-ga. ja valgud olid hästi lahutatud ja tõhusad PMP kolonnis, mis oli tõhusam kui Ascentis Express RP-Amide kolonn.
PEG (polüetüleenglükool), uurea, äädikhape, trimetoksüortosilikaat (TMOS), trimetüülklorosilaan (TMCS), trüpsiin, inimese seerumi albumiin (HSA), ammooniumkloriid, uurea, heksaan metüüldisilasaan (HMDS), metakrüloüül-spetüreenkloriid (MCTEHPOTüreen, benso-4-B), ), HPLC puhtusastmega atsetonitriil (ACN), metanool, 2-propanool ja atsetoon, ostetud ettevõttest Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Karbamiidi (8 g), polüetüleenglükooli (8 g) ja 8 ml 0,01 N äädikhappe segu segati 10 minutit ja seejärel lisati jääkülmas 24 ml TMOS-i. Reaktsioonisegu kuumutati 40 °C juures 6 tundi ja seejärel 120 °C juures 8 tundi veeta terasest. kuivatati 70 °C juures 12 tundi. Kuivatatud pehme mass jahvatati ahjus siledaks ja kaltsineeriti 550 °C juures 12 tundi. Valmistati kolm partiid ja iseloomustati, et uurida reprodutseeritavust osakeste suuruse, pooride suuruse ja pinna osas.
Ränidioksiidi osakeste pinna modifitseerimisel eelnevalt sünteesitud ligandi fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadiga (PCMP), millele järgnes radiaalne polümerisatsioon stüreeniga, valmistati polaarseid rühmi sisaldav ühend.Statsionaarne faas täitematerjalide ja polüstüreenkettide jaoks. Valmistamisprotsessi kirjeldatakse allpool.
N-fenüülmaleimiid (200 mg) ja metüülvinüülisotsüanaat (100 mg) lahustati kuivas tolueenis ja reaktsioonikolbi lisati 0,1 ml 2,2'-asoisobutüronitriili (AIBN), et valmistada fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadi kopolümeer 6 tundi temperatuuril 6 °C ja segu filtreeriti temperatuuril 6 °C (PMC). ahjus 40°C juures 3 tundi.
Kuivatatud ränidioksiidi osakesed (2 g) dispergeeriti kuivas tolueenis (100 ml), segati ja töödeldi ultraheliga 500 ml ümarapõhjalises kolvis 10 minutit. PMCP (10 mg) lahustati tolueenis ja lisati tilklehtri kaudu tilkhaaval reaktsioonikolbi. Segu kuumutati tagasijooksul 100 °C juures 8 tundi ja filtriti 6 tundi. Seejärel lahustati PMCP-ga seotud ränidioksiidi osakesed (100 g) tolueenis (200 ml) ja lisati 4-hüdroksü-TEMPO (2 ml) katalüsaatorina 100 ui dibutüültinadilauraadi juuresolekul. Segu segati 50 °C juures 8 tundi ja kuivatati 50 °C juures.
Stüreen (1 ml), bensoüülperoksiid BPO (0,5 ml) ja TEMPO-PMCP-ga seotud ränidioksiidi osakesed (1,5 g) dispergeeriti tolueenis ja puhuti läbi lämmastikuga. Stüreeni polümerisatsioon viidi läbi temperatuuril 100 °C 12 tundi. Saadud produkti koguskeemi skeem 1 on näidatud metanoolis 6 °C üle öö.
Proove degaseeriti 393 K juures 1 tund, et saada jääkrõhk alla 10-3 Torri. Suhtelise rõhu juures P/P0 = 0,99 adsorbeeritud N2 kogust kasutati pooride kogumahu määramiseks. Paljaste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste morfoloogiat uuriti seadmega High scanningopynologis, TooDkycopylogiits, TooDkycopylogiits (Japanicopylogias, TooDkycopylogis). (paljas ränidioksiidi ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakesed) asetati alumiiniumkolonnile, kasutades kleepuvat süsinikteipi. Proovidele kanti kullaga Q150T pihustuskatja ja proovidele kanti 5 nm Au kiht. See parandab madalate pingete abil protsessi efektiivsust ja tagab peeneteralise, külma pihustuselemendi (Flash sputtering, MA1A) Elementanalüüsiks kasutati r-i. Osakeste suuruse jaotuse saamiseks kasutati Malvern (Worcestershire, UK) osakeste suuruse analüsaatorit Mastersizer 2000. Paljad ränidioksiidi osakesed ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakesed (igaüks 5 mg) dispergeeriti 5 ml isopropanoolis, töödeldi ultraheliga 10 minutit ja töödeldi 5 minuti jooksul optilise bensiiniseadmega. ravimeetriline analüüs viidi läbi kiirusega 5 °C minutis temperatuurivahemikus 30–800 °C.
Klaasvooderdusega roostevabast terasest kitsa avaga kolonnid mõõtmetega (100 × 1,8 mm id) pakiti suspensiooni pakkimise meetodil, kasutades sama protseduuri, mida kasutati viites.31. Roostevabast terasest kolonn (klaasvoodriga, sisemõõt 100 × 1,8 mm) 1 µm fritti sisaldava väljalaskeliitmikuga ühendati lägapakendajaga (Alltech Deerfield, IL, USA). Valmistage ette statsionaarse faasi suspensioon, suspendeerides 150 mg kasutatud statsionaarset faasi. nii lobri lahustina kui ka liikumapaneva lahustina. Täitke kolonn järjestikku, rakendades rõhku 100 MP 10 minutiks, 80 MP 15 minutiks ja 60 MP 30 minutiks. Pakkimise ajal rakendati mehaanilist vibratsiooni kahe GC kolonni loksuti abil (Alltech, Deerfield, IL, USA), et tagada kolonni ühtlane rõhk. vältige kolonnis mis tahes kahjustusi.Eemaldage kolonn läga pakkimisüksusest ja ühendage teine ​​liitmik sisselaskeava ja LC-süsteemiga, et kontrollida selle toimivust.
Ehitati LC-pump (10AD Shimadzu, Jaapan), injektor (Valco (USA) C14 W.05) 50 nL sissepritseaasaga, membraani degaseerija (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillaaraken. Konstrueeriti spetsiaalne µLC seadme detektor (UV-2075) ja klaasvoodriga kolonn, mis minimeerib väga kitsa ribalaienduse ja mikrokolonni ühendamise. Pärast pakendamist paigaldati kapillaarid (50 μm id 365 ja redutseerivad ühenduskapillaarid (50 μm) redutseeriva liidu 1/16″ väljalaskeavale. Andmete kogumine ja kromatograafiline töötlemine viidi läbi tarkvara Multichro 2000 abil. Jälgimine lainepikkusel 254 nm (Analüüte testiti Chromatthampin Pro8 neeldumise suhtes).
Albumiin inimese seerumist, lüofiliseeritud pulber, ≥ 96% (agaroosgeelelektroforees) 3 mg segatuna trüpsiiniga (1,5 mg), 4,0 M uureaga (1 ml) ja 0,2 M ammooniumvesinikkarbonaadiga (1 ml). Lahust segati 10 minutit ja seejärel hoiti 10 minutit veevannis temperatuuril 10 °C 17 tundi. % TFA. Filtreerige lahus ja hoidke temperatuuril alla 4 °C.
Peptiidisegude ja HSA trüpsiini eraldumist hinnati eraldi PMP kolonnidel. Kontrollige peptiidisegu ja HSA trüpsiini eraldumist PMP kolonni abil ja võrrelge tulemusi Ascentis Express RP-Amide kolonniga. Teoreetiline plaadinumber arvutatakse järgmiselt:
Paljaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste SEM-kujutised on näidatud joonisel fig.2. Paljaste ränidioksiidi osakeste (A, B) SEM-pildid näitavad, et erinevalt meie varasematest uuringutest on need osakesed sfäärilised, milles osakesed on piklikud või ebakorrapärase sümmeetriaga. Ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste (C, D) pind on siledam kui paljas ränidioksiidi osakeste pind, mis võib olla tingitud kaaspinna polüahelsusest.
Skaneerivad elektronmikroskoobi kujutised paljast ränidioksiidi osakestest (A, B) ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakestest (C, D).
Paljaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste osakeste suuruse jaotused on näidatud joonisel 3(A). Mahupõhised osakeste suuruse jaotuse kõverad näitasid, et ränidioksiidi osakeste suurus suurenes pärast keemilist modifitseerimist (joonis 3A). Praeguse ja eelmise uuringu ränidioksiidi osakeste osakeste suurusjaotuse andmeid võrreldakse tabelis P.5,-1(AMP) põhineva osakese suurus. 0,36 μm, võrreldes meie eelmise uuringuga, mille ad(0,5) väärtus oli 3,05 μm (polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakesed)34. Sellel partiil oli meie eelmise uuringuga võrreldes kitsam osakeste suuruse jaotus, kuna PEG-i, karbamiidi, TMOS-i ja äädikhappe vaheline suhe oli reaktsioonisegus veidi suurem kui polüstüreeniga seotud osakeste osakeste suurus. See tähendab, et ränidioksiidi osakeste pinnafunktsionaliseerimine stüreeniga kattis ränidioksiidi pinnale ainult polüstüreenikihi (0,97 µm), samas kui PMP faasis oli kihi paksus 1,38 µm.
Paljaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste osakeste suuruse jaotus (A) ja pooride suuruse jaotus (B).
Käesoleva uuringu ränidioksiidi osakeste pooride suurus, pooride maht ja pindala on toodud tabelis 1(B). Paljaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste PSD-profiilid on näidatud joonisel 3(B). Tulemused on võrreldavad meie eelmise uuringuga. Paljaste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste pooride suurused näitavad, et nende osakaalu suurus väheneb310 võrra. 69 pärast keemilist modifitseerimist, nagu on näidatud tabelis 1(B), ja kõvera muutus on näidatud joonisel 3(B). Samamoodi vähenes ränidioksiidi osakeste pooride maht pärast keemilist modifitseerimist 0,67-lt 0,58 cm3/g-le. Praegu uuritud ränidioksiidi osakeste eripindala on 116 m2/võrreldav meie eelmises uuringus, mis on 24 m2/g. tabelis 1(B) vähenes pärast keemilist modifitseerimist ka ränidioksiidi osakeste pindala (m2/g) 116 m2/g-lt 105 m2/g-le.
Statsionaarse faasi elementanalüüsi tulemused on toodud tabelis 2. Praeguse statsionaarse faasi süsinikukoormus on 6,35%, mis on väiksem kui meie eelmise uuringu süsiniku koormus (polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakesed, vastavalt 7,93%35 ja 10,21%) kasutati näiteks fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaati (PCMP) ja 4-hüdroksü-TEMPO-t. Praeguse statsionaarse faasi lämmastiku massiprotsent on 2,21%, võrreldes varasemate uuringute lämmastiku massiprotsentidega vastavalt 0,1735 ja 0,85 massiprotsenti. See tähendab, et praeguses statsionaarses faasis on süsiniku massiprotsent suurem. toodetest (4) ja (5) olid vastavalt 2,7% ja 2,9%, samas kui lõpptoote (6) süsinikukoormus oli 6,35%, nagu on näidatud tabelis 2. Kaalukadu kontrolliti PMP statsionaarse faasiga ja TGA kõver on näidatud joonisel 4. TGA kõver näitab kaalukadu 8,6%, mis on ainult süsinikusisaldusega, kuid mitte ainult süsinikusisaldusega, 6 ja 5 %). ja H.
Fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadi ligand valiti ränidioksiidi osakeste pinna modifitseerimiseks, kuna sellel on polaarsed fenüülmaleimiidrühmad ja vinüülisotsüanaatrühmad. Vinüülisotsüanaatrühmad võivad stüreeniga edasi reageerida elava radikaalse polümerisatsiooni teel. Teiseks põhjuseks on rühma sisestamine, millel on mõõdukas interaktsioon tugeva p-analüütilise staatsilise faasi ja analüütilise faasi ja heenüülisotsüanaadi vahel. ide fragmendil puudub normaalse pH juures virtuaalne laeng. Statsionaarse faasi polaarsust saab reguleerida stüreeni optimaalse koguse ja vabade radikaalide polümerisatsiooni reaktsiooniajaga. Reaktsiooni viimane etapp (vabaradikaalpolümerisatsioon) on kriitiline ja võib muuta statsionaarse faasi polaarsust. Nende statsionaarsete faaside süsinikusisalduse kontrollimiseks tehti elementanalüüs. .Stüreeni erineva kontsentratsiooniga valmistatud SP-del on erinev süsinikusisaldus. Jällegi laadige need statsionaarsed faasid roostevabast terasest kolonnidesse ja kontrollige nende kromatograafilist jõudlust (selektiivsus, eraldusvõime, N väärtus jne). Nende katsete põhjal valiti PMP statsionaarse faasi ettevalmistamiseks optimeeritud koostis, et tagada kontrollitud polaarsus ja hea analüüdi säilivus.
Viit peptiidisegu (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliin) hinnati ka PMP kolonni kasutades, kasutades liikuvat faasi;60/40 (maht/maht) atsetonitriil/vesi (0,1% TFA) voolukiirusel 80 μL/min. Optimaalsete elueerimistingimuste korral on teoreetiline plaadinumber (N) kolonni kohta (100 × 1,8 mm id) 20 000 ± 100 (200/m² N väärtused kolmel plaadil kroomil/m²). grammid on näidatud joonisel 5A. Kiire analüüs PMP kolonnis suure voolukiirusega (700 μL/min), viis peptiidi elueeriti ühe minuti jooksul, N väärtused olid väga head, 13 500 ± 330 kolonni kohta (100 × 1,8 mm kolonni id), vastab plaadile 135,00tre 135,00 tre 1 m/m. 00 × 1,8 mm id) pakiti reprodutseeritavuse kontrollimiseks kolme erineva partiiga PMP statsionaarset faasi. Iga kolonni analüüdi kontsentratsioon registreeriti, kasutades optimaalseid elueerimistingimusi ja teoreetiliste plaatide arvu N ja retentsiooniaega, et eraldada igas kolonnis sama katsesegu. PMP kolonnide reprodutseeritavuse andmed, PMP kolonnide reprodutseeritavuse andmed on näidatud tabelis. Tabel 3.
Peptiidisegu eraldamine PMP kolonnis (B) ja Ascentis Express RP-Amide kolonnis (A);liikuv faas 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonni mõõtmed (100 × 1,8 mm id);analüütiline Ühendite elueerimise järjekord: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ja 5 (leutsiin) happe enkefaliin)).
PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) hinnati inimese seerumi albumiini trüptiliste lõhustuste eraldamiseks kõrgfektiivses vedelikkromatograafias. Joonisel fig 6 olev kromatogramm näitab, et proov on hästi eraldatud ja eraldusvõime on väga hea. HSA lõhustust analüüsiti voolukiirusega 100 µL/min, liikuva faasiga 70 µL/min. grammi (joonis 6), HSA lõhustamine on jagatud 17 piigiks, mis vastavad 17 peptiidile. HSA seedimise iga piigi eraldamise efektiivsus arvutati ja väärtused on toodud tabelis 5.
HSA trüptiline seedimine (100 × 1,8 mm id) eraldati PMP kolonnis;voolukiirus (100 µl/min), liikuv faas 60/40 atsetonitriil/vesi 0,1% TFA-ga.
kus L on kolonni pikkus, η on liikuva faasi viskoossus, ΔP on kolonni vasturõhk ja u on liikuva faasi lineaarkiirus. PMP kolonni läbilaskvus oli 2,5 × 10-14 m2, voolukiirus oli 25 μL/min ja kasutati 60/40 v/v P.0 × ACN perme. oli sarnane meie eelmise uuringu omaga, viide 34. Pindmiste poorsete osakestega täidetud kolonni läbilaskvus on: 1,7 × 10-15 1,3 μm osakeste puhul, 3,1 × 10-15 1,7 μm osakeste puhul, 5,2 × 10-15 ja 21-5 μm 21-5 μs . μm osakesed 43.Seetõttu on PMP faasi läbilaskvus sarnane 5 μm südamiku-kest osakeste omaga.
kus Wx on kloroformiga täidetud kolonni kaal, Wy on metanooliga täidetud kolonni kaal ja ρ on lahusti tihedus. Metanooli (ρ = 0,7866) ja kloroformi (ρ = 1,484) tihedused. Ränidioksiidi OSAKESTE kogupoorsus1-C018 kolonnid1-C0181-1.8 mm. Varem uuritud uurea kolonnide 31 väärtus oli vastavalt 0,63 ja 0,55. See tähendab, et uurea ligandide olemasolu vähendab statsionaarse faasi läbilaskvust. Teisest küljest on PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) kogupoorsus 0,60. CMP1 kolonnide8 läbilaskvus on väiksem kui CMP1 kolonnides8. tüüpi statsionaarsetes faasides kinnituvad C18 ligandid ränidioksiidi osakeste külge lineaarsete ahelatena, polüstüreeni tüüpi statsionaarsetes faasides aga moodustub selle ümber suhteliselt paks polümeerikiht. Tüüpilises katses arvutatakse kolonni poorsus järgmiselt:
Joonistel 7A, B on kujutatud PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) ja Ascentis Express RP-Amide kolonni (100 × 1,8 mm id), kasutades samu elueerimistingimusi (st 60/40 ACN/H2O ja 0,1% TFA).) van Deemteri krundil.Valitud peptiidisegud (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiini enkefaliin) valmistati 20 µL/ Mõlema kolonni minimaalne voolukiirus on 800 µL/min. Optimaalsed HETP väärtused 80 µL/min. Centis Express RP-Amide kolonn olid vastavalt 2,6 µm ja 3,9 µm. HETP väärtused näitavad, et PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) eraldusefektiivsus on palju parem kui kaubanduslikult saadav Ascentis Express RP-Amide kolonn (100 × 1,8 mm id). ei ole meie eelmise uuringuga võrreldes märkimisväärne. PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) suurem eraldusefektiivsus võrreldes Ascentis Express RP-Amide kolonniga põhineb osakeste kuju, suuruse ja praeguses töös kasutatud keerukate kolonni pakkimisprotseduuride paranemisel34.
(A) van Deemteri graafik (HETP versus liikuva faasi lineaarne kiirus), mis on saadud PMP kolonni (100 × 1,8 mm läbimõõduga) kasutades 60/40 ACN/H2O koos 0,1% TFA-ga. (B) van Deemteri graafik (HETP versus liikuva faasi lineaarne kiirus), mis saadi Ascentis Expressi Ascentis Expressi RP-Amide veeruga (10 CN0/0H2) (18 mm/0H2). 0,1% TFA-ga.
Valmistati polaarne manustatud polüstüreeni statsionaarne faas ja seda hinnati sünteetiliste peptiidisegude ja inimese seerumi albumiini (HAS) trüpsiinide eraldamiseks kõrgefektiivses vedelikkromatograafias. Peptiidisegude PMP kolonnide kromatograafiline jõudlus on suurepärane eraldusefektiivsuse ja eraldusvõime poolest. PMP-kolonnide parem eraldusvõime tuleneb erinevast sünteetiliste osakeste suurusest, näiteks erinevatest osakeste suurusest ja ränidioksiidist. sis statsionaarsest faasist ja komplekssest kolonni pakkimisest.Lisaks suurele eraldusefektiivsusele on selle statsionaarse faasi teine ​​eelis ka madal kolonni vasturõhk suure voolukiiruse juures.PMP kolonnidel on hea reprodutseeritavus ja neid saab kasutada peptiidisegude analüüsiks ja erinevate valkude trüpsiini lagundamiseks. Kavatseme seda kolonni kasutada P-kolonni kromograafias ka looduslike saaduste, bioaktiivsete ravimtaimede ja bioaktiivsete ühendite kromograafiaks. hinnatud valkude ja monoklonaalsete antikehade eraldamise suhtes.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography Osa I: Development of a Column Characterization Protocol.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. jt. Täiustatud aktiivsed peptiidid, mis on loodud nakkushaiguste raviks. Biotechnology. Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sünteetilised terapeutilised peptiidid: teadus ja turg.ravimite avastus.15 (1-2) täna, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ja Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. jt. Täiustatud vedelikkromatograafia-massispektromeetria võimaldab kaasata laialdaselt suunatud metaboolikat ja proteoomikat.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC roll ravimite väljatöötamisel.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ultrakõrgsurvevedelikkromatograafia põhiaspektid ja praktilised aspektid kiireks eraldamiseks.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ultra-high performance liquid chromatography in drug development.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. jt. Monoliitsed makropoorsed hüdrogeelid, mis on valmistatud õli-vees kõrge sisefaasiga emulsioonidest enteroviiruste tõhusaks puhastamiseks. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vedelikkromatograafia roll proteoomikas.J.Chromatography.A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Emerging trends in reversed-phase liquid chromatography separations ofterapeutilised peptiidid ja valgud: teooria ja rakendused.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptiidide kahemõõtmeline eraldamine RP-RP-HPLC süsteemi abil, kasutades erinevaid pH väärtusi esimeses ja teises eraldusmõõtmes.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Uuriti suure efektiivsusega kromatograafiliste kolonnide massiülekande omadusi ja kineetilist jõudlust, mis olid täidetud C18 sub-2 μm täielikult ja pindmiselt poorsete osakestega.J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Hiljutised suundumused ja analüütilised väljakutsed taimede bioaktiivsete peptiidide isoleerimisel, tuvastamisel ja valideerimisel.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-028-081.
Mueller, JB jt.Elukuningriigi proteoomiline maastik.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. jt. Terapeutiliste peptiidide allavoolu töötlemine preparatiivse vedelikkromatograafia abil. Molecule (Basel, Šveits) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Segamoodi kromatograafia ja selle rakendamine biopolümeeridele.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands for mix-mode protein chromatography: printsiip, iseloomustus ja disain.J.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).