Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on CSS-i jaoks piiratud tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Poorsed ränidioksiidiosakesed valmistati sool-geelmeetodil, tehes makropoorsete osakeste saamiseks mõningaid modifikatsioone. Need osakesed derivatiseeriti pöörduva liitmisfragmentatsiooni ahelaülekande (RAFT) polümerisatsiooni teel N-fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadi (PMI) ja stüreeniga, et valmistada polüstüreeni (PMP) statsionaarse faasi N-fenüülmaleimiidi interkalatsiooni. Kitsa avaga roostevabast terasest kolonnid (100 × 1,8 mm sisediameetriga) pakiti suspensioonpakendi abil. Hinnati viiest peptiidist (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliin) koosneva peptiidisegu PMP kolonni eraldamist (kromatograafiline jõudlus) ja inimese seerumi albumiini (HAS) trüpsiiniga lagundamist. Optimaalsetes elueerimistingimustes on peptiidisegu teoreetiline plaatide arv kuni 280 000 plaati/m². Võrreldes arendatud kolonni eraldusjõudlust kaubandusliku Ascentis Express RP-Amide kolonniga, oli täheldas, et PMP kolonni eraldusvõime oli eraldustõhususe ja lahutusvõime poolest kaubanduslikust kolonnist parem.
Viimastel aastatel on biofarmatseutiline tööstus muutunud laienevaks globaalseks turuks, mille turuosa on märkimisväärselt suurenenud. Biofarmatseutilise tööstuse plahvatusliku kasvuga1,2,3 on peptiidide ja valkude analüüs väga nõutud. Lisaks sihtpeptiidile tekib peptiidisünteesi käigus mitmeid lisandeid, mistõttu on soovitud puhtusega peptiidide saamiseks vaja kromatograafilist puhastamist. Kehavedelikes, kudedes ja rakkudes olevate valkude analüüsimine ja iseloomustamine on äärmiselt keeruline ülesanne, kuna ühes proovis on potentsiaalselt tuvastatavaid liike palju. Kuigi massispektromeetria on tõhus vahend peptiidide ja valkude sekveneerimiseks, ei ole selliste proovide ühekordne massispektromeetrisse süstimine ideaalne. Seda probleemi saab leevendada vedelikkromatograafia (LC) eraldamise rakendamisega enne MS-analüüsi, mis vähendab massispektromeetrisse antud ajahetkel sisenevate analüütide arvu4,5,6. Lisaks saab vedelfaasi eraldamise ajal analüüte fokuseerida kitsastesse piirkondadesse, kontsentreerides need analüüdid ja parandades MS-detektsiooni tundlikkust. Vedelkromatograafia (LC) on viimase kümnendi jooksul märkimisväärselt arenenud ja sellest on saanud proteoomikas populaarne tehnika. analüüs7,8,9,10.
Pöördfaasilist vedelikkromatograafiat (RP-LC) kasutatakse laialdaselt peptiidide segude puhastamiseks ja eraldamiseks, kasutades statsionaarse faasina oktadetsüülmodifitseeritud ränidioksiidi (ODS)11,12,13. RP statsionaarsed faasid ei taga aga oma keerulise struktuuri ja amfifiilse olemuse tõttu peptiidide ja valkude rahuldavat eraldamist14,15. Seetõttu on polaarsete ja mittepolaarsete osadega peptiidide ja valkude analüüsimiseks, et need analüüdid omavahel interakteeruksid ja neid säilitaksid, vaja spetsiaalselt loodud statsionaarseid faase16. Segatüüpi kromatograafia, mis pakub multimodaalseid interaktsioone, võib olla RP-LC alternatiiviks peptiidide, valkude ja muude keeruliste segude eraldamisel. On valmistatud mitu segatüüpi statsionaarset faasi ja nende faasidega täidetud kolonne on kasutatud peptiidide ja valkude eraldamiseks17,18,19,20,21. Segatüüpi statsionaarsed faasid (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaarne interkalatsioon/RPLC) sobivad peptiidide ja valkude eraldamiseks nii polaarsete kui ka mittepolaarsete osade olemasolu tõttu. rühmad22,23,24,25,26,27,28. Samamoodi näitavad kovalentselt seotud polaarsete rühmadega polaarsed interkaleeruvad statsionaarsed faasid head eraldusvõimet ja ainulaadset selektiivsust polaarsete ja mittepolaarsete analüütide suhtes, kuna eraldamine sõltub analüüdi ja statsionaarse faasi vahelisest interaktsioonist. Multimodaalsed interaktsioonid 29, 30, 31, 32. Hiljuti valmistasid Zhang jt 30 dodetsüülrühmaga termineeritud polüamiini statsionaarse faasi ja eraldasid edukalt süsivesinikke, antidepressante, flavonoide, nukleosiide, östrogeene ja mitmeid teisi analüüte. Polaarsel interkalaatoril on nii polaarsed kui ka mittepolaarsed rühmad, seega saab seda kasutada peptiidide ja valkude eraldamiseks, millel on nii hüdrofoobsed kui ka hüdrofiilsed osad. Polaarselt manustatud kolonnid (nt amiidiga manustatud C18 kolonnid) on kaubanduslikult saadaval kaubamärgi Ascentis Express RP-Amide kolonnide all, kuid neid kolonne kasutatakse ainult amiini 33 analüüsimiseks.
Käesolevas uuringus valmistati polaarselt manustatud statsionaarne faas (N-fenüülmaleimiidiga manustatud polüstüreen) ja hinnati selle abil peptiidide ja HSA trüpsiini lagundite eraldamist. Statsionaarne faas valmistati järgmise strateegia abil. Poorsed ränidioksiidiosakesed valmistati vastavalt meie eelmises publikatsioonis kirjeldatud protseduurile, tehes ettevalmistusprotokollis mõningaid muudatusi. Uurea, polüetüleenglükooli (PEG), TMOS-i, vee ja äädikhappe suhet reguleeriti, et valmistada suure poorisuurusega ränidioksiidiosakesi. Teiseks sünteesiti uus ligand, fenüülmaleimiidmetüülvinüülisotsüanaat, ja seda kasutati ränidioksiidiosakeste derivatiseerimiseks, et valmistada polaarne manustatud statsionaarne faas. Saadud statsionaarne faas pakiti roostevabast terasest kolonni (100 × 1,8 mm sisediameeter), kasutades optimeeritud pakkimisskeemi. Kolonni täitmist abistatakse mehaanilise vibratsiooniga, et tagada kolonnis homogeense kihi moodustumine. Hinnake viiest peptiidist koosnevate peptiidisegude pakkitud kolonni eraldamist; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliin) ja inimese seerumi albumiini (HAS) trüpsiiniga töödeldud peptiidide segu. Täheldati, et HSA peptiidide segu ja trüpsiiniga töödeldud peptiidid eralduvad hea lahutusvõime ja efektiivsusega. PMP kolonni eraldusvõimet võrreldi Ascentis Express RP-Amide kolonni omaga. Nii peptiidid kui ka valgud osutusid PMP kolonnil hästi lahutuvaks ja efektiivseks, kusjuures kolonn oli efektiivsem kui Ascentis Express RP-Amide kolonn.
PEG (polüetüleenglükool), uurea, äädikhape, trimetoksüortosilikaat (TMOS), trimetüülklorosilaan (TMCS), trüpsiin, inimese seerumi albumiin (HSA), ammooniumkloriid, uurea, heksaanmetüüldisilasaan (HMDS), metakrüloüülkloriid (MC), stüreen, 4-hüdroksü-TEMPO, bensoüülperoksiid (BPO), HPLC-kvaliteediga atsetonitriil (ACN), metanool, 2-propanool ja atsetoon. Ostetud firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Karbamiidi (8 g), polüetüleenglükooli (8 g) ja 8 ml 0,01 N äädikhappe segu segati 10 minutit ja seejärel lisati jääkülmas keskkonnas 24 ml TMOS-i. Reaktsioonisegu kuumutati 6 tundi temperatuuril 40 °C ja seejärel 8 tundi temperatuuril 120 °C roostevabast terasest autoklaavis. Vesi valati ära ja järelejäänud materjali kuivatati 12 tundi temperatuuril 70 °C. Kuivatatud pehme mass jahvatati ahjus siledaks ja kaltsineeriti 12 tundi temperatuuril 550 °C. Valmistati kolm partiid ja iseloomustati neid, et uurida osakeste suuruse, pooride suuruse ja pindala reprodutseeritavust.
Ränidioksiidi osakeste pinna modifitseerimisel eelnevalt sünteesitud ligandi fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadiga (PCMP) ja sellele järgneval radiaalsel polümerisatsioonil stüreeniga valmistati polaarseid rühmi sisaldav ühend. Statsionaarne faas agregaatide ja polüstüreenikettide jaoks. Valmistamisprotsessi kirjeldatakse allpool.
N-fenüülmaleimiid (200 mg) ja metüülvinüülisotsüanaat (100 mg) lahustati kuivas tolueenis ning reaktsioonikolbi lisati 0,1 ml 2,2'-asoisobutüronitriili (AIBN), et valmistada fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadi kopolümeer (PMCP). Segu kuumutati temperatuuril 60 °C 3 tundi, filtriti ja kuivatati ahjus temperatuuril 40 °C 3 tundi.
Kuivatatud ränidioksiidiosakesed (2 g) dispergeeriti kuivas tolueenis (100 ml), segati ja sonikeeriti 500 ml ümarapõhjalises kolvis 10 minutit. PMCP (10 mg) lahustati tolueenis ja lisati tilkhaaval reaktsioonikolbi tilgutuslehtri kaudu. Segu keedeti tagasijooksul temperatuuril 100 °C 8 tundi, filtreeriti, pesti atsetooniga ja kuivatati temperatuuril 60 °C 3 tundi. Seejärel lahustati PMCP-ga seotud ränidioksiidiosakesed (100 g) tolueenis (200 ml) ja lisati 4-hüdroksü-TEMPO (2 ml) 100 µl dibutüültinadilauraati katalüsaatorina. Segu segati temperatuuril 50 °C 8 tundi, filtreeriti ja kuivatati temperatuuril 50 °C 3 tundi.
Stüreen (1 ml), bensoüülperoksiid BPO (0,5 ml) ja TEMPO-PMCP-ga seotud ränidioksiidiosakesed (1,5 g) dispergeeriti tolueenis ja puhuti läbi lämmastikuga. Stüreeni polümerisatsioon viidi läbi temperatuuril 100 °C 12 tunni jooksul. Saadud produkti pesti metanooliga ja kuivatati temperatuuril 60 °C üleöö. Üldine reaktsiooniskeem on näidatud joonisel 1.
Proove degaseeriti temperatuuril 393 K 1 tund, et saada jääkrõhk alla 10-3 Torri. Pooride kogumahu määramiseks kasutati suhtelise rõhu P/P0 = 0,99 juures adsorbeerunud N2 hulka. Paljaste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste morfoloogiat uuriti skaneeriva elektronmikroskoopia abil (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jaapan). Kuivatatud proovid (paljas ränidioksiid ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakesed) asetati alumiiniumkolonnile kleeplindi abil. Proovidele kanti kuld Q150T pihustuskatmismasina abil ja proovidele sadestati 5 nm Au kiht. See parandab protsessi efektiivsust madalate pingete kasutamisel ja tagab peeneteralise külma pihustamise. Elementanalüüsiks kasutati Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementanalüsaatorit. Osakeste suurusjaotuse saamiseks kasutati Malvern (Worcestershire, Ühendkuningriik) Mastersizer 2000 osakeste suuruse analüsaatorit. Paljad ränidioksiidi osakesed ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakesed. (5 mg igaüks) dispergeeriti 5 ml isopropanoolis, sonikeeriti 10 minutit, segati vorteksil 5 minutit ja asetati Mastersizeri optilisele lauale. Termogravimeetriline analüüs viidi läbi kiirusega 5 °C minutis temperatuurivahemikus 30 kuni 800 °C.
Klaasvooderdatud roostevabast terasest kitsa avaga kolonnid mõõtmetega (100 × 1,8 mm sisediameeter) pakiti suspensiooni pakkimismeetodil, rakendades sama protseduuri, mida kasutati viites. 31. Roostevabast terasest kolonn (klaasvooderdatud, 100 × 1,8 mm sisediameeter) koos 1 µm fritiga väljalaskeühendusega ühendati suspensioonipakendiga (Alltech Deerfield, IL, USA). Valmistage statsionaarse faasi suspensioon, suspendeerides 150 mg statsionaarset faasi 1,2 ml metanoolis ja suunates selle säilituskolonni. Metanooli kasutati suspensiooni lahustina ja propellendina. Täitke kolonn järjestikku, rakendades rõhku 100 MP 10 minutit, 80 MP 15 minutit ja 60 MP 30 minutit. Pakkimise ajal rakendati mehaanilist vibratsiooni kahe GC kolonni loksutiga (Alltech, Deerfield, IL, USA), et tagada kolonni ühtlane täitmine. Sulgege suspensioonipakend ja vabastage rõhk aeglaselt, et vältida kolonni kahjustusi. Ühendage kolonn suspensioonipakendist lahti ja ühendage teine ​​​​liitmik sisselaskeava ja LC-süsteemiga, et kontrollida selle toimivust.
LC-pump (10AD Shimadzu, Jaapan), injektor (Valco (USA) C14 W.05) 50nL süstimissilmusega, membraandegaseerija (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillaaraken, spetsiaalne µLC-seade, detektor (UV-2075) ja klaasvooderdatud mikrokolonnid. Kasutati väga kitsaid ja lühikesi ühendustorusid, et minimeerida kolonni riba täiendava laienemise mõju. Pärast pakendamist paigaldati redutseeriva ühenduskoha 1/16″ väljundisse kapillaarid (50 μm sisediameetriga 365) ja redutseeriva ühenduskoha kapillaarid (50 μm). Andmete kogumine ja kromatograafiline töötlemine viidi läbi Multichro 2000 tarkvara abil. Jälgimine lainepikkusel 254 nm. Analüüte testiti UV-neeldumise suhtes. Kromatograafilisi andmeid analüüsiti OriginPro8 (Northampton, MA) abil.
Inimese seerumist pärinev albumiin, lüofiliseeritud pulber, ≥ 96% (agaroosgeelelektroforees) 3 mg segatud trüpsiini (1,5 mg), 4,0 M uurea (1 ml) ja 0,2 M ammooniumvesinikkarbonaadiga (1 ml). Lahust segati 10 minutit ja hoiti veevannis temperatuuril 37 °C 6 tundi, seejärel kustutati reaktsioon 1 ml 0,1% TFA-ga. Filtreeri lahus ja säilita temperatuuril alla 4 °C.
Peptiidisegude ja HSA trüpsiini seedimisega saadud produktide eraldamist hinnati eraldi PMP kolonnidel. Kontrollige peptiidisegu ja HSA trüpsiini seedimisega saadud produktide eraldamist PMP kolonni abil ning võrrelge tulemusi Ascentis Express RP-Amide kolonni tulemustega. Teoreetiline plaatide arv arvutatakse järgmiselt:
Paljaste ränidioksiidiosakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidiosakeste SEM-kujutised on näidatud joonisel FIG 2. Paljaste ränidioksiidiosakeste (A, B) SEM-kujutised näitavad, et erinevalt meie varasematest uuringutest on need osakesed sfäärilised, kusjuures osakesed on piklikud või ebakorrapärase sümmeetriaga. Ligandiga seotud ränidioksiidiosakeste (C, D) pind on siledam kui paljastel ränidioksiidiosakestel, mis võib olla tingitud polüstüreenikettide katmisest ränidioksiidiosakeste pinnal.
Paljaste ränidioksiidiosakeste (A, B) ja ligandiga seotud ränidioksiidiosakeste (C, D) skaneeriva elektronmikroskoobi pildid.
Paljaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste suurusjaotus on näidatud joonisel 3(A). Mahupõhised osakeste suurusjaotuse kõverad näitasid, et ränidioksiidi osakeste suurus suurenes pärast keemilist modifitseerimist (joonis 3A). Käesoleva ja eelmise uuringu ränidioksiidi osakeste suurusjaotuse andmeid on võrreldud tabelis 1(A). PMP mahupõhine osakeste suurus d(0,5) on 3,36 μm, võrreldes meie eelmise uuringuga, mille ad(0,5) väärtus oli 3,05 μm (polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakesed)34. Sellel partiil oli kitsam osakeste suurusjaotus võrreldes meie eelmise uuringuga, mis on tingitud PEG, uurea, TMOS ja äädikhappe erinevatest suhetest reaktsioonisegus. PMP faasi osakeste suurus on veidi suurem kui polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakeste faasil, mida me varem uurisime. See tähendab, et ränidioksiidi osakeste pinna funktsionaliseerimine stüreeniga sadestas ränidioksiidi pinnale ainult polüstüreeni kihi (0,97 µm), samas kui PMP faasis oli kihi paksus 1,38 µm.
Paljaste ränidioksiidiosakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidiosakeste osakeste suurusjaotus (A) ja poorisuurusjaotus (B).
Käesoleva uuringu ränidioksiidi osakeste pooride suurus, pooride maht ja pindala on esitatud tabelis 1(B). Paljaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste PSD profiilid on näidatud joonisel 3(B). Tulemused on võrreldavad meie eelmise uuringuga. Paljaste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste pooride suurused on vastavalt 310 ja 241, mis näitab, et pooride suurus väheneb pärast keemilist modifitseerimist 69 võrra, nagu on näidatud tabelis 1(B), ja kõvera muutus on näidatud joonisel 3(B). Sarnaselt vähenes ränidioksiidi osakeste pooride maht pärast keemilist modifitseerimist 0,67-lt 0,58 cm3/g-ni. Praegu uuritud ränidioksiidi osakeste eripind on 116 m2/g, mis on võrreldav meie eelmise uuringuga (124 m2/g). Nagu on näidatud tabelis 1(B), vähenes ränidioksiidi osakeste pindala (m2/g) samuti 116 m2/g-lt 105 m2/g-ni pärast... keemiline modifitseerimine.
Statsionaarse faasi elementanalüüsi tulemused on esitatud tabelis 2. Praeguse statsionaarse faasi süsinikusisaldus on 6,35%, mis on madalam kui meie eelmise uuringu süsinikusisaldus (polüstüreeniga seotud ränidioksiidiosakesed vastavalt 7,93%35 ja 10,21%)42. Praeguse statsionaarse faasi süsinikusisaldus on madal, kuna praeguse SP valmistamisel kasutati lisaks stüreenile ka mõningaid polaarseid ligande, näiteks fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaati (PCMP) ja 4-hüdroksü-TEMPO-d. Praeguse statsionaarse faasi lämmastiku massiprotsent on 2,21%, võrreldes varasemate uuringute vastavalt 0,1735 ja 0,85 massiprotsendilise lämmastikuga. See tähendab, et lämmastiku massiprotsent on praeguses statsionaarses faasis fenüülmaleimiidi tõttu suurem. Samamoodi oli saaduste (4) ja (5) süsinikusisaldus vastavalt 2,7% ja 2,9%, samas kui lõppsaaduse (6) süsinikusisaldus oli 6,35%, nagu on näidatud tabelis 2. Kaalukaotust kontrolliti PMP statsionaarse faasiga ja TGA kõver on näidatud joonisel 4. TGA kõver näitab 8,6% kaalukaotust, mis on heas kooskõlas süsiniku sisaldusega (6,35%), kuna ligandid sisaldavad lisaks C-le ka N, O ja H.
Ränidioksiidi osakeste pinna modifitseerimiseks valiti fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaatligand, kuna sellel on polaarsed fenüülmaleimiidrühmad ja vinüülisotsüanaatrühmad. Vinüülisotsüanaatrühmad saavad stüreeniga edasi reageerida elava radikaalpolümerisatsiooni teel. Teine põhjus on sellise rühma sisestamine, millel on analüüdiga mõõdukas interaktsioon ja millel puudub tugev elektrostaatiline interaktsioon analüüdi ja statsionaarse faasi vahel, kuna fenüülmaleimiidosa ei oma normaalse pH juures virtuaalset laengut. Statsionaarse faasi polaarsust saab kontrollida stüreeni optimaalse koguse ja vabade radikaalide polümerisatsiooni reaktsiooniaja abil. Reaktsiooni viimane etapp (vabade radikaalide polümerisatsioon) on kriitiline ja võib muuta statsionaarse faasi polaarsust. Nende statsionaarsete faaside süsinikusisalduse kontrollimiseks viidi läbi elementanalüüs. Täheldati, et stüreeni koguse ja reaktsiooniaja suurendamine suurendas statsionaarse faasi süsinikusisaldust ja vastupidi. Erineva stüreeni kontsentratsiooniga valmistatud SP-del on erinev süsinikusisaldus. Laadige need statsionaarsed faasid uuesti roostevabast terasest kolonnidesse ja kontrollige nende kromatograafilist jõudlust (selektiivsus, lahutusvõime, N-väärtus jne). Nende katsete põhjal... PMP statsionaarse faasi valmistamiseks valiti optimeeritud koostis, et tagada kontrollitud polaarsus ja hea analüüdi retentsioon.
PMP kolonni ja mobiilse faasi abil hinnati ka viit peptiidisegu (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliin); 60/40 (v/v) atsetonitriil/vesi (0,1% TFA) voolukiirusel 80 μL/min. Optimaalsetes elueerimistingimustes on teoreetiline plaatide arv (N) kolonni (100 × 1,8 mm sisediameeter) kohta 20 000 ± 100 (200 000 plaati/m²). Tabel 3 annab N väärtused kolme PMP kolonni kohta ja kromatogrammid on näidatud joonisel 5A. Kiire analüüs PMP kolonnil suure voolukiirusega (700 μL/min), viis peptiidi elueeriti ühe minuti jooksul, N väärtused olid väga head, 13 500 ± 330 kolonni (100 × 1,8 mm sisediameeter) kohta, mis vastab 135 000 plaadile/m (joonis 5B). Kolm identse suurusega kolonni (100 × 1,8 mm sisediameeter) täideti kolme erineva partiiga PMP statsionaarse faasiga, et kontrollida reprodutseeritavust. Analüüt Iga kolonni kontsentratsioon registreeriti optimaalsete elueerimistingimuste ja teoreetiliste taldrikute arvu N ning retentsiooniaja abil, et eraldada sama testsegu igal kolonnil. PMP kolonnide reprodutseeritavuse andmed on esitatud tabelis 4. PMP kolonni reprodutseeritavus korreleerub hästi väga madalate %RSD väärtustega, nagu on näidatud tabelis 3.
Peptiidisegu eraldamine PMP kolonnil (B) ja Ascentis Express RP-Amide kolonnil (A); liikuv faas 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonni mõõtmed (100 × 1,8 mm sisediameeter); analüütiline. Ühendite elueerimisjärjekord: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ja 5 (leutsiin) (happe enkefaliin).
PMP kolonni (100 × 1,8 mm sisediameetriga) hinnati inimese seerumi albumiini trüptiliste lõhustumissaaduste eraldamise võimet kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil. Joonisel 6 olev kromatogramm näitab, et proov on hästi eraldatud ja lahutusvõime on väga hea. HSA lõhustussaadusi analüüsiti voolukiirusel 100 µL/min, liikuva faasi segus atsetonitriil/vesi 70/30 ja 0,1% TFA-s. Nagu kromatogrammil (joonis 6) näidatud, on HSA lõhustussaad jagatud 17 piigiks, mis vastavad 17 peptiidile. Arvutati iga piigi eraldamise efektiivsus HSA lõhustussaadus ja väärtused on esitatud tabelis 5.
HSA trüptilise lagundamise teel saadud produkt (100 × 1,8 mm sisediameetriga) lahutati PMP kolonnil; voolukiirus (100 µL/min), liikuv faas 60/40 atsetonitriil/vesi koos 0,1% TFA-ga.
kus L on kolonni pikkus, η on liikuva faasi viskoossus, ΔP on kolonni vasturõhk ja u on liikuva faasi lineaarkiirus. PMP kolonni läbilaskvus oli 2,5 × 10-14 m2, voolukiirus oli 25 μL/min ja kasutati 60/40 v/v ACN/vett. PMP kolonni (100 × 1,8 mm sisediameetriga) läbilaskvus oli sarnane meie eelmise uuringu Ref.34 omaga. Pinnapoorsete osakestega täidetud kolonni läbilaskvus on: 1,7 × 10-15 1,3 μm osakeste puhul, 3,1 × 10-15 1,7 μm osakeste puhul, 5,2 × 10-15 ja 2,5 × 10-14 m2 2,6 μm osakeste puhul. 5 μm osakeste puhul 43. Seega on PMP faasi läbilaskvus sarnane 5 μm südamik-kest osakeste omaga.
kus Wx on kloroformiga täidetud kolonni mass, Wy on metanooliga täidetud kolonni mass ja ρ on lahusti tihedus. Metanooli (ρ = 0,7866) ja kloroformi (ρ = 1,484) tihedused. Eelnevalt uuritud SILICA ARTICLES-C18 kolonnide (100 × 1,8 mm sisediameetriga) 34 ja C18-Urea kolonnide 31 kogupoorsus oli vastavalt 0,63 ja 0,55. See tähendab, et uurea ligandide olemasolu vähendab statsionaarse faasi läbilaskvust. Teisest küljest on PMP kolonni (100 × 1,8 mm sisediameetriga) kogupoorsus 0,60. PMP kolonnide läbilaskvus on madalam kui C18-seotud ränidioksiidi osakestega täidetud kolonnidel, kuna C18-tüüpi statsionaarsetes faasides on C18 ligandid ränidioksiidi osakeste külge kinnitunud lineaarsete ahelatena, samas kui polüstüreeni tüüpi statsionaarsetes faasides moodustub selle ümber suhteliselt paks polümeerkiht. Ühes tüüpilises katses arvutatakse kolonni poorsus järgmiselt:
Joonisel 7A, B on näidatud van Deemteri graafiku PMP kolonn (100 × 1,8 mm sisediameeter) ja Ascentis Express RP-Amide kolonn (100 × 1,8 mm sisediameeter), kasutades samu elueerimistingimusi (st 60/40 ACN/H2O ja 0,1% TFA). Valitud peptiidisegud (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliin) valmistati mahus 20 µL/min. Mõlema kolonni minimaalne voolukiirus on 800 µL/min. PMP kolonni ja Ascentis Express RP-Amide kolonni optimaalse voolukiiruse (80 µL/min) minimaalsed HETP väärtused olid vastavalt 2,6 µm ja 3,9 µm. HETP väärtused näitavad, et PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) eraldustõhusus on palju parem kui kaubanduslikult saadaval Ascentis Express RP-Amide kolonnil (100 × 1,8 mm id). Van Deemteri graafik joonisel 7(A) näitab, et N väärtuse vähenemine voolu suurenemisega ei ole meie eelmise uuringuga võrreldes oluline. PMP kolonni (100 × 1,8 mm id) suurem eraldustõhusus võrreldes Ascentis Express RP-amiidi kolonni lisamine põhineb käesolevas töös kasutatavate osakeste kuju, suuruse ja keerukate kolonni pakkimisprotseduuride täiustustel34.
(A) van Deemteri graafik (HETP versus liikuva faasi lineaarkiirus), mis on saadud PMP kolonni (100 × 1,8 mm sisediameeter) abil 60/40 ACN/H2O lahuses koos 0,1% TFA-ga. (B) van Deemteri graafik (HETP versus liikuva faasi lineaarkiirus), mis on saadud Ascentis Express RP-Amide kolonni (100 × 1,8 mm sisediameeter) abil 60/40 ACN/H2O lahuses koos 0,1% TFA-ga.
Valmistati polaarselt manustatud polüstüreenist statsionaarne faas ja seda hinnati sünteetiliste peptiidisegude ja inimese seerumi albumiini (HAS) trüpsiiniga lagundatud saaduste eraldamiseks kõrgefektiivses vedelikkromatograafias. PMP-kolonnide kromatograafiline jõudlus peptiidisegude puhul on suurepärane nii eraldamise efektiivsuse kui ka lahutusvõime osas. PMP-kolonnide parem eraldamise jõudlus tuleneb mitmest põhjusest, näiteks ränidioksiidi osakeste suurusest ja pooride suurusest, statsionaarse faasi kontrollitud sünteesist ja kolonni keerulisest täidisest. Lisaks kõrgele eraldamise efektiivsusele on selle statsionaarse faasi teine ​​eelis madal kolonni vasturõhk suure voolukiiruse juures. PMP-kolonnidel on hea reprodutseeritavus ja neid saab kasutada peptiidisegude analüüsimiseks ja erinevate valkude trüpsiiniga lagundamiseks. Kavatseme seda kolonni kasutada looduslike saaduste, ravimtaimede bioaktiivsete ühendite ja seeneekstraktide eraldamiseks vedelikkromatograafias. Tulevikus hinnatakse PMP-kolonne ka valkude ja monoklonaalsete antikehade eraldamiseks.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Peptiidide eraldussüsteemide uuring pöördfaasikromatograafia abil. I osa: kolonni iseloomustamise protokolli väljatöötamine. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. jt. Täiustatud aktiivsed peptiidid, mis on loodud nakkushaiguste raviks. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sünteetilised terapeutilised peptiidid: teadus ja turg. Ravimite avastamine. 15 (1-2) tänapäeval, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ja Shen, Y. Täiustatud proteoomiline vedelikkromatograafia. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. jt. Täiustatud vedelikkromatograafia-massispektromeetria võimaldab laialdaselt sihitud metaboloomika ja proteoomika kaasamist. päraku piirkond. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ja Salisbury, JJ. UHPLC roll ravimite väljatöötamisel. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. ja Clausen, AM. Ülikõrgsurvevedelikkromatograafia põhialused ja praktilised aspektid kiireks lahutamiseks. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ülikõrgefektiivse vedelikkromatograafia rakendamine ravimite väljatöötamisel. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. jt. Õli-vees kõrge sisemise faasi sisaldusega emulsioonidest valmistatud monoliitsed makropoorsed hüdrogeelid enteroviiruste tõhusaks puhastamiseks. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ja Wilkins, JA. Vedelikkromatograafia roll proteoomikas. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. ja Guillarme, D. Terapeutiliste peptiidide ja valkude pöördfaasilise vedelikkromatograafia eraldamise uued trendid: teooria ja rakendused. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ja Gebler, JC. Peptiidide kahemõõtmeline eraldamine RP-RP-HPLC süsteemi abil, kasutades esimeses ja teises eraldamisdimensioonis erinevaid pH väärtusi. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. jt. Uuriti C18 alla 2 μm täis- ja pealiskaudselt poorsete osakestega täidetud suure efektiivsusega kromatograafiliste kolonnide massiülekande omadusi ja kineetilist jõudlust. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. jt. Hiljutised trendid ja analüütilised väljakutsed taimede bioaktiivsete peptiidide eraldamisel, identifitseerimisel ja valideerimisel. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB jt. Eluriigi proteoomiline maastik. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. jt. Terapeutiliste peptiidide edasine töötlemine preparatiivse vedelikkromatograafia abil. Molecule (Basel, Šveits) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Segatud režiimiga kromatograafia ja selle rakendamine biopolümeeridel. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. ja Sun, Y. Ligandid segatüüpi valgukromatograafia jaoks: põhimõte, iseloomustus ja disain. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).