Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie brauseriversioon toetab piiratud CSS-i. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada ajakohast brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Lisaks kuvame saiti pideva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Kuvab korraga kolmest slaidist koosneva karusselli. Kolme slaidi korraga läbimiseks kasutage nuppe Eelmine ja Järgmine või kolme slaidi korraga läbimiseks lõpus olevaid liuguri nuppe.
Poorsed ränidioksiidiosakesed valmistati sool-geelmeetodil, tehes laiapooriliste osakeste saamiseks mõningaid modifikatsioone. Need osakesed derivatiseeriti N-fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaadiga (PMI) ja stüreeniga pöördahela ülekande-fragmentatsiooni (RAFT) polümerisatsiooni teel, et saada N-fenüülmaleimiidiga interkaleeritud polüamiide. Stüreeni (PMP) statsionaarne faas. Kitsa avaga roostevabast terasest kolonnid (siseläbimõõt 100 × 1,8 mm) täideti suspensioonitäidisega. PMP kolonni kromatograafilist jõudlust hinnati, et eraldada viiest peptiidist (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminohappe enkefaliin) ja inimese seerumi albumiini (HAS) trüptilisest hüdrolüsaadist koosnev sünteetiliste peptiidide segu. Optimaalsetes elueerimistingimustes ulatus peptiidide seguga plaatide teoreetiline arv 280 000 plaadini ruutmeetri kohta. Arendatud kolonni eraldusvõimet võrreldes kaubandusliku Ascentis Express RP-Amide kolonniga täheldati, et PMP kolonni eraldusvõime oli eraldusvõime ja lahutusvõime osas kaubanduslikust kolonnist parem.
Biofarmatseutiline tööstus on viimastel aastatel muutunud laienevaks globaalseks turuks, mille turuosa on märkimisväärselt suurenenud. Biofarmatseutilise tööstuse plahvatusliku kasvuga1,2,3 on suur vajadus peptiidide ja valkude analüüsi järele. Lisaks sihtpeptiidile tekivad peptiidide sünteesi käigus mitmesugused lisandid, seega on peptiidi soovitud puhtuse saavutamiseks vaja kromatograafilist puhastamist. Kehavedelikes, kudedes ja rakkudes olevate valkude analüüsimine ja iseloomustamine on äärmiselt keeruline ülesanne, kuna ühes proovis on palju potentsiaalselt tuvastatavaid liike. Kuigi massispektromeetria on tõhus vahend peptiidide ja valkude sekveneerimiseks, on selliste proovide otse massispektromeetrisse sisestamisel eraldamine ebarahuldav. Selle probleemi saab lahendada vedelikkromatograafia (LC) läbiviimisega enne MS-analüüsi, mis vähendab massispektromeetrisse antud ajahetkel sisenevate analüütide hulka4,5,6. Lisaks saavad analüüdid vedelfaasi eraldamise ajal kontsentreeruda kitsasse piirkonda, kontsentreerides seeläbi neid analüüte ja suurendades MS-detektsiooni tundlikkust. Vedelkromatograafia (LC) on viimase kümnendi jooksul märkimisväärselt arenenud ja sellest on saanud laialdaselt kasutatav proteoomilise analüüsi meetod .
Pöördfaasilist vedelikkromatograafiat (RP-LC) kasutatakse laialdaselt peptiidide segude puhastamiseks ja eraldamiseks, kasutades statsionaarse faasina oktadetsüülmodifitseeritud ränidioksiidi (ODS)11,12,13. Kuid oma keerulise struktuuri ja amfoteerse olemuse tõttu14,15 ei saa RP statsionaarsed faasid tagada peptiidide ja valkude rahuldavat eraldamist. Seetõttu nõuab polaarsete ja mittepolaarsete fragmentidega peptiidide ja valkude analüüs spetsiaalselt loodud statsionaarseid faase, mis interakteeruvad ja säilitavad need analüüdid16. Segatud kromatograafia, mis pakub multimodaalseid interaktsioone, võib olla RP-LC alternatiiviks peptiidide, valkude ja muude keeruliste segude eraldamiseks. Valmistati mitu segatüüpi statsionaarset faasi ja nende statsionaarsete faasidega täidetud kolonne kasutati peptiidide ja valkude eraldamiseks17,18,19,20,21. Polaarsete ja mittepolaarsete rühmade olemasolu tõttu sobivad peptiidide ja valkude eraldamiseks segatüüpi statsionaarsed faasid (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaarne interkalatsioon/RPLC)22,23,24,25,26,27,28. Kovalentselt seotud polaarsete rühmadega polaarsed interkaleeritud statsionaarsed faasid näitavad head eraldusvõimet ja ainulaadset selektiivsust nii polaarsete kui ka mittepolaarsete analüütide suhtes, kuna eraldamine sõltub analüüdi ja statsionaarse faasi vahelisest interaktsioonist. Multimodaalsed interaktsioonid 29,30,31,32. Hiljuti said Zhang jt 30 polüamiinide behenüül-terminaalseid statsionaarseid faase ja eraldasid edukalt süsivesinikke, antidepressante, flavonoide, nukleosiide, östrogeene ja mõningaid teisi analüüte. Polaarsel statsionaarsel materjalil on nii polaarsed kui ka mittepolaarsed rühmad, seega saab seda kasutada peptiidide ja valkude eraldamiseks hüdrofoobseteks ja hüdrofiilseteks osadeks. Polaarsed sisemised kolonnid (nt C18 kolonnid amiidiga) on saadaval kaubamärgi Ascentis Express RP-Amide kolonnide all, kuid neid kolonne on kasutatud ainult amiini 33 analüüsimiseks.
Käesolevas uuringus valmistati polaarne statsionaarne faas (N-fenüülmaleimiid, polüstüreen) ja hinnati selle peptiidide eraldamist ja trüptilise HSA lõhustamist. Statsionaarse faasi valmistamiseks kasutati järgmist strateegiat. Poorsed ränidioksiidiosakesed valmistati vastavalt meie varasemates publikatsioonides kirjeldatud protseduuridele, tehes mõningaid muudatusi valmistamisskeemides 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Uurea, polüetüleenglükooli (PEG), TMOS-i ja vesilahuse-äädikhappe suhteid kohandati, et saada suure poorisuurusega ränidioksiidiosakesi. Teiseks sünteesiti uus fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaatligand ja selle derivatiseeritud ränidioksiidiosakesi kasutati polaarsete statsionaarsete faaside valmistamiseks. Saadud statsionaarne faas pakiti roostevabast terasest kolonni (siseläbimõõt 100 × 1,8 mm) vastavalt optimeeritud pakkimisskeemile. Kolonni täitmist hõlbustab mehaaniline vibratsioon, et tagada kolonnis ühtlane kiht. Täidetud kolonni hinnati viiest peptiidist (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliinpeptiid) koosneva peptiidide segu ja inimese seerumi albumiini (HSA) trüptiliste hüdrolüsaatide eraldamise osas. Täheldati, et peptiidide segu ja HSA trüptilise digestiooniga saadud saadus eraldusid hea lahutusvõime ja efektiivsusega. PMP kolonni eraldamise efektiivsust võrreldi Ascentis Express RP-Amide kolonni omaga. Täheldati, et peptiididel ja valkudel on PMP kolonnil hea lahutusvõime ja kõrge eraldamise efektiivsus ning PMP kolonni eraldamise efektiivsus on kõrgem kui Ascentis Express RP-Amide kolonnil.
PEG (polüetüleenglükool), uurea, äädikhape, trimetoksüortosilikaat (TMOS), trimetüülklorosilaan (TMCS), trüpsiin, inimese seerumi albumiin (HSA), ammooniumkloriid, uurea, heksametüülmetakrüloüüldisilasaan (HMDS), metakrüloüülkloriid (MC), stüreen, 4-hüdroksü-TEMPO, bensoüülperoksiid (BPO), atsetonitriil (ACN) HPLC jaoks, metanool, 2-propanool ja atsetoon. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Karbamiidi (8 g), polüetüleenglükooli (8 g) ja 8 ml 0,01 N äädikhappe segu segati 10 minutit ja seejärel lisati jääga jahutades 24 ml TMOS-i. Reaktsioonisegu kuumutati roostevabast terasest autoklaavis temperatuuril 40 °C 6 tundi ja seejärel temperatuuril 120 °C 8 tundi. Vesi dekanteeriti ja jääki kuivatati temperatuuril 70 °C 12 tundi. Kuivatatud pehmed klotsid jahvatati siledaks ja kaltsineeriti ahjus temperatuuril 550 °C 12 tundi. Valmistati kolm partiid ja iseloomustati neid, et testida osakeste suuruste, pooride suuruse ja pindala reprodutseeritavust.
Polüstüreenist ahelate polaarne rühm ja statsionaarne faas. Valmistamisprotseduur on kirjeldatud allpool.
N-fenüülmaleimiid (200 mg) ja metüülvinüülisotsüanaat (100 mg) lahustati veevabas tolueenis ning seejärel lisati reaktsioonikolbi 0,1 ml 2,2'-asoisobutüronitriili (AIBN), et saada fenüülmaleimiidi ja metüülvinüülisotsüanaadi (PMCP) kopolümeer. ) Segu kuumutati temperatuuril 60 °C 3 tundi, filtriti ja kuivatati ahjus temperatuuril 40 °C 3 tundi.
Kuivatatud ränidioksiidiosakesed (2 g) dispergeeriti kuivas tolueenis (100 ml), segati ja sonikeeriti 10 minutit 500 ml ümarapõhjalises kolvis. PMCP (10 mg) lahustati tolueenis ja lisati tilkhaaval reaktsioonikolbi tilklehtri kaudu. Segu keedeti püstjahutiga temperatuuril 100 °C 8 tundi, filtriti, pesti atsetooniga ja kuivatati temperatuuril 60 °C 3 tundi. Seejärel lahustati PMCP-ga (100 g) seotud ränidioksiidiosakesed tolueenis (200 ml) ja lisati 4-hüdroksü-TEMPO (2 ml) 100 μl dibutüültinadilauraadi katalüsaatori juuresolekul. Segu segati temperatuuril 50 °C 8 tundi, filtriti ja kuivatati temperatuuril 50 °C 3 tundi.
Stüreen (1 ml), bensoüülperoksiid BPO (0,5 ml) ja TEMPO-PMCP-le (1,5 g) kinnitatud ränidioksiidiosakesed dispergeeriti tolueenis ja puhuti läbi lämmastikuga. Stüreeni polümerisatsioon viidi läbi temperatuuril 100 °C 12 tundi. Saadud produkti pesti metanooliga ja kuivatati üleöö temperatuuril 60 °C. Reaktsiooni üldine skeem on näidatud joonisel 1.
Proove degaseeriti temperatuuril 393 K 1 tund, kuni jääkrõhk oli alla 10–3 Torri. Pooride kogumahu määramiseks kasutati suhtelise rõhu P/P0 = 0,99 juures adsorbeerunud N2 hulka. Puhaste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste morfoloogiat uuriti skaneeriva elektronmikroskoobi abil (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jaapan). Kuivad proovid (puhas ränidioksiid ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakesed) asetati süsiniklindi abil alumiiniumvardadele. Kuld sadestati proovile Q150T pihustusseadme abil ja proovile sadestati 5 nm paksune Au kiht. See parandab madalpinge protsessi efektiivsust ja tagab peene külmpihustamise. Elementanalüüs viidi läbi Thermo Electroni (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementkoostise analüsaatoriga. Osakeste suurusjaotuse saamiseks kasutati Malverni osakeste suurusanalüsaatorit (Worcestershire, Ühendkuningriik) Mastersizer 2000. Katmata ränidioksiidiosakesed ja ligandiga seotud ränidioksiidiosakesed (igaüks 5 mg) dispergeeriti 5 ml isopropanoolis, sonikeeriti 10 minutit, loksutati 5 minutit ja asetati Mastersizer optilisele lauale. Termogravimeetrilist analüüsi viidi läbi kiirusega 5 °C minutis temperatuurivahemikus 30 kuni 800 °C.
Klaaskiuga vooderdatud kitsa avaga roostevabast terasest kolonnid mõõtmetega (ID 100 × 1,8 mm) täideti suspensiooni täitmise meetodil, järgides sama protseduuri nagu viites 31. Roostevabast terasest kolonn (klaasvooderdatud, ID 100 × 1,8 mm) ja 1 µm fritti sisaldav väljalaskeava ühendati suspensiooni pakkimismasinaga (Alltech Deerfield, IL, USA). Valmistage statsionaarse faasi suspensioon, suspendeerides 150 mg statsionaarset faasi 1,2 ml metanoolis ja viies selle reservuaarkolonni. Metanooli kasutati suspensiooni lahustina ja kontrolllahustina. Täitke kolonn rõhujärjestusega 100 MP 10 minutit, 80 MP 15 minutit ja 60 MP 30 minutit. Pakkimisprotsessis kasutati mehaanilise vibratsiooni tagamiseks kahte gaasikromatograafia kolonni vibraatorit (Alltech, Deerfield, IL, USA), et tagada kolonni ühtlane täitmine. Sulgege suspensiooni pakkija ja vabastage rõhk aeglaselt, et vältida nööri kahjustamist. Kolonn ühendati suspensiooni otsikust lahti ja sisselaskeava külge kinnitati teine ​​liitmik, mis ühendati LC-süsteemiga, et testida selle tööd.
Kohandatud MLC konstrueeriti, kasutades LC-pumpa (10AD Shimadzu, Jaapan), proovivõtjat 50 nL süstimissilmusega (Valco (USA) C14 W.05), membraandegasaatorit (Shimadzu DGU-14A) ja UV-VIS kapillaarakent. Detektoriseade (UV-2075) ja emailitud mikrokolonn. Kasutage väga kitsaid ja lühikesi ühendustorusid, et minimeerida kolonni täiendava paisumise mõju. Pärast kolonni täitmist paigaldage kapillaar (50 µm sisediameeter 365) 1/16″ redutseeriva ühenduskoha väljundisse ja paigaldage redutseeriva ühenduskoha kapillaar (50 µm). Andmete kogumine ja kromatogrammide töötlemine toimub Multichro 2000 tarkvara abil. 254 nm juures jälgiti uuritavate analüütide UV-neeldumist 0 juures. Kromatograafilisi andmeid analüüsiti OriginPro8 (Northampton, MA) abil.
Inimese seerumi albumiin, lüofiliseeritud pulber, ≥ 96% (agaroosgeelelektroforees) 3 mg segatud trüpsiini (1,5 mg), 4,0 M uurea (1 ml) ja 0,2 M ammooniumvesinikkarbonaadiga (1 ml). Lahust segati 10 minutit ja hoiti veevannis temperatuuril 37 °C 6 tundi, seejärel kustutati reaktsioon 1 ml 0,1% TFA-ga. Filtreerige lahus ja hoidke temperatuuril alla 4 °C.
Peptiidide ja trüptilise digestiooniga töödeldud HSA segu eraldamist PMP kolonnil hinnati eraldi. Kontrollige PMP kolonni abil eraldatud peptiidide ja HSA segu trüptilist hüdrolüüsi ning võrrelge tulemusi Ascentis Express RP-Amide kolonni tulemustega. Teoreetiliste taldrikute arv arvutatakse järgmise võrrandi abil:
Puhaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste SEM-kujutised on näidatud joonisel 2. Puhaste ränidioksiidi osakeste (A, B) SEM-kujutised näitavad sfäärilist kuju, milles osakesed on piklikud või ebakorrapärase sümmeetriaga võrreldes meie varasemate uuringutega. Ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste (C, D) pind on siledam kui puhastel ränidioksiidi osakestel, mis võib olla tingitud ränidioksiidi osakeste pinda katvatest polüstüreenikettidest.
Puhaste ränidioksiidiosakeste (A, B) ja ligandiga seotud ränidioksiidiosakeste (C, D) skaneerivad elektronmikroskoobid.
Puhaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste osakeste suurusjaotus on näidatud joonisel 2.3(A). Mahulised osakeste suurusjaotuse kõverad näitasid, et ränidioksiidi osakeste suurus suurenes pärast keemilist modifitseerimist (joonis 3A). Käesoleva ja eelmise uuringu ränidioksiidi osakeste suurusjaotuse andmeid on võrreldud tabelis 1(A). PMP mahuline osakeste suurus d(0,5) oli 3,36 µm, võrreldes meie eelmise uuringu ad(0,5) väärtusega 3,05 µm (polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakesed)34. PEG, uurea, TMOS ja äädikhappe suhte muutuse tõttu reaktsioonisegus oli selle partii osakeste suurusjaotus kitsam võrreldes meie eelmise uuringuga. PMP faasi osakeste suurus on veidi suurem kui polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakeste faasil, mida me varem uurisime. See tähendab, et ränidioksiidi osakeste pinna funktsionaliseerimine stüreeniga sadestas ränidioksiidi pinnale ainult polüstüreeni kihi (0,97 µm), samas kui PMP faasis oli kihi paksus 1,38 µm.
Puhaste ränidioksiidiosakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidiosakeste osakeste suurusjaotus (A) ja poorisuurusjaotus (B).
Selles uuringus kasutatud ränidioksiidi osakeste pooride suurus, pooride maht ja pindala on näidatud tabelis 1 (B). Puhaste ränidioksiidi osakeste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste PSD profiilid on näidatud joonisel 3 (B). Tulemused olid võrreldavad meie eelmise uuringuga34. Puhaste ja ligandiga seotud ränidioksiidi osakeste pooride suurused olid vastavalt 310 Å ja 241 Å, mis näitab, et pärast keemilist modifitseerimist vähenes pooride suurus 69 Å võrra, nagu on näidatud tabelis 1 (B), ja nihkekõver on näidatud joonisel. Ränidioksiidi osakeste eripind käesolevas uuringus on 116 m2/g, mis on võrreldav meie eelmise uuringuga (124 m2/g). Nagu on näidatud tabelis 1 (B), vähenes ränidioksiidi osakeste pindala (m2/g) pärast keemilist modifitseerimist samuti 116 m2/g-lt 105 m2/g-ni.
Statsionaarse faasi elementanalüüsi tulemused on esitatud tabelis 2. Praeguse statsionaarse faasi süsinikusisaldus on 6,35%, mis on madalam kui meie eelmises uuringus (polüstüreeniga seotud ränidioksiidi osakesed vastavalt 7,93%35 ja 10,21%)42. Praeguse statsionaarse faasi süsinikusisaldus on allpool, kuna SP valmistamisel on lisaks stüreenile kasutatud mõningaid polaarseid ligande, näiteks fenüülmaleimiidmetüülvinüülisotsüanaati (PCMP) ja 4-hüdroksü-TEMPO-d. Lämmastiku massiprotsent praeguses statsionaarses faasis on 2,21% võrreldes varasemate uuringute 0,1735 ja 0,85%-ga42. See tähendab, et praegusel statsionaarsel faasil on fenüülmaleimiidi tõttu kõrge lämmastiku massiprotsent. Samamoodi on produktide (4) ja (5) süsinikusisaldus vastavalt 2,7% ja 2,9%, samas kui lõppprodukti (6) süsinikusisaldus on 6,35%, nagu on näidatud tabelis 2. Kaalukaotuse testimiseks kasutati PMP statsionaarsel faasil termogravimeetrilist analüüsi (TGA) ja TGA kõver on näidatud joonisel 4. TGA kõver näitab 8,6% kaalukaotust, mis on heas kooskõlas süsinikusisaldusega (6,35%), kuna ligandid sisaldavad lisaks C-le ka N, O ja H.
Ränidioksiidi osakeste pinna modifitseerimiseks valiti ligand fenüülmaleimiid-metüülvinüülisotsüanaat selle polaarsete fenüülmaleimiid- ja vinüülisotsüanaatrühmade tõttu. Vinüülisotsüanaatrühmad saavad stüreeniga edasi reageerida elava radikaalpolümerisatsiooni teel. Teine põhjus on sellise rühma sisestamine, millel on analüüdiga mõõdukas interaktsioon ja millel puuduvad tugevad elektrostaatilised interaktsioonid analüüdi ja statsionaarse faasi vahel, kuna fenüülmaleimiidosa ei oma normaalse pH juures virtuaalset laengut. Statsionaarse faasi polaarsust saab kontrollida stüreeni optimaalse koguse ja vabade radikaalide polümerisatsiooni reaktsiooniaja abil. Reaktsiooni viimane etapp (vabade radikaalide polümerisatsioon) on kriitilise tähtsusega, kuna see muudab statsionaarse faasi polaarsust. Nende statsionaarsete faaside süsinikusisalduse kontrollimiseks viidi läbi elementanalüüs. On täheldatud, et stüreeni koguse ja reaktsiooniaja suurendamine suurendab statsionaarse faasi süsinikusisaldust ja vastupidi. Erineva stüreeni kontsentratsiooniga valmistatud SP-del on erinev süsiniku koormus. Samamoodi asetati need statsionaarsed faasid roostevabast terasest kolonnidele ja kontrolliti nende kromatograafilisi omadusi (selektiivsus, lahutusvõime, N-väärtus jne). Nende katsete põhjal valiti PMP statsionaarse faasi valmistamiseks optimeeritud koostis, et tagada kontrollitud polaarsus ja analüüdi hea retentsioon.
PMP kolonni hinnati ka viie peptiidisegu (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leutsiin-enkefaliin) analüüsimiseks, kasutades mobiilse faasi mahtuvust. 60/40 (v/v) ACN/vesi (0,1% TFA) voolukiirusel 80 µl/min. Optimaalsetes elueerimistingimustes (200 000 plaati/m) on teoreetiliste plaatide (N) arv kolonni (100 × 1,8 mm) kohta 20 000 ± 100. Kolme PMP kolonni N väärtused on toodud tabelis 3 ja kromatogrammid joonisel 5A. Kiire analüüs suure voolukiirusega (700 µl/min) PMP kolonnil, viis peptiidi elueerus ühe minuti jooksul, suurepärane N väärtus 13 500 ± 330 kolonni kohta (100 x 1,8 mm läbimõõduga), mis vastab 135 000 plaadile/m (joonis 5B). Kolm sama suurusega kolonni (siseläbimõõt 100 x 1,8 mm) täideti kolme erineva PMP statsionaarse faasi partiiga, et testida reprodutseeritavust. Analüüdid registreeriti iga kolonni jaoks, eraldades sama testsegu igas kolonnis, kasutades optimaalseid elueerimistingimusi, teoreetiliste plaatide arvu N ja retentsiooniaega. PMP kolonnide reprodutseeritavuse andmed on esitatud tabelis 4. PMP kolonni reprodutseeritavus korreleerus hästi väga madalate %RSD väärtustega, nagu on näidatud tabelis 3.
Peptiidisegude eraldamine PMP kolonnil (B) ja Ascentis Express RP-Amide kolonnil (A), liikuv faas 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonni mõõtmed (100 x 1,8 mm sisediameeter), analüüs. Ühendite elueerimisjärjekord: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ja 5 (leutsiinhappe enkefaliin).
Inimese seerumi albumiini trüptilise hüdrolüsaadi eraldamiseks HPLC abil hinnati PMP kolonni (siseläbimõõt 100 x 1,8 mm). Joonisel 6 olev kromatogramm näitab, et proovid on hästi eraldatud ja väga hea lahutusvõimega. HSA lahuseid analüüsiti voolukiirusel 100 μl/min, liikuva faasina atsetonitriil/vesi 70/30 ja 0,1% TFA-d. HSA lõhustumine jagati 17 piigiks, nagu on näidatud kromatogrammil (joonis 6), mis vastavad 17 peptiidile. Arvutati üksikute piikide eraldamise efektiivsus HSA hüdrolüsaadist ja väärtused on esitatud tabelis 5.
HSA trüptilised hüdrolüsaadid lahutati PMP kolonnil (siseläbimõõt 100 x 1,8 mm), voolukiirusega (100 μl/min), liikuva faasi seguga 60/40 atsetonitriil/vesi ja 0,1% TFA-ga.
kus L on kolonni pikkus, η on liikuva faasi viskoossus, ΔP on kolonni vasturõhk ja u on liikuva faasi lineaarkiirus. PMP kolonni läbilaskvus oli 2,5 × 10–14 m2, voolukiirus oli 25 µl/min, kasutati 60/40 v/v. ACN/vesi. PMP kolonni (ID 100 × 1,8 mm) läbilaskvus oli sarnane meie eelmise Ref.34 uuringu omaga. Pinnaliselt poorsete osakestega täidetud kolonni läbilaskvus on 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 5 µm osakeste puhul43. Seega on PMP faasi läbilaskvus sarnane 5 μm suuruste südamik-kest osakeste läbilaskvusega.
kus Wx on kloroformiga täidetud kolonni mass, Wy on metanooliga täidetud kolonni mass ja ρ on lahusti tihedus. Metanooli (ρ = 0,7866) ja kloroformi (ρ = 1,484) tihedus. Ränidioksiid-C18 osakeste kolonni (100 × 1,8 mm ID)34 ja meie eelnevalt uuritud C18-uurea31 kolonni kogupoorsus oli vastavalt 0,63 ja 0,55. See tähendab, et uurea ligandide olemasolu vähendab statsionaarse faasi läbilaskvust. Teisest küljest on PMP kolonni (siseläbimõõt 100 × 1,8 mm) kogupoorsus 0,60. PMP kolonnid on vähem läbilaskvad kui C18-ga seotud ränidioksiidi osakestega täidetud kolonnid, kuna C18 tüüpi statsionaarsetes faasides on C18 ligandid ränidioksiidi osakeste külge kinnitunud lineaarsetes ahelates, samas kui polüstüreeni tüüpi statsionaarsetes faasides moodustub osakeste ümber suhteliselt paks polümeer. kiht A. Tüüpilises katses arvutatakse kolonni poorsus järgmiselt:
Joonisel 7A ja B on kujutatud Van Deemteri graafikuid PMP kolonni (sisediameeter 100 x 1,8 mm) ja Ascentis Express RP-Amide kolonni (sisediameeter 100 x 1,8 mm) jaoks samades elueerimistingimustes, 60/40 ACN/H2O ja 0,1% TFA 20 µl/min kuni 800 µl/min mõlema kolonni puhul. Minimaalsed HETP väärtused optimaalse voolukiiruse juures (80 µl/min) olid PMP kolonni ja Ascentis Express RP-Amide kolonni puhul vastavalt 2,6 µm ja 3,9 µm. HETP väärtused näitavad, et PMP kolonni (sisediameeter 100 x 1,8 mm) eraldustõhusus on palju kõrgem kui kaubanduslikult saadaoleval Ascentis Express RP-Amide kolonnil (sisediameeter 100 x 1,8 mm). Joonisel 7(A) olev van Deemteri graafik näitab, et N väärtuse vähenemine ei ole vooluhulga suurenedes oluliselt suurem võrreldes meie eelmise uuringuga. PMP kolonni (sisediameeter 100 × 1,8 mm) suurem eraldustõhusus võrreldes Ascentis Express RP-Amide kolonniga põhineb parendatud osakeste kujul ja suurusel ning keerukamal kolonni pakkimisprotseduuril, mida kasutatakse käesolevas töös34.
(A) Van Deemteri graafik (HETP vs. liikuva faasi lineaarkiirus), mis on saadud PMP kolonnil (sisediameeter 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O lahuses 0,1% TFA-ga. (B) Van Deemteri graafik (HETP vs. liikuva faasi lineaarkiirus), mis on saadud Ascentis Express RP-Amide kolonnil (sisediameeter 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O lahuses 0,1% TFA-ga.
Valmistati interkaleeritud polüstüreenist polaarne statsionaarne faas ja hinnati selle sobivust sünteetiliste peptiidide ja inimese seerumi albumiini (HSA) trüptilise hüdrolüsaadi segu eraldamiseks kõrgjõudlusega vedelikkromatograafias. PMP-kolonnide kromatograafiline jõudlus peptiidisegude puhul on suurepärane nii eraldamise efektiivsuse kui ka lahutusvõime osas. PMP-kolonnide parem eraldamise efektiivsus tuleneb mitmest põhjusest, nagu ränidioksiidi osakeste suurus ja pooride suurus, statsionaarsete faaside kontrollitud süntees ja keerulised kolonni täitematerjalid. Lisaks kõrgele eraldamise efektiivsusele on selle statsionaarse faasi teiseks eeliseks madal kolonni vasturõhk suurtel voolukiirustel. PMP-kolonnid on väga reprodutseeritavad ja neid saab kasutada peptiidide segude analüüsimiseks ja erinevate valkude trüptilise lagundamise jaoks. Kavatseme seda kolonni kasutada bioaktiivsete ühendite eraldamiseks looduslikest saadustest, ravimtaimede ekstraktidest ja seentest vedelikkromatograafias. Tulevikus hinnatakse PMP-kolonne ka valkude ja monoklonaalsete antikehade eraldamiseks.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pöördfaasikromatograafia peptiidide eraldussüsteemide uuring I osa: kolonni iseloomustamise protokolli väljatöötamine. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ja Petersson, P. Pöördfaasikromatograafia peptiidide eraldussüsteemide uurimine I osa: kolonni iseloomustamise protokolli väljatöötamine.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ja Petersson, P. Peptiidide eraldussüsteemide uurimine pöördfaaskromatograafia abil, I osa: kolonni iseloomustamise protokolli väljatöötamine. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ja Petersson, P. Pöördfaasikromatograafia peptiidide eraldussüsteemide uurimine I osa: kolonni omaduste protokolli väljatöötamine. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ja Petersson, P. Pöördfaasikromatograafia peptiidide eraldussüsteemide uurimine I osa: kolonni omaduste protokolli väljatöötamine.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ja Petersson, P. Peptiidide eraldussüsteemide uurimine pöördfaaskromatograafia abil, I osa: kolonni iseloomustamise protokolli väljatöötamine.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. jt. Meetodid nakkushaiguste raviks mõeldud täiustatud aktiivsete peptiidide loomiseks. Biotehnoloogia. Saavutused 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ja Khrestchatisky, M. Sünteetilised terapeutilised peptiidid: teadus ja turg. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ja Khrestchatisky, M. Sünteetilised terapeutilised peptiidid: teadus ja turg.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ja Chreschatyski M. Sünteetilised terapeutilised peptiidid: teadus ja turg.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ja Khreschatsky M. Sünteetilised terapeutilised peptiidid: teadus ja turg. Ravimite avastamine. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ja Shen, Y. Täiustatud proteoomiline vedelikkromatograafia. Xie, F., Smith, RD ja Shen, Y. Täiustatud proteoomiline vedelikkromatograafia.Vt F., Smith RD ja Shen Yu. Täiustatud proteoomiline vedelikkromatograafia. Xie, F., Smith, RD ja Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD ja Shen, Y. Täiustatud valgu koostis 液相色谱.Vt F., Smith RD ja Shen Yu. Täiustatud proteoomiline vedelikkromatograafia.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. jt. Täiustatud vedelikkromatograafia-massispektromeetria suudab ühendada laiapõhjalise metaboloomika ja proteoomika. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ja Salisbury, JJ UHPLC roll ravimite väljatöötamisel. Chesnut, SM ja Salisbury, JJ UHPLC roll ravimite väljatöötamisel.Chesnut, SM ja Salisbury, JJ UHPLC roll ravimite väljatöötamisel.Chesnut, SM ja Salisbury, JJ. UHPLC roll ravimite väljatöötamisel. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. ja Clausen, AM. Ülikõrge rõhuga vedelikkromatograafia põhialused ja praktilised aspektid kiireks eraldamiseks. Wu, N. ja Clausen, AM. Ülikõrge rõhuga vedelikkromatograafia põhialused ja praktilised aspektid kiireks eraldamiseks.Wu, N. ja Clausen, AM. Kõrgsurvevedelikkromatograafia põhialused ja praktilised aspektid kiireks lahutamiseks. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. ja Clausen, AM. Ülikõrgsurvevedelikkromatograafia põhi- ja praktilised aspektid kiireks lahutamiseks.Wu, N. ja Clausen, AM. Kõrgsurvevedelikkromatograafia põhialused ja praktilised aspektid kiireks lahutamiseks.Ajakiri "J. Sept. Science". 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ülijõudlusega vedelikkromatograafia kasutamine farmaatsiatoodete arenduses. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ülijõudlusega vedelikkromatograafia kasutamine farmaatsiatoodete arenduses.Ren, SA ja Chelischeff, P. Ülikõrgefektiivse vedelikkromatograafia kasutamine farmaatsiatoodete arenduses. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA ja Tchelitcheff, P.Ren, SA ja Chelischeff, P. Ülijõudlusega vedelikkromatograafia rakendamine ravimiarenduses.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. jt. Monoliitse makropoorne hüdrogeel, mis on saadud õli-vees emulsioonist ja millel on kõrge sisemine faasisisaldus enteroviiruse 71 tõhusaks puhastamiseks. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ja Wilkins, JA. Vedelikkromatograafia roll proteoomikas. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ja Wilkins, JA. Vedelikkromatograafia roll proteoomikas.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ja Wilkins, JA. Vedelikkromatograafia roll proteoomikas. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ja Wilkins, JA. Vedelikkromatograafia roll proteoomikas.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Uued trendid terapeutiliste peptiidide ja valkude pöördfaasilise vedelikkromatograafilise eraldamise valdkonnas: teooria ja rakendused. & Guillarme, D. Uued trendid terapeutiliste peptiidide ja valkude pöördfaasilise vedelikkromatograafilise eraldamise valdkonnas: teooria ja rakendused. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хромора фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Uued trendid terapeutiliste peptiidide ja valkude eraldamisel pöördfaasilise vedelikkromatograafia abil: teooria ja rakendused. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用. & Guillarme, D.ja Guillarmé, D. Uued trendid terapeutiliste peptiidide ja valkude eraldamisel pöördfaasilise vedelikkromatograafia abil: teooria ja rakendused.J. Pharm. Biomeditsiiniteadus. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ja Gebler, JC. Peptiidide kahemõõtmeline eraldamine RP-RP-HPLC süsteemi abil, millel on esimeses ja teises eraldusmõõtmes erinev pH. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ja Gebler, JC. Peptiidide kahemõõtmeline eraldamine RP-RP-HPLC süsteemi abil, millel on esimeses ja teises eraldusmõõtmes erinev pH.Gilar M., Olivova P., Dali AE ja Gebler JK Peptiidide kahemõõtmeline eraldamine RP-RP-HPLC süsteemi abil, millel on esimeses ja teises eraldusmõõtmes erinev pH.Gilar M., Olivova P., Dali AE ja Gebler JK. Peptiidide kahemõõtmeline eraldamine RP-RP-HPLC süsteemi abil, kasutades esimeses ja teises eraldusdimensioonis erinevaid pH väärtusi. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. jt. Täispoorsete ja pealiskaudselt poorsete C18 osakestega, mis on väiksemad kui 2 µm, täidetud kõrgjõudlusega kromatograafiakolonnide massiülekande ja kineetiliste omaduste uurimine. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. jt. Hiljutised trendid ja analüütilised väljakutsed taimede bioaktiivsete peptiidide eraldamisel, identifitseerimisel ja valideerimisel. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB jt. Eluriigi proteoomiline maastik. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. jt. Terapeutiliste peptiidide järeltöötlus preparatiivse vedelikkromatograafia abil. Molecules (Basel, Šveits) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. ja Geng, X. Segatud režiimiga kromatograafia ja selle rakendused biopolümeerides. Yang, Y. ja Geng, X. Segatud režiimiga kromatograafia ja selle rakendused biopolümeerides.Yang, Yu. ja Geng, X. Segatud režiimiga kromatograafia ja selle rakendamine biopolümeeridel. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. ja Geng, X. Segatud režiimiga kromatograafia ja selle rakendamine biopolümeerides.Yang, Yu. ja Gene, X. Segatud režiimiga kromatograafia ja selle rakendamine biopolümeeridel.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).