Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Angustifolius lupiin (NLL, Lupinus angustifolius L.) on liblikõieline taim, mida kasutatakse toidu tootmiseks ja mulla parandamiseks.NLL kui põllukultuuri ülemaailmne levik on meelitanud ligi palju patogeenseid seeni, sealhulgas lupiini antraknoosi, mis põhjustab laastavat antraknoosihaigust.NLL aretamisel on kasutatud kahte alleeli, Lanr1 ja AnMan, mis annavad suurenenud resistentsuse, kuid nende aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid jäävad teadmata.Selles uuringus kasutati Euroopa NLL proovide skriinimiseks Lanr1 ja AnMan markereid.Vaktsiini testimine kontrollitud keskkonnas kinnitas mõlema resistentse doonori efektiivsust.Diferentsiaalne geeniekspressiooniprofiil viidi läbi tüüpilistel resistentsetel ja tundlikel liinidel.Antraknoosiresistentsust seostati geeniontoloogia terminite “GO:0006952 Defense Response”, “GO:0055114 Redox Process” ja “GO:0015979 Photosynthesis” üleekspressiooniga.Lisaks näitas Lanr1 (83A: 476) liin olulist transkriptoomi ümberprogrammeerimist kiiresti pärast inokuleerimist, samas kui teised liinid näitasid selle vastuse viivitust umbes 42 tunni võrra.Kaitsereaktsioonid on seotud geenidega TIR-NBS, CC-NBS-LRR ja NBS-LRR, 10 patogeneesis osaleva valgu, lipiidide ülekandevalkude, endoglükaan-1,3-β-glükosidaasi, glütsiinirikaste rakuseina valkude ja hapniku reaktiivse tee geenidega.Varased vastused 83A:476-le, sealhulgas fotosünteesiga seotud geenide hoolikas allasurumine, langesid kokku eduka kaitsega seenbioloogia vegetatiivse kasvufaasi ajal, mis viitab sellele, et efektor käivitab immuunsuse.Mandeloopi reaktsioon aeglustub, nagu ka üldine horisontaalne takistus.
Ahtalehine lupiin (NLL, Lupinus angustifolius L.) on valgurikas teravili, mis pärineb Vahemere lääneosast1,2.Praegu kasvatatakse seda loomade ja inimeste toidukultuurina.Seda peetakse haljasväetiseks ka külvikorrasüsteemides, kuna lämmastikku siduvad sümbiootilised lämmastikku siduvad bakterid ja mulla struktuur paraneb üldiselt.NLL on viimasel sajandil läbinud kiire kodustamise protsessi ja on endiselt suure sigimissurve all3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.NLL-i laialdase viljelemisega tekitas patogeensete seente järgnevus uusi põllumajanduslikke nišše ja põhjustas uusi saaki hävitavaid haigusi. Kõige tähelepanuväärsem lupiinikasvatajate ja -kasvatajate jaoks oli antraknoosi ilmumine, mille põhjustasid patogeensed seened Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Kõige tähelepanuväärsem lupiinikasvatajate ja -kasvatajate jaoks oli antraknoosi ilmumine, mille põhjustasid patogeensed seened Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногоныrich памто Nirenberg, Feiler ja Hagedorn13. Lupiinikasvatajate ja -kasvatajate jaoks oli kõige tähelepanuväärsem antraknoosi teke, mille põhjustas patogeenne seene Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由痘tondar) enberg, Feiler ja Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生Colle，它是嵵juukseline.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракмригноза (coll Bondar) Nirenberg, Feiler ja Hagedorn13. Lupiinikasvatajate ja -kasvatajate jaoks on kõige silmatorkavam patogeense seente Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 põhjustatud antraknoosi teke.Esimesed teated haigusest pärinesid Brasiiliast ja Ameerika Ühendriikidest, tüüpilised sümptomid ilmnesid vastavalt 1912. ja 1929. aastal.Umbes 30 aasta pärast nimetati patogeen aga Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorf. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld sihtmorfoloogias. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .ja H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.ja H. Schlenk, .20. sajandi keskel tehtud esialgne haiguse fenotüüpimine näitas mõningast resistentsust NLL ja kollase lupiini (L. luteus L.) asendis, kuid kõik testitud valge lupiini (L. albus L.) asendid olid väga vastuvõtlikud15,16.Uuringud on näidanud, et antraknoosi teke on seotud sademete (õhuniiskuse) ja temperatuuri (vahemikus 12–28 °C) suurenemisega, mis põhjustab vastupidavuse halvenemist kõrgematel temperatuuridel17, 18. Tegelikult oli koniidide idanemiseks ja haiguse alguseks kuluv aeg neli korda lühem temperatuuril 24 °C kõrge õhuniiskuse korral (6 tundi) (12 tundi).Seega on käimasolev globaalne soojenemine toonud kaasa antraknoosi leviku.Siiski täheldati seda haigust Prantsusmaal (1982) ja Ukrainas (1983) kui eelseisva ohu esilekutsujat, kuid ilmselt eiras lupiinitööstus seda tol ajal20,21.Mõni aasta hiljem levis see laastav haigus üle maailma ja mõjutas ka suuri lupiini tootvaid riike, nagu Austraalia, Poola ja Saksamaa22,23,24.Pärast antraknoosipuhangut 1990. aastate keskel tuvastas ulatuslik sõelumine NLL19 proovides mitu resistentset doonorit.NLL-i resistentsust antraknoosi suhtes kontrollivad kaks erinevat domineerivat alleeli, mida leidub erinevates iduplasma allikates: Lanr1 sordis Tanjil ja Wonga ning AnMan kultivaris.Mandalay 25, 26. Need alleelid täiendavad molekulaarseid markereid, mis toetavad resistentse iduplasma selektsiooni aretusprogrammides25,26,27,28,29,30.Lanr1 alleeli kandev resistentne aretusliin 83A:476 ristati tundliku metsiku liiniga P27255, et saada antraknoosiresistentsuse suhtes eralduv RIL-populatsioon, mis võimaldas määrata Lanr1 lookuse kromosoomile NLL-1131, 32, 33. näitas kõigi kolme alleeli asukohta samas kromosoomis (NLL-11), kuid erinevates positsioonides 29, 34, 35.Kuid RIL-ide väikese arvu ning markerite ja vastavate alleelide vahelise suure geneetilise kauguse tõttu ei saa nende aluseks olevate geenide kohta usaldusväärseid järeldusi teha.Teisest küljest on lupiinide pöördgeneetika kasutamine keeruline nende väga madala regeneratsioonipotentsiaali tõttu, mis muudab geneetilise manipuleerimise tülikaks37.
Kodustatud iduplasma, mis kannab soovitud alleeli homosügootses olekus, nagu 83A:476 (Lanr1) ja Mandelup (AnMan), on avanud ukse antraknoosiresistentsuse uurimisele, pidades silmas vastandlike alleelide kombinatsioonide olemasolu metsikutes populatsioonides.Molekulaarsete mehhanismide võimalused.Võrrelge konkreetsete genotüüpide tekitatud kaitsereaktsioone.Selles uuringus hinnati NLL varajast transkriptoomilist vastust C. lupini vaktsineerimisele.Esiteks sõeluti Euroopa NLL-i iduplasma paneel, mis sisaldas 215 liini, kasutades molekulaarseid markereid, mis tähistavad Lanr1 ja AnMan alleele.Seejärel viidi antraknoosi fenotüüpimine läbi 50 NLL liinil, mis olid eelnevalt valitud molekulaarsete markerite jaoks, kontrollitud tingimustes.Nende katsete põhjal valiti diferentsiaalse kaitse geeniekspressiooni profiilide koostamiseks neli rida, mis erinevad antraknoosiresistentsuse ja Lanr1 / AnMan alleelse koostise poolest, kasutades kahte üksteist täiendavat lähenemisviisi: suure läbilaskevõimega RNA sekveneerimine ja reaalajas PCR kvantifitseerimine.
NLL-i iduplasma komplekti (N = 215) sõelumine markeritega Lanr1 (Anseq3 ja Anseq4) ning AnMan (Anseq4) ja AnMan (AnManM1) näitas, et ainult üks rida (95726, Salamanca-b lähedal) võimendab "resistentsuse" alleeli kõigi 1. markerite proportsioonide suhtes, samas kui 'Presse8's leiti allelles8. (~73,5%) read.Kolmteist rida tekitasid kaks Lanr1 markeri "resistentset" alleeli ja 8 liini Lanr1 "resistentsed" alleelid.marker.AnMan markeri "resistentsuse" alleel (täiendav tabel S1).Kaks joont olid Anseq3 markeri ja üks AnManM1 markeri jaoks heterosügootsed.42 liini (19, 5%) kandsid Anseq3 ja Anseq4 alleelide vastandlikke faase, mis näitab nende kahe lookuse vahelise rekombinatsiooni kõrget sagedust.Antraknoosi fenotüübid kontrollitud tingimustes (täiendav tabel S2) näitasid testitud genotüüpide resistentsuse varieeruvust, mis kajastus antraknoosi raskusastmes.Keskmiste skooride erinevused jäid vahemikku 1,8 (mõõdukalt resistentne) kuni 6,9 (tundlik) ja taimede massi erinevused olid vahemikus 0,62 (tundlik) kuni 4,45 g (resistentne). Eksperimendi kahes korduses täheldatud väärtuste (0,51 haiguse raskusastme skooride, P = 0,00017 ja 0,61 taime massi korral, P < 0,0001) ning nende kahe parameetri vahel (- 0,59 ja -0,77, P < 0,0001) oli oluline korrelatsioon. Katse kahes korduses täheldatud väärtuste (0,51 haiguse raskusastme skooride, P = 0,00017 ja 0,61 taime massi korral, P < 0,0001) ning nende kahe parameetri vahel (- 0,59 ja -0,77, P < 0,0001) oli oluline korrelatsioon. Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 твизбялдолеяя) , P = 0,00017 ja 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 ja -0,10,0,0,0 Р0,10,0). Katse kahel kordamisel täheldatud väärtuste (0,51 haiguse raskusastme skooride, P = 0,00017 ja 0,61 taime massi korral, P < 0,0001) ning nende kahe parameetri vahel (- 0,59 ja -0,77, P < 0,00001) leiti oluline korrelatsioon.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察度评分1︺物重量为0,61, P < 0,0001, 以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严 庍 程 円 证. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（， 和 5-9 和 5-5-5-0.和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, 0,0 Вал5, Поценка тя (оценка тя 0017 ja масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ja -0,0001) 0,77, P <0,0001. Kahes korduses täheldatud väärtuste (haiguse raskusastme skoor 0,51, P = 0,00017 ja taime kaal 0,61, P < 0,0001) ning nende kahe parameetri (-0,59 ja -0,0001) vahel oli oluline korrelatsioon 0,77, P<0,0001. ).Tundlike taimede tüüpilisteks sümptomiteks on varre kõverdumine ja keerdumine, mis meenutab "karjase vibu" struktuuri, millele järgneb ovaalsed kahjustused oranžide/roosade sporosoididega (täiendav joonis 1).Lanr1 (83A:476 ja Tanjil) ja AnMan (Mandelup) geene kandvad Austraalia lisandid on mõõdukalt resistentsed, 0,0331 ja 0,0036.Mõned liinid, mis kannavad ka "resistentseid" Lanr1 ja/või AnMan alleele, näitavad haiguse sümptomeid.
Huvitaval kombel näitasid mõned NLL-i liinid, millel puudus "resistentne" markeri alleel, kõrget antraknoosiresistentsuse taset (võrreldav või kõrgem kui Lanr1 või AnMan genotüüpide puhul), näiteks Boregine (mõlema parameetri puhul P väärtus < 0,0001), Bojar (P väärtus < 0,0001 skoori jaoks ja 0,001 P-9b/0,00 taime massi kohta) 1 hinde korral ja ebaoluline kaalu puhul). Huvitaval kombel näitasid mõned NLL-i liinid, millel puudus "resistentne" markeri alleel, kõrget antraknoosiresistentsuse taset (võrreldav või kõrgem kui Lanr1 või AnMan genotüüpide puhul), näiteks Boregine (mõlema parameetri puhul P väärtus < 0,0001), Bojar (P väärtus < 0,0001 skoori jaoks ja 0,001 P-9b/0,00 taime massi kohta) 1 hinde korral ja ebaoluline kaalu puhul). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейх высколько высокий кнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 длхерона) е P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) ja популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для дизначимоценен). Huvitaval kombel näitasid mitmed NLL-i liinid, millel puudus igasugune "resistentne" markeri alleel, kõrget resistentsust antraknoosi suhtes (võrreldav või kõrgem kui Lanr1 või AnMan genotüüpide puhul), näiteks Boregine (mõlema parameetri puhul P väärtus < 0,0001), Bojar (P väärtus < 0,0001 hindamisel ja B-väärtus < 0,0001 hinnangul ja B-väärtus < 0,0001, taimede kaal 0,00/9) 01 hindamiseks ja mitteoluline kaalu jaoks).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高気平示出高気平的爊爊縅平的炭疍基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分0≥01＇00 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Huvitav on see, et mõned NLL-süsteemid, millel ei ole antigeenseid markereid, näitavad kõrget horisontaalset resistentsust (vastab Lanr1 või AnMan geenidele või kõrgematele), näiteks Boregine (mõlemad parameetrid P < 0,0001), Bojar (P väärtus < 0,0001, taime kaal 0,001) ja tüvi B-549/0,00 (kaal ei ole oluline). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высоксов ракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров), <0,0мые параметров, <0,0,0001 са растения 0,001) ja популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Huvitaval kombel näitasid mõned NLL-liinid, millel puudusid "resistentsuse" markerite alleelid, kõrget antraknoosiresistentsuse taset (võrreldes Lanr1 või AnMan genotüüpidega või sellest kõrgemal), näiteks Boregine (mõlema parameetri P väärtus <0,0001), Bojar (P-väärtus <0,0001, taime kaal <0,0001, taimede kaal <0,0-04)/P70b04. 01, kaal ei ole oluline).See nähtus viitab uudse geneetilise resistentsuse allika võimalusele, selgitades täheldatud korrelatsiooni puudumist markerite genotüüpide ja haiguse fenotüüpide vahel (P väärtused ~ 0, 42 kuni ~ 0, 98).Seega näitas Kolmogorovi-Smirnovi test, et andmed antraknoosiresistentsuse kohta olid ligikaudu normaalselt jaotunud skooride (P-väärtused 0,25 ja 0,11) ja taime massi (P-väärtused 0,47 ja 0,55), mis viitab oletustele, et sellega on seotud rohkem alleele kui Lanr1 ja AnMan.
Antraknoosiresistentsuse skriinimise tulemuste põhjal valiti transkriptoomianalüüsiks 4 rida: 83A:476, Boregine, Mandelup ja Population 22660. Neid ridu testiti uuesti siberi katku resistentsuse suhtes inokulatsioonikatsetes RNA sekveneerimisega, eeldusel, et need olid samad, mis eelmises testis.Punktide väärtused olid järgmised: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) ja elanikkond 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokoll Illumina NovaSeq 6000 saavutas keskmiselt 40,5 Mreadi paari proovi kohta (29,7–54,4 Mreadi) (täiendav tabel S3).Joondusskoorid võrdlusjärjestuses jäid vahemikku 75,5% kuni 88,6%.Lugemiste arvu andmete keskmine korrelatsioon katsevariantide vahel bioloogiliste korduste vahel oli vahemikus 0,812 kuni 0,997 (keskmine 0,959). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei näidanud ekspressiooni ja ülejäänud 4785 geeni ekspresseeriti tühisel tasemel (baaskeskmine < 5). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei näidanud ekspressiooni ja ülejäänud 4785 geeni ekspresseeriti tühisel tasemel (baaskeskmine < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались новом (икспрессировались ое среднее <5). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei näidanud ekspressiooni ja ülejäänud 4785 geeni ekspresseeriti tühisel tasemel (baaskeskmine <5).在分析的 35 170 个基因中， 2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽值< 5).35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо е значение <5). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei ekspresseerunud ja ülejäänud 4785 geeni ekspressioon oli tühine (baaskeskmine <5).Seega oli katse ajal ekspresseeritud geenide arv (baaskeskmine ≥ 5) 27 468 (78, 1%) (täiendav tabel S4).
Alates esimesest ajahetkest reageerisid kõik NLL liinid C. lupini (tüvi Col-08) inokuleerimisele transkriptoomi ümberprogrammeerimisega (tabel 1), kuid liinide vahel täheldati olulisi erinevusi.Seega näitas resistentsusliin 83A:476 (kannab Lanr1 geeni) esimesel ajahetkel (6 hpi) olulist transkriptoomi ümberprogrammeerimist, kusjuures isoleeritud üles- ja allapoole suunatud geenide arv suurenes 31-69 korda võrreldes teiste ajahetkedega sellel ajahetkel.Lisaks oli see tipp lühiajaline, kuna vaid mõne geeni ekspressioon jäi teisel ajahetkel (12 hpi) oluliselt muutunud.Huvitav on see, et Boregine, mis näitas ka transplantaadi testis kõrget vastupanuvõimet, ei läbinud katse ajal nii massilist transkriptsiooni ümberprogrammeerimist.Siiski oli erinevalt ekspresseeritud geenide (DEG) arv Boregine'i ja 83A:476 puhul 12 HPI juures sama.Nii Mandelup kui ka populatsioon 22660 näitasid DEG piike viimasel ajahetkel (48 l/s), mis näitab kaitsereaktsioonide suhtelist viivitust.
Kuna 83A:476 läbis massilise transkriptoomi ümberprogrammeerimise vastuseks C. lupinile 6 HPI juures võrreldes kõigi teiste liinidega, olid ~91% sel ajahetkel täheldatud DEG-dest liinispetsiifilised (joonis 1).Siiski esines uuringuliinide varajastes vastustes mõningast kattumist, kuna vastavalt 68,5%, 50,9% ja 52,6% DEG Boregine'is, Mandelupis ja populatsioonis 22660 kattus teatud ajahetkedel punktis 83A:476 leitud väärtustega.Need DEG-d moodustasid aga vaid väikese osa (0, 97–1, 70%) kõigist praegu 83A: 476 abil tuvastatud DEG-dest.Lisaks olid sel ajal sidusad 11 DEG-d kõigist liinidest (täiendavad tabelid S4-S6), sealhulgas taimede kaitsereaktsioonide ühised komponendid: lipiidide ülekandevalk (TanjilG_32225), endoglükaan-1,3-β-glükosiidi ensüüm (TanjilG_23384), kaks stressiga indutseeritavat valku (TanjilG_23384) ja S5AMl22 valku S3G_G_5lji nagu 35lji. 31), aluseline lateksvalk (TanjilG_32352) ja kaks glütsiinirikast struktuurset rakuseina valku (TanjilG_19701 ja TanjilG_19702).Samuti oli suhteliselt suur kattumine transkriptsioonivastustes 83A:476 ja Boregine'i vahel 24 HPI juures (kokku 16-38% DEG) ning Mandelupi ja populatsiooni 22660 vahel 48 HPI juures (kokku 14-20% DEG).
Venni diagramm, mis näitab erinevalt ekspresseeritud geenide (DEG) arvu kitsalehise lupiini (NLL) liinidel, mis on nakatatud Colletotrichum lupiniga (tüvi Col-08, mis on saadud Wierzhenice'is Poolast lupiinipõldudelt, 1999).Analüüsitud NLL-liinid olid: 83A:476 (resistentne, Lanr1 alleeli kandja), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, AnMan alleeli kandev) ja populatsioon 22660 (väga vastuvõtlik).Lühend hpi tähistab tunde pärast vaktsineerimist.Graafiku lihtsustamiseks on nullväärtused eemaldatud.
Üleekspresseeritud geenide komplekti 6 hpi juures analüüsiti kanooniliste R-geeni domeenide olemasolu suhtes (täiendav tabel S7).See uuring näitas klassikaliste haigusresistentsuse geenide transkriptoomilist indutseerimist NBS-LRR domeenidega ainult 83A: 476 juures.See komplekt koosnes ühest TIR-NBS-LRR geenist (tanjilg_05042), viiest CC-NBS-LRR geenist (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ja tanjilg_16162) ning neljast NBS-NBS-LRR geenist (tanjilg_LR ja Tanjilg2LR (tanjilg6,16162). 162), samuti Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) ja Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Kõigil neil geenidel on kanoonilised domeenid, mis on paigutatud konserveeritud järjestustesse.Lisaks NBS-LRR domeeni geenidele aktiveeriti 6 hpi juures mitu RLL kinaasi, nimelt üks Boregine'is (TanjilG_19877), kaks Mandelupis (TanjilG_07141 ja TanjilG_19877) ning populatsioonis 22660 (TanjilG_0ji, kaks in 3601_4A ja 3601_4A 2 in8181) :476.
C. lupini (tüvi Col-08) inokuleerimisel oluliselt muutunud ekspressiooniga geenidele viidi läbi geeniontoloogia (GO) rikastusanalüüs (täiendav tabel S8). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli "GO:0006952 kaitsereaktsioon", mis ilmnes 6-st 16-st (aeg × joon) kombinatsioonist, millel oli suur tähtsus (P väärtus < 0,001) (joonis 2). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli "GO:0006952 kaitsereaktsioon", mis ilmnes 6-st 16-st (aeg × joon) kombinatsioonist, millel oli suur tähtsus (P väärtus < 0,001) (joonis 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защикятный», отовскоятый» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli "GO:0006952 kaitsereaktsioon", mis esines 6-s 16-st (aeg × põlvnemine) kombinatsioonis, millel oli suur tähtsus (P väärtus < 0,001) (joonis 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 丶（的生物过程术语是个中，具有高显着性(P 值< 0,001）（图2）). Kõige tüüpilisem bioloogilise protsessi termin on "GO:0006952 kaitsereaktsioon", mis esineb 6-s 16-st (时间×线) kombinatsioonist, millel on suur tähtsus (P väärtus < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяр1 инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli 'GO:0006952 kaitsereaktsioon', mis esines 6 kombinatsioonis 16-st (aeg × joon), millel oli suur tähtsus (P väärtus < 0,001) (joonis 2).See termin oli 83A-s kahel ajahetkel üleesindatud: 476 ja Boregine (6 ja 24 hpi) ning ühel ajahetkel Mandelupis ja Population 22660 (vastavalt 12 ja 6 hpi).See on oodatud tulemus, mis tõstab esile resistentsete liinide seenevastase vastuse.Lisaks reageeris 83A:476 C. lupinile, indutseerides kiiresti geenid, mis olid seotud oksüdatiivse purskega, mida tähistab termin "GO:0055114 redoksprotsess", mis näitab spetsiifilist kaitsereaktsiooni, samas kui Boregine näitas spetsiifilisi kaitsereaktsioone, mis olid seotud terminiga "GO".:0006950 Vastus stressile”.Populatsioon 22660 aktiveeris sekundaarseid metaboliite hõlmava horisontaalse resistentsusreaktsiooni, tuues esile liigse arvu termineid "GO:0016104 Triterpeeni biosünteesi protsess" ja "GO:0006722 Triterpeeni metabolismi protsess" (mõlemad terminid kuuluvad samasse geenikomplekti), võttes arvesse GO: geenide rikastumisreaktsiooni2 ja Mandeleeni rikastumisreaktsiooni2 stabiilsuse analüüsi tulemusi. 60. Lisaks sisaldavad varajane reaktsioon 83A:476 (6 hpi) ja hiline reaktsioon Mandelup ja populatsioon 22660 terminit GO:0015979 „fotosüntees” ja muid sellega seotud bioloogilisi protsesse.
Siberi katku lupiiniga (1999. aastal Poolas Wierzhenice'is asuvalt lupiinipõldudelt saadud Col-08 tüvi) transkriptoomiliste reaktsioonide käigus erinevalt ekspresseeritud geenide annotatsioonis valitud bioprotsessi geeniontoloogia terminid on tugevalt liialdatud.Analüüsitud NLL-liinid olid: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, teadmata geneetiline taust), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (tundlik).
Kuna selle uuringu eesmärk oli tuvastada geene, mis aitavad kaasa antraknoosiresistentsusele, analüüsiti terminitele GO „GO: 0006952 kaitsereaktsioonid“ ja „GO: 0055114 redoksprotsessid“ omistatud geene piirväärtustega, kuna lähteväärtus on ≥ 30 vähemalt ühe reaga.× ajahetk, mis ühendab statistiliselt olulisi log2 väärtusi (kordne muutus).Nendele kriteeriumidele vastavate geenide arv oli GO:0006952 puhul 65 ja GO:0055114 puhul 524.
83A:476 näitas kaks DEG piiki, millele on lisatud termin GO:0006952, esimene 6 geeni tolli kohta (64 geeni, üles- ja allareguleerimine) ja teine ​​24 geeni tolli kohta (15 geeni, ainult üles reguleerimine).Boregine näitas ka, et GO:0006952 saavutas haripunkti samal ajahetkel, kuid väiksema DEG-ga (11 ja 8) ja eelisaktiveerimisega.Mandeloop näitas kahte GO piiki: 0006952 12 ja 48 HPI juures, mõlemad kandsid 12 geeni (esimene aktiveerivate geenidega ja teine ​​ainult supresseerivate geenidega), samas kui 22660 populatsioonil 6 HPI juures (13 geeni) oli kasvupiigi ülekaal suurem.määrus.Tuleb märkida, et 96, 4% GO:0006952 DEG-st nendes piikides oli sama tüüpi vastus (üles või alla), mis näitab kaitsereaktsioonide olulist kattumist, hoolimata kaasatud geenide arvu erinevustest.Suurim terminiga GO:0006952 seotud järjestuste rühm kodeerib nälgimise stressiga seotud sõnumivalku 22 (SAM22-sarnane), mis kuulub klassi 10 patogeneesiga seotud valgu (PR-10) valgu klade ja tuumvalgu lateksi.sarnane (MLP-sarnane) valk) valk (joonis 3).Need kaks rühma erinesid väljenduse olemuse ja vastuse suuna poolest.SAM22-sarnaseid valke kodeerivad geenid näitasid järjepidevat ja olulist induktsiooni varajastel ajahetkedel (6 või 12 hpi) ega reageerinud üldiselt katse lõpus (48 hpi), samas kui MLP-sarnased valgud näitasid koordinatsiooni 6 hpi juures.hpi.83A:476 ja Mandelup 48 hj/in, peaaegu kõik muud andmepunktid ei reageerinud.Lisaks järgisid SAM22-sarnaste valgugeenide ekspressiooniprofiilide erinevused antraknoosiresistentsuse täheldatud varieeruvust, kuna resistentsematel liinidel oli rohkem ajapunkte, mis neid geene oluliselt indutseerisid, kui vastuvõtlikumatel geenidel.Teine LlR18A/B-sarnane PR-10 geen näitas SAM22-taolise valgu geeniga väga sarnast ekspressioonimustrit.
Tuvastati bioloogilise protsessi termini “GO:0006952 Defense Response” põhikomponendid ning Lanr1 ja AnMan alleelide kandidaatgeenide ekspressioonimustrid.Log2 skaala esindab log2 väärtusi (kordne muutus) inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt, Wizhenica, Poola, 1999) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel samal ajahetkel.Analüüsiti järgmisi kitsalehelise lupiini liine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (tundlik).
Lisaks hinnati RNA-seq kandidaatgeenide Lanr1 (TanjilG_05042) ja AnMan (TanjilG_12861) ekspressiooniprofiile (joonis 3).Geen TanjilG_05042 näitas olulist vastust (aktiveerumist) 83A:476 juures ainult esimesel ajahetkel (6 hpi), samas kui TanjilG_12861 oli Mandeloopis oluline ainult kahel ajahetkel: 6 hpi (allareguleerimine) ja 24 hpi (6 hpi).Koos.).reguleeritav)).
Termini GO:0055114 "redoksprotsess" kõige enam üleekspresseeritud geenid olid tsütokroom P450 valke ja peroksidaasi kodeerivad geenid (joonis 4).Proovide puhul, mis eraldati 83A:476-st 6 HPI juures, täheldati üldiselt maksimaalset või minimaalset log2 (kordne muutus) väärtust (86,6% geenide puhul) nakatatud ja kontrolltaimede vahel, mis tõstab esile selle genotüübi kõrge vastuse soole inokuleerimisele.83A:476 näitas kõige olulisemat GO: 0055114 DEG 6 hpi juures (503 geeni), ülejäänud liinid aga 48 hpi juures (Boregine, 31 geeni; Mandelup, 85 geeni; ja populatsioon 22660, 78 geeni)).Enamikus GO:0055114 perekonna geenides täheldati kahte tüüpi vastuseid vaktsineerimisele (aktiveerimine ja inhibeerimine).Huvitav on see, et kuni 97,6% DEG-dest, mis tuvastati termini GO: 0055114 jaoks Mandelupe'is võimsusel 48 hj. Need tähelepanekud viitavad sellele, et vaatamata oluliselt väiksemale skaalale (st muteerunud redoksgeenide arvule 85 versus 503) on hilinenud transkriptoomiliste reaktsioonide muster varase mandeloosiga 6:4 sarnane sipelgas3:4.Boregine'is ja populatsioonis 22660 on see lähenemine madalam, vastavalt 51,6% ja 75,6%.
Selgusid bioloogilise protsessi termini “GO:0055114 Redoksprotsess” põhikomponentide väljendusmustrid.Log2 skaala esindab log2 väärtusi (kordne muutus) inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt, Wizhenica, Poola, 1999) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel samal ajahetkel.Analüüsiti järgmisi kitsalehelise lupiini liine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (tundlik).
83A:476 C. lupini (tüvi Col-08) inokuleerimise transkriptoomilised vastused hõlmasid ka terminile GO:0015979 "fotosüntees" omistatud geenide koordineeritud vaigistamist ja muid seotud bioloogilisi protsesse (joonis 5).See GO:0015979 DEG komplekt sisaldas 105 geeni, mis olid 6 hpi juures 83A:476 juures oluliselt represseeritud.Selles alamhulgas reguleeriti Mandelupis ka 37 geeni 48 HPI juures ja 35 geeni samal ajal 22 660 populatsioonis, sealhulgas 19 DEG-d, mis on ühised mõlemale genotüübile.Terminiga GO: 0015979 seotud DEG-d ei aktiveeritud märkimisväärselt üheski kombinatsioonis (rida x aeg).
Selgusid bioloogilise protsessi termini “GO:0015979 Fotosüntees” põhikomponentide väljendusmustrid.Log2 skaala esindab log2 väärtusi (kordne muutus) inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt, Wizhenica, Poola, 1999) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel samal ajahetkel.Analüüsiti järgmisi kitsalehelise lupiini liine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (tundlik).
Diferentsiaalekspressioonianalüüsi tulemuste põhjal ja arvatavasti kaasatud kaitsereaktsioonidesse patogeensete seente vastu, valiti see seitsmest geenist koosnev komplekt ekspressiooniprofiilide kvantifitseerimiseks reaalajas PCR-iga (täiendav tabel S9).
Oletatav valgugeen TanjilG_10657 indutseeriti märkimisväärselt kõigis uuritud liinides ja ajapunktides võrreldes kontroll- (miimika) taimedega (täiendavad tabelid S10, S11).Lisaks näitas TanjilG_10657 ekspressiooniprofiil katse käigus kõigi liinide puhul suurenevat trendi.Populatsioon 22660 näitas TanjilG_10657 suurimat tundlikkust inokuleerimise suhtes 114-kordse aktivatsiooniga ja kõrgeimat suhtelist ekspressioonitaset (4,4 ± 0,4) 24 HPI juures (joonis 6a).PR10 LlR18A valgu geen TanjilG_27015 näitas samuti aktiveerumist kõigil joontel ja ajapunktidel, statistilise olulisusega enamikus andmepunktides (joonis 6b).Sarnaselt TanjilG_10657-ga täheldati TanjilG_27015 kõrgeimat suhtelist ekspressioonitaset 22660 inokuleeritud populatsioonis 24 HPI juures (19,5 ± 2,4).Happe endokitinaasi geen TanjilG_04706 oli kõigis liinides ja kõigil ajahetkedel märkimisväärselt ülesreguleeritud, välja arvatud Boregine 6 hpi (joonis 6c).See indutseeriti tugevalt esimesel ajahetkel (6 HPI) 83A:476 juures (10,5 korda) ja mõõdukalt suurenes teistes liinides (6,6–7,5 korda).Katse ajal jäi TanjilG_04706 ekspressioon sarnasele tasemele 83A:476 ja Boregine puhul, samas kui Mandelupis ja populatsioonis 22660 suurenes see oluliselt, jõudes suhteliselt kõrgete väärtusteni (vastavalt 5,9 ± 1,5 ja 6,2 ± 1,5).Endoglükaan-1,3-β-glükosidaasilaadne geen TanjilG_23384 näitas kõrget aktivatsiooni kahel esimesel ajahetkel (6 ja 12 hpi) kõigil liinidel, välja arvatud populatsioon 22660 (joonis 6d).TanjilG_23384 kõrgeimaid suhtelisi ekspressioonitasemeid täheldati teisel ajahetkel (12 hpi) Mandelupis (2,7 ± 0,3) ja 83A:476 (1,5 ± 0,1).24 HPI juures oli TanjilG_23384 ekspressioon kõigis uuritud liinides suhteliselt madal (0,04 ± 0,009 kuni 0,44 ± 0,12).
Valitud geenide (ag) ekspressiooniprofiilid, mis selgusid kvantitatiivse PCR abil.Numbrid 6, 12 ja 24 tähistavad tunde pärast vaktsineerimist.Normaliseerimiseks kasutati geene LanDExH7 ja LanTUB6 ning seeriatevaheliseks kalibreerimiseks LanTUB6.Vearibad tähistavad standardhälvet, mis põhineb kolmel bioloogilisel kordusel, millest igaüks on kolme tehnilise korduse keskmine. Inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud 1999. aastal lupiinipõllult Poolast Wierzenicas) ja kontrolltaimede (vajalikult inokuleeritud) ekspressioonitasemete erinevuste statistiline olulisus on märgitud andmepunktide kohal (*P väärtus < 0,05, **P väärtus ≤ 01,0,0.0). Inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud 1999. aastal lupiinipõllult Poolast Wierzenicas) ja kontrolltaimede (vajalikult inokuleeritud) ekspressioonitasemete erinevuste statistiline olulisus on märgitud andmepunktide kohal (*P väärtus < 0,05, **P väärtus ≤ 01,0,0.0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, ло 99 Col-09 я люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точнихе, 0,5, над точниче ение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Andmepunktide kohal on täheldatud statistiliselt olulisi erinevusi nakatatud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud 1999. aastal lupiinipõllult Wierzhenice'is Poolas) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) ekspressioonitasemete vahel (*P väärtus < 0,05, **P-väärtus ≤ 0,0 0,01).接种 (Colletotrichum lupini), Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模槍，水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,01, ***P 值0.0.0)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对玤）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменныюпч-08, лич-08, на в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены отмечены над точкам0, Польша ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Andmepunktide kohal on täheldatud statistiliselt olulisi erinevusi nakatatud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt Verzhenice'is Poolas 1999. aastal) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) ekspressioonitasemete vahel (*P väärtus < 0,05 , **P-väärtus ≤ 0,01, 0,01, 0,0 .01).Analüüsitud NLL-liinid olid: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli), Boregine (resistentne, teadmata geneetiline taust) ja populatsioon 22660 (tundlik).
Kandidaatgeen TanjilG_05042 Lanr1 lookuses näitas oluliselt erinevat ekspressioonimustrit RNA-seq uuringutes saadud profiilidest (joonis 6e).Selle geeni olulist aktiveerumist täheldati Mandelupis ja 22660 populatsioonis (vastavalt kuni 39,7 ja 11,7 korda), mille tulemuseks oli suhteliselt kõrge ekspressioonitase (vastavalt kuni 1,4 ± 0,14 ja 7,2 ± 1,3).83A:476 näitas ka TanjilG_05042 geeni mõningast ülesreguleerimist (kuni 3,8 korda), kuid saavutatud suhtelised ekspressioonitasemed (0,044 ± 0,002) olid enam kui 30 korda madalamad kui Mandelupis ja 22660 populatsioonis täheldatud.qPCR-ga analüüsitud tulemused näitasid olulisi erinevusi ekspressioonitasemetes proovivaktsineeritud (kontroll)variantide genotüüpide vahel, saavutades 58-kordse erinevuse populatsioonide 22660 ja 83A:476, samuti populatsioonide 22660 ja 22660 vahel. Boregine'i ja Mandalupi vahel saavutati kahekordne erinevus.
Kandidaatgeen AnMan lookuses TanjilG_12861 aktiveerus vastusena vaktsineerimisele 83A:476 ja Mandelupis, oli populatsioonis 22660 neutraalne ja Boregine'is alareguleeritud (joonis 6f).Geeni TanjilG_12861 suhteline ekspressioon oli kõrgeim inokuleeritud 83A puhul: 476 (0,14 ± 0,01).17,4 kDa I klassi kuumašokivalgu geen TanjilG_05080 HSP17.4 näitas madalamat suhtelist ekspressioonitaset kõigis uuritud tüvedes ja ajapunktides (joonis 6g).Kõrgeimat väärtust täheldati 24 HPI juures 22660 populatsioonis (0,14 ± 0,02, kaheksakordne kasv vaktsineerimisele).
Geeniekspressiooniprofiilide võrdlus (joonis 7) näitas kõrget korrelatsiooni TanjilG_10657 ja nelja muu geeni vahel: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) ja 4 TanjilG_10657 (r = 0,80) ja 4 TanjilG_.9.Sellised tulemused võivad viidata nende geenide kaasreguleerimisele kaitsereaktsioonide ajal.Geenid TanjilG_12861 ja TanjilG_23384 näitasid teiste geenidega võrreldes erinevaid ekspressiooniprofiile madalama Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendi väärtustega (vastavalt 0,08 kuni 0,43 ja -0,19 kuni 0,28).
Korrelatsioonid geeniekspressiooniprofiilide vahel tuvastati kvantitatiivse PCR abil.Analüüsiti järgmisi kitsalehise lupiini liine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata) ja populatsioon 22660 (tundlik).Arvutati kolm ajapunkti (6, 12 ja 24 tundi pärast nakatamist), sealhulgas inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, mis saadi 1999. aastal Poolas Wierzhenice'i lupiinipõldudelt) ja kontrolltaimed (võltsinokuleeritud).Skaala näitab Pearsoni korrelatsioonikordaja väärtust.
Tuginedes andmetele, mis saadi 6 hobujõuga tolli kohta, viidi WGCNA läbi 9981 kraadi juures, mis tuvastati nakatatud ja kontrolltaimede võrdlemisel, et keskenduda varajasele kaitsereaktsioonile (täiendav tabel S12).Leiti kakskümmend kaks geenimoodulit (klastrit), millel on korrelatsioonis (positiivsed või negatiivsed) ekspressiooniprofiilid genotüüpide ja eksperimentaalsete variantide vahel. Keskmiselt langesid geeniekspressiooni tasemed järjestuses 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemal variandil oli see tendents siiski tugevam kontrolltaimedel). Keskmiselt langesid geeniekspressiooni tasemed järjestuses 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemal variandil oli see tendents siiski tugevam kontrolltaimedel). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Rahvaarv 22660 (в обоих вариантац, элеац, нетац, нотентах, сильнее у контрольных растений). Keskmiselt langesid geeniekspressiooni tasemed suurusjärgus 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemal variandil oli see tendents siiski tugevam kontrolltaimedel).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Rahvaarv 22660 的顺序下降（然而，作两势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> rahvaarv 22660 的 顺序 下降 （Ｇ 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Rahvaarv 22660 (однако в обоих варианэбельтахлеих варинянентах е у контрольных растений). Keskmiselt langesid geeniekspressiooni tasemed seerias 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (kuid mõlema variandi puhul oli see tendents tugevam kontrolltaimedel).Vaktsineerimine tõi kaasa geeniekspressiooni ülesreguleerimise, eriti moodulites 18, 19, 14, 6 ja 1 (mõju kahanevas järjekorras), negatiivse regulatsiooni (nt moodulid 9 ja 20) või neutraalsete mõjudega (nt moodulid 11, 22, 8 ja 13).GO termini rikastamise analüüs (täiendav tabel S13) näitas "GO: 0006952 kaitsereaktsioonid" nakatatud mooduli (18) jaoks maksimaalse aktiveerimisega, sealhulgas qPCR-ga analüüsitud geenid (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_016l57, TanjilG_016l57 ja enamik) pressitud fotosünteesi moodulid (9).Mooduli 18 kontsentraator (joonis 8) tuvastati kui TanjilG_26536 geen, mis kodeerib PR-10-sarnast LlR18B valku, ja mooduli 9 kontsentraator tuvastati kui TanjilG_28955 geen, mis kodeerib fotosüsteemi II PsbQ valku.Antraknoosiresistentsuse kandidaatgeen Lanr1, TanjilG_05042, leiti moodulist 22 (joonis 9) ja see on seotud terminitega "GO:0044260 Cellular makromolekulaarsed metaboolsed protsessid" ja "GO:0006355 Transkriptsiooniregulatsioon, DNA mallimine", mis kannab TanjilG hub_01212.geen kodeerib kuumastressi transkriptsioonifaktorit A-4a (HSFA4a).
Moodulite geenide koosekspressiooni kaalutud võrguanalüüs koos bioloogilise protsessi üleesindatud terminitega "GO: 0006952 Kaitsereaktsioonid".Ligeerimist lihtsustati, et tõsta esile neli qPCR-iga analüüsitud geeni (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ja TanjilG_27015).
Mooduli geenikoekspressiooni kaalutud võrguanalüüs, millel on üleesindatud bioloogilise protsessi termin "GO: 0006355: Transkriptsiooni regulatsioon, DNA mallimine" ja mis kannab antraknoosiresistentsuse kandidaatgeeni Lanr1 TanjilG_05042.Ligeerimist lihtsustati, et eraldada TanjilG_05042 geen ja keskne TanjilG_01212 geen.
Austraalias kogutud antraknoosiresistentsuse sõeluuring näitas, et enamik varakult vabastatud kultivaridest olid vastuvõtlikud;Kalya, Coromup ja Mandelup on kirjeldatud kui mõõdukalt vastupidavad, samas kui Wonga, Tanjil ja 83A:476 on kirjeldatud kui väga vastupidavad26,27,31.oli sama resistentsuse alleel, tähisega Lanr1, ning Coromupil ja Mandelupil oli erinev alleel, tähistusega AnMan10, 26, 39, samas kui Kalya andis edasi erineva alleeli., Lanr2.Antraknoosiresistentsuse sõeluuringul Saksamaal tuvastati resistentne liin Bo7212, mille kandidaatalleel oli muu kui Lanr1, tähisega LanrBo36.
Meie uuring näitas Lanr1 alleeli väga madalat sagedust (umbes 6%) testitud iduplasmas.See tähelepanek on kooskõlas Ida-Euroopa iduplasma skriinimise tulemustega, kasutades Anseq3 ja Anseq4 markereid, mis näitasid, et Lanr1 alleel esineb ainult kahes Valgevene liinis.See viitab sellele, et Lanr1 alleeli ei kasutata kohalikes aretusprogrammides veel laialdaselt, erinevalt Austraaliast, kus see on üks peamisi alleele markeri abil aretuses.See võib olla tingitud Lanr1 alleeli madalamast resistentsuse tasemest Euroopa välitingimustes võrreldes Austraalia raportiga.Lisaks on antraknoosi uuringud Austraalia suure sademesisaldusega piirkondades näidanud, et Lanr1 alleeli vahendatud resistentsusreaktsioonid ei pruugi olla tõhusad ilmastikutingimustes, mis soodustavad patogeeni kasvu ja kiiret arengut 19, 42.Tegelikult täheldati käesolevas uuringus mõningaid antraknoosi sümptomeid ka Lanr1 alleeli kandvates genotüüpides, mis viitab sellele, et resistentsus võib C. lupini arenguks optimaalsetes tingimustes kaduda.Lisaks on võimalikud valepositiivsed tõlgendused Anseq3 ja Anseq4 markerite olemasolu kohta, mis asuvad Lanr1 lookusest ligikaudu 1 cM kaugusel 28, 30, 43 .
Meie uuring näitas, et Lanr1 alleeli kandev 83A:476 reageeris C. lupini inokuleerimisele ulatusliku transkriptoomi ümberprogrammeerimisega esimesel analüüsitud ajahetkel (6 hpi), samas kui Mandelupis, mis kandis AnMan alleeli, täheldati transkriptoomilisi reaktsioone palju hiljem.(24 kuni 48 hj).Need kaitsereaktsioonide ajalised variatsioonid on seotud haiguse sümptomite erinevustega, rõhutades patogeeni varajase äratundmise tähtsust edukaks reageerimiseks resistentsusele.Taimekoe nakatamiseks peavad siberi katku eosed peremehe pinnal läbima mitu arenguetappi, sealhulgas idanemist, rakkude jagunemist ja appressooriumi moodustumist.Lisand on nakkuslik struktuur, mis kinnitub peremeesorganismi pinnale ja hõlbustab tungimist peremeesorganismi kudedesse.Seega näitasid C. gloeosporioides eosed herneekstraktis tuuma esimest jagunemist pärast 75–90-minutilist inkubeerimist, idutoru moodustumist 90–120 minuti pärast ja supressiooni 4 tunni pärast 45 .Mango C. gloeosporioides näitas pärast 3-tunnist inkubeerimist enam kui 40% koniidide idanemist ja umbes 20% appressorite moodustumist 4 tunni pärast.C. gloeosporioides'e virulentsusega seotud CAP20 geen näitas epifüüte moodustavates koniidides transkriptsioonilist aktiivsust pärast 3,5-tunnist inkubeerimist avokaado pinnavahas kõrge CAP20 valgu kontsentratsiooniga 4 tunni ja 46 minuti pärast.Sarnaselt indutseeriti C. trifolii melaniini biosünteesi geenide aktiivsus 2-tunnise inkubeerimise ajal, millele järgnes 1 tunni pärast appressooriumi moodustumine.Lehtede kudede uuringud on näidanud, et C. acutatum'iga nakatatud maasikatel on esimene supressioon 8 hpi juures, samas kui C. coccode'iga nakatatud tomatitel on esimene supressioon 4 hpi48,49.suures osas kooskõlas Colletotrichum spp.nakkusprotsess.Kiired kaitsereaktsioonid 83A:476-le viitavad taimeresistentsuse ja efektor-käivitatud immuunsuse (ETI) geenide osalemisele selles reas, samas kui Mandelupi hilinenud vastused toetavad mikro-seotud molekulaarmustriga vallandatud immuunsuse (MTI) hüpoteesi 50. Varajased vastused 83A-le: 476 ja Mandelup.Seda kontseptsiooni toetab ka üles- või allareguleeritud geenide osaline kattumine hilinenud vastuses, kuna ETI-d peetakse sageli kiirendatud ja tõhustatud MTI vastuseks, mis kulmineerub programmeeritud rakusurmaga nakkuskohas, mida tuntakse anafülaktilise šokina 51,52 .
Enamik geene, mis on omistatud üleesindatud terminile Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response", on stressist põhjustatud paastusõnumi 22 valgu (sarnane SAM22-ga) ja seitsme peamise lateksivalgulaadse (MLP) 11 homoloogi.-sarnased valgud 31, 34, 43 ja 423 näitasid järjestuste sarnasust.SAM22-sarnased geenid näitasid olulist aktivatsiooni, mis kestis kauem, näidates suurenenud antraknoosiresistentsuse taset (83A: 476 ja Boregine).MLP-sarnased geenid olid aga allareguleeritud ainult kandidaatresistentsuse alleeli kandvates liinides (83A:476/Lanr1 6 hpi juures ja Mandelup/AnMan 24 hpi juures).Tuleb märkida, et kõik tuvastatud SAM22-sarnased homoloogid pärinevad geeniklastrist, mis hõlmab umbes 105 kb, samas kui MLP-sarnased geenid pärinevad genoomi erinevatest piirkondadest.Selliste SAM22-sarnaste geenide koordineeritud aktiveerimine leiti ka meie eelmises uuringus NLL-i resistentsuse kohta Diaporthetoxica inokulatsiooni suhtes, mis viitab sellele, et need on seotud kaitsereaktsiooni horisontaalsete komponentidega.Seda järeldust toetavad ka teated SAM22-sarnaste geenide positiivsest vastusest vigastusele või ravile salitsüülhappe, seente indutseerijate või vesinikperoksiidiga.
On näidatud, et MLP-sarnased geenid reageerivad paljudele taimeliikidele erinevatele abiootilistele ja biootilistele stressidele, sealhulgas bakteriaalsetele, viiruslikele ja patogeensetele seeninfektsioonidele55.Reaktsiooni suunad teatud taimede ja patogeenide vahelistele interaktsioonidele varieerusid tugevast suurenemisest (st puuvilla nakatumise ajal Verticillium dahliae'ga) kuni olulise vähenemiseni (st pärast õunapuu nakatumist Alternaria spp.)56,57.MLP-sarnase geeni 423 olulist allareguleerimist on täheldatud avokaado kaitsevõime ajal F. niger nakkuse vastu ja õunapuu Botryosphaeria berengeriana f. nakatumise ajal.cn.piricola ja Alternaria alternata on õuna patotüübid58,59.Lisaks oli MLP-sarnast geeni 423 üleekspresseerivatel õunakallidel resistentsusega seotud geenide ekspressioon madalam ja nad olid seeninfektsioonile vastuvõtlikumad59.Pärast Fusarium oxysporum f-i supresseeriti resistentses hariliku oa iduplasmas ka MLP-sarnane geen 423.cn.Ubade infektsioon 60.
Teised meie RNA-seq uuringus tuvastatud PR-10 perekonna liikmed olid LlR18A ja LlR18B geenid vastuseks ülesreguleerimisele, samuti ülesreguleeritud (1 geen) või allareguleeritud (3 geeni) geen lipiidide ülekandevalgu DIR1 jaoks..Lisaks tõstab WGCNA selle mooduli keskpunktina esile LlR18B geeni, mis on väga vastuvõtlik vaktsineerimisele ja kannab mitmeid kaitsva vastuse geene.LlR18A ja LlR18B geenid indutseeriti kollastes lupiini lehtedes vastusena patogeensetele bakteritele, samuti NLL vartes pärast D. toxica nakatamist, samas kui nende geenide riisi homoloog RSOsPR10 indutseeriti kiiresti seeninfektsiooniga, mis arvatavasti oli seotud D6 non-the-2000 happe geeni jasmoonilise 16,563 signaaliga. spetsiifilised lipiidide transpordivalgud, mis on vajalikud süsteemse omandatud resistentsuse (SAR) tekkeks.Kaitsereaktsioonide arenedes transporditakse DIR1 valk infektsioonikoldest läbi floeemi, et indutseerida SAR-i kaugetes elundites.Huvitav on see, et TanjilG_02313 DIR1 geen indutseeriti märkimisväärselt esimesel ajahetkel liinides 84A:476 ja populatsioonis 22660, kuid antraknoosiresistentsus arenes edukalt välja ainult real 84A:476.See võib viidata DIR1 geeni mõningasele subfunktsionaliseerimisele NLL-is, kuna ülejäänud kolm homoloogi vastasid inokuleerimisele ainult liinis 83A:476 6 hpi juures ja see reaktsioon oli suunatud allapoole.
Meie uuringus olid kõige levinumad komponendid, mis vastavad bioloogilisele protsessile, mida nimetatakse "GO:0055114 redoksprotsessiks", tsütokroom P450 valk, peroksidaas, linoolhappe 9S-/13S-lipoksügenaas ja 1-aminotsüklopropaan-1-karboksüülhappe oksüdaas.Lisaks määratleb meie WGCNA HSFA4a homoloogi moodulina, mis kannab selliseid mooduleid nagu Lanr1 resistentsuse geenikandidaat TanjilG_05042.HSFA4a on taimede tuuma transkriptsiooni redoks-sõltuva regulatsiooni komponent.
Tsütokroom P450 valgud on oksidoreduktaasid, mis katalüüsivad NADPH-st ja/või O2-st sõltuvaid hüdroksüülimisreaktsioone primaarses ja sekundaarses metabolismis, sealhulgas ksenobiootikumide, aga ka hormoonide, rasvhapete, steroolide, rakuseina komponentide, biopolümeeride ja kaitseühendite biosüntees. 0,6 log2 (kordne muutus) 5,7-ni suure hulga muudetud homoloogide (37) ja konkreetsete geenide reageerimismustrite erinevuste tõttu, mis peegeldavad ülespoole suunatud revisjoni..Ainult RNA-seq andmete kasutamine NLL geenide oletatava bioloogilise funktsiooni selgitamiseks sellises suures valgu superperekonnas oleks väga spekulatiivne.Siiski väärib märkimist, et mõned tsütokroom P450 geenid on seotud suurenenud resistentsusega patogeensete seente või bakterite suhtes, sealhulgas allergiliste reaktsioonide tekkega 69, 70, 71.
III klassi peroksidaasid on multifunktsionaalsed taimeensüümid, mis osalevad paljudes ainevahetusprotsessides taimede kasvu ja arengu ajal, samuti vastusena keskkonnamõjudele, nagu soolsus, põud, kõrge valguse intensiivsus ja patogeenide rünnak72.Peroksidaasid osalevad mitmete taimeliikide koostoimes Anthracis'ega, sh Stylosanthes humilis ja C. gloeosporioides, Lens culinaris ja C. truncatum, Phaseolus vulgaris ja C. lindemuthianum, Cucumis sativus ja C. lagenarium73,74,75,76.Reaktsioon on väga kiire, mõnikord isegi 4 HPI juures, enne kui seen tungib taimekoesse73.Peroksidaasi geen reageeris ka D. toxica NLL inokuleerimisele.Lisaks tüüpilistele funktsioonidele oksüdatiivse purske reguleerimisel või oksüdatiivse stressi kõrvaldamisel võivad peroksidaasid häirida patogeeni kasvu, luues füüsilisi barjääre, mis põhinevad rakuseina tugevdamisel spetsiifiliste ühendite lignifitseerimise, subühiku või ristsidumise ajal.Selle funktsiooni võib in silico omistada TanjilG_03329 geenile, mis kodeerib oletatavat ligniini moodustavat anioonperoksidaasi, mis oli meie uuringus 83A:476 resistentses liinis 6 HPI juures oluliselt ülesreguleeritud, kuid mitte teiste tüvede ja ajapunktide puhul, mis ei reageerinud.
Linoolhappe 9S-/13S-lipoksügenaas on lipiidide biosünteesi oksüdatiivse raja esimene samm78.Selle raja saadustel on taimekaitses mitmeid funktsioone, sealhulgas rakuseina tugevdamine kalloosi ja pektiini ladestumise kaudu ning oksüdatiivse stressi reguleerimine reaktiivsete hapnikuliikide tootmise kaudu79, 80, 81, 82, 83.Käesolevas uuringus muudeti linoolhappe 9S-/13S-lipoksügenaasi ekspressiooni kõigis tüvedes, kuid vastuvõtlikus populatsioonis 22660 valitses erinevatel ajahetkedel ülesreguleerimine, samas kui resistentset Lanr1 ja AnMan alleeli kandvate tüvede puhul rõhutab see oksülipiini kihi reaktsiooni mitmekesistamist nende anthraxi kaitsvate kihtide vahel.
1-aminotsüklopropaan-1-karboksülaatoksüdaasi (ACO) homoloog oli lupiiniga inokuleerimisel oluliselt ülesreguleeritud (9 geeni) või allareguleeritud (2 geeni).Kahe erandiga ilmnesid kõik need reaktsioonid 6 hj juures.83A:476 juures.ACO valkude vahendatud ensümaatiline reaktsioon on etüleeni tootmise kiirust piirav etapp ja seetõttu on see kõrgelt reguleeritud84.Etüleen on taimne hormoon, mis mängib erinevaid rolle taimede arengu reguleerimisel ning reageerimisel abiootilistele ja biootilistele stressitingimustele.ACO transkriptsiooni indutseerimine ja etüleeni signaaliraja aktiveerimine on seotud riisi resistentsuse suurendamisega hemibiotroofse seente oryzae oryzae suhtes, reguleerides reaktiivsete hapnikuliikide ja fütoaleksiinide tootmist.Väga sarnane M. oryzae ja C. lupini88,89 vahel leitud lehtede nakatumise protsess selles uuringus kirjeldatud ACO homoloogide olulise ülesreguleerimise taustal liinis 83A:476 nihutab võimalust anda resistentsus NLL antraknoosi etüleeni suhtes signaali keskseks sammuks molekulaarsetes radades.
Käesolevas uuringus täheldati paljude fotosünteesiga seotud geenide ulatuslikku supressiooni 6 hpi juures 83A:476 ja 48 hpi Mandeloop ja 22660 populatsioonis.Nende muutuste ulatus ja progresseerumine on võrdeline tasemega.Selles katses täheldati resistentsust antraknoosi suhtes.Hiljuti on mitmes taime-patogeeni interaktsiooni mudelis, sealhulgas patogeensetes bakterites ja seentes, teatatud fotosünteesiga seotud transkriptide tugevast ja varasest represseerimisest.Kiirustamine (mõnede interaktsioonide korral 2 HPI-st) ja fotosünteesiga seotud geenide globaalne allasurumine vastuseks infektsioonile võivad vallandada taime immuunsuse, mis põhineb reaktiivsete hapnikuliikide kasutuselevõtul ja nende koostoimel salitsüülhappe rajaga allergiliste reaktsioonide vahendamiseks 90,94.
Kokkuvõtteks võib öelda, et kõige resistentsema liini (83A: 476) jaoks pakutud kaitsereaktsiooni mehhanismid hõlmavad kiiret patogeeni äratundmist R-geeni poolt (arvatavasti TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ja allergilise reaktsiooni vahendatud salitsüülhappe ja etüleeni signaaliülekannet, millele järgneb pikamaa SAR-i loomine.tegevust toetab DIR-1 valk.Tuleb märkida, et C. lupini nakkuse biotroofne periood on väga lühike (umbes 2 päeva), millele järgneb nekrootiline kasv95.Üleminek nende etappide vahel võib olla seotud nekroosi ja etüleeniga indutseeritavate valkude ekspressiooniga, mis toimivad peremeestaimede ülitundlikkusreaktsioonide vallandajana.Seetõttu on ajaaken C. lupini edukaks püüdmiseks biotroofses staadiumis väga kitsas.Redoks- ja fotosünteesiga seotud geenide ümberprogrammeerimine, mida täheldati 83A:476 juures 6 hpi juures, on kooskõlas seente hüüfide progresseerumisega ja kuulutab eduka kaitsereaktsiooni arengut biotroofilises staadiumis.Mandelupi ja 22660 populatsiooni transkriptoomilised vastused võivad enne nekrootilisele kasvule üleminekut seente püüdmiseks liiga hiljaks jääda, kuid Mandelup võib olla efektiivsem kui 22660 populatsioon, kuna PR-10 valgu suhteliselt kiire reguleerimine soodustab horisontaalset resistentsust.
ETI, mida juhib kanooniline R geen, näib olevat tavaline mehhanism ubade resistentsuseks antraknoosi suhtes.Seega annab liblikõielise Medicago truncatula mudelresistentsuse antraknoosi suhtes RCT1 geen, mis kuulub TIR-NBS-LRR97 taime R geeniklassi.See geen annab vastuvõtlikele taimedele ülekandmisel ka lutsernis laia toimespektriga resistentsuse antraknoosi suhtes.Harilikul oal (P. vulgaris) on praeguseks tuvastatud üle kahe tosina antraknoosiresistentsuse geeni.Mõnda neist geenidest leidub piirkondades, kus puuduvad kanoonilised R-geenid, kuid paljud teised asuvad NBS-LRR geeniklastrit kandvate kromosoomide, sealhulgas TIR-NBS-LRR99, servades.Kogu genoomi hõlmav SSR-uuring kinnitas ka NBS-LRR geeni seost hariliku oa antraknoosiresistentsusega.Kanooniline R-geen leiti ka genoomses piirkonnas, mis kannab valge lupiini 101 peamist antraknoosiresistentsuse lookust.
Meie töö näitab, et kohene resistentsusreaktsioon, mis aktiveerub taimenakkuse varases staadiumis (soovitavalt hiljemalt 12 hpi), kaitseb ahtalehist lupiini tõhusalt patogeense seente Collelotrichum lupini põhjustatud antraknoosi eest.Kasutades suure läbilaskevõimega sekveneerimist, demonstreerisime Lanr1 ja AnMan resistentsuse geenide vahendatud antraknoosiresistentsuse geenide erinevat ekspressiooniprofiili NLL taimedes.Edukas kaitse hõlmab redoks-, fotosünteesi- ja patogeneesis osalevate valkude geenide hoolikat kavandamist mõne tunni jooksul pärast taime esimest kokkupuudet patogeeniga.Sarnased, kuid ajaliselt viivitatud kaitsereaktsioonid on taimede kaitsmisel haiguste eest palju vähem tõhusad.Lanr1 geeni vahendatud siberi katku resistentsus sarnaneb R-geeni tüüpilise kiire reageerimisega (efektori poolt käivitatud immuunsus), samas kui AnMan geen annab suure tõenäosusega horisontaalse vastuse (immuunsus, mille käivitab mikroobidega seotud molekulaarmuster), tagades mõõduka jätkusuutlikkuse.
Antraknoosimarkerite skriinimiseks kasutatud 215 NLL liini koosnesid 74 kultivarist, 60 liinist, mis saadi ristamise või aretamise teel, 5 mutandist ja 76 looduslikust või algsest iduplasmast.Liinid tulid 17 riigist, peamiselt Poolast (58), Hispaaniast (47), Saksamaalt (27), Austraaliast (26), Venemaalt (19), Valgevenest (7), Itaaliast (5) ja teistelt liinidelt.10 riigist.Komplekt sisaldab ka võrdlusresistentseid jooni: 83A:476, Tanjil, Wonga, mis kannab Lanr1 alleeli ja Mandelup, mis kannab AnMani alleeli.Liinid saadi Euroopa lupiini geneetiliste ressursside andmebaasist, mida haldab Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poola (täiendav tabel S1).
Taimi kasvatati kontrollitud tingimustes (fotoperiood 16 tundi, temperatuur 25°C päeval ja 18°C ​​öösel).Analüüsiti kahte bioloogilist kordust.DNA eraldati kolme nädala vanustest lehtedest, kasutades DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt protokollile.Eraldatud DNA kvaliteeti ja kontsentratsiooni hinnati spektrofotomeetriliste meetoditega (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).AnManM1 markerit, mis tähistab antraknoosiresistentsuse geeni AnMan (tuletatud cv. Mandelupist) ja markereid Anseq3 ja Anseq4, mis külgnevad geeniga Lanr1 (tuletatud cv. Tanjilist), analüüsiti 11, 26, 28.Resistentse alleeli homosügootid hinnati väärtusega "1", vastuvõtlikud - "0" ja heterosügootid - 0,5.
Tuginedes markerite AnManM1, AnSeq3 ja AnSeq4 sõelumise tulemustele ning seemnete saadavusele lõplikeks järelkatseteks, valiti antraknoosiresistentsuse fenotüüpimiseks 50 NLL liini.Analüüs viidi läbi kahes eksemplaris arvutiga juhitavas kasvuhoones 14-tunnise fotoperioodiga temperatuurivahemikus 22 °C päeval ja 19 °C öösel.Seemneid kriimustatakse (lõigatakse terava teraga ära embrüo vastasküljelt seemnekest), et vältida seemnete uinumist liiga kõvast seemnekestast ja tagada ühtlane idanemine.Taimi kasvatati pottides (11 × 11 × 21 cm) steriilse pinnasega (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varssavi, Poola).Inokuleerimine viidi läbi Colletotrichum lupini Col-08 tüvega, mis kasvatati 1999. aastal Suur-Poolas Verzhenitsa (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) põllul kasvatatud ahtalehiste lupiinitaimede vartest.Hankige ala.Sporulatsiooni esilekutsumiseks kasvatati isolaate SNA söötmes 20 °C juures musta valguse all 21 päeva.Neli nädalat pärast külvi, kui taimed olid jõudnud 4-6 lehe faasi, viidi läbi inokuleerimine, pihustades koniidide suspensiooni kontsentratsiooniga 0,5 x 106 koniidi 1 ml kohta.Pärast inokuleerimist hoiti taimi 24 tundi pimedas niiskuse juures umbes 98% ja temperatuuril 25 °C, et hõlbustada koniidide idanemist ja nakkusprotsessi.Seejärel kasvatati taimi 14-tunnise fotoperioodi all 22 °C päeval / 19 °C öösel ja 70% niiskuse juures.Haiguse skoor määrati 22 päeva pärast nakatamist ja see oli vahemikus 0 (immuunsus) kuni 9 (väga vastuvõtlik), olenevalt nekrootiliste kahjustuste olemasolust või puudumisest vartel ja lehtedel.Lisaks mõõdeti peale punktide andmist taimede kaal.Markerite genotüüpide ja haiguse fenotüüpide vahelised seosed arvutati kahe järjestuse punktkorrelatsioonidena (heterosügootsete markerite puudumine antraknoosiresistentsuse fenotüübi analüüsimiseks mõeldud joonte komplektis).