Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
On vaja usaldusväärset in vitro süsteemi, mis suudaks täpselt reprodutseerida südame füsioloogilist keskkonda ravimite testimiseks.Inimese südamekoekultuurisüsteemide piiratud kättesaadavus on viinud südameravimite mõju ebatäpsete tõlgendusteni.Siin oleme välja töötanud südame koekultuuri mudeli (CTCM), mis stimuleerib elektromehaaniliselt südamelõike ja läbib füsioloogilise venituse südametsükli süstoolse ja diastoolse faasi ajal.Pärast 12-päevast kultiveerimist parandas see lähenemine osaliselt südamesektsioonide elujõulisust, kuid ei säilitanud täielikult nende struktuurilist terviklikkust.Seetõttu leidsime pärast väikeste molekulide sõelumist, et 100 nM trijodotüroniini (T3) ja 1 μM deksametasooni (Dex) lisamine meie söötmele säilitas sektsioonide mikrostruktuuri 12 päeva.Kombinatsioonis T3/Dex-raviga säilitas CTCM-süsteem transkriptsiooniprofiilid, elujõulisuse, metaboolse aktiivsuse ja struktuurse terviklikkuse 12 päeva jooksul värske südamekoega samal tasemel.Lisaks kutsub südamekoe liigne venitamine kultuuris esile hüpertroofilise südame signaaliülekande, mis annab tõendeid CTCM-i võime kohta jäljendada südame venitusest põhjustatud hüpertroofilisi seisundeid.Kokkuvõtteks võib CTCM modelleerida südame füsioloogiat ja patofüsioloogiat kultuuris pika aja jooksul, võimaldades usaldusväärset ravimite sõeluuringut.
Enne kliinilisi uuringuid on vaja usaldusväärseid in vitro süsteeme, mis suudavad täpselt reprodutseerida inimese südame füsioloogilist keskkonda.Sellised süsteemid peaksid jäljendama muutunud mehaanilist venitust, südame löögisagedust ja elektrofüsioloogilisi omadusi.Loommudeleid kasutatakse tavaliselt südamefüsioloogia sõelumisplatvormina, millel on piiratud usaldusväärsus ravimite mõju kajastamisel inimese südames1, 2.Lõppkokkuvõttes on ideaalne südamekoekultuuri eksperimentaalne mudel (CTCM) mudel, mis on väga tundlik ja spetsiifiline erinevate terapeutiliste ja farmakoloogiliste sekkumiste jaoks, reprodutseerides täpselt inimese südame füsioloogiat ja patofüsioloogiat3.Sellise süsteemi puudumine piirab uute südamepuudulikkuse ravimeetodite avastamist4,5 ja on viinud ravimite kardiotoksilisuseni, mis on turult lahkumise peamine põhjus6.
Viimase kümnendi jooksul on kaheksa mittekardiovaskulaarset ravimit kliinilisest kasutusest kõrvaldatud, kuna need põhjustavad QT-intervalli pikenemist, mis põhjustab ventrikulaarseid arütmiaid ja äkksurma7.Seega on üha suurem vajadus usaldusväärsete prekliiniliste sõeluuringustrateegiate järele, et hinnata kardiovaskulaarset efektiivsust ja toksilisust.Hiljutine inimese poolt indutseeritud pluripotentsete tüvirakkudest pärinevate kardiomüotsüütide (hiPS-CM) kasutamine ravimite skriinimisel ja toksilisuse testimisel pakub sellele probleemile osalise lahenduse.Selle meetodi peamised piirangud on aga hiPS-CM-ide ebaküpsus ja südamekoe mitmerakulise keerukuse puudumine.Hiljutised uuringud on näidanud, et seda piirangut saab osaliselt ületada, kasutades varajast hiPS-CM-i südamekoe hüdrogeelide moodustamiseks vahetult pärast spontaansete kontraktsioonide algust ja suurendades aja jooksul järk-järgult elektrilist stimulatsiooni.Kuid neil hiPS-CM mikrokudedel puuduvad täiskasvanud müokardi küpsed elektrofüsioloogilised ja kontraktiilsed omadused.Lisaks on inimese südamekoel keerulisem struktuur, mis koosneb erinevate rakutüüpide, sealhulgas endoteelirakkude, neuronite ja stromaalsete fibroblastide heterogeensest segust, mis on omavahel ühendatud spetsiifiliste ekstratsellulaarse maatriksi valkude komplektidega.See mittekardiomüotsüütide populatsioonide 11, 12, 13 heterogeensus täiskasvanud imetaja südames on peamiseks takistuseks südamekoe modelleerimisel üksikute rakutüüpide abil.Need peamised piirangud rõhutavad füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes intaktse müokardikoe kultiveerimise meetodite väljatöötamise tähtsust.
Inimese südame kultiveeritud õhukesed (300 µm) lõigud on osutunud paljulubavaks inimese puutumata müokardi mudeliks.See meetod võimaldab juurdepääsu täielikule 3D-mitmerakulisele süsteemile, mis on sarnane inimese südamekoele.Kuni 2019. aastani piiras kultiveeritud südamelõikude kasutamist kultuuri lühike (24 h) ellujäämine.Selle põhjuseks on mitmed tegurid, sealhulgas füüsikalis-mehaanilise venituse puudumine, õhu-vedeliku liides ja lihtsate kandjate kasutamine, mis ei toeta südamekoe vajadusi.2019. aastal näitasid mitmed uurimisrühmad, et mehaaniliste tegurite kaasamine südamekoekultuurisüsteemidesse võib pikendada kultuuri eluiga, parandada südame ekspressiooni ja jäljendada südamepatoloogiat.Kaks elegantset uuringut 17 ja 18 näitavad, et üheteljeline mehaaniline koormus avaldab kultiveerimise ajal positiivset mõju südame fenotüübile.Nendes uuringutes ei kasutatud aga südametsükli dünaamilist kolmemõõtmelist füüsikalis-mehaanilist koormust, kuna südame sektsioonid olid koormatud kas isomeetriliste tõmbejõudude 17 või lineaarse auksotoonilise koormusega 18 .Need koe venitamise meetodid põhjustasid paljude südamegeenide allasurumise või ebanormaalsete venitusreaktsioonidega seotud geenide üleekspressiooni.Nimelt on Pitoulis et al.19 töötas välja dünaamilise südamelõigude kultuuri vanni südametsükli rekonstrueerimiseks, kasutades jõuanduri tagasisidet ja pingeajameid.Kuigi see süsteem võimaldab täpsemat in vitro südametsükli modelleerimist, piirab meetodi keerukus ja madal läbilaskevõime selle süsteemi rakendamist.Meie labor on hiljuti välja töötanud lihtsustatud kultiveerimissüsteemi, mis kasutab elektrilist stimulatsiooni ja optimeeritud söödet, et säilitada sea ja inimese südamekoe lõikude elujõulisus kuni 6 päeva20,21.
Käesolevas käsikirjas kirjeldame südame koekultuuri mudelit (CTCM), kasutades sea südame sektsioone, mis sisaldavad humoraalseid näpunäiteid kolmemõõtmelise südamefüsioloogia ja patofüsioloogilise venituse kokkuvõtmiseks südametsükli ajal.See CTCM võib suurendada prekliiniliste ravimite prognoosimise täpsust tasemeni, mida pole kunagi varem saavutatud, pakkudes kulutõhusat keskmise läbilaskevõimega südamesüsteemi, mis jäljendab imetajate südame füsioloogiat/patofüsioloogiat prekliiniliste ravimite testimise jaoks.
Hemodünaamilised mehaanilised signaalid mängivad kriitilist rolli kardiomüotsüütide funktsiooni säilitamisel in vitro 22, 23, 24.Praeguses käsikirjas oleme välja töötanud CTCM-i (joonis 1a), mis võib jäljendada täiskasvanute südamekeskkonda, kutsudes esile nii elektrilise kui ka mehaanilise stimulatsiooni füsioloogilistel sagedustel (1, 2 Hz, 72 lööki minutis).Et vältida kudede liigset venitamist diastoli ajal, kasutati 3D-printimisseadet, et suurendada koe suurust 25% (joonis 1b).Süsteemi C-PACE poolt indutseeritud elektriline stimulatsioon algas 100 ms enne süstooli, kasutades andmehõivesüsteemi, et täielikult reprodutseerida südametsükkel.Koekultuurisüsteem kasutab programmeeritavat pneumaatilist täiturmehhanismi (LB Engineering, Saksamaa), et tsükliliselt laiendada painduvat silikoonmembraani, et põhjustada südame viilude laienemist ülemises kambris.Süsteem ühendati läbi rõhuanduri välise õhuliiniga, mis võimaldas täpselt reguleerida rõhku (± 1 mmHg) ja aega (± 1 ms) (joonis 1c).
a Kinnitage koeosa seadme kultiveerimiskambri sees oleva sinisega näidatud 7 mm tugirõnga külge.Kultuurikamber on õhukambrist eraldatud õhukese painduva silikoonmembraaniga.Asetage iga kambri vahele tihend, et vältida lekkeid.Seadme kaanel on grafiitelektroodid, mis pakuvad elektrilist stimulatsiooni.b Suure koeseadme, juhtrõnga ja tugirõnga skemaatiline kujutis.Koelõigud (pruunid) asetatakse ülegabariidilisele seadmele nii, et juhtrõngas asetatakse seadme välisservas olevasse soonde.Kasutades juhikut, asetage akrüülliimiga kaetud tugirõngas ettevaatlikult südamekoe osa kohale.c Graafik, mis näitab elektrilise stimulatsiooni aega sõltuvalt programmeeritava pneumaatilise täiturmehhanismi (PPD) juhitavast õhukambri rõhust.Elektrilise stimulatsiooni sünkroonimiseks rõhuandurite abil kasutati andmehõiveseadet.Kui rõhk kultiveerimiskambris jõuab seatud läveni, saadetakse impulsssignaal C-PACE-EM-i, et käivitada elektriline stimulatsioon.d Pilt neljast inkubaatori riiulile asetatud CTCM-ist.Neli seadet on pneumaatilise ahela kaudu ühendatud ühe PPD-ga ja hemostaatilisesse klappi sisestatakse rõhuandurid, mis jälgivad rõhku pneumaatilises ahelas.Iga seade sisaldab kuut koeosa.
Ühe pneumaatilise ajamiga saime juhtida 4 CTCM-seadet, millest igaüks mahutas 6 koeosa (joonis 1d).CTCM-is muudetakse õhurõhk õhukambris vedelikukambris sünkroonseks rõhuks ja see kutsub esile südamelõigu füsioloogilise laienemise (joonis 2a ja lisafilm 1).Kudede venituse hindamine 80 mm Hg juures.Art.näitas koelõikude venitamist 25% võrra (joonis 2b).On näidatud, et see protsentuaalne venitus vastab füsioloogilisele sarkomeeri pikkusele 2, 2–2, 3 µm normaalse südameosa kontraktiilsuse korral 17, 19, 25.Kudede liikumist hinnati kohandatud kaamera sätete abil (täiendav joonis 1).Kudede liikumise amplituud ja kiirus (joonis 2c, d) vastasid venitusele südametsükli ajal ning ajale süstoli ja diastoli ajal (joonis 2b).Südamekoe venitus ja kiirus kontraktsiooni ja lõõgastumise ajal püsisid kultuuris 12 päeva konstantsena (joonis 2f).Elektrilise stimulatsiooni mõju hindamiseks kontraktiilsusele kultiveerimise ajal töötasime välja meetodi aktiivse deformatsiooni määramiseks, kasutades varjutusalgoritmi (täiendav joonis 2a, b) ja suutsime eristada deformatsioone elektrilise stimulatsiooniga ja ilma.Sama osa südamest (joonis 2f).Lõike liigutatavas piirkonnas (R6-9) oli pinge elektrilise stimulatsiooni ajal 20% kõrgem kui elektrilise stimulatsiooni puudumisel, mis näitab elektrilise stimulatsiooni panust kontraktiilsesse funktsiooni.
Tüüpilised jäljed õhukambri rõhu, vedelikukambri rõhu ja kudede liikumise mõõtmiste kohta kinnitavad, et kambri rõhk muudab vedelikukambri rõhku, põhjustades vastavat koelõike liikumist.b Koelõikude venitusprotsendi tüüpilised jäljed (sinine), mis vastavad venitusprotsendile (oranž).c Südamelõigu mõõdetud liikumine on kooskõlas mõõdetud liikumiskiirusega.(d) Tsüklilise liikumise (sinine joon) ja kiiruse (oranž punktiirjoon) tüüpilised trajektoorid südame tükis.e Tsükli aja (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), kontraktsiooniaja (n = 19 viilu rühma kohta), lõõgastusaja (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), kudede liikumise (n = 25) kvantifitseerimine.viilud)/rühm erinevatest sigadest), süstoolse kiiruse tipp (n = 24(D0), 25(D12) viilu/rühm erinevatelt sigadelt) ja maksimaalne lõõgastusmäär (n=24(D0), 25(D12) viilu/rühm erinevatelt sigadelt).Kahepoolse Studenti t-test ei näidanud olulist erinevust üheski parameetris.f (punase) ja ilma (sinise) elektrilise stimulatsioonita koelõikude tüüpilised tüveanalüüsi jäljed, kümme piirkondlikku koelõikude piirkonda samast lõigust.Alumised paneelid näitavad pinge protsentuaalse erinevuse kvantifitseerimist koelõikudes koos elektrilise stimulatsiooniga ja ilma selleta kümnes piirkonnas erinevatest sektsioonidest. (n = 8 viilu/rühm erinevatest sigadest, tehakse kahesabalise Studenti t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 viilu/rühm erinevatest sigadest, tehakse kahesabalise Studenti t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 lõiku/rühm erinevatest sigadest, kahe sabaga Studenti t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，5， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，5， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sektsiooni/rühm, erinevatest sigadest, kahe sabaga Studenti t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Meie eelmises staatilises biomimeetilises südameviilude kultuurisüsteemis [20, 21] säilitasime 6 päeva jooksul südameviilude elujõulisuse, funktsiooni ja struktuurse terviklikkuse, rakendades elektrilist stimulatsiooni ja optimeerides söötme koostist.Kuid 10 päeva pärast langesid need näitajad järsult.Viitame oma eelmises staatilises biomimeetilises kultuurisüsteemis 20, 21 kontrolltingimustes (Ctrl) kasvatatud sektsioonidele ja kasutame oma varem optimeeritud söödet MC tingimustena ja kultuuri samaaegse mehaanilise ja elektrilise stimulatsiooni (CTCM) all.kutsus .Esiteks tegime kindlaks, et mehaaniline stimulatsioon ilma elektrilise stimulatsioonita oli kudede elujõulisuse säilitamiseks 6 päeva jooksul ebapiisav (täiendav joonis 3a, b).Huvitav on see, et füsio-mehaanilise ja elektrilise stimulatsiooni kasutuselevõtuga STCM-i abil jäi 12-päevaste südamelõikude elujõulisus MS-i tingimustes samaks kui värsketes südamelõikudes, kuid mitte Ctrl-tingimustes, nagu näitab MTT analüüs (joonis 1).3a).See viitab sellele, et mehaaniline stimulatsioon ja südametsükli simuleerimine võivad hoida koeosad elujõulisena kaks korda kauem, kui meie eelmises staatilises kultuurisüsteemis teatati.Kuid koelõikude struktuurse terviklikkuse hindamine südame troponiini T ja konneksiin 43 immunomärgistamise abil näitas, et konneksiin 43 ekspressioon oli MC kudedes 12. päeval oluliselt kõrgem kui samal päeval kontrollides.Siiski ei säilinud ühtlane konneksiin 43 ekspressioon ja Z-ketta moodustumine (joonis 3b).Kudede struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimiseks kasutame tehisintellekti (AI) raamistikku26, troponiin-T ja konneksiini värvimisel põhinevat pildipõhist süvaõppe torujuhet43, et automaatselt kvantifitseerida südameviilude struktuurne terviklikkus ja fluorestsents lokaliseerimise tugevuse osas.See meetod kasutab konvolutsioonilist närvivõrku (CNN) ja sügavat õpperaamistikku, et usaldusväärselt kvantifitseerida südamekoe struktuurset terviklikkust automatiseeritud ja erapooletult, nagu on kirjeldatud viites.26. MC koe struktuurne sarnasus oli paranenud päevaga 0 võrreldes staatiliste kontrolllõikudega.Lisaks näitas Massoni trikroomvärvimine oluliselt väiksemat fibroosi protsenti MS tingimustes võrreldes kontrolltingimustega kultiveerimise 12. päeval (joonis 3c).Kuigi CTCM suurendas südamekoe lõikude elujõulisust 12. päeval tasemele, mis sarnanes värske südamekoe omaga, ei parandanud see oluliselt südamelõikude struktuurset terviklikkust.
tulpdiagramm näitab värskete südameviilude (D0) või südameviilude kultuuri MTT elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva jooksul kas staatilises kultuuris (D12 Ctrl) või CTCM-is (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) on tehtud erinevatest lõikudest # sigade # # p. 0001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12-ga Ctrl). tulpdiagramm näitab värskete südameviilude (D0) või südameviilude kultuuri MTT elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva jooksul kas staatilises kultuuris (D12 Ctrl) või CTCM-is (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) < ANO # VA/grupi test on tehtud erinevatest lõikudest # 0 p; .0001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12-ga Ctrl).histogramm näitab MTT värske südamelõike (D0) või südamelõikude kultuuri elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva jooksul kas staatilises kultuuris (D12 kontroll) või CTCM-is (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12-ga Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向 测试；，10 测试；，D#0#0 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12」もも比，**phistogramm, mis näitab MTT elujõulisuse kvantifitseerimist värsketes südamelõikudes (D0) või 12 päeva staatilises kultuuris kultiveeritud südamelõikudes (D12 kontroll) või CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll)), 12 (D12 MC) lõiku/rühma erinevatest ANOVA-dest;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga, **p < 0,01 võrreldes D12-ga Ctrl).b Troponiin-T (roheline), konneksiin 43 (punane) ja DAPI (sinine) värskelt isoleeritud südamelõikudes (D0) või staatilistes tingimustes (Ctrl) või CTCM-i tingimustes (MC) 12 päeva kultiveeritud südamelõikudes tüüpiliste immunofluorestsentskujutistega (tühi skaala = 100 µm). Südamekoe struktuurse terviklikkuse tehisintellekti kvantifitseerimine (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühm, igaüks erinevatest sigadest, viiakse läbi ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ****p < 0,0001-ga). Südamekoe struktuurse terviklikkuse tehisintellekti kvantifitseerimine (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühm, igaüks erinevatest sigadest, viiakse läbi ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ****p < 0,0001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 MCпгзо Ctrl 2, (D12) (D12) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 ja ****p < 0,0001 по сравне12). Südamekoe struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimine tehisintellekti abil (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lõiku/rühma erinevatest sigadest, tehtud ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 vs. D0 ja ****p < 0,001 võrreldes D1201).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühm, igaüks erinevatest sigadest, ühesuunaline ANOVA test <0#0#0p10;#. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühm igaüks erinevatest sigadest, ühesuunaline 且渔 ANOVAp0 #0.####D; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl MCпрпр1), 7 (D1/2рес1) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению2). Tehisintellekt südamekoe struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimiseks (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lõiku/rühm erinevaid sigu, ühesuunaline ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Võrdluseks ****p < 0,0201 võrreldes D1201). c Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude tüüpilised kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (n = 10 viilu rühma kohta erinevatest sigadest, tehakse ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrrelduna 1 ja 0,001). c Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude tüüpilised kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (n = 10 viilu rühma kohta erinevatest sigadest, viiakse läbi ühesuunaline ANOVA test; #### p < 0,00-ga 0,1 võrreldes D1 ja 0,1). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тени0 p1 поронний тени0 p1 поронний тени0 p1 поронний тени0 ANOVA; и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massoni trikroomvärviga värvitud südamelõikude tüüpilised kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (katmata skaala = 500 µm) (n = 10 lõiku rühma kohta erinevatelt sigadelt, tehtud ühesuunaline ANOVA test; #### p < 0 ,0001 Ctrl 0,0001 võrreldes D0-ga ja D0-ga ***p < .1). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右））伈右）（裸尺0）（裸尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 伎D0 相比，D0p2 <丸比，*** . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸 尦躸 裸尺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单同 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 ####0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром ая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощонью однофактор; # #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massoni trikroomvärviga (tühi = 500 µm) värvitud südamelõikude tüüpilised kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (n = 10 lõiku rühma kohta, igaüks erinevast seast, testitud ühesuunalise dispersioonanalüüsiga ;### # p < 0,0001 ***p < 0,0,1 võrreldes D0-ga, 0,2 ***p1 võrreldes D0-ga).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Me oletasime, et väikeste molekulide lisamisega söötmele saab CTCM-i kultiveerimise ajal parandada kardiomüotsüütide terviklikkust ja vähendada fibroosi arengut.Seetõttu sõelusime väikeste molekulide osas meie staatilisi kontrollkultuure 20, 21 segavate tegurite väikese arvu tõttu.Selle ekraani jaoks valiti deksametasoon (Dex), trijodotüroniin (T3) ja SB431542 (SB).Neid väikeseid molekule on varem kasutatud hiPSC-CM kultuurides, et kutsuda esile kardiomüotsüütide küpsemine, suurendades sarkomeeri pikkust, T-tuubuleid ja juhtivuse kiirust.Lisaks pärsivad teadaolevalt nii Dex (glükokortikoid) kui ka SB põletikku 29, 30.Seetõttu testisime, kas ühe või nende väikeste molekulide kombinatsiooni lisamine parandaks südameosade struktuurset terviklikkust.Esialgseks sõelumiseks valiti iga ühendi annus rakukultuurimudelites tavaliselt kasutatavate kontsentratsioonide alusel (1 µM Dex27, 100 nM T327 ja 2,5 µM SB31).Pärast 12-päevast kultiveerimist andis T3 ja Dexi kombinatsioon optimaalse kardiomüotsüütide struktuurse terviklikkuse ja minimaalse kiulise remodelleerumise (täiendavad joonised 4 ja 5).Lisaks põhjustas T3 ja Dexi kahe- või kahekordsete kontsentratsioonide kasutamine tavakontsentratsioonidega võrreldes kahjulikke mõjusid (täiendav joonis 6a, b).
Pärast esialgset sõelumist võrdlesime 4 kultiveerimistingimusi (joonis 4a): Ctrl: südamelõigud, mida kultiveeriti meie eelnevalt kirjeldatud staatilises kultuuris, kasutades meie optimeeritud söödet;20.21 TD: T3 ja Ctrl s lisatud Dex kolmapäeval;MC: südamelõigud, mida kasvatati CTCM-is, kasutades meie eelnevalt optimeeritud söödet;ja MT: CTCM koos T3 ja Dexi lisamisega söötmele.Pärast 12-päevast kultiveerimist jäi MS ja MT kudede elujõulisus samaks, mis MTT testiga hinnati värsketes kudedes (joonis 4b).Huvitav on see, et T3 ja Dexi lisamine transwell-kultuuridele (TD) ei toonud kaasa elujõulisuse olulist paranemist võrreldes Ctrl-tingimustega, mis näitab mehaanilise stimulatsiooni olulist rolli südamesektsioonide elujõulisuse säilitamisel.
eksperimentaalne skeem, mis kujutab nelja kultiveerimistingimusi, mida kasutati mehaanilise stimulatsiooni ja T3/Dex lisamise mõju hindamiseks söötmel 12 päeva jooksul. b Tulpdiagramm näitab elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis 4 kultiveerimistingimustes (Ctrl, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) on tehtud erinevatest viiludest #0 #p; 0001, ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12-ga Ctrl). b Tulpdiagramm näitab elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis 4 kultiveerimistingimustes (Ctrl, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) on tehtud erinevatest viiludest #0 #p; 0001, ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12 ctrl-ga). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 päeva pärast вания (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D122 тпорсовру122 (D12)) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 D0 ja **p < 0,01). b Tulpdiagramm näitab elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis 4 kultiveerimistingimustes (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värske südameosaga (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) erinevatest lõikudest ANO #0 p, üks # test # p . 01, ###p < 0,001 vs. D0 ja **p < 0,01 võrreldes D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15)D12D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，###p < ** 0.0001，###p < 丌 0.0D01.0D01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срез0дими срез0дасn () 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, D12, 0,0001, #0#1 p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramm, mis näitab kõiki 4 kultiveerimistingimust (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värske südame lõikudega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), erinevatest sigadest 12 (D12 MC) lõiku rühma kohta, ühesuunaline ANOVA test; D # ###p1<.0.0##p1. **p<0,01 vs kontroll D12). c Tulpdiagramm näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis 4 kultiveerimistingimuses (Ctrl, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 6 viilu rühma kohta erinevatest sigadest, tehakse ühesuunaline ANOVA test; ###p < 0,001, võrreldes D0 ja 0,2 ***p < 0-ga.2). c Tulpdiagramm näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis 4 kultiveerimistingimuses (Ctrl, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 6 viilu rühma kohta erinevatest sigadest, tehakse ühesuunaline ANOVA test; ###p < 0,001, võrreldes D0 ja 0,2 ***p < 0-ga.2). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 päeva jooksul (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свитныйя от разных свитныней, ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogramm näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis 4 kultiveerimistingimustes (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värske südamelõikega (D0) (n = 6 lõiku rühma kohta erinevatelt sigadelt, teostatud ühesuunaline ANOVA test; ###p < 0,001 võrreldes D0 ja 01***01-ga). c.糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###***D < 0.001，与D0（縌 0p1 （ 0.001，与D0相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， 来自 猪 ， ， ， 猪 嵋 ANO ， ， ， ，试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после култивирования култивирования рования (контроль, TD, MC ja MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разныных, от разныных, срезов/группа ены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramm, mis näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigi 4 kultiveerimistingimuste (kontroll, TD, MC ja MT) puhul võrreldes värske südamelõikega (D0) (n = 6 lõiku rühma kohta, erinevatelt sigadelt, ühepoolne Kas ANOVA testid tehti, ###p < 0,001, ***p võrreldes D0,001-ga, 0,001-ga võrreldes 0,001-ga, 0,2***p).d Värskete (sinine), 12. päeva MC (roheline) ja 12. päeva MT (punane) kudede tüveanalüüsi graafikud kümnes piirkondlikus koelõike punktis (n = 4 viilu rühma kohta, ühesuunaline ANOVA test; rühmade vahel ei olnud olulist erinevust).e Vulkaani graafik, mis näitab erinevalt ekspresseeritud geene värsketes südamelõikudes (D0) võrreldes südameosadega, mida kultiveeriti staatilistes tingimustes (Ctrl) või MT tingimustes (MT) 10–12 päeva.f Sarkomeeri geenide soojuskaart südamesektsioonide jaoks, mida on kultiveeritud kõigis kultiveerimistingimustes.Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Kardiomüotsüütide dediferentseerumise tunnuseks on metaboolne sõltuvus rasvhapete oksüdatsioonilt glükolüüsile üleminekust.Ebaküpsed kardiomüotsüüdid kasutavad ATP tootmiseks peamiselt glükoosi ja neil on väheste kristallidega hüpoplastilised mitokondrid5,32.Glükoosi kasutamise analüüsid näitasid, et MC ja MT tingimustes oli glükoosi kasutamine sarnane päeva 0 kudede omaga (joonis 4c).Ctrl-proovid näitasid aga glükoosi kasutamise olulist suurenemist võrreldes värske koega.See näitab, et CTCM ja T3 / Dexi kombinatsioon suurendab kudede elujõulisust ja säilitab 12-päevaste kultiveeritud südameosade metaboolse fenotüübi.Lisaks näitas tüveanalüüs, et tüvetasemed jäid MT ja MS tingimustes 12 päeva samaks kui värskes südamekoes (joonis 4d).
Et analüüsida CTCM-i ja T3 / Dexi üldist mõju südame viilukoe globaalsele transkriptsioonimaastikule, teostasime RNAseq-i kõigi nelja erineva kultiveerimistingimuste südameviiludele (täiendavad andmed 1).Huvitaval kombel näitasid MT lõigud suurt transkriptsioonilist sarnasust värske südamekoega, 13 642 geenist ekspresseeriti ainult 16 erinevalt.Kuid nagu me varem näitasime, näitasid Ctrl-lõigud 10–12-päevase kultuuri järel 1229 erinevalt ekspresseeritud geeni (joonis 4e).Neid andmeid kinnitas südame ja fibroblasti geenide qRT-PCR (täiendav joonis 7a-c).Huvitaval kombel näitasid Ctrl-i sektsioonid südame- ja rakutsükli geenide allareguleerimist ja põletikuliste geeniprogrammide aktiveerimist.Need andmed viitavad sellele, et dediferentseerumine, mis tavaliselt toimub pärast pikaajalist kultiveerimist, on MT tingimustes täielikult nõrgenenud (täiendav joonis 8a, b).Sarkomeeri geenide hoolikas uurimine näitas, et ainult MT tingimustes on sarkomeeri (joonis 4f) ja ioonikanalit (täiendav joonis 9) kodeerivad geenid säilinud, kaitstes neid supressiooni eest Ctrl, TD ja MC tingimustes.Need andmed näitavad, et mehaanilise ja humoraalse stimulatsiooni (T3/Dex) kombinatsiooniga võib südamelõigu transkriptoom jääda sarnaseks värskete südameviiludega pärast 12-päevast kultuuri.
Neid transkriptsiooni leide toetab tõsiasi, et kardiomüotsüütide struktuurne terviklikkus südamesektsioonides säilib kõige paremini MT tingimustes 12 päeva, nagu näitab intaktne ja lokaliseeritud konneksiin 43 (joonis 5a).Lisaks vähenes MT tingimustes oluliselt fibroos südamesektsioonides võrreldes Ctrl-ga ja sarnaselt värskete südamelõikudega (joonis 5b).Need andmed näitavad, et mehaanilise stimulatsiooni ja T3/Dex-ravi kombinatsioon säilitab tõhusalt südame struktuuri südameosades kultuuris.
a Tüüpilised immunofluorestsentskujutised troponiin-T (roheline), konneksiin 43 (punane) ja DAPI (sinine) kohta värskelt isoleeritud südamelõikudes (D0) või kultiveeritud 12 päeva kõigis neljas südamesektsiooni kultuuritingimustes (skaala riba = 100 µm).). Südamekoe struktuurse terviklikkuse tehisintellekti kvantifitseerimine (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, viiakse läbi ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0 ja *5.1 võrrelduna D0 ja *5.1 või 0.0.0-ga. ). Südamekoe struktuurse terviklikkuse tehisintellekti kvantifitseerimine (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viilu/rühm erinevatest sigadest, viiakse läbi ühesuunaline ANOVA test; #### Ctrl p < 0,0001 võrreldes D0 ja *5. ). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта), Ctrl интеллекта (TMC) (D51,2D10) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению <****01 п0,0 и 5p с D0,0 сравнению с D12 Ctrl). Südamekoe struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimine tehisintellekti abil (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) lõiku/rühm erinevatest sigadest, tehtud ühesuunaline ANOVA test; ##****## p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja *p < 0,0-ga.1 võrrelduna *p < 0,0-ga.1).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、、5（D12 TD、D12 MC 和D12臺蛡 和D12 MT（工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000112 䯎４D0112对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p <0.05 盔 0.05；相比）.Südamekoe struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimine tehisintellekti abil erinevatel sigadel (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) lõiku/rühm) ühesuunalise ANOVA testiga;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja *p < 0,05 või ****p < 0,0001 võrreldes D12-ga Ctrl). b Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude tüüpilised kujutised ja kvantifitseerimine (skaalariba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viilu/rühm teostati erinevatest sigadest; <0 #0 sigade ühesuunaline test #0#0. D0 ja ***p < 0,001 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl). b Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude tüüpilised kujutised ja kvantifitseerimine (skaalariba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viilu/rühm teostati erinevatest sigadest; <0 #0 sigade ühesuunaline test #0#0. D0 ja ***p < 0,001 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителеным ка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполнятниро #0, выполняется #0#0#1; по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Massoni trikroomvärviga värvitud südamelõikude tüüpilised kujutised ja kvantifitseerimine (skaala riba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) lõiku rühma kohta erinevatest sigadest, teostatud <*** v. 0,001 või ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D01＀D =1D010（n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析，方差分析；####p0D1４ 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 100 µ0 n = 500 µ0 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 片片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差单因素方差 䯁因素方差 <䯁因素方差 切片 #. ***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Массца (тим00ромом Массца) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ*** ANOVA; ####p < не0,0,0сра1 по 0,0 ,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Massoni trikroomiga värvitud südamelõikude tüüpilised kujutised ja kvantifitseerimine (skaala riba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) lõiku erinevatest sigadest rühma kohta, üks ANOVA meetod <***, 0 kuni 0, 0,1 võrrelduna 0 # # 0,0. ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Lõpuks hinnati CTCM-i võimet jäljendada südame hüpertroofiat, suurendades südamekoe venitust.CTCM-is tõusis õhukambri tipprõhk 80 mmHg-lt 80 mmHg-ni.Art.(tavaline venitus) kuni 140 mmHg Art.(joonis 6a).See vastab venituse suurenemisele 32% (joonis 6b), mida varem näidati vastava venituse protsendina, mis on vajalik südamelõikude jaoks, et saavutada sarkomeeri pikkus, mis on sarnane hüpertroofia korral.Südamekoe venitus ja kiirus kontraktsiooni ja lõõgastumise ajal jäid kuue kultiveerimispäeva jooksul konstantseks (joonis 6c).MT tingimustest pärit südamekude allutati kuue päeva jooksul normaalsetele venitustingimustele (MT (normaalne)) või ülevenitustingimustele (MT (OS)).Juba pärast neljapäevast kultiveerimist oli hüpertroofilise biomarkeri NT-ProBNP sisaldus söötmes MT (OS) tingimustes oluliselt kõrgem võrreldes MT (normaalsete) tingimustes (joonis 7a).Lisaks suurenes pärast kuuepäevast kultiveerimist raku suurus MT-s (OS) (joonis 7b) oluliselt võrreldes MT-südame osadega (normaalne).Lisaks suurenes NFATC4 tuuma translokatsioon märkimisväärselt ülevenitatud kudedes (joonis 7c).Need tulemused näitavad patoloogilise remodelleerumise järkjärgulist arengut pärast hüpertensiooni ja toetavad kontseptsiooni, et CTCM-seadet saab kasutada platvormina venitus-indutseeritud südame hüpertroofia signaalimise uurimiseks.
Tüüpilised jäljed õhukambri rõhu, vedelikukambri rõhu ja kudede liikumise mõõtmiste kohta kinnitavad, et kambri rõhk muudab vedelikukambri rõhku, põhjustades vastavat koelõike liikumist.b Tavaliselt venitatud (oranž) ja ülevenitatud (sinine) koelõikude tüüpilised venitusprotsendi ja venituskiiruse kõverad.c Tulpdiagramm, mis näitab tsükliaega (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), kokkutõmbumisaega (n = 18-19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), lõõgastusaega (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt) ), kudede liikumise amplituudi (n = 14 viilu/rühmas), herne kiirust / rühmas, erinevatest sigadest, kiirust = 1 sigade kohta sead) ja maksimaalne lõõgastuskiirus (n = 14 (D0), 15 (D6) ) lõigud/rühmad) erinevatelt sigadelt), kahe sabaga Studenti t-test ei näidanud olulist erinevust üheski parameetris, mis näitab, et need parameetrid püsisid konstantsena 6-päevase kultiveerimise ajal ülepingega.Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
NT-ProBNP kontsentratsiooni kvantifitseerimise tulpdiagramm kultuurisöötmes südameviiludest, mida kultiveeriti MT normaalse venituse (Norm) või ülevenitamise (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viilu/rühma erinevatest sigadest, võrreldes venitusega 0; **p on tehtud <0;. **p on tehtud <0; NT-ProBNP kontsentratsiooni kvantifitseerimise tulpdiagramm kultuurisöötmes südameviiludest, mida kultiveeriti MT normaalse venituse (Norm) või ülevenitamise (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viilude/rühma kohta erinevatest sigadest, **p ANO on teostatud <0; 0,0 normaalsega).NT-ProBNP kontsentratsiooni kvantitatiivne histogramm kultiveerimissöötmes südameviiludest, mida kasvatati normaalse MT venituse (norm) või ülevenituse (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4).MTOS) viilu / rühm erinevatest sigadest, teostatud kahefaktoriline dispersioonanalüüs;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 võrreldes normaalse venitusega). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓庡(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行弯向方差分析） ，p < 0,01）. NT-ProBNP kontsentratsiooni kvantifitseerimine südamelõikudes, mida on kultiveeritud MT normaalse venituse (Norm) või ülevenituse (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) erinevatest 猪的幇䏐叐叐幌叐叐双！动; **võrreldes tavalise venitamisega, p < 0,01).histogramm NT-ProBNP kontsentratsioonide kvantifitseerimine südameviiludes, mida kasvatati normaalse MT venituse (norm) või ülevenituse (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ja D4 MTOS) viilu/rühm erinevatest sigadest, kahesuunaline dispersioonanalüüs;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 võrreldes normaalse venitusega). b Tüüpilised kujutised troponiin-T ja WGA-ga värvitud südameviilude jaoks (vasakul) ja raku suuruse kvantifitseerimine (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) rakku/rühm 10 erinevast lõigust erinevatelt sigadelt, kahe sabaga Studenti t-testi < võrreldi 0 normaalsega; ****0p < . b Tüüpilised kujutised troponiin-T ja WGA-ga värvitud südameviilude jaoks (vasakul) ja raku suuruse kvantifitseerimine (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) rakku/rühm 10 erinevast lõigust erinevatelt sigadelt, kahe sabaga Studenti t-testi < võrreldi 0 normaalsega . ****0 p1. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественадголмерасрасов ва) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится, два- проводится; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponiin-T ja AZP-ga (vasakul) värvitud südamesektsioonide esinduslikud kujutised ja raku suuruse kvantifitseerimine (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) rakku/rühm 10 erinevast sektsioonist erinevatest sigadest, kahe sabaga Studenti t-testi < võrreldi 0; ****pin01 normiga). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代辏切片的代辨揃30D ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学玌有尾学生t比，****p < 0,0001）. b Tüüpilised kujutised südamelõikudest, mis on värvitud calcarein-T ja WGA-ga (vasakul) ja raku suurus (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 erinevast viilust (D6 MTNorm)) 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ja количественкаn (количественкаn) = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, ****тьа,0денСритю0,0денСритери; сравнению с нормальным растяжением). b Troponiin-T ja AZP-ga värvitud südamesektsioonide tüüpilised kujutised (vasakul) ja raku suuruse kvantifitseerimine (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 erinevast sektsioonist erinevatelt sigadelt. Rakud/rühm, kahe sabaga kriteerium Student's t;****p < 0,0001 võrreldes normaalse tüvega). c Tüüpilised pildid 0. ja 6. päeva MTOS-i südameviilude kohta, mis on immunomärgistatud troponiin-T ja NFATC4 suhtes ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimine CM-ide tuumadesse (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm erinevatest õpilaste sigadest, *t 0.0-test on tehtud <5-sabaga). c Tüüpilised pildid 0. ja 6. päeva MTOS-i südameviilude kohta, mis on immunomärgistatud troponiin-T ja NFATC4 suhtes ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimine CM-ide tuumadesse (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm erinevatest sigadest, *t-ptai test on tehtud 0 ;0 ;0). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и иммуномеченых для тропонина-Т ja NFATC4, слокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинеристодронннияетсо ента; *p < 0,05). c Südamelõikude tüüpilised kujutised 0 ja 6 päeva MTOS-iga, immunomärgistatud troponiin-T ja NFATC4 suhtes ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimine kooparakkude tuumas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm erinevatest sigadest) viidi läbi kahe ttai testiga Student;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第 6 天 和第 天MTOS 心脏切片丄代表性和代表性的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 曂〼 5 学生t 曂. c Kalkaniin-T ja NFATC4 immunomärgistamise tüüpilised pildid 第0天和第6天MTOS südamelõikudest ja NFATC4 erinevatest NFATC4 易位至CM rakutuumast的痗痗痄痴切, 涤 OS 3 (D)双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонимаркировки тропониколном-Т ja NFATC4 кации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюде < Стьюх свиней). c Tüüpilised kujutised MTOS-i südameviiludest päeval 0 ja 6 erinevate sigade troponiin-T ja NFATC4 immunomärgistamiseks ja NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimiseks CM-i tuumas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm, kahe sabaga < t'.0 ;Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Translatiivsed kardiovaskulaarsed uuringud nõuavad rakulisi mudeleid, mis reprodutseerivad täpselt südame keskkonda.Selles uuringus töötati välja ja iseloomustati CTCM-seade, mis võib stimuleerida südame üliõhukesi osi.CTCM süsteem sisaldab füsioloogiliselt sünkroniseeritud elektromehaanilist stimulatsiooni ning T3 ja Dex vedeliku rikastamist.Kui sea südamelõigud puutusid nende teguritega kokku, jäid nende elujõulisus, struktuurne terviklikkus, metaboolne aktiivsus ja transkriptsiooniline ekspressioon pärast 12-päevast kultiveerimist samaks kui värskes südamekoes.Lisaks võib südamekoe liigne venitamine põhjustada hüperekstensioonist põhjustatud südame hüpertroofiat.Üldiselt toetavad need tulemused füsioloogiliste kultiveerimistingimuste kriitilist rolli normaalse südamefenotüübi säilitamisel ja pakuvad platvormi ravimite sõeluuringuks.
Kardiomüotsüütide toimimiseks ja ellujäämiseks optimaalse keskkonna loomisele aitavad kaasa paljud tegurid.Kõige ilmsemad neist teguritest on seotud (1) rakkudevaheliste interaktsioonidega, (2) elektromehaanilise stimulatsiooniga, (3) humoraalsete teguritega ja (4) metaboolsete substraatidega.Füsioloogilised rakkudevahelised interaktsioonid nõuavad mitme rakutüübi keerulisi kolmemõõtmelisi võrke, mida toetab rakuväline maatriks.Selliseid keerulisi rakulisi interaktsioone on raske in vitro rekonstrueerida üksikute rakutüüpide kooskultuuri abil, kuid neid saab kergesti saavutada, kasutades südamesektsioonide organotüüpset olemust.
Kardiomüotsüütide mehaaniline venitus ja elektriline stimulatsioon on südame fenotüübi säilitamiseks kriitilised 33, 34, 35.Kuigi mehaanilist stimulatsiooni on laialdaselt kasutatud hiPSC-CM konditsioneerimiseks ja küpsemiseks, on mitmed elegantsed uuringud hiljuti proovinud südameviilude mehaanilist stimuleerimist kultuuris, kasutades üheteljelist laadimist.Need uuringud näitavad, et 2D üheteljeline mehaaniline koormus avaldab kultuuri ajal positiivset mõju südame fenotüübile.Nendes uuringutes koormati südame sektsioone kas isomeetriliste tõmbejõududega17, lineaarse auksotoonilise koormusega18 või taastati südametsükkel jõuanduri tagasiside ja pingeajamite abil.Kuid need meetodid kasutavad üheteljelist koe venitust ilma keskkonna optimeerimiseta, mille tulemuseks on paljude südamegeenide pärssimine või ebanormaalsete venitusreaktsioonidega seotud geenide üleekspressioon.Siin kirjeldatud CTCM annab 3D elektromehaanilise stiimuli, mis jäljendab loomulikku südametsüklit tsükliaja ja füsioloogilise venituse osas (25% venitus, 40% süstool, 60% diastool ja 72 lööki minutis).Kuigi see kolmemõõtmeline mehaaniline stimulatsioon üksi ei ole koe terviklikkuse säilitamiseks piisav, on koe elujõulisuse, funktsiooni ja terviklikkuse adekvaatseks säilitamiseks vajalik humoraalse ja mehaanilise stimulatsiooni kombinatsioon T3/Dexiga.
Humoraalsed tegurid mängivad täiskasvanu südame fenotüübi moduleerimisel olulist rolli.Seda tõsteti esile HiPS-CM uuringutes, kus rakkude küpsemise kiirendamiseks lisati söötmele T3 ja Dex.T3 võib mõjutada aminohapete, suhkrute ja kaltsiumi transporti läbi rakumembraanide36.Lisaks soodustab T3 MHC-α ekspressiooni ja MHC-β allareguleerimist, soodustades kiirete tõmbluste müofibrillide moodustumist küpsetes kardiomüotsüütides võrreldes aeglaste tõmblustega müofibrillidega loote CM-s.T3 defitsiit hüpotüreoidsetel patsientidel põhjustab müofibrillaarsete ribade kadumise ja toonuse vähenemise37.Dex toimib glükokortikoidi retseptoritele ja on näidatud, et see suurendab müokardi kontraktiilsust isoleeritud perfusiooniga südametes;38 arvatakse, et see paranemine on seotud mõjuga kaltsiumi ladestuspõhisele sisenemisele (SOCE) 39,40.Lisaks seostub Dex oma retseptoritega, põhjustades laia rakusisese reaktsiooni, mis pärsib immuunfunktsiooni ja põletikku30.
Meie tulemused näitavad, et füüsiline mehaaniline stimulatsioon (MS) parandas kultuuri üldist jõudlust võrreldes Ctrl-ga, kuid ei suutnud säilitada elujõulisust, struktuurset terviklikkust ja südame ekspressiooni 12 päeva jooksul kultuuris.Võrreldes Ctrl-ga parandas T3 ja Dexi lisamine CTCM (MT) kultuuridele elujõulisust ja säilitas sarnased transkriptsiooniprofiilid, struktuurne terviklikkus ja metaboolne aktiivsus värske südamekoega 12 päeva.Lisaks loodi koe venituse astet kontrollides STCM-i abil hüperekstensioonist põhjustatud südame hüpertroofia mudel, mis illustreerib STCM-süsteemi mitmekülgsust.Tuleb märkida, et kuigi südame remodelleerimine ja fibroos hõlmavad tavaliselt terveid organeid, mille ringlevad rakud võivad pakkuda sobivaid tsütokiine, samuti fagotsütoosi ja muid remodelleerumisfaktoreid, võivad südame lõigud siiski jäljendada fibrootilist protsessi vastusena stressile ja traumale.müofibroblastidesse.Seda on selles südamelõike mudelis varem hinnatud.Tuleb märkida, et CTCM-i parameetreid saab moduleerida rõhu/elektrilise amplituudi ja sageduse muutmisega, et simuleerida paljusid haigusseisundeid, nagu tahhükardia, bradükardia ja mehaaniline vereringe tugi (mehaaniline koormamata süda).See muudab süsteemi uimastitestide jaoks keskmise läbilaskevõimega.CTCM-i võime modelleerida ülepingest põhjustatud südame hüpertroofiat sillutab teed selle süsteemi testimiseks isikupärastatud ravi jaoks.Kokkuvõtteks võib öelda, et käesolev uuring näitab, et mehaaniline venitus ja humoraalne stimulatsioon on südamekoe lõikude kultuuri säilitamiseks kriitilise tähtsusega.
Kuigi siin esitatud andmed viitavad sellele, et CTCM on väga paljutõotav platvorm puutumata müokardi modelleerimiseks, on sellel kultiveerimismeetodil mõned piirangud.CTCM-i kultuuri peamiseks piiranguks on see, et see tekitab viiludele pidevaid dünaamilisi mehaanilisi pingeid, mis välistab võimaluse iga tsükli jooksul aktiivselt jälgida südamelõike kontraktsioone.Lisaks on südamesektsioonide väiksuse (7 mm) tõttu piiratud võimalus hinnata süstoolset funktsiooni väljaspool kultuurisüsteeme traditsiooniliste jõuandurite abil.Praeguses käsikirjas ületame selle piirangu osaliselt, hinnates optilist pinget kontraktiilse funktsiooni indikaatorina.See piirang nõuab aga täiendavat tööd ja seda võidakse tulevikus käsitleda, võttes kasutusele meetodid südameviilude funktsiooni optiliseks jälgimiseks kultuuris, näiteks optiline kaardistamine, kasutades kaltsiumi ja pingetundlikke värvaineid.Teine CTCM-i piirang on see, et töömudel ei mõjuta füsioloogilist stressi (eel- ja järelkoormus).CTCM-is indutseeriti rõhk vastassuundades, et reprodutseerida 25% füsioloogilist venitust diastoolis (täielik venitus) ja süstool (kontraktsiooni pikkus elektrilise stimulatsiooni ajal) väga suurtes kudedes.See piirang tuleks tulevastes CTCM-i disainides eemaldada, avaldades mõlemalt poolt piisavat survet südamekoele ja rakendades täpseid rõhu ja mahu suhteid, mis esinevad südamekambrites.
Selles käsikirjas kirjeldatud ülevenitusest põhjustatud ümberkujundamine piirdub hüpertroofiliste hüpervenitussignaalide jäljendamisega.Seega võib see mudel aidata uurida venitus-indutseeritud hüpertroofset signaaliülekannet, ilma et oleks vaja humoraalseid või neuraalseid tegureid (mida selles süsteemis ei eksisteeri).CTCM-i paljususe suurendamiseks on vaja täiendavaid uuringuid, näiteks koos immuunrakkudega kultiveerimine, tsirkuleerivad plasma humoraalsed tegurid ja innervatsioon neuronaalsete rakkudega koos kasvatamisel parandavad haiguste modelleerimise võimalusi CTCM-iga.
Selles uuringus kasutati 13 siga.Kõik loomadega seotud protseduurid viidi läbi vastavalt institutsionaalsetele juhistele ja need kiitis heaks Louisville'i ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee.Aordikaar kinnitati klambriga ja südant perfuseeriti 1 l steriilse kardiopleegiaga (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/ml hepariini, pH kuni 7,4); südameid säilitati jääkülmas kardiopleegilises lahuses kuni jääl laborisse transportimiseni, mis on tavaliselt <10 min. südameid säilitati jääkülmas kardiopleegilises lahuses kuni jääl laborisse transportimiseni, mis on tavaliselt <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично льду.10 обынично südameid hoiti jääkülmas kardiopleegilises lahuses kuni jääl laborisse transportimiseni, mis tavaliselt võtab aega <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Hoidke südameid jääl kardiopleegia kuni laborisse transportimiseni jääl, tavaliselt <10 min.
CTCM-seade töötati välja SolidWorksi arvutipõhise disaini (CAD) tarkvaras.Kultuurikambrid, jagajad ja õhukambrid on valmistatud CNC läbipaistvast akrüülplastist.7 mm läbimõõduga varurõngas on valmistatud suure tihedusega polüetüleenist (HDPE) keskel ja sellel on o-rõnga soon, mis mahutab selle all oleva kandja tihendamiseks kasutatava silikoonist o-rõnga.Õhuke ränidioksiidi membraan eraldab kultuurikambri eraldusplaadist.Silikoonmembraan on laseriga lõigatud 0,02″ paksusest silikoonlehest ja selle kõvadus on 35A.Alumine ja ülemine silikoontihendid on laseriga lõigatud 1/16″ paksusest silikoonlehest ja nende kõvadus on 50A.Ploki kinnitamiseks ja õhukindla tihendi loomiseks kasutatakse 316L roostevabast terasest kruvisid ja tiibmutreid.
Spetsiaalne trükkplaat (PCB) on mõeldud integreerimiseks süsteemiga C-PACE-EM.PCB-l olevad Šveitsi masina pistikupesad on ühendatud grafiitelektroodidega hõbetatud vaskjuhtmete ja elektroodidesse keeratud pronkskruvidega 0-60.Trükkplaat asetatakse 3D-printeri kaane sisse.
CTCM-seadet juhib programmeeritav pneumaatiline täiturmehhanism (PPD), mis loob südametsükliga sarnase kontrollitud vereringe rõhu.Kui rõhk õhukambris suureneb, laieneb painduv silikoonmembraan ülespoole, surudes keskkonna koekoha alla.Seejärel venitatakse selle vedeliku väljutamise tõttu koe pindala, mis jäljendab südame füsioloogilist laienemist diastoli ajal.Lõõgastumise tipphetkel rakendati elektrilist stimulatsiooni läbi grafiitelektroodide, mis vähendas rõhku õhukambris ja põhjustas koelõikude kokkutõmbumise.Toru sees on rõhuanduriga hemostaatiline ventiil õhusüsteemi rõhu tuvastamiseks.Rõhuanduri poolt tajutav rõhk rakendatakse sülearvutiga ühendatud andmekogujale.See võimaldab pidevalt jälgida rõhku gaasikambris.Kui kambri maksimaalne rõhk saavutati (standardne 80 mmHg, 140 mmHg OS), kästi andmehõiveseade saata signaal süsteemile C-PACE-EM, et genereerida 2 ms kahefaasiline pingesignaal, mis on seatud väärtusele 4 V.
Südamelõigud saadi ja kultiveerimistingimused 6 süvendis viidi läbi järgmiselt: Viige kogutud südamed ülekandeanumast alusele, mis sisaldas külma (4 °C) kardiopleegiat.Vasak vatsake eraldati steriilse teraga ja lõigati 1-2 cm3 tükkideks.Need koeplokid kinnitati koeliimiga koealustele ja asetati vibreerivasse mikrotoomi koevanni, mis sisaldas Tyrode'i lahust ja pidevalt hapnikuga (3 g/l 2,3-butaandioonmonooksiim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM glukoosi (0,447 mM 1047 M, 0,8 M, 1047 g), 2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M lahust), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M lahust), kuni 1 L ddH2O).Vibreeriv mikrotoom määrati lõikama 300 µm paksuseid viile sagedusega 80 Hz, horisontaalse vibratsiooni amplituudiga 2 mm ja edasiliikumise kiirusega 0,03 mm/s.Kudevann ümbritseti jääga, et hoida lahus jahedana, ja temperatuuri hoiti 4 °C juures.Viige koelõigud mikrotoomivannist inkubatsioonivanni, mis sisaldab pidevalt hapnikuga küllastunud Tyrode'i lahust jääl, kuni saadakse piisavalt lõike ühe kultiveerimisplaadi jaoks.Transwell-kultuuride jaoks kinnitati koelõigud steriilsetele 6 mm laiustele polüuretaantugedele ja asetati 6 ml optimeeritud söötmesse (199 söödet, 1x ITS-i lisand, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-aluseline ja 2x antibiootikum-seenevastane).Koeosadele rakendati C-Pace'i kaudu elektrilist stimulatsiooni (10 V, sagedus 1,2 Hz).TD tingimuste jaoks lisati värske T3 ja Dex 100 nM ja 1 μM iga söötmevahetuse korral.Sööde küllastatakse hapnikuga enne asendamist 3 korda päevas.Koelõike kultiveeriti inkubaatoris 37 °C ja 5% CO2 juures.
CTCM-i kultuuride jaoks asetati koelõigud kohandatud 3D-printerile Petri tassile, mis sisaldas modifitseeritud Tyrode'i lahust.Seade on loodud suurendama südamelõigu suurust 25% tugirõnga pindalast.Seda tehakse selleks, et südame osad ei veniks pärast Tyrode'i lahusest söötmesse viimist ja diastoli ajal.Histoakrüülliimi kasutades kinnitati 300 µm paksused lõigud 7 mm läbimõõduga tugirõngale.Pärast koelõikude kinnitamist tugirõnga külge lõigake üleliigsed koelõigud ära ja asetage kinnitatud koelõigud tagasi Tyrode'i lahuse vanni jääl (4°C), kuni ühe seadme jaoks on ette valmistatud piisavalt lõike.Kõigi seadmete töötlemisaeg kokku ei tohiks ületada 2 tundi.Pärast 6 koeosa kinnitamist nende tugirõngaste külge pandi CTCM-seade kokku.CTCM-i kultuurikamber on eeltäidetud 21 ml eelhapnikuga söötmega.Viige koelõigud kultiveerimiskambrisse ja eemaldage pipetiga ettevaatlikult kõik õhumullid.Seejärel juhitakse koeosa auku ja surutakse õrnalt kohale.Lõpuks asetage seadmele elektroodi kork ja viige seade inkubaatorisse.Seejärel ühendage CTCM õhutoru ja C-PACE-EM süsteemiga.Pneumaatiline ajam avaneb ja õhuklapp avab CTCM-i.Süsteem C-PACE-EM oli konfigureeritud andma 4 V pinget 1,2 Hz kahefaasilise stimulatsiooni ajal 2 ms jooksul.Söödet vahetati kaks korda päevas ja elektroode vahetati üks kord päevas, et vältida grafiidi kogunemist elektroodidele.Vajadusel saab koelõike nende kultuurisüvenditest eemaldada, et väljutada nende alla sattunud õhumullid.MT ravitingimuste jaoks lisati T3 / Dex värskelt iga söötme vahetusega 100 nM T3 ja 1 μM Dex.CTCM-seadmeid kultiveeriti inkubaatoris 37 °C ja 5% CO2 juures.
Südamelõikude venitatud trajektooride saamiseks töötati välja spetsiaalne kaamerasüsteem.Peegelkaamerat (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jaapan) kasutati koos Navitar Zoom 7000 18-108 mm makroobjektiiviga (Navitar, San Francisco, CA).Visualiseerimine viidi läbi toatemperatuuril pärast söötme asendamist värske söötmega.Kaamera on paigutatud 51° nurga alla ja videot salvestatakse 30 kaadrit sekundis.Esiteks kasutati koos Image-J-ga avatud lähtekoodiga tarkvara (MUSCLEMOTION43), et mõõta südamelõikude liikumist.Mask loodi MATLAB-i (MathWorks, Natick, MA, USA) abil, et määrata müra vältimiseks südamelõikudele huvipakkuvad piirkonnad.Käsitsi segmenteeritud maskid rakendatakse kõikidele piltidele kaadrijadas ja edastatakse seejärel pistikprogrammi MUSCLEMOTION.Muscle Motion kasutab iga kaadri pikslite keskmist intensiivsust, et mõõta selle liikumist võrdluskaadri suhtes.Andmed registreeriti, filtreeriti ja neid kasutati tsükliaja kvantifitseerimiseks ja koe venivuse hindamiseks südametsükli ajal.Salvestatud video järeltöötlemisel kasutati esimest järku nullfaasi digitaalset filtrit.Kudede venivuse (peak-to-peak) kvantifitseerimiseks viidi läbi tippude-tipuni analüüs, et eristada salvestatud signaali piike ja madalikke.Lisaks tehakse detrendimine, kasutades 6. järku polünoomi, et kõrvaldada signaali triivi.Programmikood töötati välja MATLABis, et määrata koe globaalne liikumine, tsükli aeg, lõõgastusaeg ja kokkutõmbumisaeg (täiendav programmikood 44).
Pingutuse analüüsiks, kasutades samu videoid, mis on loodud mehaaniliseks venituse hindamiseks, jälgisime esmalt kahte pilti, mis kujutasid liikumispiike (kõrgeimad (ülemised) ja madalaimad (alumised) liikumispunktid) vastavalt tarkvarale MUSCLEMOTION.Seejärel segmenteerisime koepiirkonnad ja rakendasime segmenteeritud koele varjutusalgoritmi vormi (täiendav joonis 2a).Seejärel jagati segmenteeritud kude kümneks alampinnaks ja iga pinna pinge arvutati järgmise võrrandi abil: pinge = (Sup-Sdown)/Sdown, kus Sup ja Sdown on vastavalt kuju kaugused kanga ülemisest ja alumisest varjust (täiendav joonis .2b).
Südamelõigud fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 48 tundi.Fikseeritud kudesid dehüdreeriti 10% ja 20% sahharoosis 1 tund, seejärel 30% sahharoosis üleöö.Seejärel sisestati lõigud optimaalse lõiketemperatuuri segusse (OCT ühend) ja külmutati järk-järgult isopentaani / kuivjää vannis.Säilitage OCT manustusplokke kuni eraldamiseni temperatuuril -80 °C.Slaidid valmistati sektsioonidena paksusega 8 μm.
Südameosadelt OCT eemaldamiseks kuumutage slaide kuumutusplokil temperatuuril 95 °C 5 minutit.Lisage igale slaidile 1 ml PBS-i ja inkubeerige 30 minutit toatemperatuuril, seejärel immutage lõigud, seadistades 0,1% Triton-X PBS-is 15 minutiks toatemperatuuril.Et vältida mittespetsiifiliste antikehade seondumist prooviga, lisage objektiklaasidele 1 ml 3% BSA lahust ja inkubeerige 1 tund toatemperatuuril.Seejärel eemaldati BSA ja slaidid pesti PBS-ga.Märkige iga näidis pliiatsiga.Primaarsed antikehad (lahjendatud 1:200 1% BSA-s) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ja troponiin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) lisati 90 minuti jooksul (sekundaarselt lahjendatud 1:2% BSA) a Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), küüliku Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vastu veel 90 minutit. Pestud 3 korda PBS-ga Et eristada sihtmärgi värvumist taustast, kasutasime kontrollina ainult sekundaarset antikeha. Lõpuks lisati DAPI-i ja nukleaarsed slaidid (vektorid) ja vektorid. ed küünelakiga. -x suurendus) ja Keyence mikroskoop 40x suurendusega.
WGA värvimiseks kasutati WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) kontsentratsioonis 5 μg/ml PBS-is ja kanti fikseeritud lõikudele 30 minutiks toatemperatuuril.Seejärel pesti slaide PBS-ga ja igale objektiklaasile lisati Sudaani musta ja inkubeeriti 30 minutit.Seejärel pesti slaide PBS-ga ja lisati vectashield manustamiskeskkond.Slaidid visualiseeriti Keyence'i mikroskoobiga 40-kordse suurendusega.
ÜMT eemaldati proovidest, nagu ülalpool kirjeldatud.Pärast OCT eemaldamist kastke slaidid üleöö Bouini lahusesse.Seejärel loputati slaide 1 tund destilleeritud veega ja seejärel asetati 10 minutiks Bibrich aaloehappe fuksia lahusesse.Seejärel pesti slaidid destilleeritud veega ja asetati 10 minutiks 5% fosfomolübdeeni/5% fosfovolframhappe lahusesse.Ilma loputamiseta kandke slaidid 15 minutiks otse aniliinsinise lahusesse.Seejärel pesti slaidid destilleeritud veega ja asetati 2 minutiks 1% äädikhappe lahusesse.Slaidid kuivatati 200 N etanoolis ja kanti üle ksüleeni.Värvitud slaidid visualiseeriti Keyence mikroskoobi abil, millel oli 10x objektiiv.Fibroosi pindala protsent kvantifitseeriti tarkvara Keyence Analyzer abil.
CyQUANT™ MTT rakkude elujõulisuse test (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalooginumber V13154, vastavalt tootja protokollile koos mõningate muudatustega.Eelkõige kasutati MTT analüüsi ajal koe ühtlase suuruse tagamiseks 6 mm läbimõõduga kirurgilist stantsi.Kuded plaaditi individuaalselt MTT substraati sisaldava 12 süvendiga plaadi süvenditesse vastavalt tootja protokollile.Sektsioone inkubeeritakse 37 °C juures 3 tundi ja eluskude metaboliseerib MTT substraadi, moodustades purpurse formazaani ühendi.Asendage MTT lahus 1 ml DMSO-ga ja inkubeerige 37 °C juures 15 minutit, et eraldada südamesektsioonidest lilla formazaan.Proovid lahjendati 1:10 DMSO-s 96-augulistel läbipaistva põhjaga plaatidel ja lilla värvi intensiivsus mõõdeti 570 nm juures, kasutades Cytation plaadilugejat (BioTek).Näidud normaliseeriti iga südamelõigu kaalu järgi.
Südamelõigude sööde asendati glükoosi kasutamise testi jaoks söötmega, mis sisaldas 1 μCi / ml [5-3H]-glükoosi (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA), nagu eelnevalt kirjeldatud.Pärast 4-tunnist inkubeerimist lisage avatud mikrotsentrifuugi tuubi 100 µl söödet, mis sisaldab 100 µl 0,2 N HCl.Seejärel asetati toru stsintillatsioonitorusse, mis sisaldas 500 μl dH2O, et aurustada [3H]2O 72 tunniks temperatuuril 37 °C.Seejärel eemaldage mikrotsentrifuugi katsut stsintillatsioonikatsutist ja lisage 10 ml stsintillatsioonivedelikku.Stsintillatsiooniloendused viidi läbi vedelikstsintillatsioonianalüsaatoriga Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Seejärel arvutati glükoosi kasutamine, võttes arvesse [5-3H]-glükoosi spetsiifilist aktiivsust, mittetäielikku tasakaalu ja tausta, [5-3H]-lahjendust märgistamata glükoosiks ja stsintillatsiooniloenduri efektiivsust.Andmed normaliseeritakse südame sektsioonide massi järgi.
Pärast kudede homogeniseerimist Trizolis eraldati RNA südamesektsioonidest, kasutades Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 vastavalt tootja protokollile.RNAseci raamatukogu ettevalmistamine, järjestamine ja andmete analüüs viidi läbi järgmiselt:
RNA raamatukogu valmistamise lähtematerjalina kasutati 1 μg RNA-d proovi kohta.Järjestusraamatukogud genereeriti NEBNext UltraTM RNA raamatukogu ettevalmistamise komplekti Illumina jaoks (NEB, USA) abil, järgides tootja soovitusi ja iga proovi atribuutide järjestustele lisati indeksikoodid.Lühidalt, mRNA puhastati kogu RNA-st, kasutades polü-T oligonukleotiididega kinnitatud magnethelmeid.Fragmenteerimine viiakse läbi kahevalentseid katioone kasutades kõrgel temperatuuril NEBNext First Strand sünteesireaktsioonipuhvris (5X).Esimene cDNA ahel sünteesiti, kasutades juhuslikke heksameeri praimereid ja M-MuLV pöördtranskriptaasi (RNaas H-).Seejärel sünteesitakse teine ​​cDNA ahel, kasutades DNA polümeraas I ja RNaasi H. Ülejäänud üleulatuvad osad muudetakse eksonukleaasi/polümeraasi aktiivsuse toimel tömbideks otsteks.Pärast DNA fragmendi 3'-otsa adenüülimist kinnitatakse sellele juuksenõela aasastruktuuriga NEBNext Adapter, et valmistada see hübridiseerimiseks ette.Eelistatud pikkusega 150-200 bp cDNA fragmentide selekteerimiseks.raamatukogu fragmendid puhastati AMPure XP süsteemiga (Beckman Coulter, Beverly, USA).Seejärel kasutati enne PCR-i 3 μl USER Enzyme'i (NEB, USA) koos adapteriga ligeeritud suuruses valitud cDNA-ga 15 minutit temperatuuril 37 °C ja seejärel 5 minutit temperatuuril 95 °C.Seejärel viidi läbi PCR, kasutades Phusion High-Fidelity DNA polümeraasi, universaalseid PCR praimereid ja indeksi (X) praimereid.Lõpuks puhastati PCR tooted (AMPure XP süsteem) ja raamatukogu kvaliteeti hinnati süsteemiga Agilent Bioanalyzer 2100.Seejärel sekveneeriti cDNA raamatukogu Novaseqi sekvenaatoriga.Illumina töötlemata pildifailid teisendati töötlemata lugemisteks, kasutades CASAVA Base Callingit.Toorandmed salvestatakse FASTQ(fq)-vormingus failidesse, mis sisaldavad lugemisjadasid ja vastavaid põhikvaliteete.Valige HISAT2, et sobitada filtreeritud järjestuse lugemised Sscrofa11.1 võrdlusgenoomiga.Üldiselt toetab HISAT2 mis tahes suurusega genoome, sealhulgas genoome, mis on suuremad kui 4 miljardit alust, ja enamiku parameetrite jaoks on määratud vaikeväärtused.RNA Seq andmete splaissimise lugemisi saab tõhusalt joondada, kasutades HISAT2, mis on praegu kõige kiirem süsteem, sama või parema täpsusega kui mis tahes muu meetod.
Transkriptide arvukus peegeldab otseselt geeniekspressiooni taset.Geeniekspressiooni tasemeid hinnatakse genoomi või eksonitega seotud transkriptide arvukuse (sekveneerimise arvu) järgi.Lugemiste arv on võrdeline geeniekspressiooni tasemete, geeni pikkuse ja sekveneerimise sügavusega.Arvutati FPKM (fragmendid tuhande aluspaari transkripti kohta, järjestatud miljoni aluspaari kohta) ja diferentsiaalse ekspressiooni P-väärtused määrati DESeq2 paketi abil.Seejärel arvutasime sisseehitatud R-funktsiooni "p.adjust" põhjal Benjamini-Hochbergi meetodil9 iga P väärtuse valetuvastussageduse (FDR).
Südamelõikudest eraldatud RNA muundati cDNA-ks kontsentratsioonis 200 ng/μl, kasutades SuperScript IV Vilo Master segu firmalt Thermo (Thermo, kat. nr 11756050).Kvantitatiivne RT-PCR viidi läbi, kasutades Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 süvendiga läbipaistvat reaktsiooniplaati (Thermo, kat. nr 4483319) ja optilist mikroampliimi (Thermo, kat. nr 4311971).Reaktsioonisegu koosnes 5 µl Taqman Fast Advanced Master segust (Thermo, kat. nr 4444557), 0,5 µl Taqman Praimerist ja 3,5 µl H2O-st, mis on segatud süvendi kohta.Viidi läbi standardsed qPCR tsüklid ja CT väärtusi mõõdeti Applied Biosystems Quantstudio 5 reaalajas PCR seadmega (384 süvendiga moodul; toode nr A28135).Taqmani praimerid osteti firmadelt Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss060181), AGL1 (Ss06061) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04243805_u1) Kõikide proovide geeniväärtused GGAH_15588_m normaliseeriti.
NT-ProBNP vabanemist söötmes hinnati NT-ProBNP komplekti (siga) (kat. nr MBS2086979, MyBioSource) abil vastavalt tootja protokollile.Lühidalt, igasse süvendisse lisati kahes eksemplaris 250 µl igat proovi ja standardit.Vahetult pärast proovi lisamist lisage igasse süvendisse 50 µl analüüsireaktiivi A.Raputage plaati õrnalt ja sulgege hermeetikuga.Seejärel inkubeeriti tablette 37 °C juures 1 tund.Seejärel aspireerige lahus ja peske süvendeid 4 korda 350 µl 1X pesulahusega, inkubeerides pesulahust iga kord 1–2 minutit.Seejärel lisage igasse süvendisse 100 µl analüüsireaktiivi B ja sulgege plaadi hermeetikuga.Tabletti loksutati õrnalt ja inkubeeriti 37 °C juures 30 minutit.Aspireerige lahus ja peske süvendeid 5 korda 350 µl 1-kordse pesulahusega.Lisage igasse süvendisse 90 µl substraadi lahust ja sulgege plaat.Inkubeerige plaati 37 °C juures 10-20 minutit.Lisage igasse süvendisse 50 µl stopplahust.Plaati mõõdeti kohe, kasutades Cytation (BioTek) plaadilugejat, mis oli seatud 450 nm juurde.
Võimsuse analüüsid viidi läbi, et valida rühma suurused, mis annavad> 80% võimsust, et tuvastada parameetri 10% absoluutne muutus 5% I tüüpi veamääraga. Võimsuse analüüsid viidi läbi, et valida rühma suurused, mis annavad> 80% võimsust, et tuvastada parameetri 10% absoluutne muutus 5% I tüüpi veamääraga. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнарунеялнен для обнарунеялнения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Võimsuse analüüs viidi läbi, et valida rühma suurused, mis annaksid >80% võimsust 10% absoluutse parameetri muutuse tuvastamiseks 5% I tüüpi veamääraga.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和5４诤I型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和5４诤I型 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечилоѶне10% обеспечил бы ния параметров и 5% частоты ошибок типа I. Võimsuse analüüs viidi läbi, et valida rühma suurus, mis annaks >80% võimsust 10% absoluutse parameetri muutuse ja 5% I tüüpi veamäära tuvastamiseks.Enne katset valiti koelõigud juhuslikult.Kõik analüüsid olid seisundipimedad ja proovid dekodeeriti alles pärast kõigi andmete analüüsimist.Kõigi statistiliste analüüside tegemiseks kasutati GraphPad Prism tarkvara (San Diego, CA). Kogu statistika puhul peeti p-väärtusi olulisteks väärtustel <0,05. Kogu statistika puhul peeti p-väärtusi olulisteks väärtustel <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kogu statistika puhul peeti p-väärtusi olulisteks väärtustel <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kogu statistika puhul peeti p-väärtusi olulisteks väärtustel <0,05.Kahesabaline Studenti t-test viidi läbi andmetega ainult 2 võrdlusega.Mitme rühma vahelise olulisuse määramiseks kasutati ühe- või kahesuunalist ANOVA-d.Post hoc testide tegemisel rakendati mitme võrdluse arvessevõtmiseks Tukey korrektsiooni.RNAseci andmetel on FDR ja p.adjust arvutamisel erilised statistilised kaalutlused, nagu on kirjeldatud jaotises Meetodid.
Lisateavet uuringu kavandamise kohta leiate selle artikliga seotud loodusuuringute aruande kokkuvõttest.