Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Vaja on usaldusväärset in vitro süsteemi, mis suudaks ravimite testimiseks täpselt reprodutseerida südame füsioloogilist keskkonda. Inimeste südamekoekultuurisüsteemide piiratud kättesaadavus on viinud südame ravimite mõjude ebatäpsete tõlgendusteni. Siin oleme välja töötanud südamekoekultuuri mudeli (CTCM), mis stimuleerib südamelõike elektromehaaniliselt ja läbib füsioloogilise venituse südametsükli süstoolse ja diastoolse faasi ajal. Pärast 12-päevast kultiveerimist parandas see lähenemisviis osaliselt südamelõikude elujõulisust, kuid ei säilitanud täielikult nende struktuurilist terviklikkust. Seetõttu leidsime pärast väikeste molekulide skriinimist, et 100 nM trijodotüroniini (T3) ja 1 μM deksametasooni (Dex) lisamine meie söötmele säilitas lõikude mikrostruktuuri 12 päeva. Kombinatsioonis T3/Dex-raviga säilitas CTCM-süsteem transkriptsiooniprofiilid, elujõulisuse, metaboolse aktiivsuse ja struktuurilise terviklikkuse samal tasemel kui värske südamekude 12 päeva jooksul. Lisaks kutsub südamekoe liigne venitamine kultuuris esile hüpertroofilise südame signaaliülekande, mis annab tõendeid CTCM-i võime kohta jäljendada südame venituse poolt esile kutsutud hüpertroofilisi seisundeid. Kokkuvõtteks võib öelda, et CTCM suudab modelleerida südame füsioloogiat ja patofüsioloogiat kultuuris pika aja jooksul, võimaldades usaldusväärset ravimite skriinimist.
Enne kliinilisi uuringuid on vaja usaldusväärseid in vitro süsteeme, mis suudavad täpselt taasesitada inimese südame füsioloogilist keskkonda. Sellised süsteemid peaksid jäljendama muutunud mehaanilist venitust, südame löögisagedust ja elektrofüsioloogilisi omadusi. Loommudeleid kasutatakse tavaliselt südamefüsioloogia skriiningplatvormina, mille usaldusväärsus ravimite mõju kajastamisel inimese südames on piiratud1,2. Lõppkokkuvõttes on ideaalne südamekoe kultuuri eksperimentaalne mudel (CTCM) mudel, mis on väga tundlik ja spetsiifiline mitmesuguste terapeutiliste ja farmakoloogiliste sekkumiste jaoks, taasesitades täpselt inimese südame füsioloogiat ja patofüsioloogiat3. Sellise süsteemi puudumine piirab uute südamepuudulikkuse ravimeetodite avastamist4,5 ja on viinud ravimite kardiotoksilisuseni, mis on peamine turult lahkumise põhjus6.
Viimase kümnendi jooksul on kliinilisest kasutusest eemaldatud kaheksa mittekardiovaskulaarset ravimit, kuna need põhjustavad QT-intervalli pikenemist, mis viib ventrikulaarsete arütmiate ja äkksurmani. Seega on üha suurem vajadus usaldusväärsete prekliiniliste sõeluuringute strateegiate järele, et hinnata kardiovaskulaarset efektiivsust ja toksilisust. Inimese indutseeritud pluripotentsete tüvirakkudest saadud kardiomüotsüütide (hiPS-CM) hiljutine kasutamine ravimite sõeluuringutes ja toksilisuse testides pakub sellele probleemile osalise lahenduse. Siiski on hiPS-CM-ide ebaküpsus ja südamekoe mitmerakulise keerukuse puudumine selle meetodi peamised piirangud. Hiljutised uuringud on näidanud, et seda piirangut saab osaliselt ületada, kasutades varajast hiPS-CM-i südamekoe hüdrogeelide moodustamiseks vahetult pärast spontaansete kokkutõmmete algust ja suurendades järk-järgult elektrilist stimulatsiooni aja jooksul. Nendel hiPS-CM mikrokudedel puuduvad aga täiskasvanud müokardi küpsed elektrofüsioloogilised ja kontraktiilsed omadused. Lisaks on inimese südamekoel keerulisem struktuur, mis koosneb erinevat tüüpi rakkude heterogeensest segust, sealhulgas endoteelirakud, neuronid ja strooma fibroblastid, mis on omavahel ühendatud spetsiifiliste rakuväliste maatriksvalkude komplektidega. See mitte-kardiomüotsüütide populatsioonide heterogeensus11,12,13 täiskasvanud imetaja südames on peamine takistus südamekoe modelleerimisel individuaalsete rakutüüpide abil. Need olulised piirangud rõhutavad meetodite väljatöötamise olulisust terve müokardikoe kultiveerimiseks füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes.
Inimese südame õhukesed (300 µm) lõigud on osutunud paljulubavaks terve inimese müokardi mudeliks. See meetod annab juurdepääsu täielikule 3D-hulkrakulisele süsteemile, mis sarnaneb inimese südamekoega. Kuni 2019. aastani piiras kultiveeritud südamelõikude kasutamist aga lühike (24 h) kultuuri ellujäämisaeg. Selle põhjuseks on mitmed tegurid, sealhulgas füüsikalis-mehaanilise venituse puudumine, õhu-vedeliku piirpind ja lihtsate keskkondade kasutamine, mis ei toeta südamekoe vajadusi. 2019. aastal näitasid mitmed uurimisrühmad, et mehaaniliste tegurite lisamine südamekoe kultuurisüsteemidesse võib pikendada kultuuri eluiga, parandada südame ekspressiooni ja jäljendada südamepatoloogiat. Kaks elegantset uuringut17 ja18 näitavad, et ühesuunaline mehaaniline koormus avaldab kultiveerimise ajal positiivset mõju südame fenotüübile. Need uuringud ei kasutanud aga südametsükli dünaamilist kolmemõõtmelist füüsikalis-mehaanilist koormust, kuna südamelõike koormati kas isomeetriliste tõmbejõudude17 või lineaarse auksotoonilise koormusega18. Need koevenitusmeetodid põhjustasid paljude südamegeenide pärssimise või ebanormaalsete venitusreaktsioonidega seotud geenide üleekspressiooni. Märkimisväärselt töötasid Pitoulis jt. 19 välja dünaamilise südamelõikude kultuurivanni südametsükli rekonstrueerimiseks, kasutades jõuanduri tagasisidet ja pingeajameid. Kuigi see süsteem võimaldab täpsemat südametsükli in vitro modelleerimist, piirab meetodi keerukus ja madal läbilaskevõime selle süsteemi rakendamist. Meie labor on hiljuti välja töötanud lihtsustatud kultuurisüsteemi, mis kasutab elektrilist stimulatsiooni ja optimeeritud keskkonda, et säilitada sea ja inimese südamekoe lõikude elujõulisust kuni 6 päeva 20,21.
Käesolevas käsikirjas kirjeldame südamekoekultuuri mudelit (CTCM), mis kasutab sea südame lõike, mis sisaldab humoraalseid vihjeid, et korrata südame füsioloogiat ja patofüsioloogilist paisumist südametsükli ajal. See CTCM võib suurendada prekliiniliste ravimite ennustamise täpsust enneolematule tasemele, pakkudes kulutõhusat ja keskmise läbilaskevõimega südamesüsteemi, mis jäljendab imetajate südame füsioloogiat/patofüsioloogiat prekliinilisteks ravimite testideks.
Hemodünaamilised mehaanilised signaalid mängivad kardiomüotsüütide funktsiooni säilitamisel in vitro kriitilist rolli [22,23,24]. Käesolevas käsikirjas oleme välja töötanud CTCM-i (joonis 1a), mis suudab jäljendada täiskasvanu südamekeskkonda, indutseerides nii elektrilist kui ka mehaanilist stimulatsiooni füsioloogilistel sagedustel (1,2 Hz, 72 lööki minutis). Liigse koevenituse vältimiseks diastooli ajal kasutati 3D-printimisseadet, et suurendada koe suurust 25% võrra (joonis 1b). C-PACE-süsteemi poolt indutseeritud elektriline stimulatsioon ajastati algama 100 ms enne süstooli, kasutades andmete kogumise süsteemi, et südame tsükkel täielikult taasesitada. Koekultuurisüsteem kasutab programmeeritavat pneumaatilist ajamit (LB Engineering, Saksamaa), et tsükliliselt laiendada painduvat silikoonmembraani, et põhjustada südameviilude laienemist ülemises kambris. Süsteem ühendati välise õhuvoolikuga rõhuanduri kaudu, mis võimaldas täpselt reguleerida rõhku (± 1 mmHg) ja aega (± 1 ms) (joonis 1c).
a Kinnitage koelõik seadme kultuurikambris oleva 7 mm tugirõnga külge, mis on näidatud sinisega. Kultiveerimiskamber on õhukambrist eraldatud õhukese painduva silikoonmembraaniga. Lekete vältimiseks asetage iga kambri vahele tihend. Seadme kaas sisaldab grafiitelektroode, mis pakuvad elektrilist stimulatsiooni. b Suure koeseadme, juhtrõnga ja tugirõnga skemaatiline esitus. Koelõigud (pruunid) asetatakse ülisuurele seadmele, kusjuures juhtrõngas on paigutatud seadme välisserva soonde. Juhiku abil asetage koeakrüülliimiga kaetud tugirõngas ettevaatlikult südamekoe lõigule. c Graafik, mis näitab elektrilise stimulatsiooni aega õhukambri rõhu funktsioonina, mida juhib programmeeritav pneumaatiline ajam (PPD). Andmete kogumise seadet kasutati elektrilise stimulatsiooni sünkroniseerimiseks rõhuandurite abil. Kui rõhk kultuurikambris saavutab seatud läve, saadetakse C-PACE-EM-ile impulsssignaal elektrilise stimulatsiooni käivitamiseks. d Pilt neljast CTCM-ist, mis on paigutatud inkubaatori riiulile. Neli seadet on ühendatud ühe PPD-ga pneumaatilise vooluringi kaudu ja rõhuandurid on sisestatud hemostaatilisse klappi, et jälgida rõhku pneumaatilises vooluringis. Iga seade sisaldab kuut koelõiku.
Ühe pneumaatilise ajamit kasutades suutsime juhtida nelja CTCM-seadet, millest igaüks mahutas 6 koelõiku (joonis 1d). CTCM-is muundatakse õhukambris olev õhurõhk vedelikukambris sünkroonseks rõhuks ja see kutsub esile südamelõigu füsioloogilise laienemise (joonis 2a ja lisafilm 1). Koevenituse hindamine rõhul 80 mm Hg. Art. näitas koelõikude venitust 25% võrra (joonis 2b). See venituse protsent vastab füsioloogilisele sarkomeeri pikkusele 2,2–2,3 µm normaalse südamelõigu kontraktiilsuse korral17,19,25. Koe liikumist hinnati kohandatud kaamerasätete abil (lisajoonis 1). Koe liikumise amplituud ja kiirus (joonis 2c, d) vastasid venitusele südametsükli ajal ning ajale süstooli ja diastooli ajal (joonis 2b). Südamekoe venitus ja kiirus kokkutõmbumise ja lõdvestumise ajal püsisid 12 päeva kultuuris konstantsena (joonis 2f). Elektrilise stimulatsiooni mõju hindamiseks kontraktiilsusele kultiveerimise ajal töötasime välja meetodi aktiivse deformatsiooni määramiseks varjutusalgoritmi abil (lisajoonis 2a, b) ja suutsime eristada deformatsioone elektrilise stimulatsiooniga ja ilma. Sama südameosa (joonis 2f). Lõike liikuvas piirkonnas (R6-9) oli pinge elektrilise stimulatsiooni ajal 20% kõrgem kui elektrilise stimulatsiooni puudumisel, mis näitab elektrilise stimulatsiooni panust kontraktiilsesse funktsiooni.
Õhukambri rõhu, vedelikukambri rõhu ja koeliikumise mõõtmiste representatiivsed kõverad kinnitavad, et kambri rõhk muudab vedelikukambri rõhku, põhjustades vastava koelõigu liikumise. b Koelõikude protsendilise venituse (sinine) representatiivsed kõverad, mis vastavad protsendilisele venitusele (oranž). c Südamelõigu mõõdetud liikumine on kooskõlas mõõdetud liikumiskiirusega. (d) Tsüklilise liikumise (sinine joon) ja kiiruse (oranž punktiirjoon) representatiivsed trajektoorid südamelõigus. e Tsükliaja (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), kontraktsiooniaja (n = 19 viilu rühma kohta), lõdvestusaja (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), koeliikumise (n = 25) kvantifitseerimine. viilud)/rühm erinevatelt sigadelt), süstoolse tippkiiruse (n = 24(D0), 25(D12) viilu/rühm erinevatelt sigadelt) ja lõdvestuskiiruse (n = 24(D0), 25(D12) viilu/rühm erinevatelt sigadelt) kvantifitseerimine. Kahepoolse Studendi t-testiga ei täheldatud olulist erinevust üheski parameetris. f Koelõikude representatiivsed pingeanalüüsi jäljed elektrilise stimulatsiooniga (punane) ja ilma (sinine), kümme samast sektsioonist pärit koelõikude piirkondlikku piirkonda. Alumised paneelid näitavad pinge protsentuaalse erinevuse kvantifitseerimist koelõikudes elektrilise stimulatsiooniga ja ilma selleta kümnes piirkonnas erinevatest sektsioonidest. (n = 8 viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati kahepoolse Studenti t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati kahepoolse Studenti t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 sektsiooni/rühma erinevatelt sigadelt, kahesuunaline Studendi t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，5， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，5， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sektsiooni/rühma, erinevatelt sigadelt, kahesuunaline Studendi t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Meie eelmises staatilises biomimeetilises südamelõikude kultiveerimissüsteemis [20, 21] säilitasime südamelõikude elujõulisuse, funktsiooni ja struktuurilise terviklikkuse 6 päeva jooksul, rakendades elektrilist stimulatsiooni ja optimeerides söötme koostist. 10 päeva pärast langesid need näitajad aga järsult. Viitame meie eelmises staatilises biomimeetilises kultiveerimissüsteemis 20, 21 kontrolltingimustes (Ctrl) kultiveeritud lõikudele ja kasutame oma eelnevalt optimeeritud söödet MC tingimuste ja samaaegse mehaanilise ja elektrilise stimulatsiooni (CTCM) kultuurina. nimetatakse . Esiteks tegime kindlaks, et mehaaniline stimulatsioon ilma elektrilise stimulatsioonita ei olnud koe elujõulisuse säilitamiseks 6 päeva jooksul piisav (lisajoonis 3a, b). Huvitaval kombel jäi füsiomehaanilise ja elektrilise stimulatsiooni kasutuselevõtuga STCM-i abil 12-päevaste südamelõikude elujõulisus samaks kui värsketel südamelõikudel MS tingimustes, kuid mitte Ctrl tingimustes, nagu näitas MTT analüüs (joonis 1). 3a). See viitab sellele, et mehaaniline stimulatsioon ja südametsükli simulatsioon võivad hoida koelõike elujõulisena kaks korda kauem kui meie eelmises staatilises kultiveerimissüsteemis teatati. Koelõikude struktuurilise terviklikkuse hindamine südame troponiin T ja konneksiin 43 immunomärgistamise teel näitas aga, et konneksiin 43 ekspressioon oli MC kudedes 12. päeval oluliselt kõrgem kui samal päeval kontrollrühmas. Konneksiin 43 ühtlane ekspressioon ja Z-ketta moodustumine ei säilinud aga täielikult (joonis 3b). Koe struktuurilise terviklikkuse kvantifitseerimiseks kasutame tehisintellekti (AI) raamistikku26 ja südamelõikude struktuurilise terviklikkuse ja fluorestsentsi automaatseks kvantifitseerimiseks lokaliseerimise tugevuse osas pildipõhist süvaõppe torujuhet43. See meetod kasutab konvolutsioonilist närvivõrku (CNN) ja süvaõppe raamistikku, et südamekoe struktuurilist terviklikkust usaldusväärselt automatiseeritud ja erapooletul viisil kvantifitseerida, nagu on kirjeldatud viites26. MC kude näitas 0. päevaga võrreldes paremat struktuurilist sarnasust võrreldes staatiliste kontrolllõikudega. Lisaks näitas Massoni trikroomvärvimine MS tingimustes oluliselt madalamat fibroosi protsenti võrreldes kontrolltingimustega 12. kultuuripäeval (joonis 3c). Kuigi CTCM suurendas südamekoe sektsioonide elujõulisust 12. päeval värske südamekoe omaga sarnasele tasemele, ei parandanud see oluliselt südamesektsioonide struktuurilist terviklikkust.
Tulpdiagramm näitab MTT elujõulisuse kvantifitseerimist värskete südameviilude (D0) või südameviilude kultuuri 12 päeva jooksul kas staatilises kultuuris (D12 Ctrl) või CTCM-is (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12 Ctrl-iga). Tulpdiagramm näitab MTT elujõulisuse kvantifitseerimist värskete südameviilude (D0) või südameviilude kultuuri 12 päeva jooksul kas staatilises kultuuris (D12 Ctrl) või CTCM-is (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12 Ctrl-iga).Histogramm näitab MTT värskete südamelõikude (D0) või südamelõikude kultuuri elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva jooksul kas staatilises kultuuris (D12 kontroll) või CTCM-is (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll). ) , 12 (D12 MC) lõiku/rühm erinevatelt sigadelt, teostatakse ühesuunaline ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12-ga (Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组， ANO进测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001D，####p < 与相比，**p.)histogramm, mis näitab MTT elujõulisuse kvantifitseerimist värsketes südamelõikudes (D0) või 12 päeva staatilises kultuuris (D12 kontroll) või CTCM-is (D12 MC) kultiveeritud südamelõikudes (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll)), 12 (D12 MC) lõiku/rühm erinevatelt sigadelt, ühesuunaline ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga, **p < 0,01 võrreldes D12-ga (Ctrl).b Troponiin-T (roheline), konneksiin 43 (punane) ja DAPI (sinine) värskelt isoleeritud südamelõikudes (D0) või staatilistes tingimustes (Ctrl) või CTCM tingimustes (MC) 12 päeva kultiveeritud südamelõikudes) representatiivsetel immunofluorestsentspiltidel (tühi skaala = 100 µm). Südamekoe struktuuri terviklikkuse tehisintellekti kvantifitseerimine (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühma, igaüks erinevalt sigalt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-ga). Südamekoe struktuuri terviklikkuse tehisintellekti kvantifitseerimine (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühma, igaüks erinevalt sigalt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-ga). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7), (D12) D12 срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***ю101 D12 Ctrl). Südamekoe struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimine tehisintellekti abil (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektsiooni/rühma erinevatelt sigadelt, teostatud ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 vs. D0 ja ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-iga).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühm igaüks erinevat siga, ühesuunaline ANOVA test <丸与 䎎0p10;#.相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viilu/rühm igaüks erinevatest sigadest, ühesuunaline ANOVA test <0###0p0#0.###0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl MC), 7 (D5) (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA. Tehisintellekt südamekoe struktuurilise terviklikkuse kvantifitseerimiseks (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektsiooni/rühma igast erinevast sigast, ühesuunaline ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Võrdluseks ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-iga). c Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude representatiivsed kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (skaala tühi = 500 µm) (n = 10 viilu/rühma, igaüks erinevalt sigalt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 võrreldes D12 Ctrl-ga). c Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude representatiivsed kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (skaala tühi = 500 µm) (n = 10 viilu/rühma, igaüks erinevatest sigadest, teostati ühesuunaline ANOVA test; #### p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 võrreldes D12 Ctrl-ga). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест# p#VA; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massoni trikroomvärviga (katmata skaala = 500 µm) värvitud südamelõikude representatiivsed kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (n = 10 lõiku/rühm erinevatelt sigadelt, teostatud ühesuunaline ANOVA test; #### p < 0,0001 võrreldes päevaga D0 ja ***p < 0,001 võrreldes päevaga D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0庉（裸尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 似 与D0 相比 0,00p相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸尦躣 尸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单 拑 单 单向 单 向 单向0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофю дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massoni trikroomvärviga värvitud südamelõikude representatiivsed kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (paremal) (tühi = 500 µm) (n = 10 lõiku/rühm, igaüks erinevalt sealt, testitud ühesuunalise dispersioonanalüüsiga;### # p < 0,0001 võrreldes päevaga D0, ***p < 0,001 võrreldes päevaga D12 Ctrl).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Meie hüpotees oli, et väikeste molekulide lisamine kultuurikeskkonda võib parandada kardiomüotsüütide terviklikkust ja vähendada fibroosi teket CTCM kultuuri ajal. Seetõttu skriiniti väikeseid molekule, kasutades meie staatilisi kontrollkultuure20,21, kuna segavaid tegureid oli vähe. Selle skriinimise jaoks valiti deksametasoon (Dex), trijodotüroniin (T3) ja SB431542 (SB). Neid väikeseid molekule on varem kasutatud hiPSC-CM kultuurides kardiomüotsüütide küpsemise indutseerimiseks, suurendades sarkomeeri pikkust, T-tuubuleid ja juhtivuskiirust. Lisaks on teada, et nii Dex (glükokortikoid) kui ka SB pärsivad põletikku29,30. Seetõttu testisime, kas ühe või nende väikeste molekulide kombinatsiooni lisamine parandaks südamelõikude struktuurilist terviklikkust. Esialgseks skriinimiseks valiti iga ühendi annus rakukultuuri mudelites tavaliselt kasutatavate kontsentratsioonide põhjal (1 μM Dex27, 100 nM T327 ja 2,5 μM SB31). Pärast 12-päevast kultiveerimist andis T3 ja Dexi kombinatsioon tulemuseks optimaalse kardiomüotsüütide struktuuri terviklikkuse ja minimaalse kiulise ümberehituse (lisajoonised 4 ja 5). Lisaks tekitas T3 ja Dexi kahekordse või topeltkontsentratsiooni kasutamine kahjulikke toimeid võrreldes normaalsete kontsentratsioonidega (lisajoonised 6a, b).
Pärast esialgset sõeluuringut võrdlesime nelja kultiveerimistingimust otseselt (joonis 4a): Ctrl: südamelõigud, mida kultiveeriti meie eelnevalt kirjeldatud staatilises kultuuris, kasutades optimeeritud keskkonda; 20.21 TD: T3 ja Ctrl lisati kolmapäeval Dex; MC: südamelõigud, mida kultiveeriti CTCM-is, kasutades meie eelnevalt optimeeritud keskkonda; ja MT: CTCM, millele oli lisatud T3 ja Dex. Pärast 12-päevast kultiveerimist jäi MS- ja MT-kudede elujõulisus samaks kui värsketes kudedes, mida hinnati MTT testiga (joonis 4b). Huvitaval kombel ei parandanud T3 ja Dex lisamine transwell-kultuuridele (TD) elujõulisust oluliselt võrreldes Ctrl-tingimustega, mis näitab mehaanilise stimulatsiooni olulist rolli südamelõikude elujõulisuse säilitamisel.
Eksperimentaalne kujundusdiagramm, mis kujutab nelja kultiveerimistingimust, mida kasutati mehaanilise stimulatsiooni ja T3/Dex lisandi mõju hindamiseks söötmel 12 päeva jooksul. b Tulpdiagramm näitab elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimustes (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12 Ctrl-iga). b Tulpdiagramm näitab elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimustes (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja **p < 0,01 võrreldes D12 kontroll-ga). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во4 культивирования (контроль, TD, MC ja MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TDMT1), D12 TDMT срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Tulpdiagramm näitab elujõulisuse kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimustes (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südamelõikudega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) lõiku/rühm erinevatelt sigadelt, ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 ja **p < 0,01 võrreldes D12 Ctrl-iga). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、、、、D12D15D10)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##00p1 <与##00p1相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ja MT) по сравнению со свежими со свежими срез0дами срез0 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA, ####p <0, ####p <0, ####p <0, # сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramm, mis näitab kõiki nelja kultuuritingimust (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südamelõikudega (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), erinevatelt sigadelt 12 (D12 MC) lõiku/rühm, ühesuunaline ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontroll D12). c Tulpdiagramm näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimuses (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 6 viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 võrreldes D12 Ctrl-ga). c Tulpdiagramm näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimuses (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südameviiludega (D0) (n = 6 viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 võrreldes D12 Ctrl-ga). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 всехло культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от развиных от разнению односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogramm näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimuses (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südamelõikudega (D0) (n = 6 lõiku/rühm erinevatelt sigadelt, teostatud ühesuunaline ANOVA test; ###p < 0,001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 võrreldes D12 Ctrl-ga). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐12，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.0丸D < 0.0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , ， 的 , ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после култивирования культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от раз свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramm, mis näitab glükoosivoo kvantifitseerimist 12 päeva pärast kultiveerimist kõigis neljas kultiveerimistingimuses (kontroll, TD, MC ja MT) võrreldes värskete südamelõikudega (D0) (n = 6 lõiku/rühm, erinevatelt sigadelt, ühepoolsed). Viidi läbi WRE ANOVA testid, ###p < 0,001 võrreldes D0-ga, ***p < 0,001 võrreldes D12-ga (kontroll).d Värskete (sinine), 12. päeva MC (roheline) ja 12. päeva MT (punane) kudede tüveanalüüsi graafikud kümnes piirkondlikus koelõikepunktis (n = 4 viilu/rühm, ühesuunaline ANOVA test; rühmade vahel ei olnud olulist erinevust). e Vulkaanigraafik, mis näitab erinevalt ekspresseeritud geene värsketes südamelõikudes (D0) võrreldes staatilistes tingimustes (Ctrl) või MT tingimustes (MT) 10–12 päeva kultiveeritud südamelõikudega. f Sarkomeeri geenide soojuskaart iga kultiveerimistingimuse korral. Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Metaboolne sõltuvus üleminekust rasvhapete oksüdatsioonilt glükolüüsile on kardiomüotsüütide dedifferentseerumise tunnus. Ebaküpsed kardiomüotsüüdid kasutavad ATP tootmiseks peamiselt glükoosi ja neil on hüpoplastilised mitokondrid, milles on vähe kristasid5,32. Glükoosi kasutamise analüüsid näitasid, et MC ja MT tingimustes oli glükoosi kasutamine sarnane 0-päevaste kudede omaga (joonis 4c). Ctrl proovid näitasid aga glükoosi kasutamise olulist suurenemist võrreldes värske koega. See näitab, et CTCM ja T3/Dexi kombinatsioon suurendab kudede elujõulisust ja säilitab 12-päevaselt kultiveeritud südamelõikude metaboolse fenotüübi. Lisaks näitas tüveanalüüs, et tüvetasemed jäid MT ja MS tingimustes samaks kui värskes südamekoes 12 päeva jooksul (joonis 4d).
CTCM-i ja T3/Dexi üldise mõju analüüsimiseks südamelõigu koe globaalsele transkriptsioonimaastikule viisime läbi RNAseq-i südamelõigudel kõigis neljas erinevas kultuuritingimuses (lisaandmed 1). Huvitaval kombel näitasid MT-lõigud suurt transkriptsioonilist sarnasust värske südamekoega, kusjuures 13 642 geenist ainult 16 ekspresseeriti erinevalt. Nagu me aga varem näitasime, näitasid Ctrl-lõigud 10–12 päeva pärast kultuuris viibimist 1229 erinevalt ekspresseeritud geeni (joonis 4e). Neid andmeid kinnitas südame- ja fibroblastide geenide qRT-PCR (lisajoonis 7a-c). Huvitaval kombel näitasid Ctrl-lõigud südame- ja rakutsükli geenide allareguleerimist ning põletikuliste geeniprogrammide aktiveerimist. Need andmed viitavad sellele, et dedifferentseerumine, mis tavaliselt toimub pärast pikaajalist kultiveerimist, on MT tingimustes täielikult nõrgenenud (lisajoonis 8a, b). Sarkomeeri geenide hoolikas uurimine näitas, et ainult MT tingimustes säilivad sarkomeeri (joonis 4f) ja ioonkanali (lisajoonis 9) kodeerivad geenid, kaitstes neid supressiooni eest Ctrl, TD ja MC tingimustes. Need andmed näitavad, et mehaanilise ja humoraalse stimulatsiooni (T3/Dex) kombinatsiooniga võib südamelõigu transkriptoom jääda 12 päeva pärast kultuuris säilitamist sarnaseks värskete südamelõiguga.
Neid transkriptsioonilisi leide toetab asjaolu, et südamelõikude kardiomüotsüütide struktuuriline terviklikkus säilib kõige paremini MT tingimustes 12 päeva jooksul, nagu näitab nii terve kui ka lokaliseeritud konneksiin 43 (joonis 5a). Lisaks oli MT tingimustes südamelõikude fibroos oluliselt vähenenud võrreldes Ctrl-iga ja sarnane värskete südamelõikudega (joonis 5b). Need andmed näitavad, et mehaanilise stimulatsiooni ja T3/Dex-ravi kombinatsioon säilitab südame struktuuri kultuuris südamelõikudes tõhusalt.
a Troponiin-T (roheline), konneksiin 43 (punane) ja DAPI (sinine) representatiivsed immunofluorestsentskujutised värskelt isoleeritud südamelõikudes (D0) või kultiveeritud 12 päeva jooksul kõigis neljas südamelõikude kultiveerimistingimuses (skaalariba = 100 µm). ). Südamekoe struktuuri terviklikkuse tehisintellekti abil kvantifitseerimine (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja *p < 0,05 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-ga). Südamekoe struktuuri terviklikkuse tehisintellekti abil kvantifitseerimine (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; #### p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja *p < 0,05 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-ga). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = D51,2D10) D12 MC ja D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравне0,0001 по сравне; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Südamekoe struktuurse terviklikkuse kvantifitseerimine tehisintellekti abil (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) sektsiooni/rühma erinevatelt sigadelt, teostatud ühesuunaline ANOVA test; #### p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja *p < 0,05 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-iga).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*盌渖戌5盌智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 比 戯戔 渔0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Südamekoe struktuurilise terviklikkuse kvantifitseerimine tehisintellekti abil erinevatel sigadel (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) sektsiooni/rühma) ühesuunalise ANOVA testiga;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja *p < 0,05 või ****p < 0,0001 võrreldes D12-ga (Ctrl). b Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude representatiivsed kujutised ja kvantifitseerimine (skaalariba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-iga). b Massoni trikroomvärviga värvitud südameviilude representatiivsed kujutised ja kvantifitseerimine (skaalariba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati ühesuunaline ANOVA test; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga ja ***p < 0,001 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-iga). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителенная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выпоялннияетностостостоялняетс; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 ja ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Massoni trikroomvärviga värvitud südamelõikude representatiivsed kujutised ja kvantifitseerimine (skaalariba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) lõiku/rühm erinevatelt sigadelt, teostatud ühesuunaline ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 ja ***p < 0,001 või ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）D01（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差0.0###p与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ0 n（0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 片 片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差分析；###00D01.相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Масссона (тил500ромом Масссона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA <нера; #0,0#0p01 с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Massoni trikroomiga värvitud südamelõikude representatiivsed kujutised ja kvantifitseerimine (skaalariba = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) lõiku erinevatelt sigadelt/rühmast, üks ANOVA meetod; ####p < 0,0001 võrreldes D0-ga, ***p < 0,001 või ****p < 0,0001 võrreldes D12 Ctrl-iga).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Lõpuks hinnati CTCM-i võimet jäljendada südamehüpertroofiat, suurendades südamekoe venitust. CTCM-is suurenes õhukambri tipprõhk 80 mmHg-lt 80 mmHg-ni. Art. (normaalne venitus) kuni 140 mmHg-ni Art. (joonis 6a). See vastab venituse 32% suurenemisele (joonis 6b), mida varem näidati vastava venituse protsendina, mis on vajalik südamelõikude jaoks, et saavutada hüpertroofia korral täheldatuga sarnane sarkomeeri pikkus. Südamekoe venitus ja kiirus kokkutõmbumise ja lõdvestumise ajal püsisid kuue kultiveerimispäeva jooksul konstantsena (joonis 6c). MT tingimustest pärit südamekude allutati kuue päeva jooksul normaalsele venitusele (MT (normaalne)) või ülevenituse tingimustele (MT (OS)). Juba pärast neljapäevast kultiveerimist oli hüpertroofilise biomarkeri NT-ProBNP tase MT (OS) tingimustes söötmes oluliselt kõrgem võrreldes MT (normaalsete) tingimustega (joonis 7a). Lisaks suurenes pärast kuuepäevast kultiveerimist rakkude suurus MT (OS)-s (joonis 7b) oluliselt võrreldes MT südamelõikudega (normaalsed). Lisaks oli NFATC4 tuuma translokatsioon ülevenitatud kudedes oluliselt suurenenud (joonis 7c). Need tulemused näitavad patoloogilise ümberehituse progresseeruvat arengut pärast hüperdistensiooni ja toetavad kontseptsiooni, et CTCM-seadet saab kasutada platvormina venitusest tingitud südame hüpertroofia signaaliülekande uurimiseks.
Õhukambri rõhu, vedelikukambri rõhu ja koeliikumise mõõtmiste representatiivsed jäljed kinnitavad, et kambri rõhk muudab vedelikukambri rõhku, põhjustades koelõigu vastava liikumise. b Tüüpilised venitusprotsendi ja venituskiiruse kõverad normaalselt venitatud (oranžid) ja ülevenitatud (sinised) koelõikude jaoks. c Tulbadiagramm, mis näitab tsükliaega (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), kontraktsiooniaega (n = 18–19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt), lõdvestusaega (n = 19 viilu rühma kohta, erinevatelt sigadelt)), koeliikumise amplituudi (n = 14 viilu/rühm, erinevatelt sigadelt), maksimaalset süstoolset kiirust (n = 14 viilu/rühm, erinevatelt sigadelt) ja maksimaalset lõdvestuskiirust (n = 14 (D0), 15 (D6)) lõiku/rühma) erinevatelt sigadelt). Kahesuunaline Studendi t-test ei näidanud olulist erinevust üheski parameetris, mis näitab, et need parameetrid püsisid 6-päevase ülepingega kultiveerimise ajal konstantsena. Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
NT-ProBNP kontsentratsiooni tulpdiagramm-kvantifitseerimine südamelõikude kultuurisöötmes, mida kultiveeriti MT normaalse venituse (Norm) või ülevenituse (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline ANOVA; **p < 0,01 võrreldes normaalse venitusega). NT-ProBNP kontsentratsiooni tulpdiagramm kvantifitseerimine südamelõikude kultuurisöötmes, mida kultiveeriti MT normaalse venituse (Norm) või ülevenituse (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline ANOVA; **p < 0,01 võrreldes normaalse venitusega).NT-ProBNP kontsentratsiooni kvantitatiivne histogramm kultuurikeskkonnas, mis pärines erinevate sigade normaalse MT venituse (norm) või ülevenituse (OS) tingimustes kultiveeritud südameviiludest (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4).MTOS) viilu/rühm, teostati kahefaktoriline dispersioonanalüüs;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 võrreldes normaalse venitusega). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a NT-ProBNP kontsentratsiooni kvantifitseerimine südame viiludes, mida kasvatati MT normaalse venituse (norm) või ülevenituse (OS) tingimustes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) erinevatest猪的切片/组，可以双向方方发发动 **võrreldes tavalise venitamisega, p < 0,01).histogramm. NT-ProBNP kontsentratsioonide kvantifitseerimine erinevatelt sigadelt pärinevate normaalse MT venituse (norm) või ülevenituse (OS) tingimustes kultiveeritud südameviiludes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ja D4 MTOS) viilu/rühma, kahesuunaline dispersioonanalüüs;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 võrreldes normaalse venitusega). b Tüüpilised kujutised troponiin-T ja WGA-ga värvitud südameviilude kohta (vasakul) ja rakkude suuruse kvantifitseerimise kohta (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) rakku/rühm 10 erinevast viilust erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline Studenti t-test; ****p < 0,0001 võrreldes normaalse venitusega). b Tüüpilised kujutised troponiin-T ja WGA-ga värvitud südameviilude kohta (vasakul) ja rakkude suuruse kvantifitseerimise kohta (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) rakku/rühm 10 erinevast viilust erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline Studenti t-test; ****p < 0,0001 võrreldes normaalse venitusega). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественадразмолераствеянного клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводи хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponiin-T ja AZP-ga värvitud südamelõikude representatiivsed kujutised (vasakul) ja rakkude suuruse kvantifitseerimine (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) rakku/rühm 10 erinevast lõigust erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline Studendi t-test; ****p < 0,0001 võrreldes normaalse tüvega). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代辀怏3（左）和细胞大小量化（右）用肌钙蛋白-T MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学甦 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Südameviilude representatiivsed kujutised, mis on värvitud kalkareiin-T ja WGA-ga (vasakul) ning rakkude suurus (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 erinevast viilust (D6 MTNorm)). Rakud/组，两方法有尾学生t-test；võrreldes normaalse venitusega，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ja АЗП (слева) ja колкичестверанка (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двутрийстороней Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponiin-T ja AZP-ga värvitud südamelõikude representatiivsed kujutised (vasakul) ja rakkude suuruse kvantifitseerimine (paremal) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 erinevast lõigust erinevatelt sigadelt) Rakud/rühm, kahesuunaline kriteerium Student'i t; ****p < 0,0001 võrreldes normaalse tüvega). c 0. ja 6. päeva MTOS-i südameviilude representatiivsed kujutised, mis on immunomärgistatud troponiin-T ja NFATC4 suhtes ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimine südamerakkude tuumadesse (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline Studenti t-test; *p < 0,05). c Tüüpilised kujutised 0. ja 6. päeva MTOS-i südameviiludest, mis on immunomärgistatud troponiin-T ja NFATC4 suhtes ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimine südamerakkude tuumadesse (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm erinevatelt sigadelt, teostati kahesuunaline Studenti t-test; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т ja NFATC4, чиякола оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинетпля , , двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Südamelõikude representatiivsed pildid 0. ja 6. päeval pärast MTOS-i, immunomärgistatud troponiin-T ja NFATC4 suhtes ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimine kavernoossete rakkude tuumas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm erinevatelt sigadelt) teostati kahepoolse Studenti t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细マ核的量化6的量化 4（Dn)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Kalkaniin-T ja NFATC4 immunomärgistamise tüüpilised pildid 第0天和第6天MTOS südameviiludest ja NFATC4 erinevatest NFATC4 易位至CM rakutuumast的quantity化 (n = 4 (D0), 焤 6, 焤 3, D时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропоницном-Т ja NFATC4 транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий *

0,05). c MTOS-i südameviilude representatiivsed kujutised troponiin-T ja NFATC4 immunomärgistamise ning NFATC4 translokatsiooni kvantifitseerimise kohta erinevate sigade südamelihase tuumas 0. ja 6. päeval (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viilu/rühm, kahesuunaline t-kriteerium Studenti test; *p < 0,05).Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.
Translatiivsed kardiovaskulaarsed uuringud vajavad rakumudeleid, mis reprodutseerivad täpselt südame keskkonda. Selles uuringus töötati välja ja iseloomustati CTCM-seadet, mis suudab stimuleerida südame üliõhukesi lõike. CTCM-süsteem hõlmab füsioloogiliselt sünkroniseeritud elektromehaanilist stimulatsiooni ning T3 ja Dex vedeliku rikastamist. Kui sea südamelõike nendele teguritele eksponeeriti, jäi nende elujõulisus, struktuuriline terviklikkus, metaboolne aktiivsus ja transkriptsiooniline ekspressioon samaks kui värskes südamekoes pärast 12-päevast kultiveerimist. Lisaks võib südamekoe liigne venitamine põhjustada südame hüpertroofiat, mis on põhjustatud hüperekstensioonist. Üldiselt toetavad need tulemused füsioloogiliste kultuuritingimuste kriitilist rolli normaalse südame fenotüübi säilitamisel ja pakuvad platvormi ravimite skriinimiseks.
Kardiomüotsüütide toimimiseks ja ellujäämiseks optimaalse keskkonna loomisele aitavad kaasa paljud tegurid. Neist kõige ilmsemad on seotud (1) rakkudevaheliste interaktsioonidega, (2) elektromehaanilise stimulatsiooniga, (3) humoraalsete faktoritega ja (4) metaboolsete substraatidega. Füsioloogilised rakkudevahelised interaktsioonid nõuavad keerukaid kolmemõõtmelisi võrgustikke, mis koosnevad mitmest rakutüübist ja mida toetab rakuväline maatriks. Selliseid keerulisi rakulisi interaktsioone on raske in vitro rekonstrueerida üksikute rakutüüpide kooskultuuri abil, kuid seda saab hõlpsasti saavutada südamelõikude organotüübilise olemuse abil.
Kardiomüotsüütide mehaaniline venitus ja elektriline stimulatsioon on südame fenotüübi säilitamiseks kriitilise tähtsusega33,34,35. Kuigi mehaanilist stimulatsiooni on laialdaselt kasutatud hiPSC-CM konditsioneerimiseks ja küpsemiseks, on mitmed elegantsed uuringud hiljuti püüdnud südamelõike mehaaniliselt stimuleerida kultuuris ühesuunalise koormuse abil. Need uuringud näitavad, et 2D ühesuunaline mehaaniline koormus avaldab südame fenotüübile kultiveerimise ajal positiivset mõju. Nendes uuringutes koormati südame lõike kas isomeetriliste tõmbejõududega17, lineaarse auksotoonilise koormusega18 või taastati südametsükkel jõuanduri tagasiside ja pingeajamite abil. Need meetodid kasutavad aga ühesuunalist koevenitust ilma keskkonna optimeerimiseta, mille tulemuseks on paljude südamegeenide pärssimine või ebanormaalsete venitusreaktsioonidega seotud geenide üleekspressioon. Siin kirjeldatud CTCM pakub 3D-elektromehaanilist stiimulit, mis jäljendab loomulikku südametsüklit tsükli aja ja füsioloogilise venituse osas (25% venitus, 40% süstool, 60% diastol ja 72 lööki minutis). Kuigi ainuüksi sellest kolmemõõtmelisest mehaanilisest stimulatsioonist ei piisa kudede terviklikkuse säilitamiseks, on kudede elujõulisuse, funktsiooni ja terviklikkuse piisavaks säilitamiseks vajalik humoraalse ja mehaanilise stimulatsiooni kombinatsioon T3/Dex abil.
Humoraalsed faktorid mängivad olulist rolli täiskasvanud südame fenotüübi moduleerimisel. Seda rõhutati HiPS-CM uuringutes, kus kultuurikeskkonda lisati T3 ja Dex, et kiirendada rakkude küpsemist. T3 võib mõjutada aminohapete, suhkrute ja kaltsiumi transporti läbi rakumembraanide36. Lisaks soodustab T3 MHC-α ekspressiooni ja MHC-β allareguleerimist, soodustades kiirete tõmblevate müofibrillide moodustumist küpsetes kardiomüotsüütides võrreldes aeglaste tõmblevate müofibrillidega loote kardiomüotsüütides. T3 puudulikkus hüpotüreoidismiga patsientidel põhjustab müofibrillaarsete ribade kadu ja toonuse arengu aeglustumist37. Dex toimib glükokortikoidretseptoritele ja on näidatud, et see suurendab müokardi kontraktiilsust isoleeritud perfuseeritud südametes;38 arvatakse, et see paranemine on seotud mõjuga kaltsiumi ladestumisest tingitud sisenemisele (SOCE)39,40. Lisaks seondub Dex oma retseptoritega, põhjustades laia rakusisese reaktsiooni, mis pärsib immuunfunktsiooni ja põletikku30.
Meie tulemused näitavad, et füüsiline mehaaniline stimulatsioon (MS) parandas üldist kultuuri tulemuslikkust võrreldes Ctrl-iga, kuid ei suutnud säilitada elujõulisust, struktuurilist terviklikkust ja südame ekspressiooni 12 päeva jooksul kultuuris. Võrreldes Ctrl-iga parandas T3 ja Dexi lisamine CTCM (MT) kultuuridele elujõulisust ja säilitas sarnased transkriptsiooniprofiilid, struktuurilise terviklikkuse ja metaboolse aktiivsuse värske südamekoega 12 päeva jooksul. Lisaks loodi koe venituse astet kontrollides STCM-i abil hüperekstensioonist indutseeritud südame hüpertroofia mudel, mis illustreerib STCM-süsteemi mitmekülgsust. Tuleb märkida, et kuigi südame remodelleerumine ja fibroos hõlmavad tavaliselt terveid organeid, mille ringlevad rakud suudavad pakkuda sobivaid tsütokiine, samuti fagotsütoosi ja muid remodelleerumisfaktoreid, suudavad südame sektsioonid stressi ja trauma korral siiski fibrootilist protsessi jäljendada. Seda on selles südamelõigu mudelis varem hinnatud. Tuleb märkida, et CTCM-i parameetreid saab moduleerida rõhu/elektrilise amplituudi ja sageduse muutmisega, et simuleerida paljusid seisundeid, nagu tahhükardia, bradükardia ja mehaaniline vereringe tugi (mehaaniline koormamata süda). See muudab süsteemi keskmise läbilaskevõimega ravimitestimiseks. CTCM-i võime modelleerida ülepingest tingitud südamehüpertroofiat sillutab teed selle süsteemi testimiseks personaalseks teraapiaks. Kokkuvõtteks näitab käesolev uuring, et mehaaniline venitus ja humoraalne stimulatsioon on südamekoe lõikude kultuuri säilitamiseks kriitilise tähtsusega.
Kuigi siin esitatud andmed viitavad sellele, et CTCM on väga paljutõotav platvorm terve müokardi modelleerimiseks, on sellel kultiveerimismeetodil mõned piirangud. CTCM-i kultiveerimise peamine piirang on see, et see avaldab viiludele pidevat dünaamilist mehaanilist pinget, mis välistab südame viilude kokkutõmbumise aktiivse jälgimise võimaluse iga tsükli ajal. Lisaks on südamelõikude väikese suuruse (7 mm) tõttu piiratud võimalus hinnata süstoolset funktsiooni väljaspool kultuurisüsteeme traditsiooniliste jõuandurite abil. Käesolevas käsikirjas ületame selle piirangu osaliselt, hinnates optilist pinget kontraktiilse funktsiooni indikaatorina. See piirang nõuab aga edasist tööd ja seda võidakse tulevikus lahendada, tutvustades meetodeid südamelõikude funktsiooni optiliseks jälgimiseks kultuuris, näiteks optilist kaardistamist kaltsiumi ja pingetundlike värvainete abil. CTCM-i teine ​​piirang on see, et töötav mudel ei manipuleeri füsioloogilise stressiga (eel- ja järelkoormus). CTCM-is indutseeriti rõhku vastassuundades, et reprodutseerida väga suurtes kudedes 25% füsioloogilist venitust diastoolis (täielik venitus) ja süstoolis (kontraktsiooni pikkus elektrilise stimulatsiooni ajal). See piirang tuleks tulevastes CTCM-i disainides eemaldada, avaldades südamekoele mõlemalt poolt piisavat survet ja rakendades täpseid rõhu-mahu suhteid, mis esinevad südame kambrites.
Selles käsikirjas kirjeldatud ülevenituse poolt indutseeritud remodelleerumine piirdub hüpertroofiliste hüpervenituse signaalide jäljendamisega. Seega saab see mudel aidata venitusest indutseeritud hüpertroofilise signaaliülekande uurimisel ilma humoraalsete või neuraalsete faktorite vajaduseta (mida selles süsteemis ei eksisteeri). CTCM-i mitmekesisuse suurendamiseks on vaja täiendavaid uuringuid, näiteks kooskultiveerimine immuunrakkudega, ringlevate plasma humoraalsete faktorite ja innervatsiooniga neuronaalsete rakkudega kooskultiveerimisel parandab haiguste modelleerimise võimalusi CTCM-iga.
Selles uuringus kasutati kolmteist siga. Kõik loomadega tehtavad protseduurid viidi läbi vastavalt institutsiooni suunistele ja need kiitis heaks Louisville'i ülikooli loomade hoolduse ja kasutamise komitee. Aordikaar suleti klambriga ja südant perfundeeriti 1 liitri steriilse kardiopleegiaga (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml hepariini, pH kuni 7,4); Südamed säilitati jääkülmas kardiopleegilises lahuses kuni laborisse transportimiseni jääl, mis tavaliselt kestab <10 minutit. Südamed säilitati jääkülmas kardiopleegilises lahuses kuni laborisse transportimiseni jääl, mis tavaliselt kestab <10 minutit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично льду.10 обынично Südamed säilitati jääkülmas kardiopleegilises lahuses kuni laborisse transportimiseni jääl, mis tavaliselt võtab aega <10 minutit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Hoidke südameid jääl kardiopleegia korral kuni laborisse transportimiseni jääl, tavaliselt <10 minutit.
CTCM-seade töötati välja SolidWorksi arvutipõhise projekteerimise (CAD) tarkvaras. Kultiveerimiskambrid, vaheseinad ja õhukambrid on valmistatud CNC läbipaistvast akrüülplastist. 7 mm läbimõõduga tugirõngas on keskel valmistatud suure tihedusega polüetüleenist (HDPE) ja sellel on o-rõnga soon silikoon-o-rõnga jaoks, mida kasutatakse söötme all oleva tihendamiseks. Kultiveerimiskambrit eraldab eraldusplaadist õhuke ränidioksiidmembraan. Silikoonmembraan on laserlõigatud 0,02-tollisest paksusest silikoonlehest ja selle kõvadus on 35A. Alumine ja ülemine silikoontihend on laserlõigatud 1/16-tollisest paksusest silikoonlehest ja nende kõvadus on 50A. Ploki kinnitamiseks ja õhukindla tihendi loomiseks kasutatakse 316L roostevabast terasest kruvisid ja tiibmutreid.
C-PACE-EM süsteemiga integreerimiseks on loodud spetsiaalne trükkplaat (PCB). Trükkplaadil olevad Šveitsi masina pistikupesad on ühendatud grafiitelektroodidega hõbetatud vasktraatide ja elektroodide külge keeratud pronksist 0-60 kruvide abil. Trükkplaat asetatakse 3D-printeri kattesse.
CTCM-seadet juhib programmeeritav pneumaatiline ajam (PPD), mis loob kontrollitud vereringerõhu, mis sarnaneb südametsükliga. Kui rõhk õhukambris suureneb, laieneb painduv silikoonmembraan ülespoole, surudes koe alla vedeliku. Seejärel venitatakse koepiirkonda vedeliku väljutamise teel, jäljendades südame füsioloogilist laienemist diastooli ajal. Lõdvestuspunkti saavutamisel rakendati grafiitelektroodide kaudu elektrilist stimulatsiooni, mis vähendas õhukambris olevat rõhku ja põhjustas koelõikude kokkutõmbumise. Toru sees on hemostaatiline klapp koos rõhuanduriga, mis tuvastab õhusüsteemi rõhku. Rõhuanduri poolt tuvastatud rõhk suunatakse sülearvutiga ühendatud andmekogujale. See võimaldab pidevalt jälgida gaasikambris olevat rõhku. Kui saavutati maksimaalne kambrirõhk (standardne 80 mmHg, 140 mmHg OS), anti andmekogumisseadmele käsk saata signaal C-PACE-EM süsteemile, et genereerida 2 ms pikkune kahefaasiline pingesignaal, mis on seatud 4 V-le.
Südamelõigud saadi ja kultiveerimistingimused 6 süvendis viidi läbi järgmiselt: kogutud südamed viidi ülekandeanumast külma (4 °C) kardiopleegiaga alusele. Vasak vatsake isoleeriti steriilse teraga ja lõigati 1–2 cm3 tükkideks. Need koeplokid kinnitati koeliimiga koetugedele ja asetati vibreerivasse mikrotoomi koevanni, mis sisaldas Tyrode'i lahust ja mida pidevalt hapnikuga rikastati (3 g/l 2,3-butaandioonmonooksiimi (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glükoos (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M lahust), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M lahust), kuni 1 l ddH2O). Vibreeriv mikrotoom seadistati lõikama 300 µm paksuseid viile sagedusega 80 Hz, horisontaalse vibratsiooniamplituudiga 2 mm ja edasiliikumiskiirusega 0,03 mm/s. Koevann oli ümbritsetud jääga, et hoida lahus jahedana, ja temperatuuri hoiti 4 °C juures. Kandke koelõigud mikrotoomivannist inkubatsioonivanni, mis sisaldas pidevalt hapnikuga rikastatud Tyrode'i lahust jääl, kuni saadakse ühe kultuuriplaadi jaoks piisavalt lõike. Transwell-kultuuride jaoks kinnitati koelõigud steriilsetele 6 mm laiustele polüuretaanist tugedele ja asetati 6 ml optimeeritud söötmesse (199 sööde, 1x ITS lisand, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-leeliseline ja 2X antibiootikum-seenevastane). Koelõikudele rakendati elektrilist stimulatsiooni (10 V, sagedus 1,2 Hz) C-Pace'i kaudu. TD tingimuste jaoks lisati iga söötme vahetuse ajal värsket T3 ja Dex kontsentratsiooniga 100 nM ja 1 μM. Keskkond küllastatakse hapnikuga enne asendamist 3 korda päevas. Koelõike kultiveeriti inkubaatoris temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 juures.
CTCM-kultuuride puhul asetati koelõigud spetsiaalselt valmistatud 3D-printerile Petri tassi, mis sisaldas modifitseeritud Tyrode'i lahust. Seade on loodud suurendama südamelõigu suurust 25% võrra tugirõnga pindalast. Seda tehakse nii, et südamelõigud ei veniks pärast Tyrode'i lahusest keskkonda ja diastooli ajal ülekandmist. Histoakrüülliimi abil kinnitati 300 µm paksused lõigud 7 mm läbimõõduga tugirõngale. Pärast koelõikude kinnitamist tugirõngale lõigati üleliigsed koelõigud ära ja asetati kinnitatud koelõigud tagasi jääle (4 °C) Tyrode'i lahuse vanni, kuni ühe seadme jaoks on ette valmistatud piisavalt lõike. Kõigi seadmete kogutöötlusaeg ei tohiks ületada 2 tundi. Pärast 6 koelõigu kinnitamist tugirõngastele pandi CTCM-seade kokku. CTCM-kultuurikamber oli eelnevalt täidetud 21 ml eelnevalt hapnikuga rikastatud söötmega. Kandke koelõigud kultuurikambrisse ja eemaldage ettevaatlikult õhumullid pipeti abil. Seejärel juhitakse koelõik auku ja surutakse õrnalt paika. Lõpuks asetatakse seadmele elektroodikork ja viiakse seade inkubaatorisse. Seejärel ühendatakse CTCM õhuvooliku ja C-PACE-EM süsteemiga. Pneumaatiline ajam avaneb ja õhuventiil avab CTCM-i. C-PACE-EM süsteem konfigureeriti andma 4 V sagedusel 1,2 Hz bifaasilise stimulatsiooni ajal 2 ms jooksul. Keskkonda vahetati kaks korda päevas ja elektroode üks kord päevas, et vältida grafiidi kogunemist elektroodidele. Vajadusel saab koelõike oma kultuurisüvenditest eemaldada, et eemaldada nende alla sattunud õhumullid. MT-ravi tingimustes lisati iga keskkonnavahetuse ajal värske T3/Dex koos 100 nM T3 ja 1 μM Dex-iga. CTCM-seadmeid kultiveeriti inkubaatoris temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 atmosfääris.
Südameviilude venitatud trajektooride saamiseks töötati välja spetsiaalne kaamerasüsteem. Kasutati peegelkaamerat (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jaapan) koos Navitar Zoom 7000 18-108mm makroobjektiiviga (Navitar, San Francisco, CA). Visualiseerimine viidi läbi toatemperatuuril pärast söötme asendamist värske söötmega. Kaamera asetati 51° nurga alla ja videot salvestati kiirusega 30 kaadrit sekundis. Esmalt kasutati südameviilude liikumise kvantifitseerimiseks avatud lähtekoodiga tarkvara (MUSCLEMOTION43) koos Image-J-ga. Mask loodi MATLABi (MathWorks, Natick, MA, USA) abil, et määratleda südamelöökide huvipakkuvad piirkonnad müra vältimiseks. Käsitsi segmenteeritud maskid rakendati kõigile kaadrijada piltidele ja seejärel edastati need MUSCLEMOTION pluginale. Muscle Motion kasutab iga kaadri pikslite keskmist intensiivsust, et kvantifitseerida selle liikumist võrdluskaadri suhtes. Andmed salvestati, filtreeriti ja kasutati tsükliaja kvantifitseerimiseks ja koe venituse hindamiseks südametsükli ajal. Salvestatud videot töödeldi järeltöötlusega, kasutades esimese järgu nullfaasilist digitaalfiltrit. Koe venituse (tipust tippu) kvantifitseerimiseks viidi läbi tippudevaheline analüüs, et eristada salvestatud signaali tippe ja madalseisusid. Lisaks teostati trendide kõrvaldamine kuuenda järgu polünoomi abil, et kõrvaldada signaali triiv. MATLABis töötati välja programmikood globaalse koe liikumise, tsükliaja, lõdvestusaja ja kokkutõmbumisaja määramiseks (täiendav programmikood 44).
Pingeanalüüsiks, kasutades samu mehaanilise venituse hindamiseks loodud videoid, joonistasime esmalt kaks kujutist, mis esindavad liikumispiike (kõrgeimad (ülemised) ja madalaimad (alumised) liikumispunktid) vastavalt MUSCLEMOTION tarkvarale. Seejärel segmenteerisime koepiirkonnad ja rakendasime segmenteeritud koele varjutusalgoritmi (lisajoonis 2a). Seejärel jagati segmenteeritud kude kümneks alampinnaks ja iga pinna pinge arvutati järgmise võrrandi abil: pinge = (ülemine-allamine)/allamine, kus ülemine ja allamine on vastavalt kuju kaugused kanga ülemisest ja alumisest varjust (lisajoonis 2b).
Südamelõike fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 48 tundi. Fikseeritud kudesid dehüdreeriti 1 tund 10% ja 20% sahharoosilahuses ning seejärel üleöö 30% sahharoosilahuses. Seejärel paigutati lõigud optimaalse lõiketemperatuuri hoidvasse ühendisse (OCT-ühend) ja külmutati järk-järgult isopentaani/kuivjää vannis. Säilita OCT-blokke temperatuuril -80 °C kuni eraldamiseni. Slaidid valmistati 8 μm paksuste lõikudena.
OCT eemaldamiseks südamelõikudest kuumutage slaide kuumutusplokil temperatuuril 95 °C 5 minutit. Lisage igale slaidile 1 ml PBS-i ja inkubeerige 30 minutit toatemperatuuril, seejärel permeerige lõike, lahustades 0,1% Triton-X PBS-is 15 minutit toatemperatuuril. Mittespetsiifiliste antikehade prooviga seondumise vältimiseks lisage slaididele 1 ml 3% BSA lahust ja inkubeerige 1 tund toatemperatuuril. Seejärel eemaldati BSA ja slaidid pesti PBS-iga. Märgistage iga proov pliiatsiga. Primaarsed antikehad (lahjendatud 1:200 1% BSA-s) (konneksiin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ja troponiin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) lisati 90 minuti jooksul, seejärel sekundaarsed antikehad (lahjendatud 1:200 1% BSA-s) hiire Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) ja küüliku Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vastu veel 90 minutit. Pesesime 3 korda PBS-iga. Sihtmärgi värvimise eristamiseks taustast kasutasime kontrollina ainult sekundaarset antikeha. Lõpuks lisati DAPI tuumavärv ja slaidid asetati Vectashieldi (Vector Laboratories) sisse ja suleti küünelakiga. -x suurendus) ja Keyence'i mikroskoobiga 40x suurendusega.
WGA värvimiseks kasutati WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) kontsentratsiooniga 5 μg/ml PBS-is ja kanti fikseeritud lõikudele 30 minutiks toatemperatuuril. Seejärel pesti slaide PBS-iga ja igale slaidile lisati Sudaani musta värvi ning inkubeeriti 30 minutit. Seejärel pesti slaide PBS-iga ja lisati Vectashieldi kinnituskeskkond. Slaidid visualiseeriti Keyence'i mikroskoobi abil 40-kordse suurendusega.
OCT eemaldati proovidest nagu eespool kirjeldatud. Pärast OCT eemaldamist kasteti slaidid üleöö Bouini lahusesse. Seejärel loputati slaide 1 tund destilleeritud veega ja asetati seejärel 10 minutiks Bibrichi aaloehappe fuksiini lahusesse. Seejärel pesti slaide destilleeritud veega ja asetati 10 minutiks 5% fosfomolübdeeni ja 5% fosfovolframhappe lahusesse. Ilma loputamiseta viidi slaidid otse 15 minutiks aniliinsinise lahusesse. Seejärel pesti slaide destilleeritud veega ja asetati 2 minutiks 1% äädikhappe lahusesse. Slaidid kuivatati 200 N etanoolis ja viidi ksüleeni. Värvitud slaidid visualiseeriti Keyence'i mikroskoobi abil, millel oli 10x objektiiv. Fibroosipindala protsent kvantifitseeriti Keyence Analyzer tarkvara abil.
CyQUANT™ MTT rakkude elujõulisuse analüüs (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalooginumber V13154, vastavalt tootja protokollile mõningate muudatustega. Täpsemalt kasutati MTT analüüsi ajal ühtlase koe suuruse tagamiseks 6 mm läbimõõduga kirurgilist augustit. Koed plaaditi individuaalselt 12-süvendilise plaadi süvenditesse, mis sisaldasid MTT substraati vastavalt tootja protokollile. Lõike inkubeeriti temperatuuril 37 °C 3 tundi ja eluskude metaboliseeris MTT substraadi, moodustades lilla formasaani ühendi. Asendage MTT lahus 1 ml DMSO-ga ja inkubeerige temperatuuril 37 °C 15 minutit, et ekstraheerida lilla formazaan südamelõikudest. Proovid lahjendati DMSO-s suhtega 1:10 96-süvendilistes läbipaistva põhjaga plaatides ja lilla värvuse intensiivsust mõõdeti lainepikkusel 570 nm, kasutades Cytation plaadilugejat (BioTek). Näidud normaliseeriti iga südamelõigu kaalu suhtes.
Glükoosi kasutamise testiks asendati südameviilude söötme 1 μCi/ml [5-3H]-glükoosi sisaldava söötmega (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA), nagu eelnevalt kirjeldatud. Pärast 4-tunnist inkubeerimist lisati 100 µl söödet avatud mikrotsentrifuugituubi, mis sisaldas 100 µl 0,2 N HCl-i. Seejärel asetati tuub stsintillatsioonituubi, mis sisaldas 500 μl dH2O, et aurustada [3H]2O 72 tunniks temperatuuril 37 °C. Seejärel eemaldati mikrotsentrifuugituub stsintillatsioonituubist ja lisati 10 ml stsintillatsioonivedelikku. Stsintillatsiooniloendused viidi läbi Tri-Carb 2900TR vedelikstsintillatsioonianalüsaatoriga (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Seejärel arvutati glükoosi kasutamine, võttes arvesse [5-3H]-glükoosi spetsiifilist aktiivsust, mittetäielikku tasakaalu ja tausta, [5-3H]-glükoosi lahjendust märgistamata glükoosiks ja stsintillatsiooniloenduri efektiivsust. Andmed on normaliseeritud südamelõikude massi suhtes.
Pärast koe homogeniseerimist Trizolis eraldati südamelõikudest RNA, kasutades Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 vastavalt tootja juhistele. RNAsec teeki ettevalmistamine, sekveneerimine ja andmete analüüs viidi läbi järgmiselt:
RNA raamatukogu ettevalmistamise lähtematerjalina kasutati 1 μg RNA-d proovi kohta. Sekveneerimisteegid genereeriti Illumina (NEB, USA) NEBNext UltraTM RNA raamatukogu ettevalmistuskomplekti abil, järgides tootja soovitusi, ja iga proovi atribuutjärjestustele lisati indekskoodid. Lühidalt, mRNA puhastati totaal-RNA-st, kasutades polü-T oligonukleotiididega kinnitatud magnetilisi helmeid. Fragmenteerimine viidi läbi kahevalentsete katioonide abil kõrgel temperatuuril NEBNext esimese ahela sünteesi reaktsioonipuhvris (5X). Esimese ahela cDNA sünteesiti juhuslike heksameerpraimerite ja M-MuLV pöördtranskriptaasi (RNase H-) abil. Teise ahela cDNA sünteesiti seejärel DNA polümeraas I ja RNase H abil. Ülejäänud üleulatuvad otsad muundatakse eksonukleaasi/polümeraasi aktiivsuse abil nürideks otsteks. Pärast DNA fragmendi 3' otsa adenüleerimist kinnitati sellele juuksenõelakujulise aasa struktuuriga NEBNext adapter, et valmistada see hübridisatsiooniks ette. Eelistatud pikkusega 150–200 bp cDNA fragmentide valimiseks. Raamatukogu fragmendid puhastati AMPure XP süsteemi (Beckman Coulter, Beverly, USA) abil. Seejärel kasutati 3 μl USER ensüümi (NEB, USA) koos adapteriga ligeeritud suurusega selekteeritud cDNA-ga 15 minutit temperatuuril 37 °C ja seejärel 5 minutit temperatuuril 95 °C enne PCR-i. Seejärel viidi PCR läbi, kasutades Phusion High-Fidelity DNA polümeraasi, universaalseid PCR praimereid ja Index (X) praimereid. Lõpuks puhastati PCR-produktid (AMPure XP süsteem) ja raamatukogu kvaliteeti hinnati Agilent Bioanalyzer 2100 süsteemil. Seejärel sekveneeriti cDNA raamatukogu Novaseq sekvenaatori abil. Illumina toorpildifailid teisendati toorlugemiteks, kasutades CASAVA Base Callingut. Toorandmed salvestatakse FASTQ(fq) vormingus failides, mis sisaldavad lugemisjärjestusi ja vastavaid aluskvaliteete. Valige HISAT2, et sobitada filtreeritud sekveneerimislugemid Sscrofa11.1 võrdlusgenoomiga. Üldiselt toetab HISAT2 igas suuruses genoome, sealhulgas üle 4 miljardi aluspaari pikkuseid genoome, ning enamiku parameetrite jaoks on seatud vaikeväärtused. RNA Seq andmete splaissingu lugemid saab HISAT2 abil, mis on praegu kiireim saadaolev süsteem, tõhusalt joondada sama või parema täpsusega kui ükski teine ​​meetod.
Transkriptide arvukus peegeldab otseselt geeniekspressiooni taset. Geeniekspressiooni taset hinnatakse genoomi või eksonitega seotud transkriptide arvukuse (sekveneerimise arvu) järgi. Lugemiste arv on proportsionaalne geeniekspressiooni tasemete, geeni pikkuse ja sekveneerimise sügavusega. FPKM (fragmendid tuhande aluspaari kohta, mis sekveneeriti transkripti miljoni aluspaari kohta) arvutati ja diferentsiaalse ekspressiooni P-väärtused määrati DESeq2 paketi abil. Seejärel arvutasime iga P-väärtuse jaoks valepositiivsuse määra (FDR), kasutades Benjamini-Hochbergi meetodit9, mis põhineb sisseehitatud R-funktsioonil „p.adjust“.
Südamelõikudest eraldatud RNA konverteeriti cDNA-ks kontsentratsioonil 200 ng/μl, kasutades Thermo SuperScript IV Vilo Master segu (Thermo, kat. nr 11756050). Kvantitatiivne RT-PCR viidi läbi, kasutades Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-süvendilise läbipaistva reaktsiooniplaadi (Thermo, kat. nr 4483319) ja microamp optilise liimi (Thermo, kat. nr 4311971). Reaktsioonisegu koosnes 5 µl Taqman Fast Advanced Master segust (Thermo, kat. nr 4444557), 0,5 µl Taqman Primerist ja 3,5 µl veest, segatuna süvendi kohta. Viidi läbi standardsed qPCR tsüklid ja CT väärtused mõõdeti Applied Biosystems Quantstudio 5 reaalaja PCR instrumendiga (384-süvendiline moodul; tootenumber A28135). Taqmani praimerid osteti firmalt Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Kõikide proovide CT väärtused normaliseeriti majapidamisgeeni GAPDH suhtes.
NT-ProBNP vabanemist söötmest hinnati NT-ProBNP komplekti (siga) (katalooginumber MBS2086979, MyBioSource) abil vastavalt tootja protokollile. Lühidalt, igasse süvendisse lisati kahes korduses 250 µl igast proovist ja standardist. Kohe pärast proovi lisamist lisati igasse süvendisse 50 µl analüüsireagenti A. Raputa plaati õrnalt ja sulge hermeetikuga. Seejärel inkubeeriti tablette temperatuuril 37 °C 1 tund. Seejärel imeti lahus välja ja pesti süvendeid 4 korda 350 µl 1X pesulahusega, inkubeerides pesulahust iga kord 1-2 minutit. Seejärel lisati igasse süvendisse 100 µl analüüsireagenti B ja sulgeti plaadi hermeetikuga. Tabletti loksutati õrnalt ja inkubeeriti temperatuuril 37 °C 30 minutit. Imeti lahus välja ja pesti süvendeid 5 korda 350 µl 1X pesulahusega. Lisage igasse süvendisse 90 µl substraadilahust ja sulgege plaat. Inkubeerige plaati temperatuuril 37 °C 10–20 minutit. Lisage igasse süvendisse 50 µl stopplahust. Plaati mõõdeti kohe Cytation (BioTek) plaadilugejaga, mis oli seatud lainepikkusele 450 nm.
Võimsusanalüüsid viidi läbi selleks, et valida grupi suurused, mis annavad >80% võimsuse parameetri 10% absoluutse muutuse tuvastamiseks 5% I tüüpi veamääraga. Võimsusanalüüsid viidi läbi selleks, et valida rühma suurused, mis annavad >80% võimsuse parameetri 10% absoluutse muutuse tuvastamiseks 5% I tüüpi veamääraga. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Võimsusanalüüs viidi läbi selleks, et valida rühma suurused, mis annaksid >80% võimsuse 10% absoluutse parameetri muutuse tuvastamiseks 5% I tüüpi veamääraga.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечилоѶ10% изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Võimsusanalüüs viidi läbi, et valida rühma suurus, mis annaks >80% võimsuse 10% absoluutse parameetri muutuse ja 5% I tüüpi veamäära tuvastamiseks.Koelõigud valiti enne katset juhuslikult. Kõik analüüsid olid tingimuslikult pimemeetodil ja proovid dekodeeriti alles pärast kõigi andmete analüüsimist. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism tarkvaraga (San Diego, CA). Kõigi statistiliste andmete puhul peeti p-väärtusi oluliseks väärtustel <0, 05. Kõigi statistikate puhul loeti p-väärtusi oluliseks väärtuste <0,05 korral. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kõigi statistikate puhul loeti p-väärtusi oluliseks väärtuste <0,05 korral.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kõigi statistikate puhul loeti p-väärtusi oluliseks väärtuste <0,05 korral.Kahesuunaline Studendi t-test viidi läbi andmetel, kasutades ainult kahte võrdlust. Mitme rühma vahelise olulisuse määramiseks kasutati ühesuunalist või kahesuunalist ANOVA-d. Post hoc testide tegemisel rakendati Tukey korrektsiooni, et arvestada mitmete võrdlustega. RNAsec andmete puhul tuleb FDR-i ja p-korrigeerimise arvutamisel arvestada spetsiaalsete statistiliste kaalutlustega, nagu on kirjeldatud meetodite osas.
Lisateavet uuringu ülesehituse kohta leiate selle artikliga lingitud loodusuuringute aruande kokkuvõttest.