Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Uued immunoloogilised ja massispektromeetrilised meetodid AFEX-iga eeltöödeldud maisiseemne püsivate oligosahhariidide kompleksseks analüüsiks. Lignotselluloosne biomass on jätkusuutlik alternatiiv fossiilkütustele ja seda kasutatakse laialdaselt biotehnoloogiate väljatöötamiseks selliste toodete nagu toit, sööt, kütused ja kemikaalid tootmiseks. Nende tehnoloogiate võti on kulukonkurentsivõimeliste protsesside väljatöötamine taimerakkude seintes esinevate komplekssete süsivesikute muundamiseks lihtsuhkruteks, nagu glükoos, ksüloos ja arabinoos. Kuna lignotselluloosne biomass on väga visa, tuleb seda soovitud produkti saamiseks kombineerida termokeemilistele töötlustele (nt ammoniaagikiudude koorimine (AFEX), lahjendatud happed (DA), ioonvedelikud (IL)) ja bioloogilistele töötlustele (nt ensümaatiline hüdrolüüs ja mikroobne kääritamine). Kui aga hüdrolüüsiprotsessis kasutatakse kaubanduslikke seenensüüme, on ainult 75–85% moodustunud lahustuvatest suhkrutest monosahhariidid ja ülejäänud 15–25% on lahustuvad, raskesti töödeldavad oligosahhariidid, mis pole mikroorganismidele alati kättesaadavad. Varem oleme edukalt isoleerinud ja puhastanud lahustuvaid kangekaelseid oligosahhariide, kasutades süsiniku ja diatomiitmulla eraldamise ning suuruseralduskromatograafia kombinatsiooni, ning uurinud ka nende ensüümide inhibeerivaid omadusi. Oleme leidnud, et kõrgema polümerisatsiooniastmega (DP) metüülitud uroonhappe asendusi sisaldavaid oligosahhariide on kaubanduslike ensüümisegudega raskem töödelda kui madala DP-ga ja neutraalseid oligosahhariide. Siin kirjeldame mitmete täiendavate meetodite kasutamist, sealhulgas glükaani profiilimist, kasutades taime biomassi glükaanidele spetsiifilisi monoklonaalseid antikehi (mAb-sid), et iseloomustada glükaani sidemeid taimerakkude seintes ja ensümaatilistes hüdrolüsaatides, maatriksi abil laserdesorptsioonionisatsiooni ja lennuaja massispektromeetriat. MALDI-TOF-MS kasutab struktuuriinformatiivseid diagnostilisi piike, mis on saadud spektroskoopia abil pärast negatiivsete ioonide sekundaarset lagunemist, gaasikromatograafiat ja massispektromeetriat (GC-MS), et iseloomustada oligosahhariidide sidemeid derivatiseerimisega ja ilma. Oligosahhariidide väikese suuruse (DP 4–20) tõttu on neid molekule keeruline kasutada mAb-de sidumiseks ja iseloomustamiseks. Selle probleemi lahendamiseks rakendasime uut biotiini konjugeerimisel põhinevat oligosahhariidide immobiliseerimismeetodit, mis märgistas edukalt enamiku madala DP-ga lahustuvatest oligosahhariididest mikrotiiterplaadi pinnal, mida seejärel kasutati suure läbilaskevõimega monoklonaalsete antikehade süsteemis spetsiifilise ligeerimise analüüsiks. See uus meetod hõlbustab tulevikus täiustatud suure läbilaskevõimega glükoosianalüüside väljatöötamist, mida saab diagnostilistel eesmärkidel kasutada biomarkerites esinevate oligosahhariidide isoleerimiseks ja iseloomustamiseks.
Lignotselluloosne biomass, mis koosneb põllumajandus-, metsandus-, rohu- ja puitmaterjalidest, on potentsiaalne tooraine biopõhiste toodete, sealhulgas toidu, sööda, kütuse ja keemiliste lähteainete tootmiseks kõrgema väärtusega toodete saamiseks1. Taimerakkude seintes esinevad süsivesikud (näiteks tselluloos ja hemitselluloos) depolümeriseeruvad keemilise töötlemise ja biotransformatsiooni (näiteks ensümaatilise hüdrolüüsi ja mikroobse kääritamise) teel monosahhariidideks. Levinud eeltöötluste hulka kuuluvad ammoniaagikiudude paisutamine (AFEX), lahjendatud hape (DA), ioonvedelik (IL) ja auruplahvatus (SE), mis kasutavad kemikaalide ja kuumuse kombinatsiooni lignotselluloosi tootmise vähendamiseks taimerakkude seinte avamise teel3,4. aine kangekaelsus,5. Ensümaatiline hüdrolüüs viiakse läbi suure tahke aine sisaldusega, kasutades kaubanduslikke aktiivseid süsivesikuid sisaldavaid ensüüme (CAZymes) ja mikroobset kääritamist transgeensete pärmide või bakterite abil, et toota biopõhiseid kütuseid ja kemikaale6.
Kaubanduslikes ensüümides sisalduvad CAZüümid koosnevad keerulisest ensüümide segust, mis lõhustavad sünergistlikult keerulisi süsivesikute ja suhkru sidemeid, moodustades monosahhariide2,7. Nagu me varem teatasime, muudab ligniini ja süsivesikute aromaatsete polümeeride keeruline võrgustik need väga raskesti töödeldavaks, mis viib mittetäieliku suhkru muundumiseni, akumuleerides 15–25% suguoligosahhariide, mida eeltöödeldud biomassi ensümaatilise hüdrolüüsi käigus ei teki. See on levinud probleem erinevate biomassi eeltöötlusmeetodite puhul. Mõned selle kitsaskoha põhjused hõlmavad ensüümi inhibeerimist hüdrolüüsi ajal või oluliste ensüümide puudumist või madalat taset, mis on vajalikud taimse biomassi suhkrusidemete lagundamiseks. Suhkrute koostise ja struktuuriliste omaduste, näiteks oligosahhariidide suhkrusidemete mõistmine aitab meil parandada suhkru muundumist hüdrolüüsi ajal, muutes biotehnoloogilised protsessid naftatoodetega võrreldes kulukonkurentsivõimeliseks.
Süsivesikute struktuuri määramine on keeruline ja nõuab selliste meetodite kombinatsiooni nagu vedelikkromatograafia (LC)11,12, tuumamagnetresonantsspektroskoopia (NMR)13, kapillaarelektroforees (CE)14,15,16 ja massispektromeetria (MS)17. ,18. MS-meetodid, näiteks lennuaja massispektromeetria laserdesorptsiooni ja maatriksi abil tehtava ionisatsiooniga (MALDI-TOF-MS), on mitmekülgne meetod süsivesikute struktuuride tuvastamiseks. Hiljuti on naatriumioonide aduktide kokkupõrkest indutseeritud dissotsiatsiooni (CID) tandem-MS-i kõige laialdasemalt kasutatud oligosahhariidide kinnituskohtadele, anomeersetele konfiguratsioonidele, järjestustele ja hargnemiskohtadele vastavate sõrmejälgede tuvastamiseks 20, 21.
Glükaani analüüs on suurepärane vahend süsivesikute sidemete põhjalikuks tuvastamiseks22. See meetod kasutab taimerakkude seina glükaani vastu suunatud monoklonaalseid antikehi (mAb-sid) sondidena, et mõista keerulisi süsivesikute sidemeid. Maailmas on saadaval üle 250 mAb-i, mis on loodud erinevate lineaarsete ja hargnenud oligosahhariidide vastu, kasutades erinevaid sahhariide24. Taimerakkude seina struktuuri, koostise ja modifikatsioonide iseloomustamiseks on laialdaselt kasutatud mitmeid mAb-sid, kuna taimerakkude tüübist, organist, vanusest, arengustaadiumist ja kasvukeskkonnast olenevalt on olulisi erinevusi25,26. Hiljuti on seda meetodit kasutatud taime- ja loomasüsteemide vesiikulite populatsioonide ja nende vastavate rollide mõistmiseks glükaani transpordis, mis on määratud subtsellulaarsete markerite, arenguetappide või keskkonnastiimulite abil, ning ensümaatilise aktiivsuse määramiseks. Mõned tuvastatud glükaanide ja ksülaanide erinevad struktuurid on näiteks pektiin (P), ksülaan (X), mannan (M), ksüloglükaanid (XylG), segatud sidemega glükaanid (MLG), arabinoksülaan (ArbX), galaktomannaan (GalG), glükuroonhappe-arabinoksülaan (GArbX) ja arabinogalaktaan (ArbG)29.
Vaatamata kõigile neile uurimistöödele on vaid vähesed uuringud keskendunud oligosahhariidide akumuleerumise olemusele suure tahke aine koormusega (HSL) hüdrolüüsi ajal, sealhulgas oligosahhariidide vabanemisele, oligomeersete ahelate pikkuse muutustele hüdrolüüsi ajal, erinevatele madala DP-ga polümeeridele ja nende kõveratele, jaotustele 30, 31, 32. Samal ajal, kuigi glükaani analüüs on osutunud kasulikuks vahendiks glükaani struktuuri põhjalikuks analüüsiks, on vees lahustuvaid madala DP-ga oligosahhariide antikehade meetodite abil keeruline hinnata. Väiksemad DP-ga oligosahhariidid molekulmassiga alla 5–10 kDa ei seondu ELISA plaatidega 33, 34 ja pestakse enne antikehade lisamist minema.
Siin demonstreerime esmakordselt ELISA testi avidiiniga kaetud plaatidel, kasutades monoklonaalseid antikehi, kombineerides lahustuvate tulekindlate oligosahhariidide üheastmelise biotinüülimisprotseduuri glükoosianalüüsiga. Meie glükoosianalüüsi lähenemisviis valideeriti MALDI-TOF-MS ja GC-MS-põhise komplementaarsete oligosahhariidide sidemete analüüsi abil, kasutades hüdrolüüsitud suhkrukompositsioonide trimetüülsilüül (TMS) derivatiseerimist. Seda uuenduslikku lähenemisviisi saab tulevikus arendada suure läbilaskevõimega meetodina ja leida laiemat rakendust biomeditsiinilistes uuringutes35.
Ensüümide ja antikehade translatsioonijärgsed modifikatsioonid, näiteks glükosüülimine,36 mõjutavad nende bioloogilist aktiivsust. Näiteks mängivad seerumi valkude glükosüülimise muutused olulist rolli põletikulise artriidi korral ja glükosüülimise muutusi kasutatakse diagnostiliste markeritena37. Kirjanduses on teatatud mitmesugustest glükaanidest, mis esinevad kergesti mitmesuguste haiguste korral, sealhulgas seedetrakti ja maksa kroonilised põletikulised haigused, viirusinfektsioonid, munasarja-, rinna- ja eesnäärmevähk38,39,40. Glükaanide struktuuri mõistmine antikehadel põhinevate glükaani ELISA meetodite abil annab haiguste diagnoosimisel täiendava kindluse ilma keeruliste MS-meetodite kasutamiseta.
Meie varasem uuring näitas, et kangekaelsed oligosahhariidid jäid pärast eeltöötlust ja ensümaatilist hüdrolüüsi hüdrolüüsimata (joonis 1). Varem avaldatud töös töötasime välja aktiivsöe tahkefaasilise ekstraheerimismeetodi oligosahhariidide eraldamiseks AFEX-eeltöödeldud maisiseemne hüdrolüsaadist (ACSH)8. Pärast esialgset ekstraheerimist ja eraldamist fraktsioneeriti oligosahhariidid edasi suuruseralduskromatograafia (SEC) abil ja koguti molekulmassi järjekorras. Erinevatest eeltöötlustest vabanenud suhkru monomeere ja oligomeere analüüsiti suhkru koostise analüüsi abil. Erinevate eeltöötlusmeetoditega saadud suhkru oligomeeride sisalduse võrdlemisel on kangekaelsete oligosahhariidide olemasolu biomassi monosahhariidideks muundamisel tavaline probleem ja võib viia suhkru saagise vähenemiseni vähemalt 10–15% ja isegi kuni 18% USA-s. Seda meetodit kasutatakse oligosahhariidide fraktsioonide edasiseks suuremahuliseks tootmiseks. Saadud ACH-d ja selle järgnevaid erineva molekulmassiga fraktsioone kasutati käesolevas töös oligosahhariidide iseloomustamiseks eksperimentaalse materjalina.
Pärast eeltöötlust ja ensümaatilist hüdrolüüsi jäid püsivad oligosahhariidid hüdrolüüsimata. Siin (A) on kujutatud oligosahhariidide eraldamise meetodit, milles oligosahhariidid eraldatakse AFEX-iga eeltöödeldud maisikuivati ​​hüdrolüsaadist (ACSH), kasutades aktiivsöe ja diatomiitmullaga täidetud kihti; (B) Oligosahhariidide eraldamise meetod. Oligosahhariidid eraldati edasi suuruseralduskromatograafia (SEC) abil; (C) Erinevatest eeltöötlustest (lahjendatud hape: DA, ioonvedelik: IL ja AFEX) vabanenud sahhariidmonomeerid ja oligomeerid. Ensümaatilise hüdrolüüsi tingimused: kõrge tahke aine sisaldus 25% (m/m) (ligikaudu 8% glükaani sisaldus), 96 tundi hüdrolüüsi, 20 mg/g kaubandusliku ensüümi sisaldus (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 suhe) ja (D) AFEX-iga eeltöödeldud maisikuivatist (ACS) vabanenud glükoosi, ksüloosi ja arabinoosi suhkrumonomeerid ja oligomeerid.
Glükaani analüüs on osutunud kasulikuks tööriistaks tahkete biomassi jääkidest eraldatud ekstraktide glükaanide põhjalikuks struktuurianalüüsiks. Vees lahustuvad sahhariidid on aga selle traditsioonilise meetodi abil alaesindatud,41 kuna madala molekulmassiga oligosahhariide on ELISA plaatidel raske immobiliseerida ja need pestakse enne antikehade lisamist välja. Seetõttu kasutati antikehade sidumiseks ja iseloomustamiseks üheetapilist biotinüülimismeetodit, et katta lahustuvad, mittevastavad oligosahhariidid avidiiniga kaetud ELISA plaatidel. Seda meetodit testiti, kasutades meie varem toodetud ACSH-d ja selle molekulmassil (või polümerisatsiooniastmel, DP) põhinevat fraktsiooni. Üheetapilist biotinüülimist kasutati oligosahhariidide sidumisafiinsuse suurendamiseks, lisades süsivesiku redutseerivasse otsa biotiin-LC-hüdrasiidi (joonis 2). Lahuses reageerib redutseeriva otsa poolatsetaalrühm biotiin-LC-hüdrasiidi hüdrasiidrühmaga, moodustades hüdrasoonsideme. Redutseerija NaCNBH3 juuresolekul redutseeritakse hüdrasoonside stabiilseks biotinüülitud lõpp-produktiks. Suhkru redutseeriva otsa modifitseerimisega sai võimalikuks madala DP-ga oligosahhariidide seondumine ELISA plaatidega ja meie uuringus tehti seda avidiiniga kaetud plaatidel, kasutades glükaani sihtivaid monoklonaalseid antikehi.
Biotinüleeritud oligosahhariidide suhtes ELISA-meetodil monoklonaalsete antikehade skriining. Siin (A) on näidatud oligosahhariidide biotinüleerimise ja järgneva ELISA-skriiningu kombinatsioon glükaani sihtimisega monoklonaalsete antikehadega NeutrAvidiniga kaetud plaatidel ning (B) reaktsioonisaaduste biotinüleerimise üheastmeline protseduur.
Seejärel lisati primaarsetele ja sekundaarsetele antikehadele avidiiniga kaetud plaadid, mis sisaldasid oligosahhariidiga konjugeeritud antikehi, ning pesti valgus- ja ajatundlikus keskkonnas. Pärast antikehade seondumise lõppemist lisati plaadi inkubeerimiseks TMB substraat. Reaktsioon peatati lõpuks väävelhappega. Inkubeeritud plaate analüüsiti ELISA lugejaga, et määrata iga antikeha seondumistugevust ja tuvastada antikeha-spetsiifilist ristsidumist. Katse üksikasjade ja parameetrite kohta vaata vastavat jaotist „Materjalid ja meetodid“.
Me demonstreerime selle äsja väljatöötatud meetodi kasulikkust spetsiifilistes rakendustes, iseloomustades ACSH-s esinevaid lahustuvaid oligosahhariide, samuti lignotsellulooshüdrolüsaatidest eraldatud toor- ja puhastatud oligosahhariidide fraktsioone. Nagu joonisel 3 näidatud, on bioatsüülitud glükoosi analüüsimeetodite abil ACSH-s tuvastatud kõige levinumad epitoop-asendatud ksülaanid tavaliselt uroon- (U) või metüüluroon- (MeU) ja pektiin-arabinogalaktaanid. Enamikku neist leiti ka meie eelmises uuringus, mis käsitles hüdrolüüsimata tahkete ainete (UHS) glükaanide analüüsi.
Raskesti reageerivate oligosahhariidide epitoopide tuvastamine rakuseina glükaani vastu suunatud monoklonaalse antikeha abil. „Neutraalne“ fraktsioon on ACN fraktsioon ja „happeline“ fraktsioon on FA fraktsioon. Heledamad punased toonid soojuskaardil näitavad suuremat epitoopide sisaldust ja heledamad sinised toonid näitavad tühja tausta. Skaalal olevad värviväärtused põhinevad N=2 preparaatide töötlemata OD väärtustel. Paremal on näidatud antikehade poolt äratuntavad peamised epitoobid.
Neid mittetselluloosseid struktuure ei suutnud lõhustada testitud kaubanduslikus ensüümisegus, mis sisaldab ka kõige sagedamini kasutatavaid kaubanduslikke ensüüme, kõige levinumad tsellulaasid ja hemitsellulaasid. Seetõttu on nende hüdrolüüsiks vaja uusi abiensüüme. Ilma vajalike mittetselluloossete abisensüümideta takistavad need mittetselluloossed sidemed täielikku muundumist monosahhariidideks, isegi kui nende lähtepolümeerid hüdrolüüsitakse ulatuslikult lühemateks fragmentideks ja lahustatakse kaubanduslike ensüümisegude abil.
Signaali jaotuse ja selle seondumistugevuse edasine uurimine näitas, et seondumisepitoope oli kõrge DP-ga suhkrufraktsioonides (A, B, C, DP kuni 20+) madalam kui madala DP-ga fraktsioonides (D, E, F, DP) dimeerides) (joonis 1). Happefragmendid on mittetselluloossetes epitoopides sagedasemad kui neutraalsetes fragmentides. Need nähtused on kooskõlas meie eelmises uuringus täheldatud mustriga, kus kõrge DP-ga ja happefragmendid olid ensümaatilise hüdrolüüsi suhtes resistentsemad. Seetõttu võivad mittetselluloossete glükaani epitoopide ning U ja MeU asendused oluliselt kaasa aidata oligosahhariidide stabiilsusele. Tuleb märkida, et seondumise ja tuvastamise efektiivsus võib olla problemaatiline madala DP-ga oligosahhariidide puhul, eriti kui epitoop on dimeerne või trimeerne oligosahhariid. Seda saab testida erineva pikkusega kaubanduslike oligosahhariidide abil, millest igaüks sisaldab ainult ühte epitoopi, mis seondub spetsiifilise monoklonaalse antikehaga.
Seega paljastas struktuurispetsiifiliste antikehade kasutamine teatud tüüpi raskesti siduvaid sidemeid. Sõltuvalt kasutatava antikeha tüübist, sobivast ligeerimismustrist ja selle tekitatud signaali tugevusest (kõige rohkem ja kõige vähem külluses) saab identifitseerida uusi ensüüme ja lisada ensüümisegule poolkvantitatiivselt, et glükokonversioon täielikumalt toimuks. ACSH oligosahhariidide analüüsi näitel saame luua iga biomassimaterjali glükaani sidemete andmebaasi. Siinkohal tuleb märkida, et antikehade erinevat afiinsust tuleks arvesse võtta ja kui nende afiinsus pole teada, tekitab see teatud raskusi erinevate antikehade signaalide võrdlemisel. Lisaks võib glükaani sidemete võrdlemine kõige paremini toimida sama antikeha proovide vahel. Need raskesti siduvad sidemed saab seejärel linkida CAZyme'i andmebaasiga, kust saame identifitseerida ensüüme, valida kandidaatensüüme ja testida sidemeid lõhkuvaid ensüüme või arendada mikroobseid süsteeme nende ensüümide ekspresseerimiseks biorafineerimistehastes kasutamiseks44.
Selleks, et hinnata, kuidas immunoloogilised meetodid täiendavad alternatiivseid meetodeid lignotsellulooshüdrolüsaatides esinevate madalmolekulaarsete oligosahhariidide iseloomustamiseks, viisime läbi MALDI (joonis 4, S1-S8) ja TMS-ist saadud sahhariidide analüüsi GC-MS-i abil samal paneelil (joonis 5) oligosahhariidi osas. MALDI-d kasutatakse selleks, et võrrelda, kas oligosahhariidi molekulide massijaotus vastab kavandatud struktuurile. Joonisel 4 on näidatud neutraalsete komponentide ACN-A ja ACN-B MS. ACN-A analüüs kinnitas pentoossuhkrute vahemikku DP 4–8 (joonis 4) kuni DP 22 (joonis S1), mille kaalud vastavad MeU-ksülaani oligosahhariididele. ACN-B analüüs kinnitas pentoos- ja glükoksülaani seeriaid DP-ga 8–15. Lisamaterjalides, näiteks joonisel S3, näitavad FA-C happelise fragmendi massijaotuse kaardid (Me)U-asendatud pentoossuhkrute vahemikku DP-ga 8–15, mis on kooskõlas ELISA-põhisel monoklonaalsete antikehade skriinimisel leitud asendatud ksülaanidega. Epitoobid on järjepidevad.
ACS-is esinevate lahustuvate mittevastavate oligosahhariidide MALDI-MS spekter. Siin (A) ACN-A madala massivahemikuga fraktsioonid, mis sisaldavad metüleeritud uroonhappega (DP 4-8) asendatud glükuroksülaani oligosahhariide, ja (B) ACN-B ksülaan ja metüleeritud uroonhappe oligosahhariidid, mis on asendatud glükuroksülaaniga (DP 8-15).
Tulekindlate oligosahhariidide glükaanijäägi koostise analüüs. Siin on (A) GC-MS analüüsi abil saadud erinevate oligosahhariidide fraktsioonide TMS-sahhariidide koostis. (B) Oligosahhariidides esinevate erinevate TMS-ist saadud suhkrute struktuurid. ACN – neutraalseid oligosahhariide sisaldav atsetonitriili fraktsioon ja FA – happelisi oligosahhariide sisaldav feruulhappe fraktsioon.
Oligosahhariidide fraktsiooni LC-MS analüüsist tehti veel üks huvitav järeldus, nagu on näidatud joonisel S9 (meetodid on leitavad elektroonilisest lisamaterjalist). ACN-B fraktsiooni ligeerimisel täheldati korduvalt heksoosi ja -OAc rühmade fragmente. See leid mitte ainult ei kinnita glükoosi ja MALDI-TOF analüüsis täheldatud fragmentatsiooni, vaid annab ka uut teavet võimalike süsivesikute derivaatide kohta eeltöödeldud lignotselluloosbiomassis.
Samuti viisime läbi oligosahhariidide fraktsioonide glükaani koostise analüüsi, kasutades TMS-glükaani derivatiseerimist. GC-MS-i abil määrasime oligosahhariidide fraktsioonis neuraalsete (mittederivaatide) ja happeliste suhkrute (GluA ja GalA) koostise (joonis 5). Glükuroonhapet leidub happelistes komponentides C ja D, galakturoonhapet aga happelistes komponentides A ja B, mis mõlemad on happeliste suhkrute kõrge DP-ga komponendid. Need tulemused mitte ainult ei kinnita meie ELISA ja MALDI andmeid, vaid on kooskõlas ka meie varasemate oligosahhariidide akumuleerumise uuringutega. Seetõttu usume, et kaasaegsed immunoloogilised meetodid, mis kasutavad oligosahhariidide biotinüleerimist ja sellele järgnevat ELISA-sõeluuringut, on piisavad lahustuvate raskesti lagundatavate oligosahhariidide tuvastamiseks erinevates bioloogilistes proovides.
Kuna ELISA-põhiseid monoklonaalsete antikehade skriiningumeetodeid on valideeritud mitme erineva meetodiga, tahtsime selle uue kvantitatiivse meetodi potentsiaali lähemalt uurida. Osteti kaks kaubanduslikku oligosahhariidi, ksüloheksasahhariidi oligosahhariid (XHE) ja 23-α-L-arabinofuranosüül-ksülotrioos (A2XX), ja testiti neid uue monoklonaalsete antikehade lähenemisviisi abil, mis on suunatud rakuseina glükaanile. Joonis 6 näitab lineaarset korrelatsiooni biotinüleeritud sidumissignaali ja oligosahhariidi kontsentratsiooni logaritmilise kontsentratsiooni vahel, mis viitab võimalikule Langmuiri adsorptsioonimudelile. Monoklonaalsete antikehade hulgas korreleerusid CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ja CCRC-M151 XHE-ga ning CCRC-M108, CCRC-M109 ja LM11 korreleerusid A2XX-iga vahemikus 1 nm kuni 100 nano. Antikehade piiratud kättesaadavuse tõttu katse ajal tehti iga oligosahhariidi kontsentratsiooniga piiratud arv katseid. Siinkohal tuleb märkida, et mõned antikehad reageerivad sama oligosahhariidi kui substraadi suhtes väga erinevalt, arvatavasti seetõttu, et nad seonduvad veidi erinevate epitoopidega ja neil võib olla väga erinev seondumisafiinsus. Täpse epitoobi tuvastamise mehhanismid ja tagajärjed muutuvad palju keerukamaks, kui uut monoklonaalsete antikehade lähenemisviisi rakendatakse reaalsetele proovidele.
Erinevate glükaani sihtivate monoklonaalsete antikehade detekteerimisvahemiku määramiseks kasutati kahte kaubanduslikku oligosahhariidi. Siin näitavad lineaarsed korrelatsioonid oligosahhariidi kontsentratsiooni logaritmilise kontsentratsiooniga Langmuiri adsorptsioonimustreid (A) XHE ja monoklonaalse antikeha ning (B) A2XX ja monoklonaalse antikeha puhul. Vastavad epitoobid näitavad testis substraatidena kasutatud kaubanduslike oligosahhariidide struktuure.
Glükaanidele suunatud monoklonaalsete antikehade kasutamine (glükokoomiline analüüs või ELISA-põhine monoklonaalsete antikehade skriining) on ​​võimas tööriist enamiku taimebiomassi moodustavate peamiste rakuseina glükaanide põhjalikuks iseloomustamiseks. Klassikaline glükaani analüüs iseloomustab aga ainult suuremaid rakuseina glükaane, kuna enamik oligosahhariide ei ole ELISA plaatidel tõhusalt immobiliseeritud. Selles uuringus hüdrolüüsiti AFEX-eeltöödeldud maisitoru ensümaatiliselt kõrge tahke aine sisaldusega. Suhkruanalüüsi abil määrati hüdrolüsaadis sisalduvate raskesti lagundatavate rakuseina süsivesikute koostis. Väiksemate oligosahhariidide monoklonaalsete antikehade analüüsi hüdrolüsaatides alahinnatakse aga ja oligosahhariidide tõhusaks immobiliseerimiseks ELISA plaatidel on vaja täiendavaid tööriistu.
Käesolevas dokumendis kirjeldame uudset ja tõhusat oligosahhariidide immobiliseerimismeetodit monoklonaalsete antikehade skriinimiseks, mis ühendab oligosahhariidide biotinüülimise ja seejärel ELISA-skriiningu NeutrAvidin™-kattega plaatidel. Immobiliseeritud biotinüülitud oligosahhariidid näitasid antikeha suhtes piisavat afiinsust, et võimaldada raskesti reageerivate oligosahhariidide kiiret ja tõhusat tuvastamist. Nende kangekaelsete oligosahhariidide koostise analüüs massispektromeetria abil kinnitas selle uue immunoskriiningu lähenemisviisi tulemusi. Seega näitavad need uuringud, et oligosahhariidide biotinüülimise ja ELISA-skriiningu kombinatsiooni glükaani sihtimisega monoklonaalsete antikehadega saab kasutada oligosahhariidide ristseotuste tuvastamiseks ja seda saab laialdaselt rakendada ka teistes biokeemilistes uuringutes, mis iseloomustavad oligosahhariidide struktuuri.
See biotiinipõhine glükaani profiilimise meetod on esimene aruanne, mis suudab uurida taimse biomassi lahustuvate oligosahhariidide raskesti siduvaid süsivesikute sidemeid. See aitab mõista, miks mõned biomassi osad on biokütuste tootmisel nii visad. See meetod täidab olulise lünga glükoosianalüüsi meetodites ja laiendab selle rakendust laiemale substraatide valikule peale taimsete oligosahhariidide. Tulevikus võime kasutada biotinüülimiseks roboteid ja kasutada meie väljatöötatud meetodit proovide suure läbilaskevõimega analüüsiks ELISA abil.
Pioneer 33A14 hübriidseemnetest kasvatatud maisiõled (CS) koristati 2010. aastal Kramer Farmsist Rays, Colorados. Maaomaniku loal võib seda biomassi kasutada uurimistööks. Proove hoiti toatemperatuuril kuivas, < 6% niiskusesisaldusega kilekottides. Proove hoiti toatemperatuuril kuivas, < 6% niiskusesisaldusega kilekottides. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Proove hoiti toatemperatuuril kuivas kohas lukuga kottides õhuniiskuse juures <6%.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Proove hoitakse lukuga kottides toatemperatuuril ja õhuniiskuses < 6%.Uuring vastas kohalikele ja riiklikele suunistele. Koostise analüüs viidi läbi NREL-protokolli abil. Koostises leiti 31,4% glükaani, 18,7% ksülaani, 3,3% arabinaani, 1,2% galaktaani, 2,2% atsetüüli, 14,3% ligniini, 1,7% valku ja 13,4% tuhka.
Cellic® CTec2 (138 mg valku/ml, partii VCNI 0001) on tsellulaasi, β-glükosidaasi ja Cellic® HTec2 (157 mg valku/ml, partii VHN00001) kompleksne segu ettevõttest Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg valku/ml), pektiini lagundavate ensüümide kompleksne segu, annetas DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Ensüümvalgu kontsentratsioonid määrati valgusisalduse hindamise (ja mittevalgulise lämmastiku panuse lahutamise) teel, kasutades Kjeldahli lämmastikuanalüüsi (AOAC meetod 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Diatomiitmuld 545 osteti ettevõttest EMD Millipore (Billerica, MA). Aktiivsüsi (DARCO, 100 mesh graanulid), Avicel (PH-101), pöögi ksülaan ja kõik muud kemikaalid osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-i eeltöötlus viidi läbi GLBRC-s (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Eeltöötlus viidi läbi temperatuuril 140 °C 15 minuti jooksul. 46 viibeaeg veevaba ammoniaagi ja biomassi suhtega 1:1 60% (w/w) sisaldusega roostevabast terasest lauatüüpi perioodilises reaktoris (Parr Instruments Company). See võttis aega 30 minutit. Reaktor kuumutati temperatuurini 140 °C ja ammoniaak eraldus kiiresti, võimaldades biomassil kiiresti toatemperatuurini soojeneda. AFEX-iga eeltöödeldud maisitüki (ACS) koostis oli sarnane töötlemata maisitüki (UT-CS) koostisega.
Oligosahhariidide suuremahulise tootmise lähteainena valmistati 25% (massiprotsent) kõrge tahke aine sisaldusega ACSH (ligikaudu 8% dekstraani sisaldus). ACS-i ensümaatiline hüdrolüüs viidi läbi kaubandusliku ensüümisegu abil, mis sisaldas Cellic® Ctec2 10 mg valku/g glükaani (eeltöödeldud biomassis), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg valku/g glükaani ja Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ). , 5 mg valku/g dekstraani. Ensümaatiline hüdrolüüs viidi läbi 5-liitrises bioreaktoris töömahuga 3 liitrit, pH 4,8, 50 °C ja kiirusel 250 p/min. Pärast 96-tunnist hüdrolüüsi koguti hüdrolüsaat tsentrifuugimisega kiirusel 6000 p/min 30 minutit ja seejärel kiirusel 14000 p/min 30 minutit, et eemaldada hüdrolüüsimata tahked ained. Seejärel filtreeriti hüdrolüsaat steriilselt läbi 0,22 mm filtriklaasi. Filtreeritud hüdrolüsaati säilitati steriilsetes pudelites temperatuuril 4 °C ja seejärel fraktsioneeriti süsinikul.
Ekstraktidel põhinevate biomassiproovide koostise analüüs vastavalt NREL-i laborianalüüsi protseduuridele: proovide ettevalmistamine koostise analüüsiks (NREL/TP-510-42620) ja struktuursete süsivesikute ja ligniini määramine biomassis (NREL/TP-510–42618)47.
Hüdrolüsaadivoo oligosahhariidide analüüs viidi läbi 2 ml skaalal, kasutades autoklaavil põhinevat happehüdrolüüsi meetodit. Segage hüdrolüsaadiproov 69,7 µl 72% väävelhappega 10 ml keeratava korgiga kultuurituubis ja inkubeerige 1 tund tööpinnal temperatuuril 121 °C, jahutage jääl ja filtreerige kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) viaali. Oligosahhariidide kontsentratsioon määrati, lahutades hüdrolüüsimata proovi monosahhariidide kontsentratsiooni happehüdrolüüsitud proovi suhkru kogukontsentratsioonist.
Happega hüdrolüüsitud biomassi glükoosi, ksüloosi ja arabinoosi kontsentratsioone analüüsiti Shimadzu HPLC süsteemi abil, mis oli varustatud automaatse proovivõtja, kolonniküttekeha, isokraatliku pumba ja murdumisnäitaja detektoriga Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonnil. Kolonni hoiti temperatuuril 50 °C ja elueeriti 0,6 ml/min 5 mM H2SO4-ga vees.
Hüdrolüsaadi supernatant lahjendati ja analüüsiti monomeeri ja oligosahhariidi sisalduse suhtes. Pärast ensümaatilist hüdrolüüsi saadud monomeerseid suhkruid analüüsiti HPLC abil, mis oli varustatud Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonni ja tuhakaitsekolonniga. Kolonni temperatuuri hoiti 80 °C juures, liikuva faasina kasutati vett voolukiirusega 0,6 ml/min. Oligosahhariidid määrati hüdrolüüsi teel lahjendatud happes temperatuuril 121 °C vastavalt viidetes 41, 48, 49 kirjeldatud meetoditele.
Sahhariidanalüüs viidi läbi toores, AFEX-iga eeltöödeldud ja kõigil hüdrolüüsimata biomassi jääkidel (sh seeriarakkude seina ekstraktide tootmine ja nende monoklonaalsete antikehade skriining), kasutades eelnevalt kirjeldatud protseduure 27, 43, 50, 51. Glükoomianalüüsiks valmistatakse biomassi jääkidest taimerakkude seina materjali alkoholis lahustumatud jäägid ja neid ekstraheeritakse järjestikuselt üha agressiivsemate reagentidega, nagu ammooniumoksalaat (50 mM), naatriumkarbonaat (50 mM ja 0,5% w/v), CON. (1M ja 4M, mõlemad 1% w/v naatriumboorhüdriidiga) ja happeklorit, nagu eelnevalt kirjeldatud 52,53. Seejärel analüüsiti ekstrakte ELISA-ga rakuseina glükaanile suunatud monoklonaalsete antikehade 50 komplekspaneeli suhtes ja monoklonaalsete antikehade sidumisreaktsioonid esitati soojuskaardina. Taimerakkude seina glükaanile suunatud monoklonaalsed antikehad osteti laborivarudest (CCRC, JIM ja MAC seeria).
Oligosahhariidide üheastmeline biotinüülimine. Süsivesikute konjugeerimine biotiin-LC-hüdrasiidiga viidi läbi järgmise protseduuri abil. Biotiin-LC-hüdrasiid (4,6 mg/12 μmol) lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO, 70 μl) intensiivse segamise ja kuumutamisega temperatuuril 65 °C 1 minuti jooksul. Lisati jää-äädikhape (30 µl) ja segu valati naatriumtsüanoboorhüdriidile (6,4 mg/100 µmol) ning lahustati täielikult pärast kuumutamist temperatuuril 65 °C umbes 1 minuti jooksul. Seejärel lisati kuivatatud oligosahhariidile (1–100 nmol) 5–8 μl reaktsioonisegu, et saada märgistuse 10-kordne või suurem molaarne liias redutseeriva otsa suhtes. Reaktsioon viidi läbi temperatuuril 65 °C 2 tundi, mille järel proovid kohe puhastati. Märgistamiskatsetes ei kasutatud naatriumtsüanoboorhüdriidi ilma redutseerimiseta ja proove lasti reageerida temperatuuril 65 °C 2,5 tundi.
Biotinüülitud oligosahhariidide proovide ELISA katmine ja pesemine. Avidiiniga kaetud plaadi igasse süvendisse lisati 25 μl biotinüülitud proove (100 μl igast kontsentreeritud proovist lahjendatult 5 ml 0,1 M Tris-puhverlahuses (TBS)). Kontrollsüvendid kaeti 50 μl biotiiniga kontsentratsioonil 10 μg/ml 0,1 M TBS-is. Pimekatsete kattekihina kasutati deioniseeritud vett. Tabletti inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril pimedas. Peske plaati 3 korda 0,1% lõssiga 0,1 M TBS-is, kasutades programmi nr 11 Grenier' tasapinna 3A jaoks.
Primaarsete antikehade lisamine ja pesemine. Lisage igasse süvendisse 40 µl primaarset antikeha. Inkubeerige mikrotiiterplaati 1 tund toatemperatuuril pimedas. Seejärel pesti plaate 3 korda 0,1% piimaga 0,1M TBS-is, kasutades Grenier Flat 3A pesuprogrammi nr 11.
Lisa sekundaarne antikeha ja pese. Lisa igasse süvendisse 50 µl hiire/roti sekundaarset antikeha (lahjendatud 1:5000 0,1% piimas 0,1 M TBS-is). Inkubeeri mikrotiiterplaati 1 tund toatemperatuuril pimedas. Seejärel pesti mikrotiiterplaate 5 korda 0,1% piimaga 0,1 M TBS-is, kasutades Grenier Flat 5A plaadipesuprogrammi nr 12.
Substraadi lisamine. Lisage baassubstraadile 50 µl 3,3',5,5'-tetrametüülbensidiini (TMB) (lisades 15 ml deioniseeritud vette 2 tilka puhvrit, 3 tilka TMB-d ja 2 tilka vesinikperoksiidi). Valmistage ette TMB substraat ja segage enne kasutamist vorteksil. Inkubeerige mikrotiiterplaati toatemperatuuril 30 minutit pimedas.
Täida see samm ja loe tablett. Lisa igasse süvendisse 50 µl 1 N väävelhapet ja registreeri neelduvus vahemikus 450 kuni 655 nm, kasutades ELISA lugejat.
Valmistage järgmiste analüütide 1 mg/ml lahused deioniseeritud vees: arabinoos, ramnoos, fukoos, ksüloos, galakturoonhape (GalA), glükuroonhape (GlcA), mannoos, glükoos, galaktoos, laktoos, N-atsetüülmannosamiin (manNAc), N-atsetüülglükosamiin (glcNAc), N-atsetüülgalaktosamiin (galNAc), inositool (sisestandard). Kaks standardit valmistati, lisades tabelis 1 näidatud 1 mg/ml suhkrulahuseid. Proovid külmutati ja lüofiliseeriti temperatuuril -80 °C, kuni kogu vesi oli eemaldatud (tavaliselt umbes 12–18 tundi).
Lisage analüütilise kaalu keeratava korgiga katseklaasidesse 100–500 µg proovi. Pange lisatud kogus kirja. Parim on lahustada proov kindla kontsentratsiooniga lahustis ja lisada see katseklaasi vedela alikvoodina. Kasutage iga proovikatsuti kohta sisestandardina 20 µl 1 mg/ml inositooli. Proovile lisatava sisestandardi kogus peab olema sama, mis standardkatsutisse lisatava sisestandardi kogus.
Lisage keeratava korgiga viaali 8 ml veevaba metanooli. Seejärel lisage 4 ml 3 N HCl metanoollahust, sulege viaal ja loksutage. See protsess ei kasuta vett.
Lisage oligosahhariidide proovidele ja standardsetele TMS-tuubidele 500 µl 1 M HCl metanoolilahust. Proove inkubeeriti üleöö (168 tundi) temperatuuril 80 °C termoplokis. Kuivatage metanoolisaadus toatemperatuuril kuivatuskollektori abil. Lisage 200 µl MeOH-d ja kuivatage uuesti. Seda protsessi korratakse kaks korda. Lisage proovile 200 µl metanooli, 100 µl püridiini ja 100 µl äädikhappeanhüdriidi ning segage hästi. Inkubeerige proove toatemperatuuril 30 minutit ja kuivatage. Lisage 200 µl metanooli ja kuivatage uuesti.
Lisage 200 µl Tri-Sil ja kuumutage korgiga toru 20 minutit. Kuumutage temperatuurini 80 °C ja jahutage seejärel toatemperatuurini. Kuivatage proovi kuivatuskollektoriga umbes 50 µl mahuni. Oluline on märkida, et me ei lasknud proovidel täielikult kuivada.
Lisage 2 ml heksaani ja segage korralikult keerissegistiga. Täitke Pasteuri pipettide (5–8 mm) otsad klaasvillatükiga, asetades klaasvilla 5-3/4-tollise läbimõõduga pipeti otsa. Proove tsentrifuugiti kiirusel 3000 g 2 minutit. Lahustumatud jäägid sadestati. Kuivatage proov mahuni 100–150 µl. GC-MS-i süstiti ligikaudu 1 μl lahust algtemperatuuril 80 °C ja 2,0 minutiga (tabel 2).