Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena izateko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe bistaratuko dugu.
Giza hesteetako morfogenesisak 3D epitelioaren mikroarkitekturaren eta antolamendu espazialaren kripta-billus ezaugarriak ezartzen ditu. Egitura berezi honek hesteetako homeostasia mantentzeko beharrezkoa da kripta basaleko zelula amaren nitxoa mikrobio antigeno exogenoetatik eta haien metabolitoetatik babestuz. D epitelio-egiturak funtsezkoak dira in vitro heste-ereduak eraikitzeko. Batez ere, hesteetako epitelioaren 3D morfogenesi espontaneoa eragin dezake. , Caco-2 edo hesteetako zelula epitelial organoideen hazkuntza ohiko ezarpenetan zein plataforma mikrofluidiko batean, 3D morfogenesiaren indukzioa eta ezarritako 3D epitelioen karakterizazioa irudi-modalitate anitzak erabiliz. Protokolo honek hesteetako mikroarkitektura funtzionalaren birsorkuntza lortzen du 5 d. zelula-ingeniaritza edo manipulazio konplexua behar dute, eta horrek lehendik dauden beste teknika batzuk gainditu ditzake. Gure proposatutako protokoloak ikerketa biomedikoen komunitatean inplikazio zabalak izan ditzakeela uste dugu, aplikazio biomediko, kliniko eta farmazeutikoetarako 3D hesteetako epitelio-geruzak in vitro birsortzeko metodo bat eskainiz.
Esperimentuek frogatzen dute hesteetako Caco-2 zelulek gut-on-a-chip1,2,3,4,5 edo geruza biko gailu mikrofluidikoetan6,7 hazi daitezkeela in vitro 3D morfogenesi espontaneoa jasan dezaketela, azpiko mekanismoa argi ulertu gabe. morfogenesia in vitro, Caco-2 eta pazienteetatik eratorritako heste organoideek frogatu dutena.Zelula epitelialak balioztatu ziren. Azterketa honetan, zehazki, Wnt antagonista indartsu baten, Dickkopf-1 (DKK-1), zelulen ekoizpenean eta kontzentrazioan zentratu ginen, Transwell txertaketak dituzten gut-on-a-chip eta gailu mikrofluidiko eraldatuetan, "Hibrid Chip" izenekoan. - erlazionatutako proteinak 1 edo Soggy-1) txiparen hestearekin morfogenesia inhibitzen du edo aurreegituratutako 3D epitelio geruza hausten du, kulturan zehar estres antagonikoa in vitro hesteetako morfogenesiaren erantzule dela iradokitzen du. Hori dela eta, morfogenesi sendoa lortzeko planteamendu praktiko bat epitelioaren interfazearen alboko maila aktiboa kentzea da. (adibidez, gut-on-a-chip edo hibrido-on-a-chip plataformetan) edo difusioa. Medio basolateralak (adibidez, Transwell-en txertatzeetatik putzuetako basolateraleko urtegi handietara).
Protokolo honetan, hesteetako zelulak polidimetilsiloxanoan (PDMS) oinarritutako mintz porotsuetan (6A, 7A, 8, 9 urratsak) edo Transwell-en poliester mintzak (7A, 7A, 8, 9 urratsak) edo Transwell induzitutako poliester mintzak (7A, 7A, 8, 9). morfogenesia in vitro (10. urratsa). Ehunaren espezifiko histogeniaren eta leinuaren menpeko bereizketa zelularren adierazgarri diren ezaugarri zelular eta molekularrak ere identifikatu ditugu irudi-modalitate anitz aplikatuz (11-24 urrats). mikroingurune biomekanikoaren.in vitro. 2D epitelio monogeruzetatik 3D morfogenesia eragiteko, morfogeneoaren antagonistak kendu ditugu hazkuntzako bi formetan medioa kulturaren konpartimentu basolateralera isuriz. Azkenik, 3D epitelio-geruza birsorgarri baten erabilgarritasunaren irudikapena eskaintzen dugu, epitelio-eredu birsorgarriaren geruza epitelial-menpekoko ostalariaren hazkuntza komorfomo menpekoa izan daitekeen. -kulturak, patogenoen infekzioa, hanturazko lesioa, hesi epitelialaren disfuntzioa eta probiotikoetan oinarritutako terapiak Adibidea.eraginak.
Gure protokoloa zientzialari askorentzat erabilgarria izan daiteke oinarrizko (adibidez, hesteetako mukosaren biologia, zelula amaren biologia eta garapenaren biologia) eta ikerketa aplikatuan (adibidez, droga-proba klinikoak, gaixotasunen modelizazioa, ehunen ingeniaritza eta gastroenterologia) eragin zabalean. s zelulen seinaleztapenaren dinamika aztertzen heste-garapenean, birsorkuntzan edo homeostasia garaian .Gainera, gure protokoloa baliagarria da hainbat agente infekziosotan infekzioa galdekatzeko, hala nola Norovirus 8, Severe Acute Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 edo Vibrio cholerae.Gaixotasunaren patologiaren eta patogeniaren ikusleak ere erabilgarriak dira. Txiparen mikrofisiologia-sistema baten erabilerak luzetarako ko-kultura 10 eta ondorengo ebaluazioa ahalbidetu dezake ostalariaren defentsa, erantzun immunologikoak eta patogenoekin erlazionatutako lesioen konponketa gastrointestinalaren (GI) traktuan 11. edo heste sumingarriaren sindromea simulatu daiteke pazientearen 3D hesteetako epitelio geruzak erabiliz prestatzen direnean 3D hesteetako geruzak prestatzen direnean. Gaixotasun hauek atrofia bilotsuak, kripta laburtzea, mukosaren kaltea edo hesi epitelial hondatua dira. motak, hala nola pazientearen odol periferikoko zelula mononuklearrak (PBMCak), hesteetako villus-kripta mikroarkitektura 3D dituzten ereduetara.ehun-zelula immunologiko espezifikoak, 5.
3D epitelioaren mikroegitura sekzio prozesurik gabe finkatu eta ikus daitekeenez, transkriptomika espazialean eta bereizmen handiko edo super-bereizmeneko irudietan lan egiten duten ikusleek interesa izan dezakete nitxo epitelialetako gene eta proteinen dinamika espazio-denporalaren mapak egitean.Teknologian interesatuta.Erantzuna mikrobioen edo immunitate-estimuluei.Gainera, hesteetako homeostasia koordinatzen duten hesteetako 3D-ko mukosaren geruzan ezar daiteke luzetarako ostalari-mikrobioma gurutzatu 10, 14 hainbat mikrobio-espezie, mikrobio-komunitate edo fekal-mikrobiota kolaboratuz, batez ere gut-on-chip-ean.plataforman. Ikuspegi hau bereziki erakargarria da mukosaren immunologia, gastroenterologia, giza mikrobioma, kulturomika eta mikrobiologia klinikoa ikertzen duten ikusleentzat, aurretik landu gabeko hesteetako mikrobiota laborategian landu nahi dutenentzat. Gure in vitro morfogenesi protokoloa kultura-formatu eskalagarrietara egokitu badaiteke, hala nola, hobi anitzeko txertaketak alboko plaka batean txertatzea ondo 6, 24 238 49 ondo betez, basoetan, alboetan. Elikagaien industriarako farmazia, biomedikuntza edo errendimendu handiko baheketa edo baliozkotze plataformak garatzen dituztenei ere hedatu ahal izango zaie protokoloa. Printzipioaren froga gisa, duela gutxi frogatu dugu errendimendu handiko morfogenesi-sistema multiplexaren bideragarritasuna 24 putzuko plaka formatura eskala daitekeela. Horrez gain, organo-on-a-186 produktu anitz merkaturatu dira. morfogenesi metodoa bizkortu eta potentzialki har dezakete ikerketa laborategi askok, industriak edo gobernuek eta erakunde erregulatzaileek in vitro hesteetako morfogenesiaren birprogramazio zelularra ulertzeko, sendagaiak edo bioterapikoak probatzeko. Droga hautagaien xurgapena eta garraioa ebaluatu zen 3D hesteetako ordezkoekin edo organo-modelo pertsonalizatuak edo komertzialak erabiliz.
Gizakiarentzat garrantzitsuak diren eredu esperimental kopuru mugatu bat erabili da hesteetako epitelioaren morfogenesia aztertzeko, batez ere in vitro 3D morfogenesia eragiteko inplementa daitezkeen protokolorik ez dagoelako. Izan ere, hesteetako morfogenesiari buruzko egungo ezagutzaren zati handi bat animalien ikerketetan oinarritzen da (adibidez, zebra-arraina20, saguak21 edo oiloak22). Giza garapen-prozesuak zehazten ditu. Eredu hauek modu anitzeko modu eskalagarrian probatzeko gaitasunean ere oso mugatuak dira. Hori dela eta, 3D ehun-egiturak in vitro birsortzeko gure protokoloak in vivo animalia-ereduak gainditzen ditu, baita 2D zelula-kultura eredu estatiko tradizionalak ere. Aurretik deskribatu bezala, 3D epitelio-egiturak erabiliz, hainbat zelula-esparrua lokalizatutako enkriptatze-erantzuna aztertzeko aukera eman digu. mukosak edo estimulu immunologikoak.3D epitelio geruzek espazio bat eskain dezakete aztertzeko zelula mikrobioak nola lehiatzen diren nitxo espazialak eta bilakaera ekologikoa ostalari-faktoreei erantzuteko (adibidez, barruko eta kanpoko muki-geruzak, IgA eta mikrobioen aurkako peptidoak jariatzea). adibidez, kate laburreko gantz-azidoak) oinarrizko kripten antolakuntza zelularra eta zelula amaren nitxoak moldatzen dituztenak. Ezaugarri hauek 3D geruza epitelialak in vitro ezartzen direnean soilik froga daitezke.
3D hesteetako epitelio-egiturak sortzeko gure metodoaz gain, in vitro hainbat metodo daude. Heste-organoideen kultura punta-puntako ehunen ingeniaritza-teknika bat da, hesteetako zelula amak morfogeno-baldintza espezifikoetan lantzean oinarritzen dena23,24,25. Hala ere, 3D organoide-ereduen erabilera garraioaren analisirako edo ostalari-mikroideoa sarritan hesteetako zelula organoidearen barnean sartzen baita. beraz, mikrobio-zelulak edo antigeno exogenoak bezalako osagai luminalak sartzea mugatua da.Lumen organoideetarako sarbidea mikroinjektore baten bidez hobetu daiteke,26,27, baina metodo hau inbaditzailea eta eskulana da eta ezagutza espezializatua behar du egiteko. Gainera, baldintza estatikoetan hidrogel-aldamioetan mantentzen diren organoide-kultura tradizionalek ez dute in vivo biomekanika aktiboa zehaztasunez islatzen.
Hainbat ikerketa-taldek erabilitako beste hurbilketa batzuek 3D hidrogel-aldamio preegituratuak erabiltzen dituzte hesteetako epitelioaren egitura imitatzeko, giza heste-zelula isolatuak gelaren gainazalean haziz. Hidrogel-aldamioak fabrikatu 3D-n inprimatutako, mikro-fresatutako edo litografikoki egindako moldeak erabiliz. Aspektu-erlazio handiko epitelio-egitura eta estroma-epitelio-gurutzatu gurutzatu estroma-zelulak aldamioan sartuz. Hala ere, aurreegituratutako aldamioen izaerak prozesu morfogenetiko espontaneoa bera bistaratzea eragotzi dezake. Eredu hauek ere ez dute fluxu luminal edo interstizial dinamikorik ematen, hesteetako zelulek azkenaldian erabilitako hesteetako morfogenesiaren funtzioa hidrogenesian irabazteko behar duten ebakidura-estres fluidorik gabe. plataforma mikrofluidikoa eta hesteetako epitelio-egitura ereduak laser bidez grabatzeko teknikak erabiliz.Saguaren heste-organoideek grabatutako ereduak jarraitzen dituzte heste-hodi-egiturak eratzeko, eta fluido barneko fluxua mikrofluidika-modulu baten bidez birkapitulatu daiteke.Hala ere, eredu honek ez du prozesu morfogenetiko espontaneorik erakusten, ezta hesteetako hodi mekanobiologikoek berezko mugimendu mekanobiologikoak sortzen dituzten hesteetako hodi berberak3D talde bereko inprimatzeko teknikak sortzen. Hodiaren barruan heste-segmentu desberdinen fabrikazio konplexua izan arren, eredu honek fluido-fluxu luminala eta deformazio mekanikoa ere ez ditu. Gainera, ereduaren funtzionagarritasuna mugatua izan daiteke, batez ere bioinprimaketa-prozesua amaitu ondoren, baldintza esperimentalak edo zelula-zelulen arteko elkarrekintzak asaldatuz. Hori dela eta, gure in vitro 3D morfogenesi protokoloak hurbilketa osagarri bat eskain dezake dauden metodoen erronkak gainditzeko.
Gure protokoloa 3D epitelioaren morfogenesian zentratuta dago guztiz, zelula epitelialak soilik kulturan eta inguruko beste zelularik ez, hala nola zelula mesenkimalak, zelula endotelialak eta zelula immunologikoak. Aurrez azaldu bezala, gure protokoloaren muina morfogenesi epitelialaren indukzioa da. on-a-chip eta hibrido-on-a-chip-ek 3D geruza epitelial ondulatua birsortzeko aukera ematen digu, konplexutasun biologiko osagarriak, hala nola, elkarrekintza epitelial-mesenkimalak33,34, zelula kanpoko matrizea (ECM) deposizioa 35 eta, gure ereduan, kripta-billusaren ezaugarriak, zelula amak helarazten dituztenak, fibroblasto zelula basaletan nitxo gehiago izaten jarraitzen dute. kimoak funtsezko eginkizuna du ECM proteinen ekoizpenean eta hesteetako morfogenesiaren erregulazioan in vivo35,37,38.Gure ereduari zelula mesenkimalak gehitzeak prozesu morfogenetikoa eta zelulen eranskinaren eraginkortasuna areagotu zituen. Geruza endotelialak (hau da, kapilarrak edo linfatikoak) paper garrantzitsua jokatzen du zelula garraiatze molekularra erregulatzen39 eta mikroingurumen immunologikoaren osagaiak. ehun-ereduen artean konekta daitezkeela ezinbestekoa da ehun-ereduak organo anitzeko interakzioak erakusteko diseinatuta daudenean. Hori dela eta, baliteke zelula endotelialak sartu behar izatea organo-mailako bereizmenarekin ezaugarri fisiologiko zehatzagoak modelatzeko. Pazienteak eratorritako zelula immunologikoak ere ezinbestekoak dira berezko erantzun immunologikoak, antigenoaren aurkezpena, heste-ehun gurutzatua, immunitate-ehunen espezifikoa eta mimika-testuingurua erakusteko. gaixotasuna.
Txip hibridoen erabilera gut-on-a-chip baino sinpleagoa da, gailuaren konfigurazioa sinpleagoa delako eta Transwell txertaketak erabiltzeak hesteetako epitelioaren kultura eskalagarria ahalbidetzen duelako. Hala ere, komertzialki eskuragarri dauden Transwell txertaketak poliester mintzekin ez dira elastikoak eta ezin dituzte simulatu peristaltiko-itxurako mugimenduak. Gainera, transwell-en tentsio apikalaren alde apikala tentsio apikalean jartzen da. Arly, konpartimentu apikalaren propietate estatikoek oso gutxitan ahalbidetzen dute epe luzerako bakterioen ko-kultura txip hibridoetan. Transwell-en txertaketetan 3D morfogenesia sendo eragin dezakegun arren, txip hibridoak erabiltzean, fisiologikoki garrantzitsuak diren biomekanika eta fluido apikalaren fluxuaren eskasia mugatu dezake txip hibridoen plataformak aplikazio potentzialetarako.
Ez dira guztiz finkatu giza kripta-villus ardatzaren eskala osoko berreraikuntzak gut-on-a-chip eta hibrido-on-a-chip kulturetan. Morfogenesia epitelio monogeruza batetik hasten denez, 3D mikroarkitekturak ez dute zertan kriptekin antzekotasun morfologikoa ematen in vivo. kripta eta malos-eskualdeak ez zeuden argi mugatuta. Txiparen goiko kanal altuek mikroingeniaritzako epitelioaren altuera handitzen duten arren, gehienezko altuera ~ 300-400 µm-ra mugatzen da oraindik. Heste meharrean eta lodian giza hesteetako kripten benetako sakonera ~ 135 µm eta ~ 400 µm-ko altuera da, hurrenez hurren.
Irudiaren ikuspuntutik, 3D mikroarkitekturen in situ bereizmen handiko irudiak txip bateko hesteetara mugatu daitezke, lente objektibotik geruza epitelialerako beharrezkoa den lan-distantzia milimetro gutxi batzuetakoa baita. txip batean hestearen mikrofabrikazioa geruza bakoitzaren arteko atxikimendu iraunkorra dakar, oso zaila da goiko geruza irekitzea edo kentzea geruza epitelialaren gainazaleko egitura aztertzeko.Adibidez, mikroskopio elektronikoa (SEM) erabiliz.
PDMS-ren hidrofobikotasuna faktore mugatzailea izan da mikrofluidikoetan oinarritutako molekula hidrofobo txikiak jorratzen dituzten ikerketetan, PDMS-k molekula hidrofobiko horiek modu zehatzean xurga ditzakeelako. PDMS-ren alternatibak beste material polimeriko batzuekin har daitezke. molekula fobikoak.
Azkenik, gure metodoa ez da ondo ezaugarritu errendimendu handiko baheketa edo plataforma esperimental "bakarreko" bat eskaintzeari dagokionez. Egungo protokoloak xiringa-ponpa bat behar du mikrogailu bakoitzeko, CO2 inkubagailu batean tokia hartzen duena eta eskala handiko esperimentuak eragozten dituena. Muga hori nabarmen hobetu daiteke kultura formatu berritzaileen eskalagarritasunarekin euskarri basolateralak etengabe berritzea eta kentzea ahalbidetzen dutenak).
Giza hesteetako epitelioaren 3D morfogenesia in vitro eragiteko, bi mikrokanal paralelo eta tartean mintz porotsu elastiko bat dituen hesteetako txip mikrofluidiko bat erabili dugu lumen-kapilar interfaze bat sortzeko. Gainera, kanal bakarreko gailu mikrofluidiko baten erabilera frogatzen dugu (txip hibridoa), hesteetako basolateral etengabeko fluxu basolaterala ematen duena, geruza polarizatutako hainbat epitelioaren azpian, geruza polarizatutako epitelioaren azpian, geruza polarizatutako epitelioaren azpian. zelula epitelialak froga daitezke fluxuaren manipulazio noranzkoa aplikatuz konpartimentu basolateraletik morfogenoaren antagonistak kentzeko. Prozedura esperimental osoa (1. irudia) bost atal ditu: (i) hesteetako txiparen mikrofabrikazioa edo Transwell-en txip hibrido txertagarria (1-5 urratsak; 1. koadroa), (ii) hesteetako zelula epitelialak edo giza hesteetako organoideak prestatzea;2-5 laukiak), (iii) hesteetako zelula epitelialen hazkuntza heste txipetan edo txip hibridoetan (6-9 urratsak), (iv) 3D morfogenesiaren indukzioa in vitro (10. urratsa) eta (v) ) 3D epitelioaren mikroegitura karakterizatzeko (11-24 urratsak). morfogenesia teliala kontrol espaziala, denborazkoa, baldintzapekoa edo prozedurazkoetara.
Bi kultura-plataforma ezberdin erabili ditugu: gut-on-a-chip kanal zuzenekin edo lineal ez den kanal bihurriekin, edo Transwell (TW) txertaketak dituzten txip hibridoak gailu mikrofluidiko batean, 1. koadroan deskribatzen den moduan fabrikatuta, eta 1-5 urratsak "Device Fabrication"-ek txip bakarra edo bat egiteko urrats nagusiak erakusten ditu. ) eta protokolo honetan erabiltzen den kultura-prozedura "In vitro morfogenesia"-k Caco-2 edo organoideetatik eratorritako zelula epitelialak hesteetako txip batean edo txip hibrido baten Transwell txertatzeetan hazten diren urrats orokorrak erakusten ditu, ondoren 3D morfogenesiaren indukzioa eta egitura epitelial karakterizatua eratzen. zelula-bereizkuntzaren karakterizazioan, hesteetako fisiologia-azterketetan, ostalari-mikrobioma ekosistemen ezarpenean eta gaixotasunen modelizazioan. "Cell Differentiation"-n immunofluoreszentzia-irudiak erakusten dituzte 3D Caco-2 epitelio-geruzaan adierazitako nukleoak, F-aktina eta hesteetako txipan sortutako geruza epitelialean. Fisiologiak azido sialikoaren eta N-acetilglukosamina hondakinen tindaketaren ondorioz sortutako mocoa erakusten du gari germen aglutinina fluoreszentea erabiliz. "Host-Microbe Co-Cultures"-n gainjarritako bi irudiek ostalari-mikrobioma-ko-kulturak erakusten dituzte txip batean hesteetan. zelula lialak. Eskuineko panelak 3D Caco-2 zelula epitelialekin batera landutako GFP E. coli-ren kokapena erakusten du, eta ondoren F-aktina (gorria) eta nukleoekin (urdinez) immunofluoreszentzia tindaketa. zelulak (adibidez, PBMC;berdea).Caco-2 zelulak hazi ziren 3D geruza epiteliala ezartzeko.Eskala-barra, 50 µm.Beheko lerroko irudiak: "Zelulen bereizketa" erreferentziaren baimenarekin egokituta.2.Oxford University Press;Erref.5.aren baimenarekin erreproduzitua.NAS;“Ostalari-Mikrobio-Kultura” 3. erref.ren baimenarekin egokitua.NAS;“Gaixotasunen eredua” erreferentziaren baimenarekin egokitua.5.NAS.
Bi gut-on-chip eta txip hibridoak PDMS erreplikak erabiliz fabrikatu ziren, siliziozko moldeetatik desmoldeatu ziren litografia bigunaren bidez1,44 eta SU-8-rekin modelatu. Txip bakoitzeko mikrokanalen diseinua hidrodinamika kontuan hartuta zehazten da, hala nola ebakidura-esfortzua eta presio hidrodinamikoa1,4,12. , gut-on-a-chip konplexu batean eboluzionatu da (Datu hedatuak 1b. irudia), mikrokanal kurbatu pare bat barne hartzen dituena, fluidoen egoitza-denbora handitzea, fluxu-eredu ez-linealak eta hazitako zelulen deformazio multiaxial (2a-f. irud.) 12. Heste biomekanika konplexuagoak birsortu behar direnean, heste-biomekanika konplexuagoak frogatu ahal izango ditugu. Gut-Chip bolutuak ere biziki induzitzen du 3D morfogenesia antzeko denbora-markoan, jatorrizko Gut-Chip-arekin alderatuta epitelio-hazkuntza-maila antzekoarekin, hazitako zelula mota edozein dela ere. Hori dela eta, 3D morfogenesia eragiteko, txiparen hesteen diseinu lineal eta konplexuak trukagarriak dira.2a).Txip batean tripa fabrikatzeko, prestatutako goiko PDMS geruza PDMS film porotsu bati sekuentzialki lotu zen eta, ondoren, beheko geruza batekin lerrokatu zen koroa tratatzaile baten bidez lotura itzulezinaren bidez (2b-f. irudia).Txip hibridoak fabrikatzeko, sendatutako PDMS erreplikak beirazko diapositibekin lotu ziren, mikrofluxudun gailu bakarreko transpirazioekin txertatu ahal izateko (2b-f. irudia). Datu hedatuak 2. irudia).Lotura-prozesua PDMS erreplikaren eta beiraren gainazalak oxigeno-plasma edo koroa-tratamenduarekin tratatuz egiten da. Silikonazko hodiari atxikitako mikrofabrikatutako gailua esterilizatu ondoren, gailuaren konfigurazioa prest zegoen heste-epitelioaren 3D morfogenesia egiteko (2g. irudia).
a, SU-8 eredudun siliziozko moldeetatik PDMS piezen prestaketaren ilustrazio eskematikoa. Ondu gabeko PDMS disoluzioa siliziozko molde batera isuri (ezkerrean), 60 °C-tan ondu (erdian) eta desmoldeatu (eskuinean). Desmoldeatutako PDMS zatitan moztu eta gehiago erabili ahal izateko garbitu zen.b, Argazkia. d, Goiko eta beheko PDMS osagaien eta muntatutako txiparen heste-gailuaren argazki sorta.e, Goiko, mintza eta beheko PDMS osagaien lerrokatze eskema. Geruza bakoitza plasma edo koroa tratamenduaren bidez lotzen da atzeraezinean.f, Fabrikatutako gut-on-chip gailuaren eskema. zelula idikoa kultura.Txip batean fabrikatutako tripa silikonazko hodi batekin eta xiringa muntatutako txip baten gainean jarri zen.Txip gailua 150 mm-ko Petri plaka baten estalkian jarri zen prozesatzeko.Lotzailea silikonazko hodia ixteko erabiltzen da.h, Txip hibridoen fabrikazioaren eta 3D morfogenesiaren irudiak eta 3D morfogenesia hesteetako zelula hibridoen txertaketa independentean prestatu ziren zelula hibridoen txertaketa 2D transpotoak. Txip hibridoan sartu da hesteetako 3D morfogenesia eragiteko.Erdibidea Transwell-en txertaketaren gainean ezarritako zelula-geruzaren azpian dagoen mikrokanalen bidez infusioa.Eskala-barra, 1 cm.h Erreferentziaren baimenarekin birinprimatua.4.Elsevier.
Protokolo honetan, Caco-2 zelula-lerroa eta hesteetako organoideak iturri epitelial gisa erabili ziren (3a. irudia).Bi zelula motak modu independentean landu ziren (2. koadroa eta 5. koadroa) eta ECMz estalitako hesteetako edo Transwell-eko txertatzeen mikrokanalak hazitzeko erabili ziren. 50) T-flakoetan biltzen dira tripsinizazio-likidoaren bidez disoziatutako zelulen esekidurak prestatzeko (2. koadroa). Hesteetako biopsia edo erresekzio kirurgikoetako giza hesteetako organoideak Matrigel aldamio-kupuletan hazi ziren 24 putzuko plaketan egiturazko mikroinguruneari eusteko. organoideak ~ 500 µm-ko diametroa izan arte gehitzen zen. Guztiz hazitako organoideak zelula bakarrean biltzen eta banatzen dira txip batean hesteetan edo Transwell-en txertaketetan hazteko (5. koadroa). Lehen jakinarazi dugunez, gaixotasun motaren arabera bereiz daiteke 12,13 (adibidez, ultzerako gunea, minbizia, minbizia, ultzerazio-gunea, gaixotasun kolorikoa edo normala). lesioa versus lesionatu gabeko eremua) eta traktuko kokapen gastrointestinala (adibidez, duodenoa, jejunoa, ileona, zekua, kolona edo ondestea). 5. laukian normalean heste meharreko organoideek baino morfogeno-kontzentrazio handiagoak behar dituzten organoide kolonikoak (koloideak) hazteko protokolo optimizatu bat eskaintzen dugu.
a, Heste-txipan hesteetako morfogenesiaren indukziorako lan-fluxua.Caco-2 giza hesteetako epitelioa eta hesteetako organoideak erabiltzen dira protokolo honetan 3D morfogenesia erakusteko. Isolatutako zelula epitelialak prestatutako gut-on-a-chip gailuan hazi ziren (txiparen prestaketa). (AP) fluxua hasi eta mantentzen da lehen 2 egunetan (fluxua, AP, D0-D2).Basolateral (BL) fluxua luzatze-mugimendu ziklikoekin batera (luzadura, fluxua, AP eta BL) 2D monogeruza osoa eratzen denean ere abiarazten da.Hesteetako 3D morfogenesia berez gertatu zen 5 egunen ondoren mikromorfogenesiaren zelula irudien morfogenesiaren kontraste adierazgarria, D ka5-en irudiak. urrats edo denbora-puntu esperimental bakoitza (barra grafikoa, 100 µm). Lau diagrama eskematiko hesteetako morfogenesiari dagozkion kaskadak (goian eskuinaldean) erakusten dituztenak. Eskemako gezi etenek fluidoaren fluxuaren norabidea adierazten dute.b, SEM irudia, ezarritako 3D Caco-2 epitelioaren gainazaleko topologia erakusten duena (ezkerrean). geruza (eskuinean).c, Ezarritako Caco-2 3D, klaudina (ZO-1, gorria) eta F-aktina (berdea) eta nukleoak (urdina) etiketatutako eskuila etengabeko ertz-mintzen aurrean ikuspegi horizontala. Immunofluoreszentzia zelula epitelialen bistaratze konfokala hesteetako txipetan. Geziek erdiko ikuspegi eskematikorantz seinalatzen duten geziek. d 3., 7., 9., 11. eta 13. egunetan fase-kontraste-mikroskopia bidez lortutako txip batean. Txertaketak (goiko eskuinekoa) emandako irudiaren handitze handia erakusten du.e, 3D epitelio organoidearen DIC fotomikrografia 7.f egunean hartutako xerraren gainean ezarrita dago.magenta), kopako zelulak (MUC2; berdea), F-aktina (grisa) eta nukleoak (ziana) hesteetako txipetan 3 egunez hazitako organoideak, hurrenez hurren (Ezkerrean) eta 13 eguneko (erdian) geruza epitelialean. id epitelioa txip batean hesteetan ezartzen den CellMask koloratzailearekin (eskuinean) kolorazioaz tindatuz.Eskala-barra 50 μm-koa da, bestela adierazi ezean.b Erreferentziaren baimenarekin berrargitaratua.2.Oxford University Press;c Erreferentziaren baimenarekin egokitua.2.Oxford University Press;e eta f erreferentziazko baimenarekin egokituta.12 Creative Commons License CC BY 4.0.
Txip batean hesteetan, beharrezkoa da PDMS mintz porotsuaren gainazal hidrofoboa aldatzea ECM estaldura arrakastatsua izateko. Protokolo honetan, bi metodo desberdin aplikatzen ditugu PDMS mintzen hidrofobikotasuna aldatzeko. Epitelio organoidearen kultura idikoak gainazaleko funtzionalizazioa behar du ECM proteinen deposizio eraginkorra lortzeko PDMS mikrokanaletan polietilenimina (PEI) eta glutaraldehidoa sekuentzialki aplikatuz. Azalera aldatu ondoren, ECM proteinak metatu ziren PDMS funtzionalizatuaren gainazala estaltzeko eta, ondoren, zelulak organoideen epitelioan sartu ziren. bitartekoa goiko mikrokanalera zelulek monogeruza osoa osatzen duten arte, beheko mikrokanalak baldintza estatikoak mantentzen dituen bitartean. Gainazaleko aktibaziorako eta ECM estaldurarako metodo optimizatu honek epitelio organoidearen eransketa ahalbidetzen du PDMS gainazalean 3D morfogenesia eragiteko.
Transwell kulturek ere ECM estaldura behar dute zelulak landatu aurretik;hala ere, Transwell kulturek ez dute aurretratamendu konplexurik behar txertatze porotsuen gainazala aktibatzeko. Transwell txertatzeetan Caco-2 zelulak hazteko, txertatze porotsuen ECM estaldurak Caco-2 zelula disoziatuen eransketa bizkortzen du (ordu <1) eta lotura estuen hesiaren eraketa (<1-2 egun). mintzaren gainazala (<3 h) eta organoideek hesi osoko monogeruza osatu arte mantentzen da. Transwell kulturak 24 putzuko plaketan egiten dira txip hibridorik erabili gabe.
In vitro 3D morfogenesia ezarrita dagoen geruza epitelial baten alderdi basolateralean fluido-fluxua aplikatuz has daiteke. Txip baten hesteetan, morfogenesia epiteliala bitartekoa goiko eta beheko mikrokanaletan perfusatu zenean hasi zen (3a. irudia).Aurretik deskribatu bezala, ezinbestekoa da fluido-fluxua sartzea beheko aldean. mantenugaiak eta seruma mintz porotsuetan loturiko zeluletan eta ebakidura-esfortzu luminala sortzen dute, normalean hesteetan fluxu bikoitza aplikatzen dugu txip batean.Txip hibridoetan, monogeruza epitelialak dituzten Transwell txertaketak txertatzen ziren txip hibridoetan.Ondoren, medioa Transwell txertatze porotsuaren alde basolateralaren azpian aplikatzen zen mikrokanalaren bidez.Hesteetako fluxuaren alboko 3-5 egunetan abiarazi ondoren.
Mikroingeniaritza 3D epitelial geruzen ezaugarri morfologikoak azter daitezke hainbat irudi-modalitate aplikatuz, besteak beste, fase-kontrastearen mikroskopia, interferentzia diferentzialaren kontrastearen (DIC) mikroskopia, SEM edo immunofluoreszentziaren mikroskopia konfokala (3. eta 4. irudiak). PDMS eta poliester filmen gardentasun optikoari dagokionez, gut-on-a-chip nahiz txip hibridoen plataformek denbora errealeko in situ irudiak eskain ditzakete gailua sekzio edo desmuntatu beharrik gabe. Inmunofluoreszentzia irudiak egitean (1, 3c, f eta 4b, c irudiak), zelulak normalean PF/4 paraformatu egiten dira. -100 eta % 2 (wt/vol) ) behi-serum albumina (BSA), ordenaren arabera.Zelula motaren arabera, finkatzaile, iragazkor eta blokeo-agente desberdinak erabil daitezke.Leinuaren menpeko zelula edo eskualde-markatzaileak helburu dituzten antigorputzak erabiltzen dira txipan in situ inmobilizatutako zelulak nabarmentzeko, eta ondoren bigarren mailako antigorputzak kontrataina nukleoarekin batera (d-4-2, midi, midi, 6′, 2′, 6′, 6′, 6′, 6′, 2′, 2. -fenilenoa) indola, DAPI) edo F-aktina (adibidez, fluoreszentziaz markatutako faloidina).Fluoreszentzian oinarritutako zuzeneko irudiak in situ ere egin daitezke muki-ekoizpena detektatzeko (Irudia.1, "Zelulen bereizketa" eta "Hestearen fisiologia"), mikrobio-zelulen ausazko kolonizazioa (1. irudia, "Ostalari-mikrobioen kokultura"), zelula immuneen kontratazioa (1. irudia, 'Gaixotasunaren modelizazioa') edo 3D morfologia epitelialaren ingerada (3c. irudia, geruzatik bereizita) beheko mikrokanal geruza, erreferentzian deskribatzen den moduan.2. Irudian ikusten den bezala, 3D epitelioaren morfologia eta baita eskuila apikalaren ertzean dauden mikrobiloak ere SEM bidez ikus daitezke (3b. irudia).Diferentziazio-markatzaileen adierazpena PCR5 edo zelula bakarreko RNA sekuentziazio kuantitatiboa eginez ebaluatu daiteke. Kasu honetan, zelula hibridoen 3 zelulak hazten dira. tripsinizazioaren bidez lortu eta gero analisi molekular edo genetikorako erabiltzen da.
a, Hesteetako morfogenesiaren indukziorako lan-fluxua txip hibrido batean.Caco-2 eta heste-organoideak erabiltzen dira protokolo honetan 3D morfogenesia frogatzeko txip hibridoen plataforma batean. Zelula epitelial disoziatuak Transwell-en txertatze prestatuetan hazi ziren (TW prep; ikusi beheko irudia). Behin zelulak hazi zirenean (haziak) eta mintz-baldintzetan txertatu ziren zelulak transestatikoetan txertatu ziren. W kultura). 7 egunen buruan, zelula epitelialen 2D monogeruza zuen Transwell txertaketa bakar bat txip hibrido batean integratu zen (Flow, BL) fluxu basolateral bat sartzeko (Flow, BL), eta horrek, azken finean, 3D geruza epitelial bat sortzea ekarri zuen (morfogenesia). .Goiko geruzen eskemak urrats bakoitzeko konfigurazio esperimentala erakusten du.b, Txip hibridoak (ezkerreko eskema) zelula epitelial organoideen 3D morfogenesia ekar dezakete Z posizio ezberdinetan (goiko, erdiko eta beheko) goitik beherako mikroskopio konfokalaren bistarekin;ikusi eskuineko eskema eta dagozkion puntu-lerroak).ezaugarri morfologiko agerikoak erakutsi zituen. F-aktina (ziana), nukleoa (grisa).c, Transwell estatikoetan (TW; marradun koadro zurian txertatuta) hazitako zelula epitelial organoideetatik eratorritako fluoreszentzia-mikrografia konfokalak (3D angelu-ikuspegia) eta txip hibridoa (plano osorik handiena) 2D eta 3D multzo bertikaleko morfologian alderatuz, hurrenez hurren. goiko eskuineko izkinan; "XZ") 2D eta 3D ezaugarriak ere erakusten ditu.Eskala-barra, 100 µm.c Erreferentziaren baimenarekin birinprimatua.4.Elsevier.
Kontrolak zelula berdinak (Caco-2 edo hesteetako zelula epitelial organoideak) bi dimentsioko monogeruzatan haziz presta daitezke ohiko kultura estatikoko baldintzetan. Batez ere, nutrienteen agortzea eragin daiteke mikrokanalen bolumen-ahalmen mugatuaren ondorioz (hau da, ~ 4 µL goiko kanalean jatorrizko heste-txiparen diseinuan).
Litografia biguneko prozesua gela garbi batean egin behar da. Txiparen (goiko eta beheko geruzak eta mintzak) eta txip hibrido bakoitzeko geruza bakoitzerako, fotomaskara desberdinak erabili eta fabrikatu ziren silizio-obletan bereizietan, mikrokanalen altuerak desberdinak zirelako. Txiparen hestearen goiko eta beheko mikrokanalen xede-altuera 500 µm eta txiparen altuera da, hurrenez hurren. µm.
Jarri 3 hazbeteko siliziozko oblea azetona duen plater batean. Birriratu astiro-astiro plaka 30 segundoz, gero airez lehortu oblea. Transferitu oblea IPA duen plaka batera, eta, ondoren, bira ezazu plaka 30 segundoz garbitzeko.
Piraña-disoluzio bat (hidrogeno peroxidoaren eta azido sulfuriko kontzentratuaren nahasketa, 1:3 (vol/vol)) erabil daiteke, aukeran, siliziozko obleen gainazaletik hondakin organikoak kentzea maximizatzeko.
Piranha disoluzioa oso korrosiboa da eta beroa sortzen du. Segurtasun-neurri osagarriak beharrezkoak dira. Hondakinak botatzeko, utzi soluzioa hozten eta hondakin-ontzi garbi eta lehor batera transferitzen.
Deshidratatu obleak 200 °C-ko plaka batean jarriz 10 minutuz. Deshidratatu ondoren, ostia bost aldiz astindu zen airean hozteko.
Jarri ~10 g fotorresistentzia SU-8 2100 garbitutako siliziozko oblearen erdian. Erabili pintzak fotorresistentea oblean uniformeki zabaltzeko. Noizean behin, jarri oblea 65 °C-ko plaka bero batean, fotorresistentea ez dadin itsaskorra eta errazagoa izan dadin. Ez jarri oblea zuzenean plaka beroan.
SU-8 oblean uniformeki banatu zen spin-estaldura exekutatuz. Programatu SU-8aren sarrerako bira bat 5-10 s-tan 500 rpm-an hedatzeko 100 rpm/s-ko azelerazioan. Ezarri biraketa nagusia 200 µm-ko lodiera-eredurako 1.500 rpm-tan (edo lortu µm 5 0 µm-ko altuera bat txiparen hestearen zatia; ikus behean "Urrats kritikoak") 300 rpm/s 30 segundo 1.200 rpm-ko azelerazioan ezarrita.
Biratze-abiadura nagusia silizio-oblean SU-8 ereduaren xede-lodieraren arabera doitu daiteke.
Txiparen goiko geruzaren 500 µm-ko SU-8 ereduak fabrikatzeko, Kutxa honen biraketa-estaldura eta labe leunaren urratsak (7. eta 8. urratsak) sekuentzialki errepikatu ziren (ikus 9. urratsa) 250 µm-ko bi geruza ekoizteko SU-8 geruza lodi bat, UV50 µm 0 µm-ko geruza altuko geruza batekin elkartuz. .
SU-8 estalitako obleak leun labean jarri obleak plaka bero batean 65 °C-tan 5 minutuz, gero ezarpena 95 °C-ra aldatu eta 40 minutu gehiago inkubatu.
Goiko mikrokanaleko SU-8 ereduaren 500 μm-ko altuera lortzeko, errepikatu 7. eta 8. urratsak 250 μm-ko lodierako SU-8 geruza bi sortzeko.
UV Mask Aligner-a erabiliz, egin lanpara-proba bat fabrikatzailearen argibideen arabera oblearen esposizio-denbora kalkulatzeko. (esposizio-denbora, ms) = (esposizio-dosia, mJ/cm2)/(lanpara-potentzia, mW/cm2).
Esposizio-denbora zehaztu ondoren, jarri fotomaskara UV maskararen lerrokagailuaren maskara-euskarrian eta jarri fotomaskara SU-8 estalitako oblean.
Jarri fotomaskararen gainazal inprimatua zuzenean siliziozko oblearen SU-8 estalitako aldean, UV sakabanaketa minimizatzeko.
Erakutsi SU-8 estalitako oblea eta fotomaskara bertikalki 260 mJ/cm2 UV argira aurrez zehaztutako esposizio-denborarako (ikus koadro honetako 10. urratsa).
UV esposizioaren ondoren, SU-8 estalitako siliziozko obleak 65 °C-tan 5 minutuz eta 95 °C-tan 15 minutuz labean jarri ziren plaka bero bakoitzean 200 μm-ko altuera duten ereduak fabrikatzeko. Luzatu 95 °C-tik 30 minutura 500 µm-ko altuera duten ereduak egiteko.
Garatzailea beirazko plater batean isurtzen da eta platerean. SU-8 garatzailearen bolumena aldatu egin daiteke.
Garbitu garatutako moldea ~ 10 ml garatu berriarekin eta IPA ondoren, disoluzioa pipeta batekin ihinztatuz.
Jarri ostia plasma-garbigailu batean eta jarri oxigeno-plasma (atmosferako gasa, xede-presioa 1 × 10−5 Torr, potentzia 125 W) 1,5 min.
Jarri oblea hutseko lehorgailuan, barruan kristalezko diapositiba duela.Obleak eta diapositibak elkarren ondoan jar daitezke. Hutseko lehorgailua plaka baten bidez hainbat geruzatan banatzen bada, jarri diapositibak beheko ganbaran eta obleak goiko ganberan. Jaregin 100 μL trikloro(1H, 2 H, 2 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 2 H, 100 μL trikloro disoluzio gainean eta silanizaziorako hutsa aplikatu.
Desizoztu izoztutako Caco-2 zelulen ontzi bat 37 °C-ko ur-bainu batean, eta, ondoren, desizoztutako zelulak 37 °C aurrez berotutako Caco-2 medio 15 ml dituen T75 matraze batera eraman.
Caco-2 zelulak ~% 90eko konfluentzian pasatzeko, lehenik Caco-2 medioa, PBS eta % 0,25 tripsina/1 mM EDTA berotu 37 ° C-ko ur-bainu batean.
Aspiratu ertaina hutsean aspirazio bidez. Garbitu zelulak bi aldiz 5 ml PBS epelarekin hutseko aspirazioa errepikatuz eta PBS freskoa gehituz.