Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Mikrobioen parasitoen bilakaerak hautespen naturalaren, parasitoak hobetzea eragiten duen eta noraeza genetikoa, parasitoak geneak galtzea eta mutazio kaltegarriak pilatzea eragiten dituenaren arteko kontrajartzea dakar.Hemen, makromolekula bakar baten eskalan kontraeragin hori nola gertatzen den ulertzeko, Encephalitozoon cuniculiren erribosomaren egitura krio-EM deskribatuko dugu, naturako genoma txikienetako bat duen organismo eukariotoa.E. cuniculi erribosometan rRNA-ren muturreko murrizketak aurrekaririk gabeko egitura-aldaketak dakartza, hala nola, orain arte ezezagunak diren rRNA lokailu fusionatuen eta bultorik gabeko rRNAren bilakaera.Gainera, E. cuniculi erribosomak ARNr zatiak eta proteinen galeratik bizirik iraun zuen, molekula txikiak degradatutako rRNA zatien eta proteinen egiturazko imitazio gisa erabiltzeko gaitasuna garatuz.Orokorrean, erakusten dugu aspaldian murrizten, endekatuta eta mutazio ahulgarrien menpe zeuden egitura molekularrek aktibo mantentzen dituzten konpentsazio-mekanismoak dituztela muturreko uzkurdura molekularra izan arren.
Mikrobioen parasitoen talde gehienek tresna molekular bereziak dituztenez ostalariak ustiatzeko, askotan parasito talde ezberdinentzako terapeutika desberdinak garatu behar ditugu1,2.Hala ere, ebidentzia berriek iradokitzen dute parasitoen bilakaeraren alderdi batzuk konbergenteak eta neurri handi batean aurreikus daitezkeela, mikrobioen parasitoetan esku-hartze terapeutiko zabaletarako oinarri potentziala adierazten dutenak3,4,5,6,7,8,9.
Aurretik egindako lanek mikrobioen parasitoen bilakaera-joera komun bat identifikatu dute, genomaren murrizketa edo genomaren desintegrazioa izenekoa10,11,12,13.Gaur egungo ikerketek erakusten dute mikroorganismoek beren bizimodu librea utzi eta zelula barneko parasito (edo endosinbionte) bilakatzen direnean, haien genomak metamorfosi geldo baina harrigarriak jasaten dituztela milioika urtetan9,11.Genomaren desintegrazio izenez ezagutzen den prozesu batean, mikrobioen parasitoek mutazio kaltegarriak pilatzen dituzte, lehen garrantzitsuak ziren gene asko pseudogene bihurtzen dituztenak, gene-galera eta mutazio-kolapsoa pixkanaka eragiten dutenak14,15.Kolapso honek zelula barneko organismo zaharrenen geneen %95eraino suntsitu dezake, oso erlazionatuta dauden bizidun askeko espezieekin alderatuta.Hortaz, zelula barneko parasitoen bilakaera kontrako bi indarren arteko tirabira bat da: hautespen natural darwiniarra, parasitoen hobekuntza dakar, eta genomaren kolapsoa, parasitoak ahanzturara botaz.Parasitoak sokatira horretatik atera eta bere egitura molekularraren jarduerari eustea nola lortu zuen argi dago.
Genomaren desintegrazio-mekanismoa guztiz ulertzen ez den arren, badirudi batez ere maiz desbideratze genetikoaren ondorioz gertatzen dela.Parasitoak populazio txiki, asexual eta genetikoki mugatuetan bizi direnez, ezin dute eraginkortasunez ezabatu DNAren erreplikazioan batzuetan gertatzen diren mutazio kaltegarriak.Horrek mutazio kaltegarrien pilaketa atzeraezina eta parasitoaren genomaren murrizketa dakar.Ondorioz, bizkarroiak ez ditu soilik zelula barneko ingurunean bizirauteko beharrezkoak ez diren geneak galtzen.Parasitoen populazioen ezintasuna da mutazio kaltegarri esporadikoak modu eraginkorrean ezabatzeko mutazio horiek genoma osoan pilatzea eragiten duena, haien gene garrantzitsuenak barne.
Genomaren murrizketari buruzko gaur egungo ulermenaren zati handi bat genomaren sekuentzien konparaketetan oinarritzen da soilik, etxeko funtzioak betetzen dituzten eta sendagai potentzial gisa balio duten benetako molekulen aldaketetan arreta gutxiagorekin.Konparaziozko ikerketek erakutsi dute zelula barneko mikrobio-mutazio kaltegarrien zamak proteinak eta azido nukleikoak gaizki tolestu eta agregatzeko joera duela dirudi, txaperonaren menpekotasun eta beroarekiko hipersentsibilitatea bihurtuz19,20,21,22,23.Gainera, hainbat parasitok —eboluzio independentea batzuetan 2.500 milioi urtez bereizita— kalitatea kontrolatzeko zentroen antzeko galera izan zuten proteina-sintesian5,6 eta DNA konpontzeko mekanismoetan24.Hala ere, ezer gutxi dakigu zelula barneko bizimoduak makromolekula zelularren beste propietate guztietan duen eraginari buruz, mutazio kaltegarrien zama gero eta handiagoari egokitzea barne.
Lan honetan, mikroorganismo zelula barneko proteinen eta azido nukleikoen bilakaera hobeto ezagutzeko, Encephalitozoon cuniculi parasito intrazelularen erribosomen egitura zehaztu dugu.E. cuniculi onddo-itxurako organismo bat da, mikrosporidio parasitoen talde batekoa, ezohiko genoma eukarioto txikia dutenak eta, beraz, organismo eredu gisa erabiltzen direnak genomaren desintegrazioa aztertzeko25,26,27,28,29,30.Berriki, cryo-EM erribosomaren egitura zehaztu zen Microsporidia, Paranosema locustae eta Vairimorpha necatrix31,32 (~ 3,2 Mb genoma) genometan gutxitutako genometarako.Egitura hauek iradokitzen dute ARNrren anplifikazioaren galera bat ondoko proteina erribosomikoen arteko kontaktu berrien garapenarekin edo msL131,32 proteina erribosomiko berrien eskurapenarekin konpentsatzen dela.Espezie Encephalitozoon (genoma ~ 2,5 milioi bp), bere erlatibo hurbileneko Ordospora-rekin batera, eukariotoetan genomaren murrizketa azken maila erakusten dute - 2.000 proteina kodetzen duten gene baino gutxiago dituzte, eta espero da haien erribosomak ez direla soilik rRNA hedapen zatirik (rRNA hedapen-zatirik) (rRNA eukaryomal bakterio erribosoma zatiak bereizten dituzten proteina-zatietatik bereizten dituztenak). s E. cuniculi genoman homologorik ez dutelako26,27,28.Hori dela eta, ondorioztatu dugu E. cuniculi erribosomak genomaren desintegraziorako egokitzapen molekularra ordura arte ezezagunak diren estrategiak ager ditzakeela.
Gure krio-EM egiturak ezaugarritu beharreko erribosoma zitoplasmatiko eukariotorik txikiena adierazten du eta genomaren murrizketa-mailak zelula integrala den makineria molekularraren egituran, muntaian eta eboluzioan nola eragiten duen aztertzen du.E. cuniculi erribosomak RNA tolestearen eta erribosomaren muntaketaren printzipio asko urratzen dituela ikusi genuen, eta orain arte ezezaguna den proteina erribosomiko berri bat aurkitu genuen.Nahiko ustekabean, mikrosporidio erribosomek molekula txikiak lotzeko gaitasuna garatu dutela erakusten dugu, eta hipotesia egiten dugu ARNr eta proteinen tronketek eboluzio-berrikuntzak eragiten dituztela, azken finean erribosomari ezaugarri erabilgarriak eman diezazkioketela.
Zelula barneko organismoetan proteinen eta azido nukleikoen bilakaeraren ulermena hobetzeko, E. cuniculi esporak ugaztun infektatutako zelulen kulturetatik isolatzea erabaki genuen, haien erribosomak arazteko eta erribosoma horien egitura zehazteko.Zaila da mikrosporidio parasito ugari lortzea, mikrosporidioak ezin direlako mantenugai-euskarri batean hazi.Horren ordez, hazi eta ugaltzen dira zelula ostalariaren barruan soilik.Hori dela eta, E. cuniculi erribosomak arazteko biomasa lortzeko, RK13 ugaztunen giltzurruneko zelula-lerroa E. cuniculi esporekin infektatu dugu eta infektatutako zelula horiek hazi eta hazi eta ugaldu ahal izateko hainbat astez landu ditugu.Metro koadro inguruko infektatutako zelula monogeruza bat erabiliz, 300 mg inguru Microsporidia espora arazteko eta erribosomak isolatzeko erabili ahal izan genituen.Ondoren, araztutako esporak beirazko aleekin eten genituen eta erribosoma gordinak isolatu genituen lisatuen polietilenglikol zatikatze mailakatuz.Horri esker, 300 µg gutxi gorabehera E. cuniculi erribosoma gordina lortu genituen egitura-analisirako.
Ondoren, cryo-EM irudiak bildu genituen ondoriozko erribosomaren laginak erabiliz eta irudi horiek prozesatu genituen azpiunitate erribosomiko handiari, azpiunitate txikiari eta azpiunitate txikiari dagozkion maskarak erabiliz.Prozesu horretan, 108.000 partikula erribosomiko inguruko irudiak bildu ditugu eta 2,7 Å-ko bereizmenarekin krio-EM irudiak kalkulatu ditugu (1-3 irudi osagarriak).Ondoren, cryoEM irudiak erabili ditugu E. cuniculi erribosomekin lotutako rRNA, proteina erribosomala eta hibernazio-faktore Mdf1 modelatzeko (1a, b irudiak).
a E. cuniculi erribosomaren egitura Mdf1 hibernazio faktorearekin konplexuan (pdb id 7QEP).b E. cuniculi erribosomarekin lotutako Mdf1 hibernazio faktorearen mapa.c Egitura sekundarioko mapa, mikrosporidio espezieetan berreskuratutako rRNA egitura erribosomiko ezagunekin alderatuz.Panelek anplifikatutako rRNA zatien (ES) eta erribosomaren gune aktiboen kokapena erakusten dute, deskodetzeko gunea (DC), sarcinizinaren begizta (SRL) eta peptidil transferasa zentroa (PTC) barne.d E. cuniculi erribosomaren peptidil transferasa-zentroari dagokion elektroi-dentsitateak iradokitzen du gune katalitiko honek egitura bera duela E. cuniculi bizkarroian eta bere ostalarietan, H. sapiens barne.e, f Deskodetze-zentroaren (e) dagokion elektroi-dentsitateak eta deskodetze-zentroaren egitura eskematikoek (f) adierazten dute E. cuniculi-k A1491 (E. coli zenbaketa) ordez U1491 hondarrak dituela beste eukarioto askotan.Aldaketa honek iradokitzen du E. cuniculi gune aktibo hori helburu duten antibiotikoekiko sentikorra izan daitekeela.
V. necatrix eta P. locustae erribosomen aldez aurretik ezarritako egituren aldean (bi egiturak Nosematidae mikrosporidia familia bera ordezkatzen dute eta elkarren oso antzekoak dira), 31,32 E. cuniculi erribosomek ARNr eta proteina zatikatzeko prozesu ugari jasaten dituzte.Desnaturalizazio gehiago (4-6 irudi osagarriak).rRNAn, aldaketa deigarrienak ES12L 25S rRNA zati anplifikatuaren galera osoa eta h39, h41 eta H18 helizeen endekapen partziala izan ziren (1c. irudia, 4. irudi osagarria).Proteina erribosomikoen artean, aldaketa deigarrienak eS30 proteina erabat galtzea eta eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 eta eS7 proteinak laburtzea izan ziren (4, 5 irudi osagarriak).
Hortaz, Encephalotozoon/Ordospora espezieen genomaren murrizketa izugarria haien erribosomaren egituran islatzen da: E. cuniculi erribosomek egiturazko karakterizaziopean dauden erribosoma zitoplasmatiko eukariotikoetan proteina-edukiaren galerarik nabarmenena jasaten dute, eta ez dituzte eukaryotoen bizi-esparruetan ez ezik, eukaryoteetan ere asko kontserbatzen diren rRNA eta proteina zati horiek.E. cuniculi erribosomaren egiturak aldaketa hauetarako lehen eredu molekularra eskaintzen du eta genomika konparatiboak zein zelula barneko egitura biomolekularraren ikerketek ahaztu dituzten eboluzio-gertaerak erakusten ditu (7. irudi osagarria).Jarraian, gertaera hauetako bakoitza deskribatzen dugu haien eboluzio-jatorri seguruekin eta erribosomaren funtzioan izan dezaketen eraginarekin batera.
Orduan aurkitu genuen, rRNA trunketa handiez gain, E. cuniculi erribosomek rRNA aldaerak dituztela beren gune aktiboetako batean.E. cuniculi erribosomaren peptidil transferasa-zentroak beste erribosoma eukariotoen egitura bera duen arren (1d. irudia), deskodetze-zentroa desberdina da 1491 nukleotidoaren sekuentzia-aldakuntza dela eta (E. coli zenbakikuntza, 1e, f. irudia).Behaketa hau garrantzitsua da erribosoma eukariotoen deskodetze guneak normalean G1408 eta A1491 hondarrak dituelako A1408 eta G1491 bakterio motako hondakinekin alderatuta.Aldakuntza honek erribosoma bakterio eta eukariotoek antibiotiko erribosomikoen aminoglukosidoen familiarekin eta deskodetze gunera bideratzen diren beste molekula txikiekin duten sentsibilitate ezberdinaren azpian dago.E. cuniculi erribosomaren deskodetze gunean, A1491 hondakina U1491-rekin ordezkatu zen, eta, baliteke, gune aktibo honetara zuzendutako molekula txikientzako lotura-interfaze paregabea sortuz.A14901 aldaera bera beste mikrosporidio batzuetan ere badago, hala nola P. locustae eta V. necatrix, mikrosporidia espezieen artean oso hedatuta dagoela iradokitzen du (1f. irudia).
Gure E. cuniculi erribosomaren laginak metabolikoki inaktiboen esporetatik isolatuta zeudenez, E. cuniculiren krio-EM mapa probatu genuen estres edo gosez baldintzetan aldez aurretik deskribatutako erribosomaren loturarako.Hibernazio-faktoreak 31,32,36,37, 38. Hibernazio erribosomaren aldez aurretik ezarritako egitura E. cuniculi erribosomaren krio-EM maparekin parekatu dugu.Atrakatzeko, S. cerevisiae erribosomak Stm138 hibernazio faktorearekin konplexuan erabili ziren, langost erribosomak Lso232 faktorearekin konplexuan eta V. necatrix erribosomak Mdf1 eta Mdf231 faktoreekin konplexuan.Aldi berean, Mdf1 atseden faktoreari dagokion krio-EM dentsitatea aurkitu dugu.Mdf1 V. necatrix erribosomari lotzen zaionaren antzera, Mdf1 E. cuniculi erribosomari ere lotzen zaio, non erribosomaren E gunea blokeatzen duen, ziurrenik parasitoen esporak gorputza inaktibatzen direnean metabolikoki inaktibo bihurtzen direnean erribosomak eskuragarri jartzen lagunduz (2. irudia).).
Mdf1-ek erribosomaren E gunea blokeatzen du, parasitoen esporak metabolikoki inaktibo bihurtzen direnean erribosoma inaktibatzen laguntzen duela dirudi.E. cuniculi erribosomaren egituran, Mdf1-k L1 erribosomaren zurtoinarekin aurrez ezezaguna den kontaktua osatzen duela ikusi dugu, proteinen sintesian zehar erribosomaren tRNA desazilatua askatzea errazten duen erribosomaren zatiarekin.Kontaktu hauek iradokitzen dute Mdf1 erribosomatik disoziatzen dela tRNA desazetilatuaren mekanismo bera erabiliz, erribosomak Mdf1 nola kentzen duen azaltzeko aukera emanez proteinen sintesia berriro aktibatzeko.
Hala ere, gure egiturak Mdf1 eta L1 erribosomaren hankaren arteko kontaktu ezezaguna agerian utzi zuen (proteinen sintesian erribosomaren tRNA desazilatua askatzen laguntzen duen erribosomaren zatia).Bereziki, Mdf1-k tRNA desazilatutako molekularen ukondo-segmentuaren kontaktu berdinak erabiltzen ditu (2. irudia).Orain arte ezezaguna den modelizazio molekular honek erakutsi zuen Mdf1 erribosomatik disoziatzen dela tRNA desazetilatuaren mekanismo bera erabiliz, eta horrek azaltzen du nola kentzen duen erribosomak hibernazio faktore hori proteinen sintesia berriro aktibatzeko.
rRNA eredua eraikitzean, E. cuniculi erribosomak anormalki tolestutako rRNA zatiak dituela ikusi dugu, rRNA fusionatua deitu genion (3. irudia).Bizitzaren hiru domeinuak hartzen dituzten erribosometan, rRNA tolestu egiten da ARNr oinarri gehienak oinarri parekatu eta elkarren artean tolesten diren edo proteina erribosomikoekin elkarreragiten duten egituretan.Hala ere, E. cuniculi erribosometan, badirudi ARNr-ek toleste-printzipio hori urratzen dutela beren helizeetako batzuk ARNr-eskualde tolestuetan bihurtuz.
H18 25S rRNA helizearen egitura S. cerevisiae, V. necatrix eta E. cuniculi-n.Normalean, hiru bizi-domeinuak hartzen dituzten erribosometan, lokailu hau 24 eta 34 hondakin dituen ARN helize batean harilkatzen da.Microsporidia-n, aitzitik, rRNA-ren lokailu hau pixkanaka-pixkanaka 12 hondar baino ez dituzten kate bakarreko uridina aberatseko bi lokailuetara murrizten da.Hondakin horietako gehienak disolbatzaileen eraginpean daude.Irudiak erakusten du mikrosporidio parasitoek rRNA tolestearen printzipio orokorrak urratzen dituztela dirudi, non rRNA oinarriak beste oinarri batzuekin akoplatzen diren edo rRNA-proteinen elkarrekintzetan parte hartzen duten.Mikrosporidioetan, ARNr zati batzuek tolestura desegoki bat hartzen dute, eta bertan, lehengo ARNr helizea kate bakarreko zati bat bihurtzen da ia lerro zuzen batean luzatua.Ezohiko eskualde horien presentziak mikrosporidia rRNA urrutiko rRNA zatiak lotzeko aukera ematen du RNA base kopuru minimo bat erabiliz.
Eboluzio-trantsizio honen adibiderik deigarriena H18 25S rRNA helizean ikus daiteke (3. irudia).E. colitik gizakietaraino dauden espezieetan, ARNr helize honen oinarriek 24-32 nukleotido dituzte, helize irregular samarra osatuz.V. necatrix eta P. locustae-ren aldez aurretik identifikatutako erribosomiko egituretan,31,32 H18 helizearen oinarriak partzialki deserrituta daude, baina nukleotidoen oinarri parekatzea gordetzen da.Hala ere, E. cuniculi-n ARNr zati hori 228UUUUUU232 eta 301UUUUUUUU307 lokailu laburrenak bihurtzen dira.rRNA zati tipikoak ez bezala, uridinatan aberatsak diren lokailu hauek ez dute kiribiltzen edo ez dute kontaktu handirik egiten proteina erribosomikoekin.Horren ordez, disolbatzaile irekiak eta guztiz zabaldutako egiturak hartzen dituzte, zeinetan rRNA kateak ia zuzen hedatzen diren.Konformazio hedatu honek azaltzen du nola E. cuniculik 12 ARN base soilik erabiltzen dituen H16 eta H18 rRNA helizeen arteko 33 Å-ko hutsunea betetzeko, beste espezie batzuek rRNA base bikoitza behar duten bitartean hutsunea betetzeko.
Beraz, froga dezakegu, energetikoki desegokiko tolestearen bidez, mikrosporidio parasitoek estrategia bat garatu dutela bizitzako hiru domeinuetako espezieen artean oso kontserbatuta dauden ARNr-segmentu horiek ere kontratatzeko.Antza denez, rRNA helizeak poli-U lokailu labur bilakatzen dituzten mutazioak metatuz, E. cuniculi-k ezohiko rRNA zatiak sor ditzake, ahalik eta nukleotido gutxien dituztenak rRNA zati distalen lotzeko.Honek mikrosporidiek beren oinarrizko egitura molekularraren murrizketa izugarria nola lortu duten azaltzen laguntzen du, egitura eta osotasun funtzionala galdu gabe.
E. cuniculi rRNAren beste ezaugarri ezohiko bat rRNA loditzerik gabe agertzea da (4. irudia).Bulgeak oinarri-parerik gabeko nukleotidoak dira, ARN helizetik bihurtzen direnak bertan ezkutatu beharrean.rRNA irtengune gehienek itsasgarri molekular gisa jokatzen dute, ondoko proteina erribosomikoak edo beste rRNA zati batzuk lotzen laguntzen baitute.Bultzada batzuek bisagra gisa jokatzen dute, rRNA helizea modu egokian tolestu eta tolestu ahal izateko proteinen sintesia produktiborako 41 .
a ARNr irtengune bat (S. cerevisiae zenbaketa) ez dago E. cuniculi erribosomaren egituratik, baina beste eukarioto gehienetan dago b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens eta E. cuniculi barne erribosometan.bizkarroiek ARNr oso kontserbatutako bults zahar asko falta dituzte.Loditze horiek erribosomaren egitura egonkortzen dute;horregatik, mikrosporidioetan ez egoteak mikrosporidio parasitoetan rRNA tolestearen egonkortasun murriztua adierazten du.P zurtoinekin alderatuz gero (L7/L12 zurtoinak bakterioetan) erakusten du ARNr-ko kolpeen galera batzuetan bat datorrela galdutako kolpeen ondoan kolpe berrien agerpenarekin.23S/28S rRNA-ko H42 helizeak antzinako bultoa du (U1206 Saccharomyces cerevisiae-n) gutxienez 3.500 milioi urtekoa duela, bizitzaren hiru domeinutan babesten duelako.Mikrosporidioetan, bulto hori ezabatzen da.Hala ere, bulto berri bat agertu zen galdutakoaren ondoan (A1306 E. cuniculi-n).
Harrigarria bada ere, aurkitu dugu E. cuniculi erribosomek beste espezie batzuetan aurkitutako rRNA bults gehienak ez dituztela, beste eukariotoetan kontserbatutako 30 bults baino gehiago barne (4a. irudia).Galera honek subunitate erribosomikoen eta ondoko ARNr-helizeen arteko kontaktu asko ezabatzen ditu, batzuetan hutsune handiak sortuz erribosomaren barruan, E. cuniculi erribosoma porotsuagoa bihurtuz erribosoma tradizionalenekin alderatuta (4b. irudia).Nabarmentzekoa, aurkitu genuen bulto horietako gehienak aurretik identifikatutako V. necatrix eta P. locustae erribosoma egituretan ere galdu zirela, aurreko egiturazko analisiek ahaztu gabe31,32.
Batzuetan, rRNA bults galerak bulge berrien garapenarekin batera dator bulge galduaren ondoan.Esaterako, P-zurtoin erribosomikoak U1208 bulto bat dauka (Saccharomyces cerevisiae-n) E. colitik gizakiengana bizirik iraun zuena eta, beraz, 3.500 milioi urte dituela kalkulatzen da.Proteinen sintesian zehar, bulto honek P zurtoina konformazio irekien eta itxien artean mugitzen laguntzen du, erribosomak itzulpen-faktoreak bil ditzan eta gune aktibora helarazteko.E. cuniculi erribosometan, loditze hori ez dago;hala ere, hiru oinarri-paretan bakarrik kokatutako loditze berri batek (G883) P zurtoinaren malgutasun optimoa berreskuratzen lagun dezake (4c. irudia).
Bultzerik gabeko rRNAri buruzko gure datuek iradokitzen dute rRNAren minimizazioa ez dela erribosomaren gainazaleko rRNA elementuak galtzera mugatzen, baizik eta erribosomaren nukleoa ere inplikatu daitekeela, bizi askeko zeluletan deskribatu ez den parasitoaren espezifiko den akats molekular bat sortuz.espezie biziak behatzen dira.
Proteina erribosomiko kanonikoak eta ARNr modelatu ondoren, ohiko osagai erribosomikoak ezin direla azaldu cryo-EM irudiaren hiru zatiak ikusi dugu.Zati hauetako bi molekula txikiak dira (5. irudia, 8. irudi osagarria).Lehenengo segmentua uL15 eta eL18 proteina erribosomikoen artean sartzen da normalean eL18ren C-muturrak hartzen duen posizioan, E. cuniculi-n laburtzen dena.Molekula honen identitatea zehaztu ezin badugu ere, dentsitate-irla honen tamaina eta forma ondo azaltzen da espermidina molekulen presentziak.Erribosomarekin lotzea uL15 proteinen (Asp51 eta Arg56) mikrosporidioen mutazio espezifikoen bidez egonkortzen da, badirudi erribosomak molekula txiki horrekin duen afinitatea areagotzen duela, uL15-ek molekula txikia erribosomiko egitura batean biltzeko aukera ematen baitute.2. irudi osagarria).8, datu gehigarriak 1, 2).
E. cuniculi erribosomari loturiko erribosatik kanpo nukleotidoen presentzia erakusten duen krio-EM irudiak.E. cuniculi erribosoman, nukleotido honek 25S rRNA A3186 nukleotidoaren (Saccharomyces cerevisiae zenbaketa) beste erribosoma eukarioto gehienetan duen leku bera hartzen du.b E. cuniculi-ren egitura erribosomikoan, nukleotido hori uL9 eta eL20 proteina erribosomikoen artean kokatzen da, eta horrela bi proteinen arteko kontaktua egonkortzen da.cd eL20 sekuentziaren kontserbazioaren analisia mikrosporidia espezieen artean.Microsporidia espezieen zuhaitz filogenetikoak (c) eta eL20 proteinaren (d) sekuentzia anizkoitzak lerrokatzeak erakusten du F170 eta K172 nukleotidoak lotzen dituzten hondakinak Microsporidia tipiko gehienetan kontserbatzen direla, S. lophii izan ezik, adarkatze goiztiarra izan ezik, Microsporidia ES39ren hedapena mantendu baitzuen.e Irudi honek erakusten du F170 eta K172 nukleotidoekin lotzeko hondarrak oso gutxitutako mikrosporidioaren genomaren eL20an bakarrik daudela, baina ez beste eukariotoetan.Orokorrean, datu hauek iradokitzen dute Microsporidian erribosomek AMP molekulak lotzen dituela dirudien nukleotidoen lotura gune bat garatu dutela eta proteina-proteinen elkarrekintzak erribosomiko egituran egonkortzeko erabiltzen dituela.Microsporidia-n lotze-gune honen kontserbazio handiak eta beste eukariotoetan ez egoteak iradokitzen du gune honek Microsporidia-ren biziraupenerako abantaila selektiboa eman diezaiokeela.Hortaz, mikrosporidia erribosomaren nukleotidoak lotzen dituen poltsikoa ez dirudi lehen deskribatu bezala ARNraren degradazioaren endekapenezko ezaugarri edo amaierako forma denik, baizik eta eboluzio-berrikuntza baliagarria, mikrosporidia erribosomari molekula txikiak zuzenean lotzea ahalbidetzen diona, eraikuntza molekular gisa erabiliz.erribosomak eraikitzeko blokeak.Aurkikuntza honek mikrosporidia erribosoma erribosoma bakarra da ezagutzen den nukleotido bakarra bere egitura-bloke gisa erabiltzen.f Nukleotidoen loturatik eratorritako eboluzio-bide hipotetikoa.
Bigarren pisu molekular baxuko dentsitatea uL9 eta eL30 proteina erribosomikoen arteko interfazean kokatzen da (5a. irudia).Interfaze hau Saccharomyces cerevisiae erribosomaren egituran deskribatu zen A3186 rRNAren 25S nukleotidoaren (ES39L rRNA luzapenaren parte) lotzeko gune gisa38.P. locustae ES39L erribosom endekatuetan, interfaze honek 31 nukleotido bakar ezezagun bat lotzen duela frogatu zen, eta suposatzen da nukleotido hori rRNAren azken forma murriztua dela, zeinetan ARNraren luzera ~130-230 basekoa den.ES39L nukleotido bakarrera murrizten da 32.43.Gure krio-EM irudiek dentsitatea nukleotidoen bidez azal daitekeen ideia onartzen dute.Hala ere, gure egituraren bereizmen handiagoak erakutsi zuen nukleotido hau erribosomikoaren molekula bat dela, ziurrenik AMP (5a, b irudia).
Orduan galdetu genuen ea nukleotidoen lotura gunea E. cuniculi erribosoman agertzen zen ala lehenago existitzen zen.Nukleotidoen lotura nagusiki eL30 eL30 proteina erribosomikoan Phe170 eta Lys172 hondarrek bideratzen dutenez, 4396 eukarioto adierazgarritan hondakin horien kontserbazioa ebaluatu dugu.Goiko uL15-en kasuan bezala, Phe170 eta Lys172 hondakinak Microsporidia tipikoetan bakarrik oso kontserbatuta daudela ikusi dugu, baina beste eukariotoetan ez dago, Microsporidia Mitosporidium eta Amphiamblys atipikoetan barne, zeinetan ES39L rRNA zatia murrizten ez den 44, 45. Irudia.-e).
Batera hartuta, datu hauek onartzen dute E. cuniculi eta, agian, beste mikrosporidio kanoniko batzuek eboluzionatu dutela eboluzionatu dutela erribosomaren egituran metabolito txiki kopuru handiak modu eraginkorrean harrapatzeko rRNA eta proteina mailaren beherakada konpentsatzeko.Hori horrela, erribosomatik kanpo nukleotidoak lotzeko gaitasun berezia garatu dute, eta frogatu dute egitura molekular parasitoek konpentsatzen dutela metabolito txiki ugari harrapatuz eta degradatutako RNA eta proteina zatien egiturazko imitazio gisa erabiliz..
Gure krio-EM maparen hirugarren zati simulatu gabea, azpiunitate erribosomiko handian aurkitua.Gure maparen bereizmen altu samarrak (2,6 Å) iradokitzen du dentsitate hori albo-kate handien hondakinen konbinazio berezia duten proteinei dagokiola, eta horri esker, dentsitate hori lehendik ezezaguna den proteina erribosomiko gisa identifikatu genuen.Gure homologia bilaketak erakutsi zuen msL2 Encephaliter eta Orosporidium generoko Microsporidia kladean kontserbatzen dela, baina ez dago beste espezie batzuetan, beste Microsporidia batzuen artean.Egitura erribosomikoan, msL2-k ES31L rRNA hedatuaren galerak sortutako hutsune bat hartzen du.Hutsune honetan, msL2-k rRNA tolestura egonkortzen laguntzen du eta ES31L-ren galera konpentsatu dezake (6. irudia).
a E. cuniculi erribosometan aurkitutako msL2 proteina erribosomiko espezifikoko Microsporidia-ren dentsitate elektronikoa eta eredua.b Erribosoma eukarioto gehienek, Saccharomyces cerevisiaeren 80S erribosomak barne, ES19L rRNA anplifikazioa galdu dute Microsporidian espezie gehienetan.V. necatrix microsporidia erribosomaren aldez aurretik ezarritako egiturak iradokitzen du parasito hauetan ES19L galera msL1 proteina erribosomiko berriaren bilakaerarekin konpentsatzen dela.Ikerketa honetan, E. cuniculi erribosomak RNA erribosomiko proteina imitatzaile gehigarri bat ere garatu zuela aurkitu dugu, ES19L galtzearen itxurazko konpentsazio gisa.Dena den, msL2 (gaur egun ECU06_1135 proteina hipotetiko gisa adierazia) eta msL1 jatorri estruktural eta ebolutibo desberdinak dituzte.c Eboluzioari lotuta ez dauden msL1 eta msL2 proteina erribosomikoak sortzearen aurkikuntza honek iradokitzen du erribosomek beren ARNr-an mutazio kaltegarriak pilatzen badituzte, aurrekaririk gabeko konposizio-aniztasun maila lor dezaketela estuki erlazionatutako espezieen azpimultzo txiki batean ere.Aurkikuntza honek erribosom mitokondrialaren jatorria eta eboluzioa argitzen lagun dezake, rRNA oso murriztuagatik eta espezieen arteko proteinen konposizioaren aldakortasun anormalagatik ezaguna dena.
Ondoren, msL2 proteina aurrez deskribatutako msL1 proteinarekin alderatu dugu, V. necatrix erribosoman aurkitzen den mikrosporidiaren berariazko proteina erribosomiko ezagun bakarra.MSL1 eta msL2 eboluzio aldetik erlazionatuta dauden probatu nahi genuen.Gure analisiak erakutsi du msL1 eta msL2 egitura erribosomikoan barrunbe bera hartzen dutela, baina egitura primario eta tertziario desberdinak dituztela, eta horrek eboluzio-jatorri independentea adierazten du (6. irudia).Horrela, msL2-ren aurkikuntzak espezie eukariotiko trinkoen taldeek egituraz bereizten diren proteina erribosomikoak modu independentean eboluzionatu ditzaketela frogatzen du, ARNr zatien galera konpentsatzeko.Aurkikuntza hau nabarmena da erribosoma eukarioto zitoplasmatiko gehienek proteina aldaezin bat dutelako, 81 proteina erribosomiko familia bera barne.rRNA segmentu hedatuen galerari erantzuteko msL1 eta msL2 mikrosporidioen hainbat kladetan agertzeak iradokitzen du parasitoaren arkitektura molekularraren degradazioak parasitoak konpentsazio-mutazioak bilatzea eragiten duela, eta horrek azkenean bizkarroi-populazio ezberdinetan eskuratzea ekar dezakeela.egiturak.
Azkenik, gure eredua osatu zenean, E. cuniculi erribosomaren konposizioa genomaren sekuentziatik aurreikusitakoarekin alderatu genuen.E. cuniculi genomatik hainbat proteina eL14, eL38, eL41 eta eS30 barne, E. cuniculi genomatik falta zirela uste zen, itxuraz E. cuniculi genomako homologorik ez zegoelako.Proteina erribosomiko askoren galera zelula barneko parasito eta endosinbionte oso murriztuetan ere aurreikusten da.Esaterako, aske bizi diren bakterio gehienek 54 proteina erribosomiko familia bera duten arren, proteina-familia horietako 11k bakarrik dituzte homologo detektagarriak ostalariek mugatutako bakterioen genoma bakoitzean.Nozio horren alde, eL38 eta eL4131,32 proteinarik ez duten V. necatrix eta P. locustae microsporidiatan proteina erribosomikoen galera ikusi da esperimentalki.
Hala ere, gure egiturek erakusten dute eL38, eL41 eta eS30 soilik galtzen direla benetan E. cuniculi erribosoman.eL14 proteina kontserbatu zen eta gure egiturak erakutsi zuen zergatik ezin zen proteina hori aurkitu homologia bilaketan (7. irudia).E. cuniculi erribosometan, eL14 lotze gune gehiena galtzen da rRNA-anplifikatutako ES39L degradazioaren ondorioz.ES39L ezean, eL14k bere egitura sekundarioaren zatirik handiena galdu zuen, eta eL14 sekuentziaren % 18 baino ez zen berdin-berdina E. cuniculi eta S. cerevisiae-n.Sekuentziaren kontserbazio eskas hori nabarmena da, Saccharomyces cerevisiae eta Homo sapiens-ek ere —1.500 milioi urterekin eboluzionatu zuten organismoek— eL14n hondakin berberen % 51 baino gehiago partekatzen baitute.Kontserbazio-galera anormal honek azaltzen du zergatik E. cuniculi eL14 gaur egun M970_061160 proteina ustezko gisa aipatzen den eta ez eL1427 proteina erribosomiko gisa.
eta Microsporidia erribosomak ES39L rRNA luzapena galdu zuen, eta horrek partzialki ezabatu zuen eL14 proteina erribosomikoen lotura gunea.ES39L ezean, eL14 mikroespora proteinak egitura sekundarioaren galera jasaten du, eta bertan lehengo rRNA lotzen duen α-helizea luzera minimoko begizta batean degeneratzen da.b Sekuentzia anizkoitzak lerrokatzeak erakusten du eL14 proteina oso kontserbatuta dagoela espezie eukariotoetan (% 57 legamiaren eta giza homologoen arteko sekuentzia-identitatea), baina gaizki kontserbatuta eta dibergentea mikrosporidioetan (hondakinen % 24 baino gehiago ez diren eL14 homologoaren berdinak).S. cerevisiae edo H. sapiens-tik).Sekuentziaren kontserbazio eskas honek eta egitura sekundarioaren aldakortasun horrek azaltzen du zergatik ez den aurkitu eL14 homologoa E. cuniculi-n eta zergatik uste den proteina hori E. cuniculi-n galdu dela.Aitzitik, E. cuniculi eL14 aurretik M970_061160 proteina ustezko gisa adierazi zen.Behaketa honek iradokitzen du gaur egun mikrosporidioen genomaren aniztasuna gehiegi estimatuta dagoela: gaur egun mikrosporidioetan galduta daudela uste den gene batzuk, hain zuzen ere, kontserbatzen dira, forma oso desberdinetan bada ere;aitzitik, batzuek mikrosporidia geneak kodetzen dituzte zizare espezifikoen proteinak (adibidez, M970_061160 proteina hipotetikoak) beste eukariotoetan aurkitzen diren proteina oso anitzak kodetzen dituztela.
Aurkikuntza honek iradokitzen du ARNraren desnaturalizazioak ondoko proteina erribosomikoetan sekuentziaren kontserbazioaren galera ikaragarria ekar dezakeela, proteina horiek homologia-bilaketetarako detektaezinak bihurtuz.Beraz, genoma txikietako organismoen degradazio molekularren benetako gradua gainestimatu dezakegu, izan ere, galtzen zirela uste zen proteina batzuek benetan irauten dute, nahiz eta oso eraldatuetan egon.
Nola eutsi dezakete parasitoek beren makina molekularren funtzioa muturreko genomaren murrizketa baldintzetan?Gure ikerketak galdera honi erantzuten dio E. cuniculiren egitura molekular konplexua (erribosoma) deskribatuz, genoma eukarioto txikienetako bat duen organismoa.
Ia bi hamarkadaz jakin da mikrobioen parasitoetako proteina eta ARN molekulak maiz bereizten direla beren molekula homologoetatik bizi askeko espezieetan, kalitatea kontrolatzeko zentrorik ez dutelako, haien tamainaren % 50era murrizten direlako aske bizi diren mikrobioetan, etab.tolestura eta funtzionamendua kaltetzen duten mutazio ahulgarri asko.Esaterako, genoma txikiko organismoen erribosomek, zelula barneko parasito eta endosinbionte asko barne, hainbat proteina erribosomal eta rRNA nukleotidoen heren bat ez izatea espero da bizi askeko espezieekin alderatuta 27, 29, 30, 49. Hala ere, molekula hauek parasitoetan funtzionatzen duten moduak parasitoen bidez konparatiboki aztertzen jarraitzen du.
Gure ikerketak erakusten du makromolekulen egiturak zelula barneko parasitoen eta ostalarien mugatutako beste organismo batzuen azterketa genomiko tradizionaletatik ateratzeko zailak diren eboluzioaren alderdi asko ager ditzakeela (7. irudi osagarria).Esaterako, eL14 proteinaren adibideak erakusten du espezie parasitoetan aparatu molekularren benetako degradazio-maila gainestimatu dezakegula.Parasito entzefalitikoek ehunka mikrosporidioaren gene espezifiko dituztela uste da.Hala ere, gure emaitzek erakusten dute itxuraz zehatzak diren gene horietako batzuk benetan beste eukariotoetan ohikoak diren geneen aldaera oso desberdinak besterik ez direla.Gainera, msL2 proteinaren adibideak erakusten du nola baztertzen ditugun proteina erribosomiko berriak eta makina molekular parasitoen edukia gutxiesten dugun.Molekula txikien adibideak erakusten du nola alde batera utzi ditzakegun egitura molekular parasitoen berrikuntzarik burutsuenak, jarduera biologiko berria eman dezaketenak.
Batera hartuta, emaitza hauek ostalariek mugatutako organismoen eta bizidun askeetan dauden organismoen egitura molekularren arteko desberdintasunen ulermena hobetzen dute.Erakusten dugu makina molekularrek, aspaldian murriztuak, endekatuak eta hainbat mutazio ahulgarriren menpe zeudenak, sistematikoki ezohiko egitura-ezaugarri multzo bat dutela.
Bestalde, E. cuniculi-ren erribosometan aurkitu ditugun ARNr-zati ez-kopuruek eta zati fusionatuek iradokitzen dute genomaren murrizketak bizitzaren hiru domeinuetan kontserbatzen diren oinarrizko makineria molekularren zatiak ere alda ditzakeela ia 3.500 milioi urteren buruan.espezieen bilakaera independentea.
E. cuniculi erribosometako rRNA bulge-free eta fusionatutako zatiek interes berezia dute bakterio endosinbiotikoetan RNA molekulen aurreko ikerketen argitan.Esaterako, Buchnera aphidicola afido endosinbiontean, ARNr eta tRNA molekulek tenperatura-sentikorrak diren egiturak dituztela frogatu da, A+T konposizio-alborapenagatik eta base-pare ez-kanonikoen proportzio altuagatik20,50.RNAren aldaketa hauek, baita proteina molekulen aldaketak ere, gaur egun endosinbionteek bikotekideekiko duten gehiegizko mendekotasunaren eta endosinbionteen beroa transferitzeko ezintasunaren erantzule direla uste da 21, 23 .Microsporidia parasitoen rRNA egiturazko aldaketak baditu ere, aldaketa horien izaerak iradokitzen du egonkortasun termiko murriztea eta chaperonen proteinen menpekotasun handiagoa izan daitezkeela genoma murriztua duten organismoetan RNA molekulen ezaugarri komunak.
Bestalde, gure egiturek erakusten dute parasitoen mikrosporidiak oso kontserbatutako rRNA eta proteina zatiei aurre egiteko gaitasun berezia garatu dutela, metabolito txiki ugariak eta erraz eskuragarriak erabiltzeko gaitasuna garatuz, endekaturiko ARNraren eta proteina zatien egiturazko imitazio gisa.Egitura molekularraren degradazioa..Iritzi hori onartzen da E. cunicularen ARNr eta erribosometan proteina zatien galera konpentsatzen duten molekula txikiak uL15 eta eL30 proteinen mikrosporidia-hondakin espezifikoekin lotzen direla.Horrek iradokitzen du molekula txikiak erribosomekin lotzea hautapen positiboaren produktua izan daitekeela, zeinetan Microsporidia-ren mutazio espezifikoak erribosomiko proteinetan erribosomak molekula txikiekiko duten afinitatea areagotzeko duten gaitasunagatik hautatu diren, eta horrek organismo erribosomiko eraginkorragoak sor ditzake.Aurkikuntzak mikrobioen parasitoen egitura molekularrean berrikuntza adimenduna erakusten du eta parasitoen egitura molekularrek nola mantentzen duten beren funtzioa eboluzio murrizteko arren hobeto ulertzen digu.
Gaur egun, molekula txiki horien identifikazioa ez dago argi.Ez dago argi erribosomiko egituran molekula txiki horien itxura mikrosporidio espezieen artean zergatik den desberdina.Bereziki, ez dago argi zergatik ikusten den nukleotidoen lotura E. cuniculi eta P. locustaeren erribosometan, eta ez V. necatrix-en erribosometan, V. necatrix-en eL20 eta K172 proteinetan F170 hondarra egon arren.Ezabaketa hori 43 uL6 hondarrak (nukleotidoen lotura-poltsaren ondoan kokatuta) sor dezake, hau da, tirosina V. necatrix-en eta ez treonina E. cuniculi eta P. locustae-n.Tyr43-ren albo-kate aromatiko handiak nukleotidoen lotura oztopatu dezake gainezarpen esterikoaren ondorioz.Bestela, itxurazko nukleotidoen ezabaketa krio-EM irudien bereizmen baxuaren ondoriozkoa izan daiteke, V. necatrix erribosomiko zatien modelizazioa oztopatzen duena.
Bestalde, gure lanak iradokitzen du genomaren desintegrazio prozesua indar asmatzailea izan daitekeela.Bereziki, E. cuniculi erribosomaren egiturak iradokitzen du microsporidia erribosomaren ARNr eta proteina zatiak galtzeak presio ebolutiboa sortzen duela erribosomaren egituran aldaketak sustatzen dituena.Aldaera hauek erribosomaren gune aktibotik urrun gertatzen dira eta badirudi ARNr murriztuak etengo lukeen erribosoma-muntaia optimoa mantentzen (edo berreskuratzen) laguntzen dutela.Honek iradokitzen du mikrosporidia erribosomaren berrikuntza handi bat geneen desbideraketa tamponatzeko beharra bihurtu dela dirudi.
Beharbada, hori hobeto ilustratzen da nukleotidoen loturak, orain arte beste organismoetan inoiz ikusi ez dena.Nukleotidoak lotzeko hondarrak mikrosporidio tipikoetan egoteak, baina ez beste eukariotoetan, iradokitzen du nukleotidoak lotzeko guneak ez direla soilik desagertzeko zain dauden erlikiak, edo rRNAren azken gunea nukleotido indibidualen formara berreskuratzeko.Horren ordez, gune honek aukeraketa positiboaren hainbat txandatan eboluzionatu zezakeen ezaugarri erabilgarria dirudi.Nukleotidoen lotura-guneak hautespen naturalaren azpiproduktu bat izan daitezke: ES39L degradatu ondoren, mikrosporidioak konpentsazioa bilatzera behartzen dira erribosomaren biogenesi optimoa berreskuratzeko ES39L ezean.Nukleotido honek ES39L-n A3186 nukleotidoaren kontaktu molekularrak imita ditzakeenez, nukleotido-molekula erribosomaren eraikuntza-bloke bihurtzen da, eta horren lotura are gehiago hobetzen da eL30 sekuentziaren mutazioaren bidez.
Zelula barneko parasitoen eboluzio molekularrari dagokionez, gure ikerketak erakusten du Darwinen hautespen naturalaren eta genomaren desintegrazio genetikoak ez direla paraleloki funtzionatzen, oszilatzen baizik.Lehenik eta behin, noraeza genetikoak biomolekulen ezaugarri garrantzitsuak ezabatzen ditu, eta konpentsazioa oso beharrezkoa da.Parasitoek hautespen natural darwindarraren bidez behar hori asetzen dutenean bakarrik izango dute beren makromolekulak beren ezaugarri ikusgarri eta berritzaileenak garatzeko aukera.Garrantzitsua da E. cuniculi erribosomako nukleotidoen lotura guneen bilakaerak iradokitzen du eboluzio molekularraren galera-irabazi-eredu honek mutazio kaltegarriak amortizatzen ez ezik, batzuetan makromolekula parasitoei funtzio guztiz berriak ematen dizkiela.
Ideia hori bat dator Sewell Wright-en oreka higigarriaren teoriarekin, zeinak hautespen naturalaren sistema zorrotz batek organismoen berritzeko gaitasuna mugatzen duela dio51,52,53.Hala ere, deriba genetikoak hautespen naturala hausten badu, noraeza horiek berez moldagarriak ez diren (edo kaltegarriak ere) aldaketak sor ditzakete, baina egokitasun handiagoa edo jarduera biologiko berria eskaintzen duten aldaketa gehiago eragin ditzakete.Gure esparruak ideia hori onartzen du biomolekula baten tolestura eta funtzioa murrizten duen mutazio mota bera dela bere hobekuntzaren eragile nagusia dela adieraziz.Irabazi-irabaziaren eboluzio-ereduaren ildotik, gure ikerketak erakusten du genomaren desintegrazioa, tradizioz degenerazio-prozesu gisa ikusia, berrikuntzaren eragile nagusia ere dela, batzuetan eta agian askotan makromolekulei jarduera parasito berriak eskuratzea ahalbidetzen diela.erabil ditzake.