Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.
Hiru diapositibako karrusel bat bistaratzen du aldi berean.Erabili Aurrekoa eta Hurrengoa botoiak aldi berean hiru diapositibatik mugitzeko, edo erabili amaierako graduatzaile-botoiak hiru diapositibatik aldi berean mugitzeko.
Hego-entzefalo-hesiak eta hemato-entzefalo-hesiak agente bioterapeutikoak nerbio-sistema zentraleko helburuetara iristea eragozten du, eta horrela gaixotasun neurologikoen tratamendu eraginkorra oztopatzen dute.Garuneko garraiatzaile berriak in vivo ezagutzeko, T7 fago peptidoen liburutegia sartu genuen eta odola eta likido zerebroespinala (CSF) seriean bildu genituen arratoien igerileku handi kontziente kanulatu baten bidez.Fago-klon espezifikoak oso aberastu ziren CSFn lau hautaketa txandaren ondoren.Banakako peptido hautagaien probak 1000 aldiz baino gehiago aberastea agerian utzi zuen CSFan.Garunerako peptidoen bidezko bidalketaren bioaktibitatea baieztatu zen likido zefalorakizuloko amiloide-β mailaren % 40ko murrizketak identifikatutako igarobide peptido berriarekin lotutako BACE1 peptido inhibitzaile bat erabiliz.Emaitza hauek iradokitzen dute in vivo fagoen hautapen metodoen bidez identifikatutako peptidoak ibilgailu erabilgarriak izan daitezkeela makromolekulak garunera efektu terapeutikoarekin bidaltzeko sistematikoki.
Nerbio-sistema zentraleko (CNS) zuzendutako terapia-ikerketek, neurri handi batean, CNSra bideratzeko propietateak dituzten sendagai optimizatuak eta agenteak identifikatzea bideratu dute, ahalegin gutxiagorekin garunera sendagai aktiboa bidaltzen duten mekanismoak aurkitzean.Hau aldatzen hasi da orain, botiken banaketa, batez ere molekula handiak, neurozientzia modernoko botiken garapenaren zati bat baita.Nerbio-sistema zentraleko ingurunea ondo babestuta dago hesi zerebrobaskularrak, odol-entzefalo-hesiak (BBB) ​​eta hemato-entzefalo-hesiak (BCBB)1 osatuta, eta zaila da drogak garunera ematea1,2.Molekula handietako droga ia guztiak eta molekula txikiko sendagaien %98 baino gehiago garunetik kanporatzen direla kalkulatzen da3.Horregatik, oso garrantzitsua da garuneko garraio-sistema berriak identifikatzea, farmako terapeutikoak CNSra 4,5 efiziente eta zehatzak ematen dituztenak.Hala ere, BBBk eta BCSFBk drogak emateko aukera bikaina ere eskaintzen dute, bere baskulazio zabalaren bidez garuneko egitura guztietan barneratu eta sartzen baitira.Hortaz, garunean entregatzeko metodo ez-inbaditzaileak erabiltzeko gaur egungo ahaleginak BBB6 hartzaile endogenoa erabiliz hartzaileen bidezko garraioaren (PMT) mekanismoan oinarritzen dira neurri handi batean.Transferrinaren hartzaileen bidea erabiliz azken gako aurrerapenak izan diren arren7,8, propietate hobetuak dituzten entrega-sistema berriak garatzea beharrezkoa da.Horretarako, gure helburua LCR garraioaren bitartekaritza egiteko gai diren peptidoak identifikatzea zen, printzipioz CNSra makromolekulak helarazteko edo hartzaile-bide berriak irekitzeko erabil zitezkeelako.Bereziki, sistema zerebrobaskularren hartzaile eta garraiatzaile espezifikoak (BBB eta BSCFB) sendagai bioterapeutikoen entrega aktibo eta espezifikorako helburu potentzial gisa balio dezakete.Zerebroespinal likidoa (CSF) korroide plexusaren (CS) jariatze-produktu bat da eta garuneko likido interstizialarekin zuzeneko kontaktuan dago espazio subaraknoidearen eta espazio bentrikularren bidez4.Duela gutxi frogatu da likido zerebroespinal subaraknoidea gehiegi hedatzen dela garuneko interstiziora9.Espazio parenkimalera sartzea espero dugu subaraknoidearen sarrerako bide hau erabiliz edo zuzenean BBB bidez.Hori lortzeko, in vivo phago hautapen estrategia sendo bat inplementatu dugu, bi bide ezberdin hauetatik garraiatutako peptidoak identifikatzen dituena.
Orain, in vivo phage bistaratzeko metodo sekuentzial bat deskribatzen dugu, CSF laginketarekin, errendimendu handiko sekuentziazioarekin (HTS) bateratuta, liburutegi aniztasun handieneko hasierako hautapen txandak kontrolatzeko.Zisterna handi bat (CM) kanula bat duten arratoi kontzienteei egin zitzaien baheketa, odola kutsatzea saihesteko.Garrantzitsuena, hurbilketa honek garunaren xedea eta hesi zerebrobaskularrean zehar garraio jarduera duten peptidoak hautatzen ditu.T7 fagoak haien tamaina txikiagatik (~60 nm)10 erabili ditugu eta endotelioaren eta/edo epitelio-meduluaren hesiaren zelulaz gaindiko gurutzaketa ahalbidetzen duten besikulen garraiorako egokiak direla iradoki dugu.Lau panning txandaren ondoren, fagoen populazioak isolatu ziren in vivo CSF ​​aberaste indartsua eta garuneko mikro-ontzien elkartea erakutsiz.Garrantzitsuena, gure aurkikuntzak berretsi ahal izan ditugu frogatuz, hobetsitako eta kimikoki sintetizatutako peptido hautagai onenak proteina zama likido zerebroespinalera garraiatzeko gai direla.Lehenik eta behin, CNSren efektu farmakodinamikoak ezarri ziren iraganbideko peptido nagusi bat BACE1 peptidoaren inhibitzaile batekin konbinatuz.In vivo baheketa funtzionalaren estrategiek garun-garraio-peptido berriak proteina-karga-eramaile eraginkor gisa identifikatu ditzaketela frogatzeaz gain, antzeko hautapen funtzionalaren ikuspegiak garrantzitsuak izatea espero dugu garunaren garraio-bide berriak identifikatzeko.
Plaka osatzeko unitateetan (PFU) oinarrituta, fagoen ontziratze-urratsaren ondoren, 109 inguruko aniztasuneko T7 peptido fago lineal ausazko 12-merren liburutegia diseinatu eta sortu zen (ikus Materialak eta metodoak).Garrantzitsua da kontuan izan liburutegi hau arretaz aztertu genuela in vivo panoramika baino lehen.Fago-liburutegiko laginen PCR anplifikazioak abiarazle eraldatuak erabiliz HTSrako zuzenean aplikagarriak ziren anplikonak sortu zituen (1a irudi osagarria).a) HTS11 sekuentziazio akatsak direla eta, b) abiarazleen kalitatean (NNK) 1-12 eragina eta c) basati-mota (wt) fagoak (eskeletoen txertaketak) egoneko liburutegian egoteagatik, sekuentzia iragazteko prozedura bat ezarri zen egiaztatutako sekuentziaren informazioa soilik ateratzeko (1b irudi osagarria).Iragazki-urrats hauek HTS sekuentziazio liburutegi guztietan aplikatzen dira.Liburutegi estandarrari dagokionez, guztira 233.868 irakurketa lortu ziren, eta horietatik % 39k iragazki-irizpideak gainditu zituen eta hurrengo txandetarako liburutegiaren azterketa eta aukeraketa egiteko erabili ziren (1c–e irudi osagarria).Irakurketak 3 base-pareko luzerako multiploak izan ziren nagusiki, 36 nukleotidoko gailurrarekin (1c irudi osagarria), liburutegiaren diseinua (NNK) 1-12 baieztatuz.Nabarmentzekoa, liburutegiko kideen % 11k gutxi gorabehera 12 dimentsioko basati-mota (wt) bizkarrezurra PAGISRELVDKL txertaketa zuen, eta sekuentzien ia erdiek (%49) txertaketak edo ezabaketak zituzten.Liburutegiko liburutegiko HTS-k liburutegiko peptidoen aniztasun handia baieztatu zuen: peptido-sekuentzien % 81 baino gehiago behin bakarrik aurkitu zen eta % 1.5 bakarrik ≥ 4 kopietan gertatu zen (2a irudi osagarria).Errepertorioko 12 posizio guztietan aminoazidoen maiztasunak (aa) ondo erlazionatu ziren NKK errepertorio degeneratuak sortutako kodoi-kopururako espero ziren maiztasunekin (2b irudi osagarria).Txertatze hauek kodetutako aa hondarren maiztasuna ondo erlazionatu zen kalkulatutako maiztasunarekin (r = 0,893) (2c irudi osagarria).Injekziorako fago liburutegiak prestatzeak endotoxina anplifikatzeko eta kentzeko urratsak barne hartzen ditu.Aurretik frogatu da fagoen liburutegien aniztasuna murrizten duela12,13.Hori dela eta, plaka-anplifikatutako fagoen liburutegi bat sekuentziatu genuen, endotoxinak kentzea jasan zuena eta jatorrizko liburutegiarekin alderatu genuen AAren maiztasuna kalkulatzeko.Korrelazio sendoa (r = 0.995) ikusi zen jatorrizko igerilekuaren eta anplifikatutako eta araztutako igerilekuaren artean (2d irudi osagarria), T7 fagoak erabiliz plaketan anplifikatutako klonen arteko lehiak ez zuela alborapen handirik eragin adieraziz.Konparaketa hau liburutegi bakoitzeko motibo tripeptidikoen maiztasunean oinarritzen da, liburutegien aniztasuna (~109) ezin baita guztiz atzeman HTSarekin ere.Posizio bakoitzean aa-ren maiztasun-analisiak posizioaren menpeko alborapen txiki bat agerian utzi zuen sartutako errepertorioko azken hiru posizioetan (2e irudi osagarria).Ondorioz, liburutegiaren kalitatea eta aniztasuna onargarriak zirela ondorioztatu genuen eta aniztasunean aldaketa txikiak baino ez zirela ikusi, hainbat hautaketa-txandaren artean fago-liburutegiak anplifikatu eta prestatzeagatik.
Likido zerebroespinalaren laginketa seriea egin daiteke arratoi kontzienteen CMan kanula bat kirurgikoki ezarriz, zain barnean injektatutako T7 fagoaren identifikazioa errazteko (iv) BBB eta/edo BCSFB bidez (1a-b irudia).Bi hautaketa-beso independente erabili ditugu (A eta B besoak) in vivo hautaketaren lehen hiru txandetan (1c. irudia).Apurka-apurka hautaketaren zorroztasuna areagotu dugu hautaketa-lehen hiru txandetan sartutako fago kopuru osoa murriztuz.Panning laugarren txandan, A eta B adarretako laginak konbinatu ditugu eta hiru hautaketa independente gehiago egin ditugu.Eredu honetan T7 fago partikulen in vivo propietateak aztertzeko, basati-mota (PAGISRELVDKL master insert) arratoietan injektatu zen buztanaren bidez.Likido zerebroespinaleko eta odoletik denbora-puntu desberdinetan fagoak berreskuratzeak T7 fago ikosaedriko nahiko txikiek odol-konpartimentutik hasierako garbiketa-fase azkarra izan zutela erakutsi zuen (3. irudi osagarria).Hartutako tituluen eta arratoien odol-bolumenaren arabera, gutxi gorabehera % 1 pisua bakarrik kalkulatu genuen.administratutako dosiaren fagoa odolean detektatu zen zain barneko injekziotik 10 minutura.Hasierako gainbehera azkar honen ondoren, garbiketa primario motelagoa neurtu zen 27,7 minutuko erdibizitzarekin.Garrantzitsua da, CSF konpartimentutik oso fago gutxi atera zirela, basati motako fagoen migraziorako atzealde baxua adieraziz CSF konpartimentuan (3. irudi osagarria).Batez beste, odolean T7 fagoaren % 1 x 10-3 titulu inguru eta hasieran infusatutako fagoen % 4 x 10-8 baino ez ziren detektatu likido zerebroespinalean laginketa-aldi osoan (0-250 min).Nabarmentzekoa, likido zerebroespinalean basatiaren fagoaren erdi-bizitza (25,7 min) odolean ikusitakoaren antzekoa izan zen.Datu hauek frogatzen dute CSF konpartimendua odoletik bereizten duen hesia osorik dagoela CM-kanulatutako arratoietan, eta horri esker, fago-liburutegiak in vivo aukeratzen dira odoletik erraz garraiatzen diren klonak identifikatzeko.
(a) Igerileku handi batetik likido zerebroespinala (LCR) berriro lagintzeko metodo bat ezartzea.(b) Nerbio-sistema zentralaren (CNS) hesiaren kokapen zelularra eta odol-entzefalo-hesia (BBB) ​​eta hemato-entzefaloaren hesia zeharkatzen dituzten peptidoak identifikatzeko erabilitako hautaketa-estrategia erakusten duen diagrama.(c) In vivo phage pantailaren fluxu-diagrama.Hautaketa txanda bakoitzean, fagoak (gezien barruan dauden animalien identifikatzaileak) injektatzen ziren zain barnean.Bi adar alternatibo independente (A, B) bereizita mantentzen dira 4. hautaketa-txanda arte.3. eta 4. hautapen txandetarako, CSFtik ateratako fago klon bakoitza eskuz sekuentziatu zen.(d) Odoletik (zirkulu gorriak) eta likido zerebroespinaletik (triangelu berdeak) isolatutako fagoaren zinetika bi arratoi kanulatutan hautaketa-eranean T7 peptidoen liburutegiaren (2 x 1012 fago/animalia) zain barnean injektatu ondoren.Karratu urdinek odoleko fagoen batez besteko hasierako kontzentrazioa adierazten dute, injektatutako fago kopurutik kalkulatuta, odol-bolumen osoa kontuan hartuta.Lauki beltzek odol fagoen kontzentrazioetatik estrapolatutako y lerroaren ebaki-puntua adierazten dute.(e,f) Aurkeztu peptidoan aurkitutako motibo tripeptidiko gainjarri posible guztien maiztasun erlatiboa eta banaketa.1000 irakurketetan aurkitutako motibo kopurua erakusten da.Nabarmen (p < 0,001) aberastutako motiboak puntu gorriekin markatzen dira.(e) Korrelazio-sakabanaketa grafikoa, injektatutako liburutegiko motibo tripeptidoaren maiztasun erlatiboa #1.1 eta #1.2 animalien odoletik eratorritako fagoarekin alderatuz.(f) Korrelazio-sakabanaketa grafikoa odolean eta likido zerebroespinalean isolatutako animalia fago-tripeptidoen maiztasun erlatiboak alderatuz #1.1 eta #1.2.(g, h) Odolean aberastutako fagoen sekuentziaren IDaren irudikapena (g) injektatutako liburutegien eta CSFn aberastutako fagoen (h) odolaren aurrean bi animalietan in vivo hautaketa txanda baten ondoren.Letra bakarreko kodearen tamainak adierazten du zenbateko maiztasunarekin gertatzen den aminoazido hori posizio horretan.Berdea = polarra, morea = neutroa, urdina = oinarrizkoa, gorria = azidoa eta beltza = aminoazido hidrofoboak.1a, b irudia Eduard Urich-ek diseinatu eta ekoiztu zuen.
Fago peptidoen liburutegi bat injektatu genuen bi CM instrumentu-arratoitan (A eta B kladeetan) eta likido zefalorrakideotik eta odoletik fago isolatu genuen (1d irudia).Liburutegiaren hasierako garbiketa azkarra ez zen hain nabarmena basati-mota fagoarekin alderatuta.Bi animalietan injektatutako liburutegiaren batez besteko bizitza 24,8 minutukoa izan zen odolean, basati-mota fagoaren antzekoa, eta 38,5 minutukoa CSFan.Animalia bakoitzeko odol- eta likido zefalorrakideoko fago laginak HTS-a jasan zituzten eta identifikatutako peptido guztiak motibo tripeptidiko labur baten presentzia aztertu zuten.Motibo tripeptidikoak aukeratu ziren, egitura eratzeko eta peptido-proteinen arteko elkarrekintzarako oinarri minimoa ematen dutelako14,15.Korrelazio ona aurkitu dugu injektatutako fagoen liburutegiaren eta bi animalien odoletik ateratako klonen arteko motiboen banaketan (1e. irudia).Datuek adierazten dute liburutegiaren konposizioa odol-konpartimentuan bakarrik aberasten dela.Posizio bakoitzean gehiago aztertu ziren aminoazidoen maiztasunak eta adostasun-sekuentziak Weblogo16 softwarearen egokitzapen bat erabiliz.Interesgarria da odoleko glizina-hondakinetan aberastasun handia aurkitu dugu (1g. irudia).Odola CSF-tik hautatutako klonekin alderatu zenean, hautaketa indartsua eta motiboen desautazio batzuk ikusi ziren (1f. irudia), eta aminoazido batzuk lehentasunez 12 kideko posizioetan aurrez zehaztutakoak zeuden (1h. irudia).Nabarmentzekoa, animalia indibidualak nabarmen ezberdintzen ziren likido zerebroespinalean, odoleko glizina aberastea bi animalietan ikusi zen bitartean (4a-j irudi osagarria).#1.1 eta #1.2 animalien likido zerebroespinalean sekuentzia datuen iragazketa zorrotzaren ondoren, guztira 964 eta 420 12-mer peptido esklusibo lortu ziren (1d-e irudi osagarria).Isolatutako fagoen klonak anplifikatu egin ziren eta in vivo hautaketa bigarren txanda bat jasan zuten.Bigarren hautaketa-txandatik ateratako fagoak HTS-a jasan zuten animalia bakoitzean eta identifikatutako peptido guztiak motiboak ezagutzeko programa baten sarrera gisa erabili ziren motibo tripeptidoen agerraldia aztertzeko (2a, b, ef. irudiak).CSF-tik berreskuratutako fagoaren lehen zikloarekin alderatuta, A eta B adarretan CSF-ko motibo askoren hautaketa eta deshautaketa gehiago ikusi genuen (2. irudia).Sarearen identifikazio-algoritmo bat aplikatu zen sekuentzia koherentearen eredu desberdinak irudikatzen zituzten zehazteko.Antzekotasun argia ikusi zen CSF-k berreskuratutako 12 dimentsioko sekuentzien artean A klado alternatiboetan (2c, d) eta B kladean (2g, h irudiak).Adar bakoitzeko analisi bateratuak 12-mer peptidoen hautapen-profil desberdinak agerian utzi zituen (5c, d irudi osagarria) eta denboran zehar CSF/odol tituluaren ratioaren igoera bat klonen bigarren hautaketa txandaren ondoren hautaketa lehen txandarekin alderatuta (5e irudi osagarria).).
Motibo eta peptidoen aberastea likido zerebroespinalean in vivo funtzionalaren bistaratzeko hautapenaren bi txanda jarraian.
Animalia bakoitzaren lehen txandatik (animaliak #1.1 eta #1.2) likido zerebroespinaleko fago guztiak batu, anplifikatu, HT-sekuentziatu eta berriro injektatu ziren (2 x 1010 fago/animalia) 2 SM arratoi kanulatu (#1.1 → #).2.1 eta 2.2, 1.2 → 2.3 eta 2.4).(a,b,e,f) Korrelazio sakabanaketak lehen eta bigarren hautapen txandetan CSFtik eratorritako fago guztien motibo tripeptidoen maiztasun erlatiboa alderatuz.Bi orientazioetako peptidoetan aurkitutako peptido gainjarri posible guztiak adierazten dituzten motiboen maiztasun erlatiboa eta banaketa.1000 irakurketetan aurkitutako motibo kopurua erakusten da.Konparatutako liburutegietako batean nabarmen (p < 0,001) hautatu edo baztertu diren motiboak puntu gorriz nabarmentzen dira.(c, d, g, h) CSFan aberatsak diren 12 aminoazido sekuentzia luze guztien sekuentziaren logotipoaren irudikapena in vivo hautapenaren 2. eta 1. txandetan oinarrituta.Letra bakarreko kodearen tamainak adierazten du zenbateko maiztasunarekin gertatzen den aminoazido hori posizio horretan.Logotipoa irudikatzeko, bi hautaketa-txandaren artean animalia indibidualetatik ateratako CSF ​​sekuentzien maiztasuna konparatzen da eta bigarren txandako sekuentzia aberastuak erakusten dira: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 eta (h) #1.2–#2.4.Posizio jakin batean dauden aminoazidorik aberastuenak (c, d) animalietan ez.2.1 eta zk.2.2 edo (g, h) animalietan ez.2.3 eta ez.2.4 koloretan agertzen dira.Berdea = polarra, morea = neutroa, urdina = oinarrizkoa, gorria = azidoa eta beltza = aminoazido hidrofoboak.
Hirugarren hautaketa txandaren ostean, bi animalietatik isolatutako CSF-k birkonstituitutako 332 fago klonetatik 124 sekuentzia peptidiko berezi identifikatu genituen (6a irudi osagarria).LGSVS (% 18,7) sekuentzia izan zuen proportzio erlatibo handiena, eta ondoren PAGISRELVDKL (% 8,2), MRWFFSHASQGR (% 3), DVAKVS (% 3), TWLFSLG (% 2,2) eta SARGSWREIVSLS (% 2,2) sekuentzia izan zuen.Azken laugarren txandan, hiru animalia ezberdinetatik era independentean hautatutako bi adar batu genituen (1c. irudia).CSFtik berreskuratutako 925 fago klon sekuentziatuetatik, laugarren txandan 64 peptido sekuentzia berezi aurkitu genituen (6b irudi osagarria), eta horien artean basati-mota fagoen proportzio erlatiboa % 0,8ra jaitsi zen.Laugarren txandan CSF klon ohikoenak LYVLHSRGLWGFKLAAALE (%18), LGSVS (%17), GFVRFRLSNTR (%14), KVAWRVFSLFWK (%7), SVHGV (%5), GRPQKINGARVC (%3,6) eta RLSSVDSDLSGC (%3,%) izan ziren.%)).Hautatutako peptidoen luzera tartea liburutegiko abiarazteetan nukleotidoen txertatze/ezabatze edo geldialdi goiztiar kodoiengatik da NNK liburutegiaren diseinurako kodoi endekatuak erabiltzean.Gelditzeko kodoi goiztiarrek peptido laburragoak sortzen dituzte eta aa motibo aldekoa dutelako hautatzen dira.Liburutegi sintetikoen abiarazteetan txertatze/ezabatzeetatik peptido luzeagoak izan daitezke.Honek diseinatutako geldiune-kodoia markotik kanpo kokatzen du eta irakurtzen du geldialdi-kodoi berri bat ibaian behera agertu arte.Oro har, lau hautaketa txandetarako aberastasun-faktoreak kalkulatu ditugu sarrerako datuak laginaren irteerako datuekin alderatuz.Emanaldiaren lehen txandan, basati-motako fago tituluak erabili ditugu atzeko erreferentzia ez-espezifikoa gisa.Interesgarria da, fagoen hautaketa negatiboa oso indartsua izan zen CSF lehen zikloan, baina ez odolean (3a. irudia), hau da, peptido liburutegiko kide gehienek CSF konpartimentuan difusio pasiboaren probabilitate baxuaren ondorioz izan daiteke edo fago erlatiboak bakteriofagoek baino modu eraginkorragoan atxiki edo kendu ohi dituzte odoletik.Hala eta guztiz ere, bigarren txandan, CSF-ko fagoen hautaketa indartsua ikusi zen bi kladeetan, aurreko txanda CSF hartzea sustatzen duten peptidoak erakusten zituzten fagoetan aberastu zela iradokiz (3a. irudia).Berriz ere, odol aberastasun handirik gabe.Hirugarren eta laugarren txandetan ere, fago klonak CSF-n nabarmen aberastu ziren.Sekuentzia peptidiko bakar bakoitzaren maiztasun erlatiboa konparatuz azken bi hautaketa-txanden artean, sekuentziak are gehiago aberastu zirela hautespen txandan aurkitu genuen (3b. irudia).Guztira 931 tripeptido motibo atera ziren 64 peptido sekuentzia bakar guztietatik bi peptido-orientazioak erabiliz.Laugarren txandako motiborik aberastuenak sakonago aztertu ziren txanda guztietan aberaste-profilak injektatutako liburutegiarekin alderatuta (mozketa: % 10eko aberastea) (6c irudi osagarria).Hautaketa-eredu orokorrek erakutsi zuten aztertutako motibo gehienak bi hautaketa-adarretan aurreko txanda guztietan aberastu zirela.Hala ere, motibo batzuk (adibidez, SGL, VSG, LGS GSV) A klado alternatibokoak ziren nagusiki, eta beste batzuk (adibidez, FGW, RTN, WGF, NTR) B klade alternatiboetan aberastu ziren.
Fagoz aberastutako peptidoen eta estreptavidin kargarekin konjugatutako lider peptido biotinilatuen CSF-ren garraioaren balioztatzea.
(a) Lau txandetan (R1-R4) kalkulatutako aberaste-ratioak injektatutako (sarrera = I) fagoen (PFU) tituluetan eta CSF fagoen tituluetan zehaztutako (irteera = O) oinarrituta.Azken hiru txandetako (R2-R4) aberaste-faktoreak aurreko txandarekin eta lehenengo txandarekin (R1) pisu datuekin alderatuz kalkulatu dira.Barra irekiak likido zerebroespinala dira, barra itzaldunak plasma.(***p<0,001, Student-en t-testan oinarrituta).(b) Fago-peptido ugarienen zerrenda, hautaketaren 4. txandaren ondoren CSFn bildutako fago guztien proportzio erlatiboaren arabera sailkatuta.Sei fago-klon ohikoenak kolorez, zenbakiz eta haien aberaste-faktoreak nabarmentzen dira hautapeneko 3. eta 4. txanden artean (txertaketak).(c, d) 4. txandako sei fago klon aberastuenak, fago hutsak eta gurasoen peptidoen liburutegiak banan-banan aztertu ziren CSF laginketa-eredu batean.LCR eta odol laginak adierazitako denbora-puntuetan jaso ziren.(c) 6 fago klon hautagaien (2 x 1010 fago/animalia), fago hutsak (#1779) (2 x 1010 fago/animalia) eta stock fago peptidoen liburutegiak (2 x 1012 fago/animalia).Injektatutako fago klon bakoitzaren eta fago peptidoen liburutegiaren CSF farmakokinetika denboran zehar erakusten da.(d) laginketa-denboran zehar berreskuratutako fago/mL guztien CSF/odol ratioa erakusten du.(e) Lau lider peptido sintetiko eta nahasitako kontrol bat biotinarekin estreptavidinarekin lotu ziren euren N-mugarraren bidez (tetramer display) eta ondoren injekzioarekin (buztan zaina iv, 10 mg estreptavidin/kg).Gutxienez hiru arratoi intubatu (N = 3).).CSF laginak adierazitako denbora puntuetan bildu ziren eta estreptabidina-kontzentrazioa CSF anti-streptavidin ELISA bidez neurtu zen (nd = ez da detektatu).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA proban oinarrituta).(f) 2002 #2002 (morea) fago peptidoen klon aberastuenaren aminoazidoen sekuentziaren 4. hautapen txandako hautatutako beste fago peptido klon batzuekin alderatzea.Aminoazido zati berdinak eta antzekoak kolorez kodetzen dira.
Laugarren txandan aberastutako fago guztien artean (3b. irudia), sei klon hautagai aukeratu ziren CSF laginketa ereduan banakako azterketa gehiago egiteko.Sei fago hautagai, fago huts (txertatu gabe) eta propago peptido liburutegien kantitate berdinak injektatu ziren CM kanulatutako hiru animalitan, eta CSF (3c. irud.) eta odoleko (7. irudi osagarria) entseguetan farmakokinetika zehaztu zen.Probatutako fago-kloni guztiek CSF konpartimentua kontrol-fago hutsarena baino 10-1000 aldiz handiagoa izan zuten (#1779).Adibidez, # 2020 eta # 2077 klonek kontrol fagoak baino 1000 aldiz CSF titulu handiagoak izan zituzten.Hautatutako peptido bakoitzaren profil farmakokinetikoa desberdina da, baina guztiek dute CSF homing gaitasun handia.#1903 eta #2011 klonetan etengabeko beherakada bat ikusi dugu denboran zehar, eta #2077, #2002 eta #2009 klonetan, berriz, lehenengo 10 minutuetan igotzeak garraio aktiboa adieraz dezake baina egiaztatu beharra dago.#2020, #2002 eta #2077 klonak maila altuetan egonkortu ziren, eta #2009 klonaren CSF kontzentrazioa pixkanaka gutxitu zen hasierako igoeraren ondoren.Ondoren, CSF hautagai bakoitzaren maiztasun erlatiboa bere odol-kontzentrazioarekin alderatu dugu (3d. irudia).CSF hautagai bakoitzaren batez besteko tituluaren korrelazioak bere odol-tituluarekin laginketa-aldi guztietan erakutsi zuen sei hautagaietatik hiru odol-CSFn nabarmen aberastu zirela.Interesgarria da # 2077 klonak odol-egonkortasun handiagoa erakutsi zuela (7. irudi osagarria).Peptidoek beraiek fago-partikulak ez diren karga aktiboki garraiatzeko gai direla CSF konpartimentura baieztatzeko, biotinarekin deribaturiko lau peptido lider sintetizatu ditugu peptidoak fago-partikulari atxikitzen zaizkion N-muturrean.Peptido biotinilatuak (2002, 2009, 2020 eta 2077 zk.) estreptavidinarekin (SA) konjokatu ziren, fagoen geometria nolabait imitatzen duten forma multimerikoak lortzeko.Formatu horri esker, odolean eta likido zerebroespinalean SA esposizioa neurtu ahal izan genuen, zama garraiatzeko proteina peptido gisa.Garrantzitsuena, fagoen datuak sarritan erreproduzitu zitezkeen peptido sintetikoak SA-konjugatutako formatu honetan administratzen zirenean (3e. irudia).Nahasitako peptidoek hasierako esposizio txikiagoa eta CSF garbiketa azkarragoa izan zuten 48 orduko epean maila hautemanezinekin.Peptido fago klon hauen CSF espazioan bidaltzeko bideak ezagutzeko, fago peptidoen hit indibidualen kokapena aztertu dugu immunohistokimika (IHC) erabiliz, fago-partikulak zuzenean detektatzeko in vivo 1 ordu barruko injekzio ondoren.Nabarmentzekoa, # 2002, # 2077 eta # 2009 klonak garuneko kapilaretan tindaketa indartsuaren bidez antzeman zitezkeen, kontrol-fagoa (# 1779) eta # 2020 klona detektatu ez ziren bitartean (8. irudi osagarria).Horrek iradokitzen du peptido hauek garuneko eraginari laguntzen diotela BBB zeharkatuz.Hipotesi hau egiaztatzeko azterketa zehatz gehiago behar da, BSCFB ibilbideak ere parte hartu dezakeelako.Klon aberastuenaren (#2002) aminoazidoen sekuentzia aukeratutako beste peptido batzuekin alderatzean, haietako batzuek antzeko aminoazidoen luzapenak dituztela ohartu da, eta horrek antzeko garraio-mekanismoa adieraz dezake (3f. irudia).
Plasma-profil bereziagatik eta denboran zehar CSF-ren igoera esanguratsua dela eta, 2077 fagoen pantailako klona gehiago aztertu zen 48 orduko aldi luzeagoan eta SA maila iraunkorrarekin batera ikusitako CSF-ren hazkunde azkarra erreproduzitzeko gai izan zen (4a. irudia).Identifikatutako beste fago klonei dagokienez, # 2077 garuneko kapilarrentzako oso zikindu zen eta lektina markatzaile kapilarrarekin kokalizazio garrantzitsua erakutsi zuen bereizmen handiagoan ikusita eta baliteke parenkimako espazioan tindaduraren bat (4b irudia).CNSn peptido bidezko efektu farmakologikoak lor zitezkeen ikertzeko, esperimentu bat egin genuen, zeinetan i) #2077 transito peptidoaren eta ii) BACE1 peptido inhibitzailearen bertsio biotinilatuak bi proportzio ezberdinetan nahasten ziren SArekin.Konbinazio baterako BACE1 peptido inhibitzailea bakarrik erabili dugu eta besterako BACE1 peptido inhibitzailearen eta #2077 peptidoaren 1:3 proportzioa erabili dugu.Bi laginak zain barnean eman ziren eta 40 beta-amiloide peptidoaren (Abeta40) odol eta likido zerebroespinalaren mailak neurtu ziren denboran zehar.Abeta40 CSFn neurtu zen, BACE1 inhibizioa garuneko parenkiman islatzen duelako.Espero zen bezala, bi konplexuek Abeta40-ren odol-maila nabarmen murriztu zuten (4c, d. irudia).Hala ere, peptidoaren nahasketa bat duten laginak bakarrik.2077 eta SArekin konjokaturiko BACE1 peptidoaren inhibitzaile batek Abeta40-ren beherakada nabarmena eragin zuen likido zerebroespinalean (4c. irudia).Datuek erakusten dute peptido ez.2077 gai da 60 kDa SA proteina CNSra garraiatzeko eta BACE1 peptidoaren SA-konjugatutako inhibitzaileekin efektu farmakologikoak ere eragiten ditu.
(a) T7 fagoaren injekzio klonala (2 × 10 fago/animalia) CSF peptidoaren #2077 (RLSSVDSDLSGC) eta injektatu gabeko kontrol fagoaren (#1779) epe luzerako profil farmakokinetikoak erakusten dituena CM-n intubatutako hiru arratoitan.(b) Fagoak injektatutako arratoietan (2 × 10 10 fago/animalia) mikrohodi kortiko adierazgarrien irudi mikroskopiko konfokala, 2077 peptidoaren eta ontzien kontrako tindaketa erakusten duena (lectina).Fago-klon hauek 3 arratoiri eman zizkieten eta perfusioa baino ordubetez zirkulatzen utzi zuten.Garunak sekzionatu eta T7 fago kapsidearen aurkako FITC markatutako antigorputz poliklonalekin tindatu ziren.Perfusioa eta ondorengo finkapena baino hamar minutu lehenago, DyLight594 markatutako lektina administratu zen zain barnean.Mikrohodien eta fagoen alde luminalaren (berdea) lectina tindaketa (gorria) erakusten duten irudi fluoreszenteak kapilarren eta garuneko ehun peribaskularren lumenean.Eskala-barra 10 µm-ri dagokio.(c, d) BACE1 peptido inhibitzaile biotinilatua bakarrik edo #2077 peptido biotinilatuarekin konbinatuta estreptavidinarekin akoplatu zen eta ondoren gutxienez hiru CM arratoi kanulatu (10 mg streptavidin/kg) barneko injekzioarekin.BACE1 peptidoaren inhibitzaileak Aβ40-ren murrizketa Aβ1-40 ELISA bidez neurtu zen odolean (gorria) eta likido zerebroespinalean (laranjan) adierazitako uneetan.Argitasun hobea lortzeko, puntu-lerro bat marrazten da grafikoan %100eko eskalan.(c) Aβ40-aren ehuneko murrizketa odolean (triangelu gorriak) eta likido zerebroespinalean (triangelu laranjak) #2077 peptidoarekin konjugatuta eta BACE1 peptido inhibitzailearekin tratatutako arratoietan 3:1 proportzioan.(d) BACE1 peptido inhibitzaile bati soilik akoplatutako estreptavidinarekin tratatutako arratoien odol Aβ40 (zirkulu gorriak) eta likido zerebroespinal (zirkulu laranja) murrizketa ehunekoa.Kontroleko Aβ kontzentrazioa 420 pg/ml izan zen (desbideratze estandarra = 101 pg/ml).
Phage display arrakastaz aplikatu da ikerketa biomedikoko hainbat arlotan17.Metodo hau in vivo dibertsitate baskularra aztertzeko18,19 eta garun-hodiei zuzendutako azterketetarako erabili izan da20,21,22,23,24,25,26.Ikerketa honetan, hautaketa-metodo honen aplikazioa, garun-hodietara zuzendutako peptidoen identifikazio zuzena ez ezik, hemato-entzefalo-hesia zeharkatzeko garraio-propietate aktiboa duten hautagaiak aurkitzera ere zabaldu dugu.Orain CM intubatutako arratoietan in vivo hautaketa prozedura baten garapena deskribatzen dugu eta CSF homing propietateak dituzten peptidoak identifikatzeko duen potentziala frogatzen dugu.12-mer ausazko peptidoen liburutegia erakusten duen T7 fagoak erabilita, frogatu ahal izan dugu T7 fagoa nahikoa txikia dela (60 nm-ko diametroa)10 odol-entzefalo-hesira egokitzeko, eta, horrela, odol-entzefalo-hesia edo koroide-plexua zuzenean zeharkatuz.Kanulatutako CM arratoietatik CSF bilketa ondo kontrolatutako in vivo baheketa-metodo funtzional bat zela ikusi genuen, eta ateratako fagoak baskulatura lotzen ez ezik, odol-entzefaloaren hesian zehar garraiatzaile gisa ere funtzionatzen zuela ikusi genuen.Gainera, aldi berean odola bilduz eta HTS CSF-i eta odoletik eratorritako fagoei aplikatuz, gure CSF-aren aukerak ez zuela odolaren aberastearen eraginik edo hautaketa errondaren artean hedatzeko gaitasunak baieztatu genuen.Hala ere, odol-konpartimentua hautaketa-prozeduraren parte da, CSF konpartimentura iristeko gai diren fagoek bizirik iraun behar baitute eta odolean zirkulatu behar baitute garunean aberasteko adina denbora.HTS datu gordinetatik sekuentzia-informazio fidagarria ateratzeko, plataformako sekuentziazio-erroreei egokitutako iragazkiak ezarri ditugu analisi-fluxuan.Baheketa-metodoan parametro zinetikoak sartuz, T7 fago basatien (t½ ~ 28 min) farmakozinetika azkarra baieztatu dugu odolean24, 27, 28 eta, gainera, haien erdi-bizitza zehaztu dugu likido zerebroespinalean (t½ ~ 26 min) minutuko).Odolean eta CSFn antzeko profil farmakokinetikoak izan arren, fagoen odol-kontzentrazioaren % 0,001 bakarrik detektatu ahal izan zen LCR-n, T7 fago basatiaren atzeko planoko mugikortasun baxua adieraziz odol-entzefaloaren hesian zehar.Lan honek lehen hautaketaren garrantzia azpimarratzen du in vivo panning estrategiak erabiltzean, batez ere zirkulaziotik azkar kentzen diren fago-sistemetarako, klon gutxi baitira CNS konpartimentura iristeko gai.Horrela, lehen txandan, liburutegi-aniztasunaren murrizketa oso handia izan zen, azkenean klon kopuru mugatu bat bakarrik bildu baitzen CSF eredu oso zorrotz honetan.In vivo panning estrategia honek hainbat hautaketa-urrats barne hartzen zituen, hala nola CSF konpartimentuan metaketa aktiboa, odol-konpartimentuan klonen biziraupena eta odoletik T7 klonoak azkar kentzea lehen 10 minutuetan (1d. irudia eta 4M irudi osagarria).).Horrela, lehenengo txandaren ostean, Fgo-klon desberdinak identifikatu ziren LK-an, nahiz eta hasierako igerileku bera animalia indibidualentzat erabili.Horrek iradokitzen du liburutegiko kide kopuru handia duten iturri-liburutegietarako hautaketa-pauso zorrotz anitzek aniztasunaren murrizketa nabarmena eragiten dutela.Hori dela eta, ausazko gertaerak hasierako hautaketa-prozesuaren osagai bihurtuko dira, eta emaitzan eragin handia izango dute.Litekeena da jatorrizko liburutegiko klon askok CSF aberasteko joera oso antzekoa izatea.Hala ere, baldintza esperimental berdinetan ere, hautaketaren emaitzak desberdinak izan daitezke hasierako multzoan klon jakin bakoitzaren kopuru txikia dela eta.
CSFan aberastutako motiboak odolean daudenetatik desberdinak dira.Interesgarria da animalia indibidualen odolean glizinan aberatsak diren peptidoetarako lehen aldaketa nabaritu dugula.(1g. irudia, 4e, 4f irudi osagarriak).Glizina peptidoak dituzten fagoak egonkorragoak izan daitezke eta zirkulaziotik ateratzeko aukera gutxiago.Hala ere, glizinan aberatsak diren peptido hauek ez ziren detektatu likido zerebroespinalaren laginetan, eta horrek iradokitzen du komisariotako liburutegiek bi hautaketa-pauso ezberdin igaro zirela: bata odolean eta beste bat likido zerebroespinalean metatzen utzi zuten.Laugarren hautaketa-txandaren ondoriozko CSF-aberastutako klonak proba ugari egin dira.Banaka probatutako klon ia guztiak CSFn aberastuta daudela baieztatu zen kontrol-fago hutsarekin alderatuta.Peptidoen arrakasta bat (#2077) zehatzago aztertu zen.Plasma-erdi-bizitza luzeagoa erakutsi zuen beste hit batzuekin alderatuta (3d irudia eta 7. irudi osagarria), eta interesgarria da peptido honek zisteina-hondakin bat zuen C-muturrean.Duela gutxi frogatu da peptidoei zisteina gehitzeak haien propietate farmakokinetikoak hobetu ditzakeela albuminarekin lotuz 29 .Gaur egun ez da ezagutzen 2077 peptidoarentzat eta azterketa gehiago behar du.Peptido batzuek balentzia-mendekotasuna erakutsi zuten CSF aberastean (datuak ez dira erakusten), eta hori T7 kapsidaren bistaratutako gainazaleko geometriarekin lotuta egon daiteke.Erabili dugun T7 sistemak peptido bakoitzaren 5-15 kopia erakusten ditu fago partikula bakoitzeko.IHC arratoien garun-kortexean zain barnean injektatutako klon beruneko fago hautagaietan egin zen (8. irudi osagarria).Datuek erakusten zuten gutxienez hiru klonek (2002. zenbakia, 2009. zenbakia eta 2077. zenbakia) BBBrekin elkarreragin zutela.Zehazteke dago BBB interakzio honek CSF metatzea edo klon hauek zuzenean BCSFBra mugitzea eragiten duen.Garrantzitsua denez, hautatutako peptidoek CSF garraiatzeko ahalmena mantentzen dutela erakusten dugu sintetizatzen direnean eta proteina zamarekin lotzen direnean.N-terminaleko peptido biotinilatuak SArekin lotzeak, funtsean, dagozkien fago-kloniekin lortutako emaitzak errepikatzen ditu odolean eta likido zerebroespinalean (3e. irudia).Azkenik, erakusten dugu # 2077 berunezko peptidoa gai dela SA-rekin konjugatutako BACE1 peptido biotinilatuaren inhibitzaile baten garuneko ekintza sustatzeko, CNSn efektu farmakodinamiko nabarmenak eragiten dituela CSFan Abeta40 mailak nabarmen murriztuz (4. irudia).Ezin izan dugu datu-basean homologorik identifikatu hit guztien sekuentzia peptidikoen homologia bilaketa bat eginez.Garrantzitsua da T7 liburutegiaren tamaina 109koa dela gutxi gorabehera, eta 12-merren liburutegiaren tamaina teorikoa 4 x 1015ekoa den bitartean. Hori dela eta, 12-mer peptidoen liburutegiaren aniztasun-espazioaren zati txiki bat bakarrik hautatu genuen, eta horrek esan nahi du peptido optimizatuagoak identifikatu daitezkeela ondoko sekuentzia horien ondoko sekuentzia-espazioa ebaluatuz.Hipotetikoki, peptido horien homologo naturalik aurkitu ez dugun arrazoietako bat eboluzioan zehar desautazioa izan daiteke, motibo peptidiko batzuk garunean kontrolik gabe sar ez daitezen.
Batera hartuta, gure emaitzek etorkizuneko lanetarako oinarria eskaintzen dute in vivo hesi zerebrobaskularren garraio-sistemak xehetasun gehiagorekin identifikatu eta ezaugarritzeko.Metodo honen oinarrizko konfigurazioa hautaketa-estrategia funtzional batean oinarritzen da, eta horrek garun hodietako lotura-propietateak dituzten klonak identifikatzen ez ezik, urrats kritiko bat ere barne hartzen du, non klon arrakastatsuek berezko jarduera duten hesi biologikoak in vivo CNS konpartimentuan zeharkatzeko.peptido horien garraio-mekanismoa eta garuneko eskualdeko mikrobaskulaturari lotzeko duten lehentasuna argitzea da.Horrek BBB eta hartzaileen garraiorako bide berriak aurki ditzake.Identifikatutako peptidoak zuzenean lotu daitezkeela hartzaile zerebrobaskularretara edo BBB edo BCSFB bidez garraiatutako ligando zirkulatzaileetara.Lan honetan aurkitutako CSF ​​garraio-jarduera duten bektore peptidikoak gehiago ikertuko dira.Une honetan peptido hauen garuneko espezifikotasuna ikertzen ari gara BBB edo/edo BCSFB zeharkatzeko duten gaitasunagatik.Peptido berri hauek tresna oso baliotsuak izango dira errezeptore edo bide berrien aurkikuntzarako eta makromolekulak, biologikoak, esaterako, garunera bidaltzeko plataforma oso eraginkorrak garatzeko.
Kanulatu zisterna handia (CM) aurretik deskribatutako metodoaren aldaketa erabiliz.Wistar arratoi anestesiatuak (200-350 g) aparatu estereotaxiko batean muntatu ziren eta erdiko ebakidura bat egin zen bizartutako eta aseptikoki prestatutako scalparen gainean garezurra agerian uzteko.Zulatu bi zulo goiko aldean eta finkatzeko torlojuak zuloetan.Alboko okzipitalean zulo gehigarri bat egin zen altzairu herdoilgaitzezko kanula baten gidaritza estereotaktikorako CMra.Aplikatu hortz zementua kanularen inguruan eta lotu torlojuekin.Foto-sendotu eta zementua gogortu ondoren, azaleko zauria 4/0 supramid suturarekin itxi zen.Kanularen kokapen egokia egiaztatzen da likido zerebroespinalaren (LCR) berezko isuriaren bidez.Kendu arratoia aparatu estereotaxikotik, jaso ebakuntza ondoko arreta eta minaren kudeaketa egokiak eta gutxienez astebetez sendatzen utzi, likido zerebroespinalean odol-zantzuak ikusi arte.Wistar arratoiak (Crl:WI/Han) Charles River-etik (Frantzia) lortu ziren.Arratoi guztiak patogenorik gabeko baldintza zehatzetan mantendu ziren.Animalien esperimentu guztiak Suitzako Basileako Udaleko Albaitaritza Bulegoak onartu zituen eta 2474 zk. Animalien Lizentziaren arabera egin ziren (Gamuinaren Garraio Aktiboaren Ebaluazioa Hautagai Terapeutikoen Mailak Neurtuz Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Mantendu astiro-astiro arratoia kontziente CM kanula eskuan duela.Kendu Datura kanulatik eta bildu 10 µl berez isurtzen den likido zerebroespinal.Azken finean kanularen permeabilitatea arriskuan jarri zenez, odol-kutsadura edo kolore-kolorearen frogarik ez zuten likido zerebroespinal laginak bakarrik sartu ziren ikerketa honetan.Aldi berean, buztanaren puntako ebakidura txiki batetik 10-20 μl odol hartu ziren heparina zuten hodietara (Sigma-Aldrich).LCR eta odola hainbat momentutan bildu ziren T7 fagoaren zain barneko injekzioaren ondoren.Gutxi gorabehera 5-10 μl fluido bota ziren CSF lagin bakoitza jaso aurretik, kateterraren hildako bolumenari dagokiona.
Liburutegiak T7Select 10-3b bektorea erabiliz sortu ziren T7Select sistemaren eskuliburuan (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) azaltzen den moduan.Laburbilduz, ausazko 12-mer DNA txertaketa bat sintetizatu zen formatu honetan:
NNK kodoia txertatzean geldialdi bikoitzeko kodoiak eta aminoazidoen gainespresioa saihesteko erabili zen.N nukleotido bakoitzaren eskuz nahastutako erlazio ekimolarra da, eta K adenina eta zitosina nukleotidoen eskuz nahastutako erlazio ekimolarra da.Kate bakarreko eskualdeak kate bikoitzeko DNA bihurtu ziren dNTP (Novagen) eta Klenow entzimarekin (New England Biolabs) Klenow tamponean (New England Biolabs) 3 orduz 37 °C-tan inkubatuz.Erreakzioaren ondoren, kate bikoitzeko DNA berreskuratu zen EtOH prezipitazioaren bidez.Sortutako DNA EcoRI eta HindIII murrizketa entzimekin digeritu zen (biak Rochekoak).Moztutako eta araztutako (QIAquick, Qiagen) txertaketa (T4 ligase, New England Biolabs) markoan lotu zen aurrez moztutako T7 bektore batean, 10B kapside genearen 348 aminoazidoaren ondoren.Ligatze-erreakzioak 16 °C-tan inkubatu ziren 18 orduz in vitro ontziratu baino lehen.Fagoen ontziratzea in vitro T7Select 10-3b klonazio-kitarekin (Novagen) emandako argibideen arabera egin zen eta ontziratzeko soluzioa behin anplifikatu zen Escherichia coli (BLT5615, Novagen) erabiliz lisitzeko.Lisadoak zentrifugatu, titulatu eta izoztu egin ziren -80° C-tan, glizerol-disoluzio gisa.
Salda edo plakan anplifikatutako fago-eskualde aldakorren zuzeneko PCR anplifikazioa 454/Roche-amplicon fusio-hastapen jabedunen bidez.Aurrerako fusio-hastakuntzak eskualde aldakorra (NNK) 12 (txantiloi espezifikoa), GS FLX Titanium A Adapter eta lau oinarriko liburutegiko gako-sekuentzia (TCAG) ditu (1a irudi osagarria):
Alderantzizko fusio-hastagailuak biotina ere baditu harrapatzeko aleei erantsita eta emultsioaren PCRan anplifikazio klonala egiteko beharrezkoa den GS FLX Titaniozko Egokitzailea:
Ondoren, anplikoiak 454/Roche pirosekuentziazioa jasan zituzten 454 GS-FLX Titanium protokoloaren arabera.Sanger eskuzko sekuentziaziorako (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 fagoaren DNA PCR bidez anplifikatu zen eta ondorengo lehen bikoteekin sekuentziatu zen:
Banakako plaken txertaketak PCR anplifikazioa jasan zituzten Roche Fast Start DNA Polymerase Kit-aren bidez (fabrikatzailearen argibideen arabera).Egin bero-hasiera bat (10 min 95 °C-tan) eta 35 bultzada-ziklo (50 s 95 °C-tan, 1 min 50 °C-tan eta 1 min 72 °C-tan).
Escherichia coli BL5615-n TB saldan (Sigma Aldrich) edo 500 cm2-ko plateretan (Thermo Scientific) 4 orduz 37 °C-tan liburutegietako fagoak, basati motako fagoak, CSFtik eta odoletik erreskataturiko fagoak edo banakako klonak anplifikatu ziren.Fagoak plaketatik atera ziren plakak Tris-EDTA bufferarekin (Fluka Analytical) garbituz edo plakak pipeta-puntu esterilekin bilduz.Fagoak kultura gainditzailetik edo erauzketa-tamponetik isolatu ziren polietilenglikol (PEG 8000) prezipitazio-boronda batekin (Promega) eta Tris-EDTA tamponean berriro esekitzen ziren.
Anplifikatutako fagoari endotoxina kentzeko 2-3 txanda jasan zituzten endotoxinak kentzeko aleak erabiliz (Miltenyi Biotec) zain barneko (IV) injekzio aurretik (500 μl/animalia).Lehenengo txandan, 2×1012 fago sartu ziren;bigarrenean, 2×1010 fago;hirugarren eta laugarren hautaketa txandetan, 2×109 fago animalia bakoitzeko.Adierazitako denbora-puntuetan bildutako CSF-n eta odol-laginetako fagoen edukia plaka zenbaketaren bidez zehaztu zen fabrikatzailearen argibideen arabera (T7Select sistemaren eskuliburua).Fagoen hautaketa buztaneko zainetan araztutako liburutegien injekzio bidez edo aurreko hautapen txandatik CSFtik ateratako fagoaren berriro injekzioaren bidez egin zen, eta ondorengo uztak 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min eta 240 min CSF eta 240 min laginetan egin ziren hurrenez hurren.Guztira, in vivo panning-eko lau txanda egin ziren eta horietan hautatutako bi adarrak bereizita gorde eta aztertu ziren lehen hiru hautaketa-txandetan.Hautaketa-lehen bi txandetatik CSFtik ateratako fago-txertatze guztiak 454/Roche pirosekuentziazioa jasan zituzten, eta azken bi hautaketa-txandetatik CSFtik ateratako klon guztiak eskuz sekuentziatu ziren.Lehen hautapen txandako odol-fago guztiak 454/Roche pirosekuentziazioa ere jasan zituzten.Fago-klonak injektatzeko, hautatutako fagoak E. coli (BL5615) anplifikatu ziren 500 cm2-ko plaketan 37 °C-tan 4 orduz.Banaka hautatutako eta eskuz sekuentziatutako klonak TB euskarrian hedatu ziren.Fagoen erauzketa, arazketa eta endotoxina kendu ondoren (goian deskribatu bezala), 300 μl-ko 2 × 1010 fago/animalia injektatu ziren buztan-zain batean barnean.
Sekuentzia-datuen aurreprozesatzea eta iragazketa kualitatiboa.454/Roche datu gordinak korronte-mapa formatu estandar bitar batetik (sff) Pearson-en gizakiak irakurtzeko formatu batera (fasta) bihurtu ziren saltzaileen softwarea erabiliz.Nukleotido-sekuentziaren prozesamendu gehiago egin zen jabedun C programak eta gidoiak erabiliz (argiratu gabeko software paketea) behean deskribatzen den moduan.Lehen datuen analisiak etapa anitzeko iragazketa prozedura zorrotzak barne hartzen ditu.Baliozko 12mer txertatzeko DNA sekuentziarik ez zuten irakurketak iragazteko, irakurketak sekuentzialki lerrokatu ziren hasierako etiketarekin (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), gelditzeko etiketarekin (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) eta atzeko planoarekin (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) Needleman-Wunsch test globala erabiliz.lerrokatzeak 2 inkoherentzia ahalbidetzen ditu lerrokadura bakoitzeko31.Hori dela eta, hasierako eta gelditzeko etiketarik gabeko irakurketak eta atzeko planoko txertaketak dituzten irakurketak, hau da, baimendutako bat-etortze-kopurua gainditzen duten lerrokadurak kendu ziren liburutegitik.Gainerako irakurketei dagokienez, hasierako markatik hedatzen den eta gelditzeko marka baino lehen amaitzen den N-mer DNA sekuentzia jatorrizko irakurketa-sekuentziatik kendu eta gehiago prozesatu zen (aurrerantzean "txertatu").Txertaketaren itzulpenaren ondoren, lehen geldialdiko kodoiaren ondorengo zatia txertatzetik kentzen da 5′ amaieran.Horrez gain, abiaraztearen 3′ amaieran osatu gabeko kodoiak eragiten zituzten nukleotidoak ere kendu ziren.Atzeko planoko sekuentziak soilik dituzten txertaketak baztertzeko, "PAG" aminoazidoen ereduarekin hasten diren txertaketak ere kendu ziren.Itzulpenaren osteko 3 aminoazido baino gutxiagoko peptidoak kendu ziren liburutegitik.Azkenik, kendu erredundantzia txertatzeko multzoan eta zehaztu txertatze bakar bakoitzaren maiztasuna.Analisi honen emaitzek nukleotido-sekuentzien (txertaketak) eta haien (irakurtzeko) maiztasunen zerrenda bat izan zuten (1c eta 2. irudi osagarriak).
Talde N-mer DNA txertaketak sekuentziaren antzekotasunaren arabera: 454/Roche-ren sekuentziazio-errore espezifikoak ezabatzeko (esaterako, homopolimeroen luzapenak sekuentziatzeko arazoak) eta ez hain garrantzitsuak diren erredundantziak kentzeko, aldez aurretik iragazitako N-mer DNA sekuentziaren txertaketak (txertaketak) antzekotasunaren arabera ordenatzen dira.txertaketak (gehienez bat ez datozen 2 oinarri onartzen dira) honela definitutako algoritmo iteratibo bat erabiliz: txertaketak maiztasunaren arabera ordenatzen dira lehenik (handienetik txikienera), eta berdinak badira, bigarren mailako ordenaren arabera luzeraren arabera (luzetik laburrenera) ).Horrela, sartzerik maizenek eta luzeenek lehen “taldea” definitzen dute.Taldeko maiztasuna maiztasun nagusian ezartzen da.Ondoren, ordenatutako zerrendan geratzen den txertaketa bakoitza taldean gehitzen saiatu zen pareka Needleman-Wunsch lerrokaduraren bidez.Lerrokatze batean bat-etortze, txertatze edo ezabatze-kopuruak 2ko atalasea gainditzen ez badu, txertaketa bat gehitzen da taldeari, eta talde-maiztasun orokorra gehitzen da txertaketa zenbateko maiztasunarekin.Talde batean gehitutako txertaketak erabilitako gisa markatzen dira eta prozesatzetik kanpo geratzen dira.Txertatze-sekuentzia lehendik dagoen talde batera ezin bada gehitu, txertatze-sekuentzia talde berri bat sortzeko erabiltzen da txertatze-maiztasun egokia duen eta erabilitako gisa markatuta.Iterazioa txertatze-sekuentzia bakoitza talde berri bat osatzeko erabili denean edo lehendik dagoen talde batean sar daitekeenean amaitzen da.Azken finean, nukleotidoz osatutako txertaketa multzokatuak sekuentzia peptidikoetara itzultzen dira (peptido liburutegiak).Azterketa honen emaitza txertatze-multzo bat eta dagozkien maiztasunen bat da, ondoz ondoko irakurketen kopurua osatzen dutenak (2. irudi osagarria).
Motifaren sorkuntza: peptido esklusiboen zerrenda batean oinarrituta, liburutegi bat sortu zen behean erakusten den moduan aminoazidoen eredu posible guztiak (aa).3. luzerako eredu posible bakoitza peptidotik atera zen eta bere alderantzizko eredua gehitu zen eredu guztiak (tripeptidoak) dituen motibo liburutegi komun batekin batera.Oso errepikakorrak diren motiboen liburutegiak sekuentziatu eta erredundantzia kendu.Ondoren, motibo liburutegiko tripeptido bakoitzeko, liburutegian duen presentzia egiaztatu dugu tresna konputazionalak erabiliz.Kasu honetan, aurkitutako motibo-tripeptidoa duen peptidoaren maiztasuna gehitzen zaio eta motibo-liburutegian esleitzen zaio ("motibo kopurua").Motiboen sorreraren emaitza tripeptidoen (motiboak) agerraldi guztiak eta dagozkien balioak dituen bi dimentsioko array bat da, hau da, irakurketak iragazi, taldekatu eta itzultzen direnean dagokion motiboa sortzen duten sekuentziazio-irakurketen kopurua.Goian xehetasunez deskribatutako neurriak.
Motibo kopuruaren normalizazioa eta dagozkion sakabanaketa grafikoak: lagin bakoitzeko motibo kopurua normalizatu zen.
non ni i gaia duen irakurketa kopurua den.Horrela, vi laginean i motiboa duten irakurketen (edo peptidoen) maiztasuna adierazten du.Normalizatu gabeko motibo kopururako P balioak Fisher-en proba zehatza erabiliz kalkulatu ziren.Motibo kopuruaren korrelogramei dagokienez, Spearmanen korrelazioak R-rekin motibo kopuru normalizatua erabiliz kalkulatu ziren.
Peptidoen liburutegiko posizio bakoitzean aminoazidoen edukia ikusteko, web-logogramak 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) sortu ziren.Lehenik eta behin, 12-mer peptidoaren posizio bakoitzean dagoen aminoazidoen edukia 20×12 matrize batean gordetzen da.Ondoren, posizio bakoitzean aminoazido-eduki erlatibo bera duten 1000 peptido multzo bat sortzen da fasta-sekuentzia formatuan eta web-logo 3-rako sarrera gisa ematen da, posizio bakoitzean aminoazido erlatiboaren edukiaren irudikapen grafikoa sortzen duena.peptido liburutegi jakin baterako.Dimentsio anitzeko datu multzoak ikusteko, bero-mapak sortu ziren R-n barnean garatutako tresna bat erabiliz (biosHeatmap, oraindik kaleratu gabe dagoen R paketea).Bero-mapetan aurkeztutako dendrogramak Ward-en multzokatze-metodo hierarkikoaren bidez kalkulatu ziren distantzia euklidear metrikoarekin.Motiboen puntuazioaren datuen analisi estatistikorako, normalizatu gabeko puntuaziorako P balioak kalkulatu ziren Fisher-en proba zehatza erabiliz.Beste datu multzo batzuen P balioak R-n kalkulatu ziren Student-en t-testa edo ANOVA erabiliz.
Hautatutako fago klonak eta txertatzerik gabeko fagoak buztanaren bidez (2 × 1010 fago/animalia 300 μl PBStan) injektatu ziren.Perfusioa eta ondorengo finkapena baino hamar minutu lehenago, animalia berari zain barneko DyLight594 markatutako lektina 100 μl injektatu zitzaien (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Fagoak injektatu eta 60 minutura, arratoiak bihotzean zehar nahastu ziren 50 ml PBSrekin eta 50 ml % 4 PFA/PBSrekin.Garuneko laginak, gainera, gauean finkatu ziren 4% PFA/PBS-n eta %30eko sakarosatan busti ziren gauean 4 °C-tan.Laginak flash izoztuta daude OCT nahasketan.Izoztutako laginen analisi immunohistokimikoa giro-tenperaturan egin zen 30 µm-ko kriosekzioetan %1 BSArekin blokeatuta eta T7 fagoaren aurkako FITC markatutako antigorputz poliklonalekin inkubatu (Novus NB 600-376A) 4 °C-tan.Inkubatu gauez.Azkenik, atalak 3 aldiz garbitu dira PBSarekin eta laser mikroskopio konfokalarekin (Leica TCS SP5) aztertu.
%98ko gutxieneko purutasuna duten peptido guztiak GenScript USA-k sintetizatu ditu, biotinilatuak eta liofilizatuak.Biotina glizina hirukoitzeko tarte osagarri baten bidez lotzen da N-muturrean.Egiaztatu peptido guztiak masa-espektrometria erabiliz.
Streptavidin (Sigma S0677) peptido biotinilatuaren 5 aldiz ekimolar gehiegizko batekin nahastu zen, BACE1 peptido inhibitzaile biotinilatua edo BACE1 peptido inhibitzaile biotinilatuaren eta BACE1 peptido inhibitzaile biotinilatuaren % 5-10 DMSO/PBSn inkubatutako konbinazio batekin (3:1 ratioa).Injekzio aurretik ordu 1 giro-tenperaturan.Estreptavidinarekin konjugatutako peptidoak 10 mg/kg-ko dosian injektatu ziren garun barrunbea zuten arratoien isats-zainetako batean.
Estreptabidina-peptido konplexuen kontzentrazioa ELISA bidez ebaluatu zen.Nunc Maxisorp mikrotitulazio plakak (Sigma) gau osoan estali ziren 4 ° C-tan 1,5 μg/ml saguaren aurkako estreptavidinaren antigorputzarekin (Thermo, MA1-20011).Blokeatu ondoren (blokeatzeko tampona: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) giro-tenperaturan 2 orduz, garbitu plaka 0,05% Tween-20/PBS (garbiketa tampona) 3 segundoz, CSF eta plasma laginak ondo-blokeatu:10 gehitu ziren. CSF 1:115).Ondoren, plaka gauean inkubatu zen 4 ° C-tan detekzio-antigorputzarekin (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Hiru garbiketa urratsen ondoren, estreptabidina detektatu zen TMB substratu-soluzioan (Roche) 20 minutuz inkubatuz.1M H2SO4-rekin kolorearen garapena gelditu ondoren, neurtu absorbantzia 450 nm-tan.
Streptavidin-peptide-BACE1 inhibitzaile konplexuaren funtzioa Aβ(1-40) ELISA bidez ebaluatu zen fabrikatzailearen protokoloaren arabera (Wako, 294-64701).Laburbilduz, CSF laginak diluitzaile estandarrean diluitu ziren (1:23) eta gauean inkubatu ziren 4 °C-tan BNT77 harrapatzeko antigorputz estalitako 96 putzu plaketan.Bost garbiketa-pausoren ondoren, HRP-rekin konjugatutako BA27 antigorputza gehitu eta 2 orduz inkubatu zen 4°C-tan, eta jarraian bost garbiketa-urrats egin ziren.Aβ (1-40) TMB disoluzioan 30 minutuz giro-tenperaturan inkubatuz detektatu zen.Kolorearen garapena geldiarazi ondoren, neurtu absorbantzia 450 nm-an.Plasma laginak fase solidoaren erauzketa egin ziren Aβ(1-40) ELISAren aurretik.Plasma %0,2ko DEA (Sigma) gehitu zen 96 putzuko plaketan eta giro-tenperaturan inkubatu zen 30 minutuz.SPE plakak (Oasis, 186000679) urarekin eta %100 metanolarekin segidan garbitu ondoren, plasma laginak SPE plaketan gehitu ziren eta likido guztia kendu zen.Laginak garbitu ziren (lehenengo %5 metanolarekin eta gero %30 metanolarekin) eta %2 NH4OH/%90 metanolarekin eluitu ziren.Eluatea 55 °C-tan lehortu ondoren 99 min N2 korronte konstantean, laginak diluitzaile estandarretan murriztu ziren eta Aβ (1-40) goian deskribatu bezala neurtu zen.
Nola aipatu artikulu hau: Urich, E. et al.Garunera zama bidaltzea in vivo identifikatutako igarobide-peptidoak erabiliz.zientzia.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB eta Moos T. Droga makromolekularren entrega garunera zuzendutako terapia erabiliz.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. eta Martinez-Martinez, P. Delivery of peptide and protein drugs across the blood-brain barrera.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hemato-entzefaloaren barrera: garuneko droga-garapenean dagoen botila-lepoa.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, eta Byrd, A. Droga-ematea hobetzeko eta garunera bideratzeko aukerak, plexus korideo-CSF bidearen bidez.Pharmaceutical Research 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmakoen modernizazioa Troiako zaldi molekularrekin garuna emateko.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM hartzailearen bidezko peptidoen garraioa odol-garuneko hesian zehar.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Garuneko sartzea eta antigorputz terapeutikoen eraginkortasuna areagotzea molekular anezka monobalenteak erabiliz.Neurona 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrin hartzaileak (TfR) garraioak TfR antigorputzen afinitate-aldaerak garunean hartzea zehazten du.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).