LC arazoak konpontzeko gai batzuk ez daude inoiz zaharkituta, LC praktikan arazoak baitaude, tresna teknologia denborarekin hobetzen den arren. Hainbat modutan sor daitezke arazoak LC sistema batean eta gailurraren forma txarrean amai daitezke. Gailurraren formarekin lotutako arazoak sortzen direnean, emaitza horien arrazoi posibleen zerrenda labur batek gure arazoak konpontzeko esperientzia errazten laguntzen du.
"LC Arazoak Konpontzea" zutabe hau idaztea eta hilero gaiei buruz pentsatzea dibertigarria izan da, gai batzuk ez baitira inoiz modaz pasatzen. Kromatografiaren ikerketaren arloan gai edo ideia batzuk zaharkituta geratzen diren bitartean ideia berriago eta hobeek ordezkatzen dituztenean, arazoak konpontzearen arloan, lehen arazoak konpontzeko artikulua aldizkari honetan (garai hartan LC Journal) agertu zenetik (gai batzuk oraindik ere garrantzitsuak baitira) 1983an (1). Azken urteotan, LC Arazoak Konpontzeko hainbat ataletan zentratu naiz kromatografia likidoan (LC) eragiten duten joera garaikideetan (adibidez, presioak atxikipenean duen eraginaren ulermenaren konparaketa erlatiboa [2] Aurrerapen Berriak), LC emaitzen interpretazioa eta LC tresna modernoekin arazoak nola konpondu. Hilabete honetako atalean, 2021eko abenduan hasitako nire seriea (3) jarraitzen dut, LC arazoak konpontzeko "bizitza eta heriotza" gai batzuetan zentratua — edozein arazo konpontzailerentzat bikainak diren elementuak ezinbestekoak dira, erabiltzen ari garen sistemaren adina edozein dela ere. Serie honen gai nagusia oso lotuta dago LCGCren "LC Arazoak Konpontzeko Gida" horma-taula ospetsuarekin (4). laborategi askotan zintzilik. Serie honen hirugarren zatirako, gailurraren formarekin edo gailurraren ezaugarriekin lotutako arazoetan zentratzea aukeratu dut. Sinestezina bada ere, horma-taulak gailurraren forma txarraren 44 kausa potentzial desberdin zerrendatzen ditu! Ezin ditugu arazo horiek guztiak xehetasunez aztertu artikulu batean, beraz, gaiari buruzko lehen atal honetan, gehien ikusten ditudan batzuetan zentratuko naiz. Espero dut LC erabiltzaile gazteek eta zaharrek aholku eta oroigarri lagungarriak aurkitzea gai garrantzitsu honi buruz.
Arazoak konpontzeko galderei gero eta gehiago erantzuten diet "dena da posible" esanez. Erantzun hau erraza iruditu daiteke interpretatzen zailak diren behaketak kontuan hartuta, baina askotan egokia iruditzen zait. Gailurraren forma txarraren arrazoi posible asko daudenez, garrantzitsua da adimen irekia izatea arazoa zein izan daitekeen aztertzerakoan, eta arazo potentzialak lehenesteko gai izatea arazoak konpontzeko ahaleginak hasteko, aukera ohikoenetan arreta jarriz; puntu hau oso garrantzitsua da.
Arazoak konpontzeko edozein ariketatan funtsezko urrats bat —baina uste dut gutxietsi egiten dena— konpondu beharreko arazo bat dagoela onartzea da. Arazo bat dagoela onartzeak askotan esan nahi du tresnari gertatzen zaiona gure itxaropenetatik desberdina dela onartzea, eta horiek teoriak, ezagutza enpirikoak eta esperientziak moldatzen dituzte (5). Hemen aipatzen den "gailur formak" ez du soilik gailurraren forma aipatzen (simetrikoa, asimetrikoa, leuna, leuna, ertz nagusikoa, isats-formakoa, etab.), baita zabalera ere. Benetako gailurraren formari buruzko gure itxaropenak sinpleak dira. (6) teoriak ondo babesten du testuliburuko itxaropena, kasu gehienetan, kromatografia-gailurrak simetrikoak izan behar direla eta banaketa gaussiar baten formara egokitu behar direla, 1a irudian erakusten den bezala. Gailurren zabaleretatik espero duguna gai konplexuagoa da, eta gai hau etorkizuneko artikulu batean eztabaidatuko dugu. 1. irudiko beste gailur formek beha daitezkeen beste aukera batzuk erakusten dituzte; beste era batera esanda, gauzak gaizki atera daitezkeen modu batzuk. Atal honen gainerakoan, egoera horietara eraman dezaketen adibide zehatz batzuk eztabaidatzen denbora emango dugu. forma motak.
Batzuetan, gailurrak ez dira batere ikusten eluzioa espero den kromatograman. Goiko horma-diagramak adierazten du gailur baten gabezia (laginak analito helburua kontzentrazioan duela suposatuz, detektagailuaren erantzuna zarataren gainetik ikusteko nahikoa izan beharko lukeena) normalean tresnaren arazoren batekin edo fase mugikorreko baldintza okerrekin (behatzen badira) lotuta dagoela. gailurrak, normalean "ahulegiak"). Kategoria honetako arazo eta irtenbide potentzialen zerrenda labur bat I. taulan aurki daiteke.
Goian aipatu bezala, arreta jarri eta konpontzen saiatu aurretik zenbat gailur-zabalera onartu behar den galdera gai konplexua da, eta etorkizuneko artikulu batean eztabaidatuko dut. Nire esperientziak dio gailur-zabalera esanguratsuak askotan gailur-formaren aldaketa nabarmenarekin batera gertatzen direla, eta gailur-buztantzea ohikoagoa dela gailurraurrekoa edo zatiketa baino. Hala ere, nominalki simetrikoak diren gailurrak ere zabaldu egiten dira, eta hori hainbat arrazoirengatik gerta daiteke:
Arazo horietako bakoitza xehetasunez aztertu da Troubleshooting LC aldizkariaren aurreko zenbakietan, eta gai hauetan interesa duten irakurleek aurreko artikulu hauek kontsulta ditzakete arazo hauen erroko kausen eta irtenbide posibleen inguruko informazioa lortzeko. Xehetasun gehiago.
Gailurren isats-jarioa, gailurren aurrealdea eta zatiketa fenomeno kimiko edo fisikoek eragin ditzakete, eta arazo horien irtenbide potentzialen zerrenda asko aldatzen da, arazo kimiko edo fisiko bati aurre egiten ari garen arabera. Askotan, kromatograma bateko gailur desberdinak alderatuz, zein den erruduna jakiteko pista garrantzitsuak aurki ditzakezu. Kromatograma bateko gailur guztiek forma antzekoak badituzte, ziurrenik kausa ez da fisikoa izango. Gailur bat edo gutxi batzuk bakarrik kaltetzen badira, baina gainerakoak ondo badaude, ziurrenik kausa kimikoa izango da.
Gailur-buztanaren arrazoi kimikoak oso konplexuak dira hemen laburki aztertzeko. Interesdun irakurlea "LC Troubleshooting" aldizkariaren azken alea kontsultatzera gomendatuko da sakonago aztertzeko (10). Hala ere, gauza erraza da injektatutako analitoaren masa murriztea eta gailurraren forma hobetzen den ikustea. Hala bada, orduan pista ona da arazoa "masa-gainkarga" dela. Kasu honetan, metodoa analito-masa txikiak injektatzera mugatu behar da, edo baldintza kromatografikoak aldatu behar dira, gailur-forma onak lortu ahal izateko injektatutako masa handiagoak izan arren.
Gailurraren isatsaren arrazoi fisiko asko ere egon daitezke. Aukeren inguruko eztabaida zehatzagoa nahi duten irakurleek "LC Troubleshooting" aldizkariaren beste ale berri bat (11) kontsulta dezakete. Gailurraren isatsaren arrazoi fisiko ohikoenetako bat injektorearen eta detektagailuaren arteko puntu batean konexio txarra izatea da (12). Muturreko adibide bat 1d irudian ageri da, duela aste batzuk nire laborategian lortua. Kasu honetan, lehenago erabili ez genuen injekzio-balbula berri batekin sistema bat eraiki genuen, eta bolumen txikiko injekzio-begizta bat instalatu genuen altzairu herdoilgaitzezko kapilare batean moldatutako ferrula batekin. Hasierako arazoak konpontzeko esperimentu batzuk egin ondoren, konturatu ginen injekzio-balbularen estatoreko atakaren sakonera ohituta geundena baino askoz sakonagoa zela, eta horrek atakaren behealdean bolumen hila handi bat sortzen zuela. Arazo hau erraz konpontzen da injekzio-begizta beste hodi batekin ordezkatuz, ferrula posizio egokira doi dezakegu atakaren behealdeko bolumen hila ezabatzeko.
1e irudian agertzen diren bezalako gailur-fronteak arazo fisiko edo kimikoek ere eragin ditzakete.Aurreko ertzaren kausa fisiko ohikoa da zutabearen partikula-ohea ez egotea ondo paketatuta, edo partikulak denborarekin berrantolatu izana.Fenomeno fisiko honek eragindako gailur-buztanarekin gertatzen den bezala, konpontzeko modurik onena zutabea ordezkatzea eta aurrera jarraitzea da.Funtsean, jatorri kimikoa duten aurreko ertzeko gailur-formak askotan "ez-linealak" diren atxikipen-baldintzetatik sortzen dira.Baldintza idealetan (linealetan), fase geldikorrak atxikitako analito-kantitatea (beraz, atxikipen-faktorea) linealki erlazionatuta dago zutabean dagoen analitoaren kontzentrazioarekin.Kromatografikoki, horrek esan nahi du zutabean injektatutako analito-masa handitzen den heinean, gailurra altuagoa bihurtzen dela, baina ez zabalagoa.Harreman hau hausten da atxikipen-portaera ez-lineala denean, eta gailurrak ez dira altuagoak bakarrik, baita zabalagoak ere masa gehiago injektatzen den heinean.Gainera, forma ez-linealek gailur kromatografikoen forma zehazten dute, eta ondorioz, ertz nagusi edo atzekoak sortzen dira.Gailur-buztanak eragiten dituen masa-gainkargarekin gertatzen den bezala (10), gailurra Atxikipen ez-linealak eragindako aurrerapena injektatutako analitoaren masa murriztuz ere diagnostikatu daiteke. Gailurraren forma hobetzen bada, metodoa aldatu behar da aurrerapen-ertza eragiten duen injekzio-kalitatea ez gainditzeko, edo baldintza kromatografikoak aldatu behar dira portaera hori minimizatzeko.
Batzuetan, 1f irudian erakusten den bezala, "zatitutako" gailur bat ikusten dugu. Arazo hau konpontzeko lehen urratsa gailurraren forma koeluzio partzialaren ondoriozkoa den zehaztea da (hau da, bi konposatu desberdin baina estuki eluitzen direnen presentzia). Bi analito desberdin elkarrengandik hurbil eluitzen badira, orduan haien bereizmena hobetzea da kontua (adibidez, selektibitatea, atxikipena edo plaka kopurua handituz), eta itxurazko "zatitutako" gailurrak errendimendu fisikoarekin lotuta daude. Errendimenduak ez du zerikusirik zutabearekin berarekin. Askotan, erabaki honetarako pista garrantzitsuena kromatogramako gailur guztiek forma zatituak erakusten dituzten ala bat edo bik bakarrik erakusten duten da. Bat edo bi badira, ziurrenik koeluzio arazoa da; gailur guztiak zatituta badaude, ziurrenik arazo fisikoa da, ziurrenik zutabearekin berarekin lotuta.
Zutabearen beraren propietate fisikoekin lotutako gailur zatituak normalean sarrerako edo irteerako fritak partzialki blokeatuta egoteagatik edo zutabeko partikulen berrantolaketagatik izaten dira, fase mugikorra zutabe-kanalaren eraketaren zenbait eremutan fase mugikorra baino azkarrago isurtzea ahalbidetuz. Beste eskualde batzuetan (11). Batzuetan, partzialki blokeatutako frita zutabean zeharreko fluxua alderantziz garbitu daiteke; hala ere, nire esperientzian, hau normalean epe laburreko irtenbidea da, luzekoa baino. Hau hilgarria da askotan zutabe modernoekin, partikulak zutabean berriro konbinatzen badira. Puntu honetan, hobe da zutabea ordezkatzea eta jarraitzea.
1g irudiko gailurrak, nire laborategiko kasu berri batekoa ere bai, normalean adierazten du seinalea hain altua dela, ezen erantzun-tartearen goi-muturrera iritsi dela. Xurgapen optikoko detektagailuetan (kasu honetan UV-vis), analitoaren kontzentrazioa oso altua denean, analitoak detektagailuaren fluxu-zelulatik igarotzen den argi gehiena xurgatzen du, eta oso argi gutxi uzten du detektatzeko. Baldintza hauetan, fotodetektagailutik datorren seinale elektrikoa zarata-iturri desberdinek eragin handia dute, hala nola argi galduak eta "korronte ilunak", eta horrek seinalea oso "lausoa" bihurtzen du itxuraz eta analitoaren kontzentrazioarekiko independentea. Hori gertatzen denean, arazoa erraz konpondu daiteke askotan analitoaren injekzio-bolumena murriztuz: injekzio-bolumena murriztuz, lagina diluituz edo biak.
Kromatografia eskolan, detektagailuaren seinalea (hau da, kromatogramaren y ardatza) erabiltzen dugu laginaren analitoaren kontzentrazioaren adierazle gisa. Beraz, arraroa dirudi zero azpitik dagoen seinalea duen kromatograma bat ikustea, interpretazio sinplea analitoaren kontzentrazio negatiboa adierazten duela baita – noski, fisikoki posible ez dena. Nire esperientzian, gailur negatiboak gehienetan xurgapen optikoko detektagailuak erabiltzean ikusten dira (adibidez, UV-vis).
Kasu honetan, gailur negatibo batek esan nahi du zutabetik elutzen diren molekulek fase mugikorrak berak baino argi gutxiago xurgatzen dutela gailurraren aurretik eta ondoren. Hori gerta daiteke, adibidez, detekzio-uhin-luzera nahiko baxuak (<230 nm) eta fase mugikorreko gehigarriak uhin-luzera horietan argi gehiena xurgatzen dutenean. Gehigarri horiek fase mugikorreko disolbatzaile osagaiak izan daitezke, hala nola metanola, edo buffer osagaiak, hala nola azetatoa edo formiatoa. Gailur negatiboak erabil daitezke kalibrazio-kurba bat prestatzeko eta informazio kuantitatibo zehatza lortzeko, beraz, ez dago oinarrizko arrazoirik horiek saihesteko (metodo honi batzuetan "zeharkako UV detekzioa" deitzen zaio) (13). Hala ere, gailur negatiboak guztiz saihestu nahi baditugu, xurgapen-detekzioan, irtenbiderik onena detekzio-uhin-luzera desberdina erabiltzea da, analitoak fase mugikorrak baino gehiago xurga dezan, edo fase mugikorraren konposizioa aldatzea, analitoek baino argi gutxiago xurgatzeko.
Gailur negatiboak ere ager daitezke errefrakzio-indizearen (RI) detekzioa erabiltzean, laginaren analitoaz gain beste osagai batzuen errefrakzio-indizea, hala nola disolbatzaile-matrizea, fase mugikorraren errefrakzio-indizetik desberdina denean. Hau UV-vis detekzioarekin ere gertatzen da, baina efektu hau RI detekzioarekin alderatuta ahuldu egiten da. Bi kasuetan, gailur negatiboak minimizatu daitezke laginaren matrizearen konposizioa fase mugikorrarenarekin hobeto bat etorriz.
LC arazoak konpontzeko oinarrizko gaiari buruzko hirugarren zatian, gailurren forma espero edo ohiko gailurren formatik desberdina den egoerak aztertu nituen. Arazo horien konponketa eraginkorra espero diren gailurren formen ezagutzarekin hasten da (teorian edo dauden metodoekin aurreko esperientzian oinarrituta), beraz, itxaropen horietatik desbideratzeak nabariak dira. Gailurren formaren arazoek kausa potentzial asko dituzte (zabalegiak, isatsa, ertz aurreratua, etab.). Atal honetan, gehien ikusten ditudan arrazoi batzuk zehatz-mehatz aztertzen ditut. Xehetasun hauek ezagutzeak arazoak konpontzeko abiapuntu ona eskaintzen du, baina ez ditu aukera guztiak jasotzen. Kausen eta irtenbideen zerrenda sakonago bat nahi duten irakurleek LCGCren "LC arazoak konpontzeko gida" horma-taula kontsulta dezakete.
(4) LCGC “LC Arazoak konpontzeko gida” horma-diagrama. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Datuen analisia eta seinaleen prozesamendua kromatografian (Elsevier, New York, NY, 1998), 43-96 orr.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF eta Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.