Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. CSS euskarri mugatua duen arakatzailearen bertsio bat erabiltzen ari zara. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratu bat erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Gainera, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakusten dugu.
Hiru diapositiba aldi berean dituen karrusel bat erakusten du. Erabili Aurrekoa eta Hurrengoa botoiak hiru diapositiba aldi berean mugitzeko, edo erabili amaierako graduatzaile botoiak hiru diapositiba aldi berean mugitzeko.
Auto-muntaketa bidezko neurona-organuluak in vitro plataforma itxaropentsua dira giza garapena eta gaixotasunak modelatzeko. Hala ere, organoideek ez dute in vivo dagoen konektibitatea, eta horrek heltzea mugatzen du eta portaera kontrolatzen duten beste zirkuitu batzuekin integratzea eragozten du. Hemen erakusten dugu jaioberrien arratoi biluzien kortex somatosentsorialean transplantatutako giza zelula amen eratorritako kortex-organoideek zelula mota helduak garatzen dituztela, zentzumen- eta motibazio-zirkuituetan integratzen direnak. MRIak transplante osteko organoideen hazkundea agerian utzi zuen hainbat zelula ama-lerro eta animaliatan, eta nukleo bakarreko analisiak kortikogenesiaren progresioa eta jarduera-menpeko transkripzio-programa baten sorrera agerian utzi zituen. Izan ere, transplantatutako kortex-neuronek in vitro parekoek baino propietate morfologiko, sinaptiko eta barne-mintz konplexuagoak dituzte, eta horrek Timothy sindromea duten pazienteen neurona-akatsak detektatzea ahalbidetzen du. Trazadura anatomiko eta funtzionalak erakutsi du transplantatutako organuluek talamokortexeko eta kortikokortexeko sarrerak jasotzen dituztela, eta jarduera neuronalaren in vivo erregistroek iradokitzen dute sarrera horiek erantzun sentsorialak sor ditzaketela giza zeluletan. Azkenik, kortex-organoideek axoiak arratoi-garunean zehar zabaltzen dituzte, eta haien aktibazio optogenetikoak sari-bilaketa portaera dakar. Horrela, transplantatutako giza kortexeko neuronak heltzen dira eta portaera kontrolatzen duten ostalariaren zirkuituetan parte hartzen dute. Espero dugu ikuspegi honek pazienteengandik eratorritako zeluletan beste bide batzuen bidez detektatu ezin diren kate-mailako fenotipoak detektatzea erraztea.
Giza garunaren garapena autoantolaketa prozesu harrigarri bat da, non zelulek ugaldu, bereiztu, migratu eta konektatu egiten diren zirkuitu neuronal funtzionalak osatzeko, eta hauek esperientzia sentsorialaren bidez fintzen dira. Giza garunaren garapena ulertzeko arazo nagusi bat, batez ere gaixotasunen testuinguruan, garuneko ehunerako sarbide falta da. Autoantolaketa egiten duten organuluek, giza kortexeko organoideek (hCO; giza kortexeko esfera bezala ere ezagutzen dena) barne, 2,3,4,5,6 sor ditzakete. Hala ere, hainbat mugak mugatzen dute haien aplikazio zabalagoa zirkuitu neuronalen garapena eta funtzionamendua ulertzeko. Bereziki, ez dago argi hCO heltzea in vivo dauden mikroinguruneko eta sentsorialeko sarrera jakin batzuen faltagatik mugatzen den ala ez. Gainera, hCOak ez daudenez emaitza konduktualak sor ditzaketen zirkuituetan integratuta, haien erabilgarritasuna mugatua da gaur egun nahasmendu neuropsikiatriko genetikoki konplexuak eta konduktualak modelatzeko.
HCOren transplanteak garun bizidun oso batean muga horiek gainditu ditzake. Aurreko ikerketek erakutsi dute karraskarien kortexean transplantatutako giza neuronak gai direla bizirauteko, proiektatu eta karraskarien zelulekin komunikatzeko7,8,9,10,11,12. Hala ere, esperimentu hauek normalean animalia helduetan egiten dira, eta horrek integrazio sinaptikoa eta axoiala mugatu dezake. Hemen, transplante-paradigma bat deskribatzen dugu, non hiPS zeluletatik eratorritako 3D hCO arratoi immunodefizienteen kortex somatosentsorial primarioan (S1) transplantatu genuen garapen plastikoaren hasierako fase batean. Transplantatutako hCO (t-hCO) neuronek heltze handia jasaten dute, talamokortexeko eta kortex-kortexeko sarrerak jasotzen dituzte, erantzun sentsorialak eragiten dituztenak, eta proiekzio axoinalak arratoiaren garunera hedatzen dituzte sari-bilaketa portaera bultzatzeko. t-hCOren heltze luzatuak akats neuronalak agerian utzi ditu Timothy sindromea (TS) duten pazienteetan, L motako CaV1.2 kaltzio kanal tentsioarekiko sentikorrean (CACNA1C-k kodetua) mutazioek eragindako nahaste genetiko larria.
In vivo zirkuituetan giza kortexeko neuronak aztertzeko, 3D hCO osorik transplantatu genuen estereotaktikoki arratoi atimikoen S1-n (jaio ondorengo 3-7 egunak) (1a irudia eta 1a-c irudietako datu zabalduak). Puntu honetan, talamokortexeko eta kortikokortexeko axoi proiekzioek oraindik ez dute beren S1 inerbazioa osatu (13. erreferentzia). Beraz, ikuspegi hau t-hCO integrazioa maximizatzeko diseinatuta dago, zirkuitu endogenoetan duen eragina minimizatuz. Animalia bizidunetan t-hCO-ren kokapena bistaratzeko, arratoien T2-haztatutako MRI garuneko berreraikuntzak egin genituen transplantea egin eta 2-3 hilabetera (1b irudia eta datu zabalduak, 1d irudia). t-hCO3 erraz behatu ziren eta t-hCO3-ren bolumen-neurketak xerra finkoetatik kalkulatutakoen antzekoak izan ziren (Datu Hedatuak 1d eta 1e irudiak; P > 0,05). t-hCO3 erraz behatu ziren eta t-hCO3-ren bolumen-neurketak xerra finkoetatik kalkulatutakoen antzekoak izan ziren (Datu Hedatuak 1d eta 1e irudiak; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксины фиксины (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 erraz behatu ziren, eta t-hCO3 bolumen-neurketak sekzio finkoetarako kalkulatutakoen antzekoak izan ziren (datu hedatuak, 1d irudia, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксернызово (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 erraz behatu zen, eta t-hCO3 bolumikoaren neurketak sekzio finkoetarako kalkulatutakoen antzekoak izan ziren (datu zabalduak, 1d irudia, e; P > 0,05).Transplantatutako animalien % 81ean t-hCO zehaztu genuen transplantatu eta 2 hilabetera gutxi gorabehera (n = 72 animalia; hCO 10 hiPS zelula-lerrotatik; hiPS zelula-lerroak 1. taula osagarrian). Hauetatik, % 87 garuneko kortexean kokatu ziren (1c irudia). Transplantatutako arratoi berean hainbat unetan MRI eskanerrak eginez, t-hCO bolumenaren bederatzi aldiz handiagoa zela ikusi genuen 3 hilabeteko epean (1d irudia eta datu zabalduak, 1f irudia). Transplantatutako animaliek biziraupen-tasa altua izan zuten (% 74) transplantatu eta 12 hilabetera (datu zabalduak, 1g irudia eta 2. taula osagarria), eta ez zen mugimendu- edo memoria-narriadura agerikorik, gliosirik edo elektroentzefalogramarik (EEG) aurkitu. 1g irudiko datuak eta 2. taula osagarria). 1h–m eta 3e).
a, Diseinu esperimentalaren eskema. hiPS zeluletatik eratorritako hCO arratoi biluzi jaioberrien S1-ean transplantatu zen, bereizketaren 30-60 egunetan. b, T2-pisatutako MRI irudi koronal eta horizontalak, t-hCO erakusten dutenak S1-en, transplantearen ondorengo 2 hilabeteetan. Eskala-barra, 2 mm. c, Txertatze-arrakasta-tasen kuantifikazioa hiPS zelula-lerro bakoitzerako (n = 108, barren barruko zenbakiek hIPS zelula-lerro bakoitzeko t-hCO kopurua adierazten dute) eta kortexeko edo subkortexeko kokapena (n = 88). d, Arteria koronario baten MRI irudia (ezkerrean; eskala-barra, 3 mm) eta dagokion 3D berreraikuntza bolumetrikoa (eskala-barra, 3 mm), t-hCO-ren igoera 3 hilabetetan zehar erakusten duena. e, t-hCO patroien berrikuspena arratoien garun-kortexean. Eskala-barra, 1 mm. f, t-hCOren immunozitokimikako irudi adierazgarriak, goitik ezkerretik eskuinera (bereizketa prozesuan zehar): PPP1R17 (4 hilabete), NeuN (8 hilabete), SOX9 eta GFAP (8 hilabete), PDGFRα; (8 hilabete), MAP2 (8 hilabete) eta IBA1 (8 hilabete). Eskala-barra, 20 µm. HNAren ko-adierazpenak gizakien jatorriko zelulak adierazten ditu. g, snRNA-seq: kalitate handiko t-hCO nukleo guztien Unified manifold and projection (UMAP) dimentsio-murrizketa irudigintza, Seurat integrazioaren ondoren (n=3 t-hCO lagin, n=2 hiPS zelula-lerro). Astrozitoak, astrozito-lerroko zelulak; cyc prog, zirkulazioan dauden aitzindariak; GluN DL, neurona glutamatergiko sakonak; GluN DL/SP, neurona glutamatergiko sakonak eta sublamelarrak; GluN UL, goiko geruzako neurona glutamatergikoak; oligodendrozitoak, oligodendrozitoak; OPC, oligodendrozitoen zelula progenitoreak; RELN, reelina neuronak. h, Gene Ontology (GO) terminoen aberaste-analisia, t-hCO neurona glutamatergikoetan (P < 0,05 doitua, aldaketa > 2, nukleoen % 10ean gutxienez adierazita) t-hCO neurona glutamatergikoetan hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta, nabarmen goranzko erregulazioa lortu zuten geneen artean. h, Gene Ontology (GO) terminoen aberaste-analisia, t-hCO neurona glutamatergikoetan (P < 0,05 doitua, aldaketa > 2, nukleoen % 10ean gutxienez adierazita) t-hCO neurona glutamatergikoetan hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta, nabarmen goranzko erregulazioa lortu zuten geneen artean. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией, <0,нтирова изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сираюн пос глутаматергическими нейронами hCO. h, Gene Ontology (GO) terminoen aberaste-analisia t-hCO neurona glutamatergikoetan aktibazio esanguratsua duten geneentzat (P<0,05 doitua, aldaketa >2, adierazpena gutxienez %10ean nukleoetan) hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0.05，倍数变化> 2，在至少% 10 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 后 （ 05 p.变化 变化> 2 ， 至少 % 10 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсрусспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергими нескических нейронах t-hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, geneak nabarmen goranzko erregulazioan agertu ziren (P < 0,05 doitua, aldaketa > 2, nukleoen % 10ean gutxienez adierazita) t-hCO neurona glutamatergikoetan hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta. Aberaste-terminoaren analisi ontologikoa (GO).Lerro puntuatuak 0,05eko aq balioa adierazten du. i, GluN zelula moten UMAP irudikapena t-hCO-n, 22 snRNA-seq erreferentziazko helduen motor-kortexaren datu-multzo batetik etiketa-transferentzia erabiliz. CT — kortikotalamo-zelulak, ET — garunez kanpoko zelulak, IT — barneko telentzefalo-zelulak, NP — proiekzio hurbila.
Ondoren, t-hCOren zitoarkitektura eta zelula-konposizio orokorra ebaluatu genituen. Arratoi-zelula endotelialen antigorputzen tindaketak t-hCOrekin baskularizazioa agerian utzi zuen, eta IBA1 tindaketak, berriz, arratoi-mikroglia txerto osoan zehar (1f irudia eta datu zabalduak, 3c eta d irudiak). Immunomarkaketak PPP1R17 (kortexeko aitzindariak), NeuN (neuronak), SOX9 eta GFAP (glia-eratorritako zelulak) edo PDGFRα (oligodendrozitoen aitzindariak) koespresatzen dituzten giza antigeno nuklearraren (HNA) zelula positiboak agerian utzi zituen (1f irudia). Zelula bakarreko bereizmenean t-hCOren zelula-konposizioa aztertzeko, nukleo bakarreko RNA sekuentziazioa (snRNA-seq) egin genuen bereizketaren 8 hilabete inguru igaro ondoren. Arratoi-nukleoen iragazketa masiboak eta kentzeak 21.500 kalitate handiko giza mapa mononuklear eman zituen (1g irudia eta datu zabalduak, 4a eta b irudiak). Zelula mota markatzaile tipikoen adierazpen-ereduek kortexeko zelula klase nagusien multzoak identifikatu zituzten, besteak beste, sakoneko eta azaleko neurona glutamatergikoak, zirkulazioan dauden aitzindariak, oligodendrozitoak eta astrozitoen lerroa (1g irudia, datu zabalduak, 4c irudia eta 3. taula osagarria). SATB2 eta CTIP2-ren immunomarkaketak erakutsi zuen kortexeko azpimotak egon arren, t-hCO-k ez zuela estratifikazio anatomiko argirik erakusten (datu zabalduak, 3a irudia). Faseekin bat etorritako snRNA-seq hCO-k antzeko zelula klaseak sortu zituen, salbuespen gutxi batzuekin, besteak beste, oligodendrozitoen gabezia eta neurona GABAergikoen presentzia, eta horrek aurretik jakinarazitako aitzindari lateraletako zelulen in vitro baldintza onuragarriak islatu ditzake15 (datu zabalduak, 4f-i irudia eta 4. taula osagarria). Geneen espresio diferentzialaren analisiak t-hCO eta hCO arteko neurona glutamatergikoetan desberdintasun esanguratsuak agerian utzi zituen (5. taula osagarria), besteak beste, heltze neuronalarekin lotutako gene multzoen aktibazioa, hala nola seinaleztapen sinaptikoa, lokalizazio dendritikoa eta tentsio-menpeko kanalaren jarduera (1h irudia eta 5. taula osagarria). 6. taula). Horrenbestez, t-hCO neurona glutamatergiko kortikalek transkripzio-heltze azeleratua erakutsi zuten.
t-hCO-ren transkripzio-aldaketa hauek in vitro hCO eta in vivo t-hCO-ren arteko desberdintasun morfologikoekin lotuta zeuden argitzeko, biozitinaz betetako hCO eta hCO fase berdineko berreraiki genituen sekzio akutuetan, 7-8 hilabeteko bereizketaren ondoren. hCO neuronak (2a irudia). t-hCO neuronak nabarmen handiagoak ziren, soma diametroaren 1,5 aldiz handiagoak ziren, dendrita kopuru bikoitza zuten eta in vitro hCO-rekin alderatuta dendriten luzera osoa sei aldiz handitu zen (2b irudia). Horrez gain, t-hCO neuronetan dendriten bizkarrezur-dentsitate nabarmen handiagoa ikusi genuen hCO neuronetan baino (2c irudia). Horrek iradokitzen du t-hCO neuronek luzapen eta adarkatze dendritiko zabala jasaten dutela, eta horrek, zelulen ugalketa jarraituarekin batera, transplantearen ondoren t-hCO-ren hazkunde intentsiboan lagun dezakeela (1d irudia eta Datu Hedatuen 1f irudia). Horrek propietate elektrofisiologikoak ikertzera bultzatu gintuen. Mintz-kapazitantzia zortzi aldiz handiagoa zen (datu zabalduak, 8d irudia), atseden-egoerako mintz-potentziala hiperpolarizatuagoa zen (gutxi gorabehera 20 mV), eta korronte-injekzioak kitzikapen-tasa maximo handiagoa eragin zuen t-hCO neuronetan hCO neuronetan baino. in vitro (2d irudia), e), eta hori bat dator t-hCO-ren ezaugarri morfologiko handiago eta konplexuagoekin. Gainera, korronte postsinaptiko kitzikagarri espontaneoen (EPSC) maiztasuna nabarmen handiagoa zen t-hCO neuronetan (2f irudia), eta horrek iradokitzen du t-hCO neuronetan behatutako bizkarrezur dendritikoen dentsitate handiagoa kitzikagarritasun funtzionalarekin lotuta zegoela. sinapsi sexuala. In vitro hCO neuronen izaera heldugabea baieztatu genuen markatutako neurona glutamatergikoak grabatuz (datu zabalduak, 6a-c irudiak).
a, biozitinaz betetako hCO eta t-hCO neuronen 3D berreraikuntza, 8 hilabeteko bereizketaren ondoren. b, Ezaugarri morfologikoen kuantifikazioa (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0084, *P = 0,0179 eta ***P < 0,0001). b, Ezaugarri morfologikoen kuantifikazioa (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0084, *P = 0,0179 eta ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, ezaugarri morfologikoen kuantifikazioa (n=8 hCO neurona, n=6 t-hCO neurona; **P=0,0084, *P=0,0179, eta ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P = 0,01*** 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P = 0,01*** 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, ezaugarri morfologikoen kuantifikazioa (n=8 hCO neurona, n=6 t-hCO neurona; **P=0,0084, *P=0,0179, eta ***P<0,0001).c, hCO eta t-hCO adar dendritikoen 3D berreraikuntza 8 hilabeteko bereizketaren ondoren. Izar gorriek ustezko bizkarrezurra dendritikoa adierazten dute. Bizkarrezurra dendritikoaren dentsitatearen kuantifikazioa (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0092). d, Mintz-potentzial atseden-mailaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d, Mintz-potentzial atseden-mailaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P). d, atseden-mintz potentzialaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P). d, atseden-mintz potentzialaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, hCO eta t-hCO-n errepikapen-ekintza potentzialaren jaurtiketa, korronte injekzioak handituz eragindakoa, eta jaurtiketa-tasa maximoaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, hCO eta t-hCO-n errepikapen-ekintza potentzialaren jaurtiketa, korronte injekzioak handituz eragindakoa, eta jaurtiketa-tasa maximoaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и колична колична количением максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, hCO eta t-hCO-n ekintza-potentzialaren bir-pizkundea, korrontearen igoerak eta jaurtiketa-tasa maximoaren kuantifikazioak eragindakoa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率率率甄复动作电位放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 大 及 （ （  （ （ 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, n = 16 нейронов t-10,000 *** P-10,00в t). e, hCO eta t-hCO ekintza-potentzialen errepikapen-jaurtiketa, korronte-hornidura handitu eta jaurtiketa-tasa maximoaren kuantifikazioak eragindakoa (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; *** P < 0,0001). f, EPSC espontaneoak (sEPSC) hCO eta t-hCO neuronetan, bereizketaren 8 hilabetetan, eta gertaera sinaptikoen maiztasunaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). f, EPSC espontaneoak (sEPSC) hCO eta t-hCO neuronetan, bereizketaren 8 hilabetetan, eta gertaera sinaptikoen maiztasunaren kuantifikazioa (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO eta t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественая количественая количествезнак синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSC espontaneoak (sEPSC) hCO eta t-hCO neuronetan, bereizketaren 8 hilabetetan eta gertaera sinaptikoen tasen kuantifikazioan (n=25 hCO neurona, n=17 t-hCO neurona; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO eta t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественая количественая количествезнак синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSC espontaneoak (sEPSC) hCO eta t-hCO neuronetan, bereizketaren 8 hilabetetan eta gertaera sinaptikoen tasen kuantifikazioan (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; *** P<0,0001).bf-rako, 1208-2 lerroko hCO3 eta t-hCO3 paraleloan mantendutako bereizketa-multzo beretik hartu ziren. g, Gene multzoaren aberaste-analisia (alde bakarreko Fisherren proba zehatza), t-hCO neurona glutamatergikoetan nabarmen goranzko erregulazioarekin (P < 0,05 doitua, aldaketa > 2, nukleoen % 10ean gutxienez adierazita) hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta, in vivo sagu-ikerketa batetik identifikatutako erantzun goiztiarreko (ERG) eta erantzun berantiarreko (LRG) jarduera-menpeko geneen gene-multzoak dituztenekin16 eta in vitro neuronetatik lortutako gizakientzako LRG espezifikoak17. g, Gene multzoaren aberaste-analisia (alde bakarreko Fisherren proba zehatza), t-hCO neurona glutamatergikoetan nabarmen goranzko erregulazioarekin (P < 0,05 doitua, aldaketa > 2, nukleoen % 10ean gutxienez adierazita) hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta, in vivo sagu-ikerketa batetik identifikatutako erantzun goiztiarreko (ERG) eta erantzun berantiarreko (LRG) jarduera-menpeko geneen gene-multzoak dituztenekin16 eta in vitro neuronetatik lortutako gizakientzako LRG espezifikoak17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со знаьчнитей (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядетер) в гадетерь в гадетерь нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированнысах в ованнысних в от активности мышах in vivo16, eta специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, t-hCO neurona glutamatergikoetan aktibazio esanguratsua (P<0,05 doitua, aldaketa >2, adierazpena nukleoen %10ean gutxienez) duten geneen gene-multzoaren aberastasunaren analisia (Fisherren testa zehatza), in vivo saguetan identifikatutako jarduera-menpeko gene goiztiar (ERG) eta berantiar (LRG) multzoekin alderatuta16 eta in vitro neuronetatik eratorritako gizakien LRG espezifikoekin17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化> 2，在至少%10的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类牧异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 神经 元 临 元 比<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 % 10的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （分析 （分析 （分析 （单（单） 核中 表达）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 基因组 16 和 神 神 17中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутамч сравнению с глутамчтельно нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее % 10 Анализ обоногащ гниогаще (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) eta позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 eta нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO neurona glutamatergikoak nabarmen gorago erregulatu ziren hCO neurona glutamatergikoekin alderatuta (P <0,05 doitua, aldaketa >2, gutxienez % 10). Erantzun goiztiarreko (ERG) eta erantzun berantiarreko geneen aberaste-analisia (Fisherren proba zehatza isats bakarrekoa) in vivo saguetan16 eta in vitro neuronetan identifikatutako erantzun-jardueraren menpeko geneak (LRGak).17 Gizakien LRG espezifikoak.Lerro puntuatuak Bonferroni-k zuzendutako 0,05eko P balioa adierazten du. h, GluN genearen adierazpena (gene bakoitzaren pseudo-paketea eta eskalatzea) nabarmen goranzko erregulazioa izan zuen LRG geneen snRNA-seq errepliketan t-hCO neurona glutamatergikoetan. i, SCG2 adierazpena erakusten duen immunomarkaketa t-hCO (goiko) eta hCO (beheko) neuronetan. Gezi zuriek SCG2+ zeluletara seinalatzen dute. Eskala-barra, 25 µm. Datuak batez besteko ± desbideratze estandar gisa adierazten dira.
Ex vivo xerratan t-hCOren jarduera handituan oinarrituta, snRNA-seq-ek geneen transkripzioen jarduera-menpeko goranzko erregulazioa agerian utzi zuen t-hCO-n in vitro hCO-rekin alderatuta. Glutamatergiko t-hCO neuronek erantzun berantiarren jarduera erregulatzen duten geneen maila altuagoak adierazi zituzten (2g eta h irudiak), sagu eta gizakien neuronetan egindako aurreko ikerketetan aurkitu zirenak16,17. Adibidez, BDNF18, SCG2 eta OSTN, primateen jarduera erregulatzen duen gene espezifiko batek, adierazpen handiagoa erakutsi zuen t-hCO neuronetan hCO neuronekin alderatuta (2g-i irudia). Horrela, t-hCO neuronek heltze-ezaugarri hobetuak erakutsi zituzten hCO neuronekin alderatuta transkripzio-, morfologia- eta funtzionaltasun-analisien bidez.
t-hCO heltzearen eta giza garunaren garapenaren arteko lotura gehiago ebaluatzeko, fetuaren eta helduen kortex-zelula moten transkriptomika-konparaketak egin genituen19,20 eta helduen21,22, baita garapenean zehar kortex-geneen adierazpenari buruzko datu zabalak ere23 (datu zabalduak, 5. irudia). Aurreko lanarekin24, hCO eta t-hCO transkriptomaren heltze-egoera globala 7-8 hilabeteko bereizketan in vivo garapen-denborarekin bat dator orokorrean eta bizitza fetalaren amaierarekin baliokideena da (Datu zabalduak, 5a irudia). Aipagarria da, t-hCO-n transkriptomaren heldutasun handiagoa ikusi dugula adinarekin bat datorren hCO-rekin alderatuta, baita sinaptogenesiarekin, astrogenesiarekin eta mielinizazioarekin lotutako transkriptomaren aktibazioa ere (datu zabalduak, 5b-d irudiak). Zelula-mailan, kortex-azpimota meheago baten ebidentzia aurkitu dugu t-hCO-n, neurona glutamatergikoen multzoak helduen L2/3, L5 eta L6 neurona azpimotekin gainjartzen direla (1i irudia). Aitzitik, t-hCO neurona glutamatergikoen eta neurona kortikale fetalen arteko multzoen gainjartzea mugatuagoa izan zen haurdunaldiaren erdialdean (datu zabalduak, 5e-j irudia). t-hCO neuronak funtzionalki gizakien neokortikal neuronen antzekoak diren zehazteko, gizakien L2/3 neurona piramidalen erregistro elektrofisiologikoak eta berreraikuntza anatomikoak egin genituen gizakien kortex postnataleko atal zorrotzetan (datu zabalduak, 7a irudia). L2/3 neurona piramidalen propietate elektrofisiologikoak t-hCO neurona piramidalen antzekoak ziren (datu zabalduak, 7e irudia). Morfologikoki, gizakien lagin postnataletako L2/3 neuronak t-hCOren antzekoagoak ziren hCOrenak baino, nahiz eta L2/3 zelulak luzeagoak ziren, adar gehiago zituzten oro har eta bizkarrezurreko dentsitate handiagoa zuten (3g irudia eta datu zabalduak, 7b- irudia). G).
a, kontrol eta TS hiPS zelula-lerroek ekoitzitako hCOren transplantea arratoi jaioberrietan. b, biozitinaz betetako t-hCO neuronen 3D berreraikuntza 8 hilabeteko bereizketaren ondoren. c, batez besteko luzera dendritikoen kuantifikazioa (n = 19 kontrol neurona, n = 21 TS neurona; **P = 0,0041). d, kontrol eta TS t-hCO-tik 3D bidez berreraikitako adar dendritikoak 8 hilabeteko bereizketan, eta bizkarrezurreko dendritaren dentsitatearen kuantifikazioa (n = 16 kontrol neurona, n = 21 TS neurona, ***P < 0,0001). d, kontrol eta TS t-hCO-tik 3D bidez berreraikitako adar dendritikoak 8 hilabeteko bereizketan, eta bizkarrezurreko dendritaren dentsitatearen kuantifikazioa (n = 16 kontrol neurona, n = 21 TS neurona, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцев дифференцен ковковко оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontrol eta t-hCO TS-tik adar dendritikoen 3D berreraikuntza, bereizketaren 8 hilabetetan eta bizkarrezurreko dentsitatearen kuantifikazioa (n=16 kontrol neurona, n=21 TS neurona, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 棘 密度 重建   分支神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировей контроля и ирововки через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontrol-adar dendritikoen eta TS t-hCO3-ren 3D berreraikuntza, bereizketaren 8 hilabetetan eta bizkarrezurreko dentitatearen kuantifikazioa (n=16 kontrol-neurona, n=21 TS neurona, ***P<0,0001).Asterisko gorriek ustezko bizkarrezurra dendritikoa adierazten dute. e, kontrol eta TS t-hCO neuronetan EPSC espontaneoak 8 hilabeteko bereizketaren ondoren. f, maiztasun metatuaren grafikoa eta gertaera sinaptikoen maiztasunaren eta anplitudearen kuantifikazioa (n=32 kontrol neurona, n=26 TS neurona; **P=0,0076 eta P=0,8102). g, TS eta kontrol neuronen Scholl analisia hCO eta t-hCO-n. Lerro etenek gizakien L2/3 neurona piramidal postnatalak erakusten dituzte konparaziorako (n = 24 kontrol t-hCO neurona, n = 21 TS t-hCO neurona, n = 8 kontrol hCO neurona eta n = 7 TS hCO neurona). Datuak batez besteko ± desbideratze estandar gisa adierazten dira.
t-hCO-k giza kortexeko neuronen ezaugarri morfologiko eta funtzionalak maila altuan erreplikatzeko duen gaitasunak bultzatu gintuen t-hCO gaixotasunen fenotipoak detektatzeko erabil zitekeen aztertzera. TS-n zentratu ginen, CaV1.2 kodetzen duen genean funtzio-irabazi mutazioek eragindako garapen neurologikoko nahaste larria, neuronen jarduera-menpeko geneen transkripzioa hasten duena. Ordezkapen ohikoena (p.G406R) zuten hiru TS pazienteengandik eta hiru kontrolengandik lortu genuen hCO (3a irudia). Transplantearen ondoren, ikusi genuen TS neuronen morfologia dendritikoa aldatuta zegoela kontrolekin alderatuta (3b irudia eta datu zabalduak, 8a,b irudiak), dendrita primarioen kopurua bikoiztu egin zela eta dendrita-luzeraren batez besteko eta orokorreko jaitsiera handitu zela (3c irudia eta datu zabalduak, 8c irudia). Honek bizkarrezur-dentsitate handiagoarekin eta EPSC espontaneoen maiztasun handiagoarekin lotuta zegoen TS-n kontrol-neuronekin alderatuta (3d-f irudiak eta datu zabalduak, 8g irudia). Analisi gehiagok t-hCO TS-n adarkadura dendritiko anormalen ereduak agerian utzi zituzten kontrolekin alderatuta, baina ez in vitro TS hCO-n bereizketa-etapa antzeko batean (3g irudia). Hau bat dator TS-n jarduera-menpeko uzkurdura dendritikoari buruzko gure aurreko txostenekin eta transplante-plataforma honek gaixotasunen fenotipoak in vivo detektatzeko duen gaitasuna azpimarratzen du.
Ondoren, galdetu genuen zein neurritan integratuta dauden funtzionalki t-hCO zelulak arratoiaren S1-ean. Karraskarien S1-ek sinapsi-sarrera sendoak jasotzen ditu ipsilateral bentral basal eta atzeko talamo-nukleoetatik, baita ipsilateral motor eta bigarren mailako somatosentsorialen kortexetatik eta kontralateral S1-etik ere (4a irudia). Inerbazio-eredua berreskuratzeko, hCO amorruaren birusarekin-dG-GFP/AAV-G infektatu genuen eta hCO transplantatu genion S1 arratoiari 3 egun geroago. GFP adierazpen trinkoa ikusi genuen ipsilateral S1-eko eta bentral basal gongoiletako neuronetan transplantearen 7-14 egun igaro ondoren (4b eta c irudiak). Horrez gain, talamo-markatzaile netrina G1-aren antigorputzen tindaketak talamo-bukaerak t-hCO-n agerian utzi zituen (4d eta e irudiak). Proiekzio aferente hauek t-hCO zeluletan erantzun sinaptikoak eragin ditzaketen ebaluatzeko, zelula osoko erregistroak egin genituen giza zeluletatik talamokortikaleko geruzaren sekzio zorrotzetan. Arratoiaren S1, barne-kapsula, materia zuria, t-hCO ondoko zuntzen estimulazio elektrikoa edo t-hCO-n opsina adierazten duten talamo-bukaeren aktibazio optogenetikoa AMPA hartzaileen NBQX antagonistaren eraginpean dauden t-hCO neuronetan latentzia laburreko EPSCak induzitu zituen. (4f eta g irudiak eta datu zabalduak, 9a-g irudiak). Datu hauek erakusten dute t-hCO anatomikoki integratuta dagoela arratoiaren garunean eta arratoi ostalariaren ehunak aktibatu dezakeela.
a, Amorruaren jarraipen-esperimentu baten eskema-diagrama. b, GFP eta gizakien STEM121 adierazpena t-hCO eta arratoiaren garun-kortexaren artean (goiko panela). GFP adierazpena ere erakusten da arratoiaren ipsilateral bentral basal nukleoan (VB) (beheko ezkerrean) eta ipsilateral S1-ean (beheko eskuinean). Eskala-barra, 50 µm. Karratu gorriek irudiak hartu ziren garuneko eremuak adierazten dituzte. c, GFP adierazten duten zelulen kuantifikazioa (n = 4 arratoi). d, e — Netrina G1+ talamo-terminalak t-hCO-n. d-k t-hCO eta VB nukleoak dituen korona-ebaki bat erakusten du. Eskala-barra, 2 mm. e-k Netrina G1 eta STEM121 adierazpena erakusten du t-hCO (ezkerrean) eta VB (eskuinean) neuronetan. Eskala-barra, 50 µm. Laranja koloreko puntu-lerroak t-hCO ertza adierazten du. f, g, t-hCO neuronen uneko arrastoak S1 arratoian (f) edo barne-kapsulan (g) estimulazio elektrikoaren ondoren, NBQX-rekin (morea) edo gabe (beltza) (ezkerrean). EPSC anplitudeak NBQX-rekin eta gabe (n = 6 S1 neurona, *P = 0,0119; eta n = 6 barne-kapsulako neurona, **P = 0,0022) (erdian). Arratoiaren S1 (f) edo barne-kapsularen (g) (eskuinean) estimulazio elektrikoari erantzunez EPSC erakusten duten t-hCO neuronen ehunekoa. aCSF, bizkarrezur-muineko likido artifiziala. h, 2P irudi-esperimentuaren diagrama eskematikoa (ezkerrean). GCaMP6-en adierazpena t-hCO-n (erdian). Eskala-barra, 100 µm. GCaMP6-en fluoreszentzia denbora-tartea (eskuinean). i, jarduera espontaneoaren fluoreszentziaren Z puntuazioa. j, bibote-estimulazioaren ilustrazio eskematikoa. k, z puntuaziodun 2P fluoreszentzia ibilbideak saiakuntza batean, zero unean biboteen desbideratzearekin lerrokatuta (lerro etena) adibide-zeluletan. l, zelula guztien populazioaren batez besteko z puntuazio erantzunak, zero unean biboteen desbideratzearekin lerrokatuta (lerro etena) (gorria) edo ausaz sortutako denbora-zigiluekin (grisa). m. Markatze optikoko esperimentuaren eskema-diagrama. n, t-hCO zelula baten tentsio-kurba gordinak laser urdinaren estimulazioan edo biboteen desbideratzean. Gezi gorriek argiak eragindako lehen puntak adierazten dituzte (goian) edo biboteen desbideratzeak eragindakoak (behean). Itzaldura grisak biboteen desbideratze-aldiak adierazten ditu. o, Argi-uhinen gailurrak eta biboteen desbideratze-erantzunak. p, saiakera bakarreko puntak, adibide-zeluletan biboteen desbideratzearekin lerrokatuta. 0-k biboteen desbideratzea adierazten du (lerro etena). q, zelula fotosentikor guztien populazioaren batez besteko z puntuazio jaurtiketa-tasa, zero unean biboteen desbideratzearekin lerrokatuta (lerro etena) (gorria) edo ausaz sortutako denbora-zigiluekin (grisa). r, Biboteen desbideratzeak nabarmen modulatutako unitate fotosentikorren proportzioa (n = 3 arratoi) (ezkerrean). Z-puntuazio latentzia maximoa (n = 3 arratoi; n = 5 (berde argia), n = 4 (berde iluna) eta n = 4 (ziana) biboteen desbideratze modulazio unitate arratoi bakoitzeko) (eskuinean). Datuak batez besteko ± desbideratze estandar gisa adierazten dira.
Ondoren, t-hCO estimulu sentsorialen bidez in vivo aktibatu zitekeen galdetu genuen. GCaMP6 kaltzio adierazle genetikoki kodetuak adierazten dituen hCO transplantatu genien S1 arratoietan. 150 egun igaro ondoren, zuntz fotometria edo bi fotoiko kaltzio irudigintza egin genuen (4h irudia eta datu zabalduak, 10a irudia). Ikusi genuen t-hCO zelulek jarduera erritmiko sinkronizatua erakusten zutela (4i irudia, Datu zabalduak, 10b irudia eta 1. bideo osagarria). t-hCO jarduera maximoa karakterizatzeko, zelulaz kanpoko erregistro elektrofisiologikoak egin genituen transplantatutako arratoi anesteziatuetan (datu zabalduak, 10c-f irudiak). MRI irudietatik koordenatu estereotaxikoak sortu ditugu; beraz, grabatutako unitate hauek ustezko giza neuronak adierazten dituzte, nahiz eta elektrofisiologiak berak ez duen jatorrizko espezie bat zehazten uzten. Jarduera eztanda sinkronizatuak ikusi genituen (datu zabalduak, 10d irudia). Eztandek 460 ms inguru iraun zuten eta 2 segundo inguruko isilune-aldiek bereizita zeuden (datu zabalduak, 10d eta e irudiak). Unitate bakoitzak batez beste hiru jaurtiketa egin zituen eztanda bakoitzeko, hau da, eztanda bakoitzeko erregistratutako unitateen % 73 inguru. Unitate bakoitzaren jarduerak oso korrelazionatuta zeuden, eta korrelazio horiek baldintza berdinetan erregistratutako animalia txertatu gabeetan identifikatutako unitateenak baino handiagoak ziren (datu zabalduak, 10f irudia). Identifikatutako gizakiengandik eratorritako neuronen punta-erantzunak hobeto karakterizatzeko, argi-etiketatze esperimentuak egin genituen rodopsina 2 (hChR2) katioi-kanal fotosentikorra adierazten duen hCOarekin transplantatutako arratoi anesteziatuetan, zeinaren bidez t-hCO neuronek latentzia laburreko ezagutza (10 ms baino gutxiago) egiten duten argi urdinaren estimuluei erantzunez (4m-o irudiak). t-hCO neuronek jarduera espontaneoaren eztandak erakutsi zituzten kaltzioaren irudietan behatutakoen antzeko maiztasunetan, baita t-hCO-n argi-markaketarik gabe egindako erregistro elektrofisiologikoetan ere (datu zabalduak, 10c-g irudiak). Ez zen jarduera espontaneorik ikusi in vitro erregistratutako hCO-ren etapetan. Zentzumen-estimuluen bidez t-hCO aktibatu zitekeen ebaluatzeko, arratoi-biboteak laburki desbideratu genituen t-hCO-tik (4j eta m irudiak eta datu zabalduak, 10h eta k irudiak). Aurreko ikerketen arabera8,10, t-hCO zelulen azpimultzo batek jarduera handitua erakutsi zuen biboteen desbideratzearen aurrean, baina hori ez zen ikusi datuak denbora-zigilu aleatorioekin alderatu zirenean (4k-q irudiak eta datu zabalduak, 10h-q irudiak). Izan ere, optometriadun unitate bakarren % 54 inguruk kitzikapen-tasa nabarmen handitu zuten biboteen estimulazioaren ondoren, 650 ms inguruan gailurra lortuz (4r irudia). Datu hauek guztiek iradokitzen dute t-hCO-k sarrera funtzional egokiak jasotzen dituela eta ingurumen-estimuluen bidez aktibatu daitekeela.
Ondoren, t-hCO-k arratoiengan portaera kontrolatzeko zirkuituak aktibatu zitzakeen ikertu genuen. Lehenik eta behin, t-hCO neuronen axoiak arratoiaren inguruko ehunetara proiektatzen diren ikertu genuen. HCO infektatu genuen EYFP-ri fusionatutako hChR2 kodetzen duen lentibirus batekin (hChR2-EYFP). 110 egun igaro ondoren, EYFP-ren adierazpena ikusi genuen ipsilateral kortex eskualdeetan, entzumen, motor eta somatosentsorialeko kortexak barne, baita subkortex eskualdeetan ere, estriatua, hipokanpoa eta talamoa barne (5a irudia). Proiekzio eferente hauek arratoi zeluletan erantzun sinaptikoak eragin zitzaketen ebaluatzeko, hChR2-EYFP adierazten zuten t-hCO zelulak optikoki aktibatu genituen, arratoi garuneko kortexeko zelulak garuneko sekzio zorrotzetan grabatuz. t-hCO axoien aktibazioak argi urdinarekin latentzia laburreko EPSCak eragin zituen arratoi piramide kortexeko neuronetan, eta NBQX-k blokeatu zituen (5b-g irudiak). Gainera, erantzun hauek tetrodotoxinak (TTX) blokeatu eta 4-aminopiridinak (4-AP) leheneratu ditzake, eta horrek iradokitzen du konexio monosinaptikoek eragin zituztela (5e irudia).
a, Axoiaren jarraipenaren eskema-diagrama (ezkerrean). t-hCO EYFP adierazpena (eskuinean). Eskala-barra, 100 µm. A1, entzumen-kortexa, ACC, aurreko zingulu-kortexa, d. estriatua, dortsal estriatua, HPC, hipokanpoa; Diafragma, alboko septuma, mPFC, erdiko prefrontal-kortexa, piriformea, piriforme-kortexa, v. estriatua, bentral estriatua, VPM, talamoaren bentropostomedial-nukleoa, VTA, bentral tegmental eskualdea. Karratu gorriek irudiak hartu ziren garuneko eremuak adierazten dituzte. b, Estimulazio-esperimentuaren eskema-diagrama. c, d, Argi urdinak eragindako fotokorrontearen (goian) eta tentsioaren (behean) erantzunaren adibideak gizakien (c) EYFP+ t-hCO edo arratoien (d) EYFP- zeluletan. e, f, Arratoi-neuronen egungo arrastoak t-hCO axoien argi urdinaren estimulazioaren ondoren TTX eta 4-AR (berdea), TTX (grisa) edo aCSF (beltza) (e), NBQX-rekin (morea) edo gabe (beltza)) (e). g, arratoi-zeluletan argi urdinak eragindako erantzunen latentzia (n = 16 zelula); barra horizontalek batez besteko latentzia adierazten dute (7,13 ms) (ezkerrean). NBQX-rekin edo gabe erregistratutako argi-eragile EPSCen anplitudea (n = 7 zelula; ***P < 0,0001) (erdian). NBQX-rekin edo gabe erregistratutako argi-eragile EPSCen anplitudea (n = 7 zelula; ***P < 0,0001) (erdian). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецн). NBQX-rekin edo gabe erregistratutako argi-induzitutako EPSC-en anplitudea (n = 7 zelula; ***P < 0,0001) (erdian).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецн). NBQX-rekin edo gabe erregistratutako argi-induzitutako EPSC-en anplitudea (n = 7 zelula; ***P < 0,0001) (erdian).Argi urdinari erantzuten dioten EPSCak erakusten dituzten arratoi-zelulen ehunekoa (eskuinean). h, Jokabide-zeregin baten eskema. d0, 0. eguna. i. Animalia eredugarrien errendimendua entrenamenduaren 1. egunean (ezkerrean) edo 15. egunean (eskuinean). 1. egunean (ezkerrean) edo 15. egunean (erdian eskuinean) egindako miazkada kopuruaren batez bestekoa (n = 150 argi urdin saiakera, n = 150 argi gorri saiakera; ***P < 0,0001). 1. egunean (ezkerrean) edo 15. egunean (erdian eskuinean) egindako miazkada kopuruaren batez bestekoa (n = 150 argi urdin saiakera, n = 150 argi gorri saiakera; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). 1. egunean (ezkerrean) edo 15. egunean (erdian, eskuinean) egindako miazkada kopuruaren batez bestekoa (n = 150 argi urdin saiakera, n = 150 argi gorri saiakera; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). 1. egunean (ezkerrean) edo 15. egunean (erdian, eskuinean) egindako miazkada kopuruaren batez bestekoa (n = 150 argi urdin saiakera, n = 150 argi gorri saiakera; ***P < 0,0001).1. egunean (ezkerrean erdian) edo 15. egunean (eskuinean) argi gorri eta urdineko proben metatutako miazkadak. NS, ez esanguratsua. j,k, 1. edo 15. egunean hChR2-EYFP (j) edo kontrol fluoroforoa (k) adierazten duen t-hCO transplantatu zitzaien animalia guztien portaera-ezaugarriak (hChR2-EYFP: n = 9 arratoi, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Hobespen puntuazioaren bilakaera (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Hobespen puntuazioaren bilakaera (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Hobespen puntuazioaren bilakaera (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Hobespen puntuazioen bilakaera (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS adierazpena S1-en t-hCO-ren aktibazio optogenetikoaren aurrean. FOS espresioaren irudiak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (n = 3 talde bakoitzeko; *P < 0,05, **P < 0,01 eta ***P < 0,001) (eskuinean) erakusten dira. FOS espresioaren irudiak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (n = 3 talde bakoitzeko; *P < 0,05, **P < 0,01 eta ***P < 0,001) (eskuinean) erakusten dira. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) eta количественного определения (n = 3 на группу;, * P *** 0, 0 5, ** P *** 0, 0, 0 *** 0, 0 P *** <0,001) (spрава). FOS espresioaren irudiak (ezkerrean) eta kuantifikazioarenak (n = 3 talde bakoitzeko; *P<0,05, **P<0,01 eta ***P<0,001) erakusten dira (eskuinean).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) eta количественного определения (n = 3 на группу;, * P *** 0, 0 5, ** P *** 0, 0, 0 *** 0, 0 P *** <0,001) (spрава). FOS espresioaren irudiak (ezkerrean) eta kuantifikazioarenak (n = 3 talde bakoitzeko; *P<0,05, **P<0,01 eta ***P<0,001) erakusten dira (eskuinean).Eskala-barra, 100 µm. Datuak BLAren, amigdal basolateralaren, MDTren, nukleo talamiko dorsomedialaren, PAGren eta gris periakueduktalaren batez besteko ± errore estandar gisa adierazten dira.
Azkenik, t-hCO-k arratoien portaera modulatu zezakeen galdetu genuen. Hori probatzeko, hChR2-EYFP adierazten duen hCO transplantatu genuen S1-en, eta 90 egun geroago, zuntz optikoak t-hCO-n txertatu genituen argia emateko. Ondoren, arratoiak baldintzatze operantearen paradigma aldatu batekin entrenatu genituen (5h irudia). Animaliak portaera-proba ganbera batean jarri genituen eta ausaz 5 segundoko laser estimulu urdinak (473 nm) eta gorriak (635 nm) aplikatu genituen. Animaliek ur-saria jasotzen zuten argi urdinaren estimulazioan miazkatzen bazuten, baina argi gorriaren estimulazioan ez bazuten miazkatzen. Entrenamenduaren lehen egunean, animaliek ez zuten alderik erakutsi miazkatzean argi urdinarekin edo gorriarekin estimulatzean. Hala ere, 15. egunean, hChR2-EYFP adierazten duen hCO transplantatu zitzaien animaliek miazkatzean aktiboagoa erakutsi zuten argi urdinarekin estimulatzean, argi gorriaren estimulazioarekin alderatuta. Miazkatzeko portaeran izandako aldaketa hauek ez ziren ikusi kontrol-fluoroforoa adierazten zuen hCO transplantatu zitzaien kontrol-animalietan (ikaskuntza-arrakasta-tasa: hChR2 % 89, EYFP % 0, 5i-1 irudia eta 2. bideo osagarria). Datu hauek iradokitzen dute t-hCO zelulek arratoien neuronak aktibatu ditzaketela sari-bilaketa portaera estimulatzeko. Zein arratoi t-hCO zirkuitu neuronal egon daitezkeen portaera-aldaketa hauetan inplikatuta jakiteko, optogenetikoki aktibatu genuen t-hCO animalia entrenatuetan eta ehunak bildu genituen 90 minutu geroago. Immunohistokimikak jarduera-menpeko FOS proteinaren adierazpena agerian utzi zuen portaera motibatuan parte hartzen duten hainbat garuneko eskualdetan, besteak beste, kortex prefrontal mediala, talamo mediala eta materia gris periakueduktala, eta hau kontrol-animalia estimulatu gabeetan edo animalietan adierazi zen. arroza. 5m). Datu hauek guztiek iradokitzen dute t-hCOk arratoien neuronen jarduera modula dezakeela portaera bultzatzeko.
Organoide neuronalak in vitro giza garapena eta gaixotasunak aztertzeko sistema itxaropentsua dira, baina in vivo dauden zirkuituen arteko konexio faltak mugatzen ditu. Plataforma berritzaile bat garatu dugu, non hCO transplantatu dugun jaio ondorengo arratoi immunokonprometituen S1-ean, giza zelulen garapena eta funtzioa in vivo aztertzeko. Erakutsi dugu t-hCO-k in vitro28 behatzen ez diren zelula heldu motak garatzen dituela eta t-hCO anatomikoki eta funtzionalki integratuta dagoela karraskarien garunean. t-hCO karraskarien zirkuitu neuronaletan integratzeak gizakien zelulen jardueraren eta aztertutako animalien portaeraren arteko lotura ezartzea ahalbidetu digu, t-hCO neuronek arratoien neuronen jarduera modula dezaketela erakutsiz portaera-erantzunak bultzatzeko.
Deskribatzen dugun plataformak hainbat abantaila ditu giza zelulak karraskarien garunetan transplantatzeko aurreko ikerketekin alderatuta. Lehenik eta behin, hCO transplantatu genuen jaio ondorengo arratoien garatzen ari ziren kortexean, eta horrek integrazio anatomikoa eta funtzionala erraztu dezake. Bigarrenik, t-hCO MRI monitorizazioak txertoaren posizioa eta hazkundea animalia bizidunetan aztertzeko aukera eman zigun, eta horrek epe luzeko animalia anitzeko ikerketak egiteko eta hainbat hiPS zelula-lerroren fidagarritasuna ezartzeko aukera eman zigun. Azkenik, organoide osoak transplantatu genituen, zelula bakarreko esekidura isolatuen ordez, eta horiek suntsipen gutxiago dute giza zelulentzat eta giza kortexeko neuronen integrazioa eta sorrera sustatu dezakete arratoien garunetan.
Onartzen dugu plataforma honetan egindako aurrerapenak gorabehera, denborazko, espazialeko eta espezie arteko mugapenek gizakien zirkuitu neuronalak fideltasun handiz eratzea eragozten dutela, garapenaren hasierako fase batean transplantatu ondoren ere. Adibidez, ez dago argi t-hCO-n behatutako jarduera espontaneoa garapen kortikalean behatutako jarduera erritmikoaren antzeko garapen-fenotipo bat adierazten duen, edo t-hCO-n dauden zelula mota inhibitzaileen gabeziaren ondorio den. Era berean, ez dago argi t-hCO-n laminazio faltak zenbateraino eragiten duen katearen konektibitatean30. Etorkizuneko lanak beste zelula mota batzuk integratzean zentratuko da, hala nola giza mikroglia, giza zelula endotelialak eta GABAergiko interneuronen proportzio aldakorrak, in vitro 6. muntaketa erabiliz erakusten den bezala, baita ulertzean nola gerta daitekeen integrazio eta prozesamendu neuronala t-hCO transkripzional, sinaptiko eta portaera maila aldatuetan pazienteengandik lortutako zeluletan.
Oro har, in vivo plataforma honek baliabide indartsua da, in vitro giza garunaren garapena eta gaixotasunen ikerketa osatu dezakeena. Aurreikusten dugu plataforma honek pazienteengandik eratorritako zeluletan kate-mailako fenotipo berriak aurkitzeko eta estrategia terapeutiko berriak probatzeko aukera emango digula.
Aurretik deskribatu bezala, hCO2.5 sortu genuen HiPS zeluletatik. Elikadura-geruzetan hazitako hiPS zeluletatik hCO ekoizpena hasteko, hiPS zelulen kolonia osoak kendu ziren hazkuntza-plaketatik dispasa erabiliz (0,35 mg/mL) eta atxikimendu ultra-baxuko plastikozko hazkuntza-guneetara eraman ziren, hiPS zelulen hazkuntza-ingurunearekin zituzten platerak zituztenak. (Corning) bi SMAD inhibitzailerekin osatuta: dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) eta SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) eta ROCK inhibitzailea Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Lehenengo 5 egunetan, hiPS zelulen hazkuntza-ingurunea egunero aldatu zen eta dorsomorfina eta SB-431542 gehitu ziren. Seigarren egunean esekiduran, esferoide neuronalak neurobasal-A (10888, Life Technologies), A bitaminarik gabeko B-27 osagarria (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penizilina eta estreptomizina (1:100, Life Technologies) zituen ingurune neuronal batera transferitu ziren, eta hazkuntza-faktore epidermikoa (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) eta fibroblastoen hazkuntza-faktore 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) gehitu zitzaizkien 24. egunera arte. 25. egunetik 42. egunera arte, ingurunea garunetik eratorritako faktore neurotrofikoarekin (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) eta neurotrofina 3rekin (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) osatu zen, ingurunea bi egunetik behin aldatuz. Seigarren egunean esekiduran, esferoide neuronalak neurobasal-A (10888, Life Technologies), A bitaminarik gabeko B-27 osagarria (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penizilina eta estreptomizina (1:100, Life Technologies) zituen ingurune neuronal batera transferitu ziren, eta hazkuntza-faktore epidermikoa (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) eta fibroblastoen hazkuntza-faktore 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) gehitu zitzaizkien 24. egunera arte. 25. egunetik 42. egunera arte, ingurunea garunetik eratorritako faktore neurotrofikoarekin (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) eta neurotrofina 3rekin (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) osatu zen, ingurunea bi egunetik behin aldatuz.Seigarren egunean esekiduran, esferoide neuronalak Neurobasal-A (10888, Life Technologies), A bitaminarik gabeko B-27 osagarria (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) eta penizilina zituen ingurune neuronal batera transferitu ziren.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) eta дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; I+D Systems) eta фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; I+D Systems) до 24-го дня. eta estreptomizina (1:100, Life Technologies) eta hazkuntza epidermikoaren faktorearekin (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) eta fibroblastoen hazkuntza faktore 2arekin (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) osatuta 24. egunera arte.25. egunetik 42. egunera, garunetik eratorritako faktore neurotrofikoa (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) eta neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) gehitu zitzaizkion hazkuntza-inguruneari, bi egunetik behin aldatuz.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉1素的神经培养基中和链霉（1000（Life:100 Teknologiak）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；I+G Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；I+G Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 縠 吃体 縠 含有b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链 （ ） （ （ 链 （ 100 Teknologiak） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； I+G Sistemak） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；I+G Sistemak）直至穀㬀24凳 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы (Life Technologies), На 6-й день нейробаферы (Life Technologies) В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, (1:) Life Technologies 1000 добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; I+G Systems) eta фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6. egunean, neurosferen esekidurak neurobasal-A (10888, Life Technologies), A bitaminarik gabeko B-27 osagarria (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penizilinaz neutralizatutako estreptomizina (1:100, Life Technologies) hazkuntza epidermikoaren faktorearekin (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) eta fibroblastoen hazkuntza faktore 2 (FGF2; 20 ng ml-1) osatua zituen osagarri batera aldatu ziren. I+G sistemak) до 24-го дня. I+G Sistemak) 24. egunera arte.25. egunetik 42. egunera, garunetik eratorritako faktore neurotrofikoa (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) eta faktore neurotrofiko 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) hazkuntza-inguruneari gehitu zitzaizkion bi egunetik behin. Ingurunea behin aldatu.43. egunetik aurrera, hCO neurobasal-A medio osagarririk gabekoan mantendu zen (NM; 1088022, Thermo Fisher), medioa 4-6 egunetik behin aldatuz. Elikadura-baldintzarik gabeko hiPS zeluletatik hCO lortzeko, hiPS zelulak Accutase-rekin (AT-104, Innovate Cell Technologies) inkubatu ziren 37 °C-tan 7 minutuz, zelula bakarretan disoziatu eta AggreWell 800 plaketan (34815, STEMCELL Technologies) jarri ziren putzu bakoitzeko 3 × 106 zelula bakarreko dentsitatearekin, ROCK inhibitzaile Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) osaturiko Essential 8 medioan. 24 ordu igaro ondoren, putzuetako medioa pipeteatu zen gora eta behera dorsomorfinaz (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) eta SB-431542z (10 μM; 1614) osaturiko Essential 6 medioa (A1516401, Life Technologies) zuen medioan. , Tocrida). 2. egunetik 6. egunera, Essential 6 medioa egunero ordezkatu zen dorsomorfinaz eta SB-431542 osagarriaz. Seigarren egunetik aurrera, neurosferen esekidurak neurobasal mediora eraman eta goian deskribatutako moduan mantendu ziren.
Animalien prozedura guztiak Stanford Unibertsitateko Laborategiko Animalien Zaintzako Administrazio Batzordeak (APLAC) onartutako animalien zaintzarako jarraibideen arabera egin ziren. RNU eutimiko (rnu/+) arratoi haurdunak erosi ziren (Charles River Laboratories) edo ostatu hartu zuten. Animaliak 12 orduko argi-iluntasun ziklo batean eduki ziren, janaria eta ura ad libitum zutela. Hiru eta zazpi egun bitarteko arratoi kume biluzik (FOXN1–/–) bibote heldugabeen hazkuntzagatik identifikatu ziren, hil aurretik. Kumeak (arrak eta emeak) % 2-3 isofluranoarekin anestesiatu eta estereotaxiko marko batean jarri ziren. S1-tik gorako 2-3 mm-ko diametroa zuen garezurraren trepanazioa egin zen, dura mater-aren osotasuna mantenduz. Ondoren, 30-G-ko orratz bat erabili (0,3 mm inguru) kraniotomiaren kanpoaldean dura zulatzeko. Ondoren, aplikatu HCO 3×3 cm-ko parafilm mehe batean eta kendu soberako medioa. 23 G-ko 45°-ko orratz bati lotutako Hamilton xiringa bat erabiliz, sartu hCO3 astiro-astiro orratzaren mutur distalenera. Ondoren, instalatu xiringa estereotaxiko gailura konektatutako xiringa-ponpan. Jarri orratzaren punta aurretik duraman egindako 0,3 mm-ko zabalerako zulo baten gainean (z = 0 mm) eta estutu xiringa 1-2 mm (z = gutxi gorabehera –1,5 mm) orratza A duramaterren artean egon arte. Zigilu trinko bat sortzen da. Ondoren, altxatu xiringa kortexaren gainazalaren erdigunera z = -0,5 mm-n eta injektatu hCO3 minutuko 1-2 µl-ko abiaduran. HCO3 injekzioa amaitutakoan, orratza minutuko 0,2-0,5 mm-ko abiaduran erretiratzen da, azala josi egiten da eta txakurkumea berehala jartzen da berogailu-kotoi epel batean guztiz sendatu arte. Animalia batzuk alde bietatik transplantatu ziren.
Animalien prozedura guztiak Stanford Unibertsitateko APLACek onartutako animalien zaintzarako jarraibideen arabera egin ziren. Arratoiak (transplantea egin eta 60 egun baino gehiago igaro ondoren) % 5eko isoflurano anestesiarekin induzitu eta % 1-3ko isofluranoarekin anestesiatu ziren irudiak hartzean zehar. Bistaratzerako, 7 Teslako Bruker (Bruker Corp.) zulo-eskaner horizontal aktiboki babestua, International Electric Company (IECO) gradiente-unitate batekin, 120 mm-ko barne-diametroa zuen gradiente-txertatze babestu bat (600 mT/m, 1000 T/m/s) erabili ziren AVANCE.III erabiliz, zortzi kanaleko bobina anitzeko RF eta nukleo anitzeko gaitasunak, eta Paravision 6.0.1 plataformarekin. Grabaketa 86 mm-ko barne-diametroa zuen RF bobina bolumiko aktiboki desakoplatu bat eta jasotzeko soilik lau kanaleko kriohoztutako RF bobina bat erabiliz egin zen. Axial 2D Turbo-RARE (errepikapen-denbora = 2500 ms, oihartzun-denbora = 33 ms, 2 batez besteko) 16 xerra-harrapakinekin, xerra-lodiera 0,6–0,8 mm-koa, 256 × 256 lagin dituena. Seinaleak 2 cm-ko barne-diametroa zuen koadratura-transzeptore bolumikoko RF bobina bat erabiliz jaso ziren (Rapid MR International, LLC). Azkenik, erabili barneko Imaris (BitPlane) gainazalaren estimazio-funtzioak 3D errendatzerako eta bolumen-analisirako. Transplante arrakastatsu bat transplantatutako hemisferioan T2-haztatutako MRI seinale jarraituaren eremuak sortu ziren bezala definitu zen. Txertoaren errefusa transplantatutako hemisferioan T2-haztatutako MRI seinale jarraituaren eremuak sortzen ez zituen txerto bat bezala definitu zen. t-hCO subkortikala ondorengo analisietatik kanpo utzi zen.
GCaMP6ak hCO-n egonkor adierazteko bi fotoiko kaltzio-irudietarako, hiPS zelulak pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro-rekin infektatu ziren, eta ondoren antibiotikoak hautatu ziren. Laburbilduz, zelulak EDTA-rekin disoziatu eta Essential 8 medio 1 ml-tan eseki ziren, gutxi gorabehera 300.000 zelulako dentsitatean, polibrenoaren (5 μg/ml) eta 15 μl birusaren aurrean. Ondoren, zelulak esekiduran inkubatu ziren 60 minutuz eta putzu bakoitzeko 50.000 zelulako dentsitatean erein ziren. Konfluentziaren ondoren, zelulak 5-10 μg ml-1 puromizina-rekin tratatu ziren 5-10 egunez edo kolonia egonkorrak agertu arte. HCO infekzio akutua aurretik deskribatu bezala egin zen5, aldaketa batzuekin. Laburbilduz, 30-45 eguneko hCO 1,5 ml-ko Eppendorf mikrozentrifuga-hodietara transferitu, 100 µl nerbio-medio dutenak. Ondoren, gutxi gorabehera 90 µl medio kentzen dira, 3-6 µl lentibirus titulu handiko (0,5 x 108-tik 1,2 x 109-ra) gehitzen dira hodira, eta hCO inkubagailura eramaten da 30 minutuz. Ondoren, gehitu 90-100 µl medio hodi bakoitzera eta itzuli hodiak inkubagailura gau osoan. Hurrengo egunean, transferitu hCO nerbio-medio freskora atxikimendu baxuko plaketan. 7 egun igaro ondoren, hCO 24 putzuko beirazko hondoa duten plaketara transferitu zen infekzioaren kalitatea bistaratzeko eta ebaluatzeko. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE eta pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder-ek sortu zituen. Lentibirusa esperimentu gehienetan erabiltzen da ostalariaren genoman integratuta dagoelako, eta horrek erreporter geneen adierazpena ahalbidetzen du infektatutako zelula-lerroetan. Amorruaren jarraipenerako, 30-45 egunetan hCO amorru-ΔG-eGFP eta AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA-rekin (plasmidoa #67528, Addgene) batera infektatu zen, 3 egunez ondo garbitu zen, eta S1-eko arratoietan transplantatu eta in vivo mantendu zen 7-14 egunez.
Immunozitokimikarako, animaliak anesteziatu eta PBSrekin transkardiaz perfusatu ziren, eta ondoren % 4ko paraformaldehidoa (PFA PBSn; Electron Microscopy Sciences). Garunak % 4ko PFAn finkatu ziren 2 orduz edo gau osoan 4 °C-tan, % 30eko sakarosan kriokontserbatu ziren PBSn 48-72 orduz, eta 1:1eko % 30eko sakarosa: OCTn (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) txertatu ziren, eta korona-ebakiak 30 µm-tan egin ziren kriostato bat erabiliz (Leica). Ebaki lodien immunohistokimikarako, animaliak PBSrekin perfusatu ziren, eta garuna disekzionatu eta koronalago sekzionatu zen 300-400 µm-tan bibratomo bat erabiliz (Leica) eta ebakiak % 4ko PFArekin finkatu ziren 30 minutuz. Ondoren, kriosekzioak edo sekzio lodiak PBSrekin garbitu ziren, ordubetez blokeatu ziren giro-tenperaturan (% 10eko asto-seruma normala (NDS) eta % 0,3ko Triton X-100 PBSn diluitua) eta blokeatze-soluzioarekin blokeatu ziren 4 °C-tan. – Inkubazioa Kriosekzioak gau osoan inkubatu ziren eta sekzio lodiak 5 egunez. Erabilitako lehen mailako antigorputzak hauek izan ziren: anti-NeuN (sagua, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (arratoia, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (untxia, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (oilaskoa, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sagua, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (untxia, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (untxia, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (untxia, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (sagua, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (untxia, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ahuntza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ahuntza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sagua, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sagua, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (untxia, 1:400; ABN904, Millipore) eta anti-IBA1 (ahuntza, 1:100; ab5076, abcam). Erabilitako lehen mailako antigorputzak hauek izan ziren: anti-NeuN (sagua, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (arratoia, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (untxia, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (oilaskoa, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sagua, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (untxia, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (untxia, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (untxia, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (sagua, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (untxia, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ahuntza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ahuntza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sagua, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sagua, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (untxia, 1:400; ABN904, Millipore) eta anti-IBA1 (ahuntza, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:с12нка ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (,м,1912ь0, мы1:1:1000) abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab97:5ь, ab97:5ь, ab977819, 1:200); анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, I+D Systems), нетрин G1a (козин 1160, 6, 1160 sistema), 1:1160 анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) eta анти-IBA1 (коза, 1 :100; абббка, абб5076, мабка). Erabilitako antigorputz nagusiak hauek izan ziren: anti-NeuN (sagua, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (arratoia, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (untxia, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (oilaskoa, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sagua, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (untxia, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (untxia, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (untxia, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (sagua, 1:50; ab9774, abcam), SCG2ren aurkakoa (untxia, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), SOX9ren aurkakoa (ahuntza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (ahuntza, 1:100; AF1166, R&D Systems), STEM121ren aurkakoa (sagua, 1:200; Y40410, Takara Bio), SATB2ren aurkakoa (sagua, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67ren aurkakoa (untxia, 1:400; ABN904, Millipore) eta IBA1ren aurkakoa (ahuntza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠（1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，I+G Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:101D；；AF3075，R&G Systems） Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠（1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠（1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&G Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:1006；AF3075，R&D Systems） Sistemak）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sagua, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (untxia, 1:400; ABN904, Millipore) eta anti-IBA1 (ahuntza, 1:100; ab5076, abcam).Erabilitako antigorputz nagusiak hauek izan ziren: anti-NeuN (sagua, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (arratoia, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (untxia, 1:1000; Z0334, Dako). , GFPren aurkakoa (oilaskoa, 1:1000; GTX13970, GeneTex), HNAren aurkakoa (sagua, 1:200; ab191181, abcam), NeuNren aurkakoa (untxia, 1:500; ABN78, Millipore), PDGFRAren aurkakoa (untxia, 1:200; sc-338, Santa Cruz), PPP1R17ren aurkakoa (untxia, 1:200; HPA047819, Atlas antigorputza), RECA-1ren aurkakoa (sagua, 1:50; ab9774, abcam), SCG2ren aurkakoa (untxia), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, I+G sistemak), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, I+G sistemak), анти (;мы12ь, 0:12ь, мы12ь, 0:12ь Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) eta анти-IBA1, к1,610 абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ahuntza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ahuntza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sagua, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sagua, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (untxia, 1:400; ABN904, Millipore) eta anti-IBA1 (ahuntza, 1:100; ab5076, abkam).Ondoren, atalak PBS-rekin garbitu eta bigarren mailako antigorputzarekin inkubatu ziren ordubetez giro-tenperaturan (izoztutako atalak) edo gau osoan 4°C-tan (atal lodiak). Alexa Fluor bigarren mailako antigorputza (Life Technologies) erabili zen blokeatze-soluzioan 1:1000 diluituta. PBS-rekin garbitu ondoren, nukleoak Hoechst 33258 batekin (Life Technologies) bistaratu ziren. Azkenik, portaobjektuak mikroskopio batean jarri ziren estalkiekin (Fisher Scientific) Aquamount bat (Polysciences) erabiliz eta Keyence mikroskopio fluoreszente batean (BZ-X analyzer) edo Leica TCS SP8 mikroskopio konfokal batean (Las-X) aztertu ziren irudian. Irudiak ImageJ programa (Fiji) erabiliz prozesatu ziren. t-hCO-n eta arratoi-kortexean dauden neuronen proportzioa kuantifikatzeko, 387,5 μm-ko zabalerako irudi angeluzuzenak hartu ziren t-hCO-ren erdian, arratoi-kortexaren ertzean edo haren ondoan. Txerto-ertzak ehunen gardentasunean, HNA+ nukleoetan eta/edo ehunen autofluoreszentzian izandako aldaketak ebaluatuz zehaztu ziren. Irudi bakoitzean, NeuN+ eta HNA+ zelulen kopuru osoa eremu berean zeuden NeuN+ zelulen kopuru osoarekin zatitu zen. Irudi-planoan nukleoak dituzten zelulak bakarrik zenbatzen direla ziurtatzeko, Hoechst+ ere badiren zelulak bakarrik sartzen dira kalkuluan. Gutxienez 1 mm-ko bereizketa zuten bi irudiren batez bestekoa egin zen errore estatistikoa murrizteko.
Lagina bildu baino astebete lehenago, jarri hCO transplantea duten animaliak (gutxi gorabehera 8 hilabeteko bereizketarekin) gela ilun batean, biboteak moztuta estimulazio sentsoriala gutxitzeko. Nukleoen isolamendua aurretik deskribatu bezala egin zen, aldaketa batzuekin. Laburbilduz, t-hCO eta hCO suntsitu ziren detergente-mekaniko zelula-lisi eta 2 ml-ko beirazko ehun-ehogailu bat erabiliz (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Ondoren, nukleo gordinak 40 µm-ko iragazki bat erabiliz iragazi eta 320 g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz 4 °C-tan, sakarosa dentsitate-gradiente bat egin aurretik. Zentrifugazio-urratsaren ondoren (320 g 20 minutuz 4 °C-tan), laginak % 0,04 BSA/PBS-tan berriro eseki ziren, 0,2 µl-1 RNasa inhibitzaile unitate gehituta (40 u µl-1, AM2682, Ambion) eta 40 µm-ko fluxu-iragazki batetik pasa ziren. Nukleo disoziatuak % 0,02 BSA zuen PBS-an berriro eseki eta Chromium Single Cell 3′ txip batean kargatu ziren (8.000 zelula berreskuratzea kalkulatuta, bide bakoitzeko). snRNA-seq liburutegiak Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) erabiliz prestatu ziren. snRNA-seq liburutegiak Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) erabiliz prestatu ziren. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Zelula bakarreko 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq liburutegiak Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) erabiliz prestatu ziren. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq liburutegia Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) erabiliz prestatu zen.Lagin desberdinetako liburutegiak Admera Health-ek batu eta sekuentziatu zituen NovaSeq S4-n (Illumina).
Ustezko barra-kode nuklear bakoitzaren geneen espresio-mailak 10x Genomics CellRanger analisi-software paketea (6.1.2 bertsioa) erabiliz kuantifikatu ziren. Zehazki, irakurketak mkref komandoarekin sortutako giza (GRCh38, Ensemble, 98 bertsioa) eta arratoi (Rnor_6.0, Ensemble, 100 bertsioa) erreferentzia-genomen konbinazio batekin alderatu ziren, eta kuantifikazioan introi-eskualdeetan mapatutako irakurketak sartzeko count erabiliz –include-introns=TRUE komandoarekin. t-hCO laginetarako, giza nukleoak identifikatu ziren mapatutako irakurketa guztien % 95 gutxienez giza genomarekin bat etortzearen baldintza kontserbadorean oinarrituta. Ondorengo analisi guztiak CellRanger-ek ateratako barra-kodeen matrize iragazki batean egin ziren, R paketea (4.1.2 bertsioa) Seurat (4.1.1 bertsioa)32 erabiliz.
Ondorengo analisietan kalitate handiko nukleoak bakarrik sartzen direla ziurtatzeko, iragazketa-prozesu iteratibo bat ezarri zen lagin bakoitzerako. Lehenik eta behin, 1000 gene bakar baino gutxiago aurkitu dituzten eta mitokondrio guztien % 20 baino gehiago dituzten kalitate baxuko nukleoak identifikatu eta kendu ziren. Ondoren, gene-zenbaki gordinaren matrizea normalizatu zen sctransform(vst.flavor=”v2″) funtzioa erabiliz, eta honek 3000 gene aldakorrenak ere identifikatu zituen parametro lehenetsiak erabiliz. Dimentsioen murrizketa goiko gene aldakorretan egin zen Osagai Nagusien Analisia (PCA) erabiliz, parametro lehenetsiekin, 30eko datu-multzoaren dimentsioa erabiliz (dims = 30 aukeratu zen belauneko guneen ikuskapen bisualean oinarrituta eta lagin eta multzo-analisi guztietarako erabili zen). Ondoren, klusterizazio iteratiboko hainbat txanda egin genituen (bereizmena = 1) geneak sailkatzeko, gene-kopuru anormalki baxuaren (mediana pertzentilaren azpitik), mitokondrio-gene-kopuru anormalki altuaren (mediana pertzentilaren 95etik gora) arabera, kalitate baxuko ustezko zelulak identifikatu eta kentzeko. Klusterrak eta/edo biki susmagarrien proportzio altua DoubletFinder33 paketea erabiliz identifikatutakoak (DoubletFinder puntuazioaren batez bestekoa pertzentilaren 95etik gora). t-hCO laginak (n=3) eta hCO laginak (n=3) bereiz integratu ziren IntegrateData funtzioa erabiliz, goiko parametroekin. Ondoren datu-multzo integratuaren beste iragazketa kualitatibo bat egin zen, goian deskribatutako moduan.
Kalitate baxuko kernelak kendu ondoren, datu-multzo integratua taldekatu zen (bereizmena = 0,5) eta UMAP34 bistaratzeko helburuetarako txertatu zen. Kluster bakoitzerako markatzaile-geneak FindMarkers funtzioa erabiliz zehaztu ziren, geneen espresio-datu normalizatuetatik kalkulatutako parametro lehenetsiekin. Zelula-klase nagusiak identifikatu eta sailkatzen ditugu, fetuaren eta helduen kortexeko erreferentzia-datu-multzoak markatzaile-geneen espresioarekin 19,20,21,35 eta anotazioarekin konbinatuz. Bereziki, zirkulazioan dauden aitzindariak MKI67 eta TOP2A espresioaren bidez identifikatu ziren. Progenitore-klusterrak transkripzio mitosirik ez izateagatik, metafase berantiarreko fetuaren kortexean deskribatutako glia multipotenteen progenitore-klusterrekin gainjartze handiagatik eta EGFR eta OLIG1 espresioagatik definitu ziren. Astrozito terminoa erabiltzen dugu astrozitoen bereizketaren hainbat egoera biltzeko, glia erradial berantiarretik hasi eta astrozitoen heltzeraino. Astrozito-klusterrek SLC1A3 eta AQP4 maila altuak adierazten dituzte eta fetuaren glia erradialaren eta/edo helduen astrozitoen azpimotekin mapatzen direla frogatu da. OPC-ek PDGFRA eta SOX10 adierazten dituzte, oligodendrozitoek, berriz, mielinizazio markatzaileak (MOG eta MYRF). Neurona glutamatergikoak identifikatu ziren neurona-transkriptuen (SYT1 eta SNAP25) presentziagatik, GABAergiko markatzaileen gabeziagatik (GAD2) eta NEUROD6, SLC17A7, BCL11B edo SATB2-ren adierazpenagatik. GluN neuronak goiko (SATB2 adierazpena eta BCL11B-ren galera) eta sakoneko (BCL11B adierazpena) azpiklaseetan banatu ziren. Ustezko azpiplaka (SP) neuronek SP18 markatzaile ezagunak adierazten dituzte, hala nola ST18 eta SORCS1, GluN markatzaile sakonez gain. Plexu koroideoaren antzeko zelulak TTR adierazpenaren bidez identifikatu ziren, eta meningearen antzeko zelulek fibroblastoekin lotutako geneak adierazi zituzten eta erreferentziazko datu-multzoko zelula pial/baskularrak mapatu zituzten.
t-hCO eta hCO azpiklaseen arteko geneen adierazpenaren analisi diferentziala Libra R paketea (1.0.0 bertsioa) erabiliz inplementatutako laginetan erreproduzitutako pseudo-batch metodo berri bat erabiliz egin zen. Zehazki, edgeR log-likelihood probak (3.36.0 bertsioa, R paketea) taldeentzat egin ziren, zelula-klase jakin bateko geneen kopurua batuz laginaren erreplikazio bakoitzerako. Bero-maparen bistaratzea egiteko, milioi bakoitzeko normalizatutako (CPM) balioak kalkulatzen dira edgeR (cpm() funtzioa) erabiliz eta eskalatzen dira (batez bestekoa = 0, desbideratze estandarra = 1 lortzeko). t-hCO GluN gene nabarmen goranzkoen Gene Ontology (GO) aberaste-analisia egin zen (Benjamini-Hochberg-ek zuzendutako 0,05 baino txikiagoa den P balioa, t-hCO GluN zelulen % 10 gutxienez adierazita eta aldaketaren gutxienez 2 aldiz handituta). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 erabiliz egin zen. ToppFun aplikazioa erabiltzen dugu parametro lehenetsiekin eta GO-k anotatutako hipergeometria-probetatik kalkulatutako Benjamini-Hochberg-ek zuzendutako P-balioak ematen ditugu.
Gure snRNA-seq klusterrak zelula-kluster anotatuekin lotzeko, zelula bakarreko RNA-seq primarioen edo helduen snRNA-seq19,20,21,22, datu-multzoen integrazio-ikuspegi parekatua aplikatu genuen. Seurat-eko SCTransform (v2) normalizazio-lan-fluxua erabili genuen datu-multzoen arteko klusterren gainjartzeak integratzeko eta alderatzeko (goiko parametro berdinak erabiliz). Banakako datu-multzoak ausaz azpimultzokatu ziren, jatorrizko kluster bakoitzeko 500 zelula edo nukleo arte, kalkulu-eraginkortasuna lortzeko. Aurretik deskribatutako antzeko ikuspegi bat erabiliz, klusterren gainjartzea multzo bakoitzeko erreferentziazko klusterraren etiketarekin gainjartzen ziren zelulen edo nukleoen proportzio gisa definitu zen. GluNak gehiago sailkatzeko, Seurat-en TransferData lan-fluxua erabili genuen GluN azpimultzoen datuetarako, erreferentziazko datu-multzoen etiketak esleitzeko gure GluN zelulei.
t-hCO eta hCO laginen transkriptoma globalaren heltze-egoera ebaluatzeko, gure pseudo-bulk laginak BrainSpan/psychENCODE23-rekin alderatu genituen, zeinak giza garunaren garapena hartzen duen RNA sekuentzia handi bat duen. PCA egin genuen kortexeko laginetatik eratorritako geneen espresio-matrize normalizatu konbinatu batean, kontzepzioaren ondorengo 10 asteetan eta geroago, BrainSpan kortexeko laginetan aktibo gisa identifikatu ziren 5567 genetan (gure datuekin batera) (adinaz azaldutako garapen-bariantzaren % 50 baino handiagoa bezala definituta, eredu kubiko bat erabiliz)38. Horrez gain, neurogarapenaren transkriptoma-sinadura nagusiekin lotutako geneak eratorri genituen, aurretik deskribatu bezala, matrizearen faktorizazio ez-negatiboa erabiliz. Matrizearen faktorizazio ez-negatiboaren prozedura erabiliz kalkulatutako lagin-pisuak 5b irudietan irudikatzen dira, Zhu et al.-ek deskribatutako bost sinaduretarako datu zabalduekin38. Berriz ere, jardueraren araberako transkripzio-markatzaileak aurretik argitaratutako ikerketetatik eratorri ziren. Bereziki, ERG eta LRG nabarmen goranzko erregulazioa izan zuten saguaren ikusmen-kortexaren snRNA-seq bildumaren bidez identifikatutako glutamatergiko neuronetan, Hrvatin et al.16-ren 3. taula osagarritik lortutako ikusmen-estimulazioaren ondoren. Gizakietan aberastutako LRGak KCl-z aktibatutako giza fetuen garuneko kulturetatik lortu ziren eta estimulazioaren ondorengo 6 orduetan bildu ziren, eta iragazitako geneak nabarmen goranzko erregulazioa izan zuten gizakietan, baina ez karraskarietan (4. taula osagarria). Gene multzo hauek erabiliz aberastearen analisia Fisherren proba zehatz unidirekzionala erabiliz egin zen.
Anestesiatu arratoiak isofluranoarekin, kendu garunak eta jarri sakarosa soluzio hotz eta oxigenatuan (% 95 O2 eta % 5 CO2) jarri, eta hauek dituzte atalak: 234 mM sakarosa, 11 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 eta 0,5 mM CaCl2 (310 mOsm inguru). t-hCO duten arratoien garuneko korona-ebakiak (300–400 µm) Leica VT1200 bibratomo bat erabiliz egin ziren, aurretik deskribatu bezala39. Ondoren, sekzioak giro-tenperaturako oxigenazio jarraitua zuen sekzionatze-ganbera batera eraman ziren, honako hauekin prestatuta: 10 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 eta 126 mM NaCl (298 mOsm). Grabaketa baino gutxienez 45 minutu lehenago. Sekzioak murgildutako ganbera batean grabatu ziren, non etengabe aCSFrekin perfusatu ziren (% 95 O2 eta % 5 CO2 fiala). Datu guztiak giro-tenperaturan grabatu ziren. t-hCO neuronak borosilikatozko beirazko pipeta batekin amaitu ziren, 127 mM potasio glukonato, 8 mM NaCl, 4 mM magnesio ATP, 0.3 mM sodio GTP, 10 mM HEPES eta 0.6 mM EGTA dituen disoluzio batekin beteta, pH 7.2, barne-disoluzioa KOHrekin (290 mOsm) doituta. Berreskuratzeko, biozitina (% 0,2) gehitu zitzaion grabazio-soluzioari.
Datuak MultiClamp 700B anplifikadore bat (Molecular Devices) eta Digidata 1550B digitalizatzaile bat (Molecular Devices) erabiliz eskuratu ziren, 2 kHz-tan iragazki baxuko pasabidearekin, 20 kHz-tan digitalizatu eta Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) eta MATLAB funtzio pertsonalizatuak (Mathworks) erabiliz aztertu ziren. Juntura-potentziala JPCalc erabiliz kalkulatu zen eta sarrerak -14 mV-ko kalkulatutako baliora egokitu ziren. IV. eragiketak 10-25 pA-ko urratsetan korronte-urratsen serie bat du, -250etik 750 pA-ra.
Talamoa, materia zuria eta S1 aferenteak elektrikoki estimulatu ziren talamokortikaleko xerratan hCO neuronen patch-clamp grabazioan zehar, aurretik deskribatu bezala. Laburbilduz, garuna 10°-ko angeluan okertutako 3D inprimaketa-mahai batean jarri zen, eta garunaren aurrealdea 35°-ko angeluan moztu zen. Ondoren, garuna moztutako gainazalera itsatsi eta sekzionatu zen, talamokortikaleko axoi irtenak mantenduz. Wolframiozko elektrodo bipolarrak (0,5 MΩ) bigarren mikromanipulatzaile batean muntatu eta estrategikoki kokatu ziren zelula bakoitzeko lau eskualde estimulatzeko (barne-kapsula, materia zuria, S1 eta hCO). Erregistratu erantzun sinaptikoak 300 µA-ko estimulazio fasikoaren ondoren 0,03–0,1 Hz-tan.
hChR2 adierazten duten hCO neuronak 480 nm-tan aktibatu ziren eta LED batek (Prizmatix) sortutako argi-pultsuak ×40 objektibo baten bidez (0.9 NA; Olympus) aplikatu ziren zelulen ondoan hChR2 adierazpena erregistratzeko. Argiztatutako eremuaren diametroa 0,5 mm ingurukoa da eta potentzia osoa 10-20 mW-koa da. Pultsuaren zabalera 10 ms-tan ezarri zen, hau da, ikaskuntza konduktualeko esperimentuan emandako pultsuarekin bat datorrena. Estimulazio-maiztasun desberdinak erabili ziren, 1etik 20 Hz-ra, baina serieko lehen pultsua bakarrik erabili zen kuantifikaziorako. Trenen arteko tarteak normalean 30 s baino luzeagoak dira bide inhibitzaile edo erraztatzaile sinaptikoetan eragina minimizatzeko. hChR2 erantzuna monosinaptikoa zen probatzeko, TTX (1 μM) aplikatu genuen bainuan EPSC erreakzioa desagertu arte, eta ondoren 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM) aplikatu genuen. Normalean, erantzuna minutu gutxiren buruan itzultzen da, LEDaren piztearen eta EPSC sorreraren artean atzerapen apur bat luzeagoa izanik. NBQX (10 μM) erabili zen erantzuna AMPA hartzaileek bultzatzen duten ala ez probatzeko.
HCO sekzio zorrotzak aurretik deskribatu bezala sortu ziren. Laburbilduz, hCO sekzioak % 4ko agarosan txertatu eta 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 eta 10 mM d-(+) -glukosa zituzten zeluletara transferitu ziren. Sekzioak 200-300 µm-tan moztu ziren giro-tenperaturan Leica VT1200 bibragailu bat erabiliz eta ASFn gorde ziren giro-tenperaturan. Ondoren, zelula osoen patch-camp grabazioa egin zen hCO sekzioetan SliceScope mikroskopio zuzen baten pean (Scientifica). Sekzioak aCSFrekin perfusatu ziren (% 95 O2 eta % 5 CO2) eta zelulen seinaleak giro-tenperaturan erregistratu ziren. hCO3 neuronak borosilikatozko beirazko pipeta bat erabiliz aplikatu ziren, 127 mM potasio glukonato, 8 mM NaCl, 4 mM magnesio ATP, 0,3 mM sodio GTP, 10 mM HEPES eta 0,6 mM EGTA dituen disoluzio batekin beteta. Barne pHa 7,2 da, KOH-rekin doituta (osmolaritatea 290). Berreskuratzeko, gehitu % 0,2 Biozitina barneko disoluzioari.
Datuak Clampex-ekin eskuratu ziren (Clampex 11.1, Molecular Devices), MultiClamp 700B anplifikadore bat (Molecular Devices) eta Digidata 1550B digitalizatzaile bat (Molecular Devices) erabiliz, 2 kHz-tan behe-paseko iragazkia erabiliz, 20 kHz-tan digitalizatuz eta Clampfit (10.6 bertsioa) erabiliz aztertuz, gailu molekularrak erabiliz) eta MATLAB funtzio pertsonalizatuak (MATLAB 2019b, Mathworks). Juntura-potentziala JPCalc erabiliz kalkulatu zen eta sarrerak -14 mV-ko kalkulatutako junturaren potentzialera egokitu ziren. IV. eragiketak -50etik 250 pA-ra bitarteko 5-10 pA-ko urratsetan korronte-urrats sorta bat du.
Neurona pitzatuen berreraikuntza morfologikorako, % 0,2ko biozitina (Sigma-Aldrich) gehitu zitzaion barneko disoluzioari. Zelulak gutxienez 15 minutuz prestatzen dira moztu ondoren. Ondoren, pipeta poliki-poliki sartzen da 1-2 minutuz, erregistratutako mintza guztiz zigilatu arte. Atalen fisiologia prozedura jarraituz, atalak gau osoan finkatu ziren 4 °C-tan % 4ko PFA-tan, PBS X3-rekin garbitu ziren eta 1:1000 diluitu ziren estreptavidina-konjugatutako DyLight 549 edo DyLight 405-ekin (Vector Labs). Biozitinaz (% 2; Sigma-Aldrich) betetako zelulak markatu ziren patch clamp grabazioan zehar giro-tenperaturan 2 orduz. Ondoren, atalak mikroskopia-portaobjektiboetan muntatu ziren Aquamount bat (Thermo Scientific) erabiliz eta hurrengo egunean bistaratu ziren Leica TCS SP8 mikroskopio konfokal batean, olio-murgiltze objektibo bat erabiliz, ×40 1,3ko irekidura numerikoa, ×0,9–1,0 handitzea, xy. Laginketa-tasa gutxi gorabehera 7 pixel mikra bakoitzeko da. Z-pilaketak 1 µm-ko tarteetan serieka lortu ziren, eta z-pilaketa mosaikoak eta Leica-n oinarritutako jostura automatikoak egin ziren neurona bakoitzaren zuhaitz dendritiko osoa estaltzeko. Ondoren, neuronak erdi-eskuz jarraitu ziren neuTube 40 interfazea erabiliz eta SWC fitxategiak sortu ziren. Ondoren, fitxategiak SimpleNeuriteTracer41 Fiji pluginera igo ziren (ImageJ, 2.1.0 bertsioa; NIH).
Giza kortex-ehuna baimen informatuarekin lortu zen, Stanford Unibertsitateko Berrikuspen Batzorde Instituzionalak onartutako protokolo baten arabera. Erditze osteko giza ehunen bi lagin (3 eta 18 urtekoak) lortu ziren kortex frontala (erdiko zirkunboluzio frontala) erasketa bidez, epilepsia errefraktarioaren ebakuntzaren barruan. Erasketaren ondoren, ehuna bildu NMDG-aCSF izotzez hoztutakoan, honako hauek zituena: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukosa, 2 mM tiourea, 5 mM sodio askorbatoa, 3 mM sodio pirubatoa, 0,5 mM CaCl2 4H2O eta 10 mM MgSO4 7H2O. Titratu pH 7,3-7,4ra azido klorhidriko kontzentratuarekin. Ehunak laborategira eraman ziren 30 minututan eta korona-ebakiak hartu ziren goian deskribatutako prozeduraren arabera.
Animalien prozedura guztiak Stanford Unibertsitateak APLACek onartutako animalien zaintzarako jarraibideen arabera egin ziren. Arratoiak (transplantea egin eta 140 egun baino gehiago igaro ondoren) % 5eko isoflurano anestesiarekin induzitu ziren eta % 1-3ko isofluranoarekin anestesiatu ziren intraoperatiboki. Animaliak estereotaxiko marko batean (Kopf) jarri ziren eta askapen iraunkorreko buprenorfina (SR) azalpean injektatu zen. Garezurra agerian utzi, garbitu eta 3-5 hezur-torloju sartzen ziren. t-hCO helburu gisa hartzeko, koordenatu estereotaxikoak sortu genituen MRI irudietatik. Zulo bat zulatu zen intereseko gunean eta zuntzak (400 µm-ko diametroa, NA 0.48, Doric) hCO gainazalaren azpitik 100 µm jaitsi eta garezurrari finkatu zitzaizkion UV bidez senda daitekeen hortz-zementuarekin (Relyx).
Zuntz fotometrikoen erregistroak aurretik deskribatu bezala egin ziren42. Jarduera espontaneoa erregistratzeko, arratoiak kaiola garbi batean jarri ziren eta 400 µm-ko diametroko zuntz optikoko kable bat (Doric), zuntz optikoko datu fotometrikoak eskuratzeko sistema batera konektatuta, txertatutako zuntz optikoko kableari konektatuta zegoen. Motorraren jardueraren 10 minutuko erregistroan zehar, animaliak kaiola esploratzeko libre zeuden. Sortutako jarduera erregistratzeko, arratoiak (transplantea egin eta 140 egun baino gehiago igaro ondoren) % 5eko isofluranoarekin anestesiatu ziren indukziorako eta % 1-3ko isofluranoarekin mantentzerako. Jarri animalia marko estereotaktiko batean (Kopf) eta t-hCO3-ren kontrako aldeko biboteak 2 cm ingurura moztu eta aktuadore piezoelektriko (PI) batera konektatutako sare batetik pasatu. 400 µm-ko zuntz optikoko kable bat (Doric) txertatutako zuntzera konektatu zen eta datuak eskuratzeko sistemara konektatu zen. t-hCO3-ren kontrako aldeko biboteak 50 aldiz desbideratu ziren (2 mm 20 Hz-tan, 2 s aurkezpen bakoitzeko) ausazko uneetan piezoelektriko unitate baten bidez, 20 minutuko grabazio-aldi batean. Erabili Arduino MATLAB Laguntza Paketea desbideratze-denbora MATLAB kode pertsonalizatuarekin kontrolatzeko. Gertaerak datuak eskuratzeko softwarearekin sinkronizatzen dira transistor-transistore logika (TTL) pultsuak erabiliz.
Arratoiei (transplantea egin eta 140 egun baino gehiago igaro ondoren) % 5eko isoflurano anestesia induzitu zitzaien eta % 1-3ko isofluranoarekin anestesiatu zitzaien intraoperatiboki. Animaliak estereotaxiko marko batean (Kopf) jarri ziren eta buprenorfina SR eta dexametasona azalpean injektatu zitzaizkien. Garezurra agerian utzi, garbitu eta 3-5 hezur-torloju sartzen ziren. t-hCO helburu gisa hartzeko, koordenatu estereotaxikoak sortu genituen MRI irudietatik. Kraniotomia zirkular bat (gutxi gorabehera 1 cm-ko diametroa) egin zen abiadura handiko zulagailu batekin, transplantatutako HCOaren gainean zuzenean. Hezurra ahalik eta meheena denean, baina hezur osoa zulatu aurretik, pintzak erabili gainerako pelbiseko disko osorik kentzeko, azpiko t-hCO agerian uzteko. Kraniotomia gatz esterilez bete zen, eta estalki bat eta buru-orratz berezi bat lotu zitzaizkion garezurrari UV bidez sendatutako hortz-zementuarekin (Relyx).
Bi fotoiko irudigintza Bruker multifotoi mikroskopio bat erabiliz egin zen, Nikon LWD (×16, 0.8 NA) objektibo batekin. GCaMP6 irudigintza 920 nm-tan egin zen, 1.4x z plano bakarreko handitzearekin eta 8x 7.5 fps-ko batez bestekoarekin. Arratoiak % 5eko isoflurano anestesiarekin induzitu ziren eta % 1-3ko isofluranoarekin mantendu ziren. Arratoiak buruko euskarri pertsonalizatu batean jarri eta lentearen azpian kokatu ziren. Motorraren jardueraren 3 minutuko atzeko plano-grabaketa lortu zen. 20 minutuko grabazioan, 50 puzketa (aurkezpen bakoitza 100 ms-koa) ausaz eman ziren t-hCO3-ren aurkako bibote-pad-era picospricer bat erabiliz. Erabili Arduino MATLAB Support Package leherketa-denbora MATLAB kode pertsonalizatuarekin kontrolatzeko. Sinkronizatu gertaerak datuak eskuratzeko softwarearekin (PrairieView 5.5) TTL pultsuak erabiliz. Analisirako, irudiak xy mugimendurako zuzendu ziren Fijin abian jarritako MoCo programan zuzenketa afinea erabiliz. Zelula indibidualetatik fluoreszentzia-arrastoen erauzketa CNMF-E43 erabiliz. Intereseko eskualde bakoitzerako fluoreszentzia erauzi zen, dF/F kurbetara bihurtu zen eta gero z-puntuazioetara bihurtu zen.
Arratoiei (transplantea egin eta 140 egun baino gehiago igaro ondoren) % 5eko isoflurano anestesia induzitu zitzaien eta % 1-3ko isofluranoarekin anestesiatu zitzaien intraoperatiboki. Animaliak estereotaxiko marko batean (Kopf) jarri ziren eta buprenorfina SR eta dexametasona azalpean injektatu zitzaizkien. t-hCO-ren kontrako aldeko biboteak 2 cm inguru moztu eta aktuadore piezoelektriko bati lotutako sare batetik sartu ziren. Burezurra agerian utzi eta garbitu egin zen. Altzairu herdoilgaitzezko lur-torloju bat lotu zitzaion burezurrari. t-hCO helburu gisa hartzeko, koordenatu estereotaxikoak sortu genituen MRI irudietatik. Kraniotomia zirkular bat egin (1 cm inguruko diametroa) abiadura handiko zulagailu batekin, t-hCO-ren gainean. Hezurra ahalik eta meheena denean, baina hezur osoa zulatu aurretik, erabili pintzak gainerako pelbiseko disko osorik kentzeko, azpiko t-hCO agerian uzteko. Zelula indibidualak 32 edo 64 kanaleko siliziozko dentsitate handiko zundak (Cambridge Neurotech) erabiliz erregistratu ziren, lurrerako torlojuekin konektatuta eta RHD anplifikadoreekin (Intan) aurrez anplifikatuta. Manipulatzailea erabili elektrodoak helburuko gunera jaisteko kraniotomiaren bidez, gatz esterilez beteta dagoena. Datuen bilketa 30 kHz-ko maiztasunean egin zen Open Ephys datuak eskuratzeko sistema erabiliz. Grabaketa 10 kanal baino gehiagotan jarduera erritmiko espontaneo oso korrelazionatua detektatu genuenean bakarrik jarraitu zen, eta horrek iradokitzen du elektrodoak txertoan zeudela (bi fotoiko kaltzioaren irudi-datuetan oinarrituta). Jarduera motorraren 10 minutuko atzeko plano-grabaketa lortu zen. Ondoren, t-hCO3-ren kontrako aldeko biboteak 50 aldiz desbideratu ziren (2 mm 20 Hz-tan, 2 s aurkezpen bakoitzeko) ausazko uneetan piezoelektriko baten bidez, 20 minutuko grabazio-aldi batean. Arduinorako MATLAB Laguntza Paketea (MATLAB 2019b) erabiliz, kontrolatu desbideratze-denbora MATLAB kode pertsonalizatuarekin. Erabili TTL pultsuak gertaerak datuak eskuratzeko softwarearekin sinkronizatzeko.
Markaketa optikoko esperimentuetarako, 473 nm-ko laser batera (Omicron) konektatutako 200 µm-ko kable optiko bat (Doric) kraniotomiaren gainean jarritako 200 µm-ko zuntz optiko batera konektatu zen. Hori baino lehen, jauzi-potentzia 20 mW-ra egokitu. Erabili manipulatzailea elektrodoak helburuko gunera jaisteko kraniotomiaren bidez, gatz esterilez beteta dagoena. Grabaketaren hasieran, 473 nm-ko hamar argi-pultsu (2 Hz-ko maiztasuna, 10 ms-ko pultsu-iraupena) igorri ziren. Zelula fotosentikorrak saiakuntzen % 70ean edo gehiagotan 10 ms-ko argi-erantzuna erakutsi zuten zelulak bezala definitu ziren.