Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Biopsia likidoa (LB) biomedikuntza arloan azkar ospea hartzen ari den kontzeptua da.Kontzeptua zelulaz kanpoko DNA zirkulatzailearen (ccfDNA) zatiak hautematean oinarritzen da, batez ere, zelulak hil ondoren hainbat ehunetan zati txiki gisa askatzen direnak.Zati hauen proportzio txiki bat ehun edo organismo arrotzetatik (atzerriko) jatorria da.Oraingo lanetan, kontzeptu hau muskuiluetan aplikatu dugu, itsas ura iragazteko gaitasun handiagatik ezaguna den espezie zentinela.Muskuiluek iragazki natural gisa jarduteko duten gaitasuna erabiltzen dugu hainbat iturritatik ingurumen-ADN zatiak harrapatzeko, itsas kostaldeko ekosistemen biodibertsitateari buruzko informazioa emateko.Gure emaitzek erakusten dute muskuiluaren hemolinfa tamainaz asko aldatzen diren DNA zatiak dituela, 1 kb-tik 5 kb.Eskopeta-sekuentziazioak DNA zati ugari mikrobio-jatorri arrotzak direla erakutsi zuen.Horien artean, bakterio, arkeo eta birusen DNA zatiak aurkitu ditugu, kostaldeko itsas ekosistemetan normalean aurkitu ohi diren hainbat ostalari kutsatzen dituzten birusak barne.Amaitzeko, gure ikerketak frogatzen du muskuiluei aplikatutako LB kontzeptuak itsas kostaldeko ekosistemetako mikrobio-aniztasunari buruzko ezagutza iturri aberatsa baina oraindik esploratu gabea dela.
Klima-aldaketak (CC) itsas ekosistemen biodibertsitatean duen eragina azkar hazten ari den ikerketa-eremua da.Berotze globalak estres fisiologiko garrantzitsuak eragiten ditu, itsas organismoen egonkortasun termikoaren eboluzio-mugak ere bultzatzen ditu, espezie batzuen habitatari eraginez, baldintza onuragarriagoak bilatzera bultzatuz [1, 2].Metazooen bioaniztasunari eragiteaz gain, ostalariaren eta mikrobioen arteko elkarrekintzen oreka delikatua apurtzen du CCk.Disbakteriosi mikrobio honek mehatxu larria dakar itsas ekosistementzat, itsas organismoak patogeno infekziosoen aurrean sentikorrago egiten dituelako [3, 4].Uste da SSk rol garrantzitsua betetzen duela masa-heriotzetan, eta hori arazo larria da itsas ekosistema globalak kudeatzeko [5, 6].Arazo garrantzitsua da itsas espezie askoren eragin ekonomiko, ekologiko eta nutrizionala kontuan hartuta.Hau bereziki egia da eskualde polarretan bizi diren bibalbioentzat, non CKren ondorioak berehalakoak eta larriagoak diren [6, 7].Izan ere, Mytilus spp bezalako bibalbioak.oso erabiliak dira CCk itsas ekosistemetan dituen ondorioak kontrolatzeko.Ez da harritzekoa, biomarkatzaile kopuru handi bat garatu izana haien osasuna kontrolatzeko, sarritan bi mailatako ikuspegia erabiliz, jarduera entzimatikoan edo zelulen funtzioetan oinarritutako biomarkatzaile funtzionalak, hala nola zelulen bideragarritasuna eta jarduera fagozitikoa [8].Metodo horien artean, itsasoko ur kantitate handiak xurgatu ondoren ehun bigunetan metatzen diren presio adierazle espezifikoen kontzentrazioa neurtzea ere sartzen da.Hala ere, bibalbioen iragazketa-ahalmen handiak eta zirkulazio-sistema erdi irekiak biopsia likidoaren (LB) kontzeptua erabiliz hemolinfa-biomarkatzaile berriak garatzeko aukera ematen du, pazientearen kudeaketarako ikuspegi sinple eta gutxien inbaditzailea.odol laginak [9, 10].Giza LBn zirkulatzen duten molekula mota ugari aurki daitezkeen arren, kontzeptu hau plasmako zelulaz kanpoko DNA (ccfDNA) zati zirkulatzaileen DNAren sekuentziazioan oinarritzen da batez ere.Izan ere, giza plasman zirkulatzen duen DNAren presentzia XX. mendearen erdialdetik ezagutzen da [11], baina azken urteotan baino ez da errendimendu handiko sekuentziazio metodoen agerpenak ccfDNAn oinarritutako diagnostiko klinikoa egitea.Zirkulatzen duten DNA zati horien presentzia, hein batean, zelulen heriotzaren ondoren DNA genomikoaren (nuklearra eta mitokondriala) askapen pasiboari zor zaio. Pertsona osasuntsuetan, normalean ccfDNAren kontzentrazioa baxua da (<10 ng/mL), baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia edo estresa jasaten duten pazienteetan, ehunen kalteak eraginez. Pertsona osasuntsuetan, normalean ccfDNAren kontzentrazioa baxua da (<10 ng/mL), baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia edo estresa jasaten duten pazienteetan, ehunen kalteak eraginez. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Pertsona osasuntsuetan, cccDNA-ren kontzentrazioa baxua da normalean (<10 ng/mL), baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia dituzten pazienteetan edo ehunen kalteak eragiten dituen estresaren pean.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或承常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承常较低加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 病理 或 掸 忣 扏 扏增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелить велича ны 10 нг/мл с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA kontzentrazioa baxua izan ohi da (<10 ng/ml) pertsona osasuntsuetan, baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia edo estresak dituzten pazienteetan, ehunen kaltea eraginez.ccfDNA zatien tamaina asko aldatzen da, baina normalean 150 eta 200 bp bitartekoa da.[12].Norbere eratorritako ccfDNAren analisia, hau da, zelula ostalarien normal edo eraldatutako ccfDNAren analisia erabil daiteke genoma nuklearrean eta/edo mitokondrialean dauden aldaketa genetikoak eta epigenetikoak detektatzeko, eta, horrela, medikuei zuzendutako terapia espezifikoak hautatzen lagunduz [13] .Hala ere, ccfDNA atzerriko iturrietatik lor daiteke, hala nola, ccfDNA haurdunaldian fetu-zeluletatik edo transplantatutako organoetatik [14,15,16,17].ccfDNA agente infekzioso baten (atzerriko) azido nukleikoen presentzia detektatzeko informazio-iturri garrantzitsua da, eta horrek odol-kulturek identifikatu ez dituzten infekzio hedatuak detektatzeko aukera ematen du, infektatutako ehunen biopsia inbaditzailea saihestuz [18].Azken ikerketek frogatu dute, hain zuzen, giza odolak informazio iturri aberatsa duela, patogeno birikoak eta bakterioak identifikatzeko erabil daitekeena, eta giza plasman aurkitutako ccfDNAren % 1 inguru jatorri arrotza duela [19].Azterketa hauek frogatzen dute organismo baten mikrobiomaren biodibertsitatea ccfDNA analisiaren bidez ebaluatu daitekeela.Hala ere, duela gutxi arte, kontzeptu hori gizakietan bakarrik erabiltzen zen eta, neurri txikiagoan, beste ornodun batzuetan [20, 21].
Artikulu honetan, LB potentziala erabiltzen dugu Aulacomya atraren ccfDNA aztertzeko, Kerguelen uharte azpiantartikoan aurkitu ohi den hegoaldeko espeziea, duela 35 milioi urte sortu zen goi-ordoki baten gainean dagoen uharte talde bat.erupzio bolkanikoa.In vitro sistema esperimental bat erabiliz, aurkitu dugu itsasoko uretan dauden DNA zatiak muskuiluek azkar hartzen dituztela eta hemolinfaren konpartimentuan sartzen direla.Eskopetaren sekuentziazioak erakutsi du muskuilu hemolinfa ccfDNAk bere jatorriko eta ez berezko DNA zatiak dituela, bakterio sinbiotikoak eta itsas kostaldeko ekosistema bolkaniko hotzetan ohikoak diren biometako DNA zatiak barne.Hemolymph ccfDNAk ostalari-barruti desberdinak dituzten birusetatik eratorritako sekuentzia birikoak ere baditu.Animalia zelulaniztunetako DNA zatiak ere aurkitu ditugu, hala nola arrain hezurtsuak, itsas anemonak, algak eta intsektuak.Amaitzeko, gure ikerketak frogatzen du LB kontzeptua itsas ornogabeei arrakastaz aplika daitekeela itsas ekosistemetan errepertorio genomiko aberatsa sortzeko.
Helduak (55-70 mm-ko luzera) Mytilus platensis (M. platensis) eta Aulacomya atra (A. atra) Port-au-Franceko marearteko ertz harritsuetatik (049°21,235 S, 070°13,490 E .) bildu ziren.Kerguelen uharteak 2018ko abenduan. Beste muskuilu urdin heldu batzuk (Mytilus spp.) hornitzaile komertzial batetik (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) lortu ziren eta 32 ‰ gatzun artifizial 10-20 L zituen tenperatura kontrolatuko (4°C) aireztaturiko depositu batean jarri ziren.(itsasoko gatz artifiziala Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, AEB).Esperimentu bakoitzerako, banakako maskorren luzera eta pisua neurtu ziren.
Programa honetarako doako sarbide irekiko protokoloa eskuragarri dago sarean (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Laburbilduz, LB hemolinfa muskulu abductoretatik bildu zen deskribatu bezala [22].Hemolinfa 1200×g-n zentrifugatuz argitu zen 3 minutuz, gainnadantea izoztu zen (-20°C) erabili arte.cfDNA isolatzeko eta arazteko, laginak (1,5-2,0 ml) desizoztu eta prozesatu dira NucleoSnap cfDNA kitarekin (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) fabrikatzailearen argibideen arabera.ccfDNA -80 °C-tan gorde zen azterketa gehiago egin arte.Esperimentu batzuetan, ccfDNA isolatu eta araztu zen QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) erabiliz.Araztutako DNA PicoGreen saio estandar baten bidez kuantifikatu zen.Isolatutako ccfDNAren zati-banaketa elektroforesi kapilarren bidez aztertu zen Agilent 2100 bioanalizatzaile bat erabiliz (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) Sentsibilitate handiko DNA Kit bat erabiliz.Saiakuntza ccfDNA laginaren 1 µl erabiliz egin zen fabrikatzailearen argibideen arabera.
Hemolinfa ccfDNA zatiak sekuentziatzeko, Génome Québec-ek (Montreal, Quebec, Kanada) eskopeta liburutegiak prestatu zituen Illumina MiSeq PE75 kitaren Illumina DNA Mix kit-a erabiliz.Egokitzaile estandarra (BioO) erabili zen.Datu gordinak fitxategiak eskuragarri daude NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 eta SRR8924809).Oinarrizko irakurketaren kalitatea FastQC erabiliz ebaluatu zen [23].Trimmomatic [24] mozteko egokigailuetarako eta kalitate txarreko irakurketetarako erabili da.Parekatutako muturrak dituzten eskopeta irakurketak FLASH irakurketa bakar luzeagoetan batu ziren, 20 bp-ko gutxieneko gainjartzearekin bat datozenak saihesteko [25]. Batatutako irakurketak BLASTN-ekin ohartarazi ziren NCBI Taxonomiaren datu-base bibalbio bat erabiliz (e balioa < 1e-3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun baxuko sekuentzien maskaratzea DUST erabiliz egin zen [26]. Batatutako irakurketak BLASTN-ekin ohartarazi ziren NCBI Taxonomiaren datu-base bibalbio bat erabiliz (e balioa < 1e-3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun baxuko sekuentzien maskaratzea DUST erabiliz egin zen [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннтированы оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой низкой сло сложной сло слогии пользованием HAUTSA [26]. Irakurketa bilduak BLASTN-ekin ohartarazi ziren NCBI bibalbioen taxonomiaren datu-basea erabiliz (e balioa < 1e-3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun baxuko sekuentzia maskaratzea DUST erabiliz [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和% 90 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数并的诌数诌数＿，数低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 % 90 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 du （ 并 读数 Ａ 同源）复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесонкод сономичесуз дсованием тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей нислокобы нислогии с использованием HAUTSA [26]. Irakurketa bateratuak BLASTN-ekin ohartarazi ziren NCBI bibalbioen datu-base taxonomikoa erabiliz (e balioa <1e-3 eta %90eko homologia), eta konplexutasun baxuko sekuentzia maskaratzea DUST erabiliz [26].Irakurketak bi taldetan banatu ziren: bibalbio-sekuentziarekin erlazionatuta (hemen norberak irakurtzen deitzen zaio) eta zerikusirik gabekoak (norberak irakurtzen ez dituena).Bi talde bereizita bildu ziren MEGAHIT erabiliz kontigs sortzeko [27].Bien bitartean, mikrobiomaren irakurketen banaketa taxonomikoa Kraken2 [28] erabiliz sailkatu zen eta Galaxiako Krona diagrama baten bidez grafikoki irudikatu zen [29, 30].Kmers optimoak kmers-59 direla zehaztu zen gure aurretiazko esperimentuetatik. Ondoren, autokontigak BLASTNrekin (bibalbe NCBI datu-basea, e balioa < 1e-10 eta % 60 homologia) lerrokatuz identifikatu ziren azken oharpen baterako. Ondoren, autokontigak BLASTNrekin (bibalbe NCBI datu-basea, e balioa < 1e-10 eta % 60 homologia) lerrokatuz identifikatu ziren azken oharpen baterako. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база даннытированы BI, значение e <1e-10 и гомология 60% для окончательной аннотации. Ondoren, autokontigak BLASTN (NCBI bibalbe datu-basea, e balioa <1e-10 eta % 60 homologia) bat eginez identifikatu ziren azken oharpenerako.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 同源性）对齐来识对齐来臍蠫褛识廿褜最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сончательной аннотации путем сонтиги х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология % 60). Ondoren, auto-kontigak identifikatu ziren azken oharpenerako BLASTN-ekin bat eginez (NCBI bibalbioen datu-basea, e balioa <1e-10 eta %60ko homologia). Paraleloki, norberak ez diren taldeen kontigak BLASTNrekin ohartarazi ziren (nt NCBI datu-basea, e balioa < 1e-10 eta % 60ko homologia). Paraleloki, norberak ez diren taldeen kontigak BLASTNrekin ohartarazi ziren (nt NCBI datu-basea, e balioa < 1e-10 eta % 60ko homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннные, база данннач, 1 база даннных e-1 гомология % 60). Aldi berean, atzerriko taldeen kontigak BLASTN-ekin ohartarazi ziren (NT NCBI datu-basea, e balioa <1e-10 eta %60ko homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 同源性）注释非自身组釤。组釤。羾平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 同源性）注释非自身组釤。组釤。羾 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью на BLASBINC ачение e <1e-10 и гомология % 60). Paraleloki, norberak ez diren taldeen kontigak BLASTNrekin ohartarazi ziren (nt NCBI datu-basea, e balioa <1e-10 eta %60ko homologia). BLASTX auto ez diren kontigetan ere egin zen nr eta RefSeq proteina NCBI datu-baseak erabiliz (e balioa < 1e−10 eta %60ko homologia). BLASTX auto ez diren kontigetan ere egin zen nr eta RefSeq proteina NCBI datu-baseak erabiliz (e balioa < 1e−10 eta %60ko homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белех на белен 1 10 eta гомология % 60). BLASTX auto ez diren kontigetan ere egin zen nr eta RefSeq NCBI proteinaren datu-baseak erabiliz (e balioa < 1e-10 eta %60ko homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧０ 性） 性还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧０ 性） 性 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безни NC 10 erref. гомология % 60). BLASTX auto kontigetan ere egin zen nr eta RefSeq NCBI proteina datu-baseak erabiliz (e balioa <1e-10 eta %60ko homologia).BLASTN eta BLASTX kontigak ez direnen multzoek azken kontigak adierazten dituzte (ikus Fitxategi osagarria).
PCRrako erabilitako abiarazleak S1 taulan ageri dira.Taq DNA polimerasa (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA xede geneak anplifikatzeko erabili zen.Erreakzio-baldintza hauek erabili ziren: desnaturalizazioa 95°C-tan 3 minutuz, 95°C-an minutu 1ean, errekostatzeko tenperatura ezarri 1 minutuz, 72°C-tan luzatzea 1 minutuz, 35 ziklo eta azkenik 72°C 10 minutuko epean..PCR produktuak elektroforesiaren bidez bereizi ziren SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) 95 V-tan zuten agarosa geletan (% 1,5).
Muskuiluak (Mytilus spp.) 500 ml itsasoko ur oxigenatuan (32 PSU) aklimatatu ziren 24 orduz 4°C-tan.Giza galectin-7 cDNA sekuentzia kodetzen duen txertaketa duen DNA plasmidoa (NCBI atzipen-zenbakia L07769) ontziari gehitu zitzaion 190 μg/μl-ko azken kontzentrazioan.DNA gehitu gabe baldintza berdinetan inkubatutako muskuiluak izan ziren kontrola.Hirugarren kontrol-tangak DNA zeukan muskuilurik gabe.Itsasoko uretako DNAren kalitatea kontrolatzeko, itsasoko uraren laginak (20 μl; hiru errepikapen) hartu ziren depositu bakoitzetik adierazitako unean.DNA plasmidoaren trazabilitatea lortzeko, LB muskuiluak adierazitako garaietan bildu eta qPCR eta ddPCR bidez aztertu ziren.Itsasoko uraren gatz-eduki handia dela eta, alikuotak PCR kalitateko uretan diluitu ziren (1:10) PCR saiakuntza guztien aurretik.
Tanta digitala PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokoloa erabiliz egin da (Mississauga, Ontario, Kanada).Erabili tenperatura-profila tenperatura optimoa zehazteko (S1 taula).Tantak QX200 tanta-sorgailu bat erabiliz sortu ziren (BioRad).ddPCR honela egin zen: 95°C 5 min, 95°C-ko 50 ziklo 30 s eta 1 min 1 eta 72°C 30 s, 4°C 5 min eta 90°C 5 minututan.Tanta kopurua eta erreakzio positiboak (kopia kopurua/µl) QX200 tanta irakurgailu baten bidez (BioRad) neurtu dira.10.000 tanta baino gutxiagoko laginak baztertu ziren.Ereduen kontrola ez zen egin ddPCR exekutatzen zen bakoitzean.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) eta LGALS7 lehen espezifikoak erabiliz egin zen.PCR kuantitatibo guztiak 20 µl-tan egin ziren QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) erabiliz.qPCR 15 minutuko inkubazioarekin hasi zen 95 °C-tan, 40 ziklo 95 °C-tan 10 segundoz eta 60 °C-tan 60 segundoz datu-bilketa batekin.Urtze-kurbak 95 °C-tan 5 s-tan, 65 °C 60 s-tan eta 97 °C-tan qPCRaren amaieran neurketak erabiliz sortu ziren.qPCR bakoitza hirukoiztuta egin zen, kontrol-laginak izan ezik.
Muskuiluak filtrazio-tasa handiagatik ezagunak direnez, lehenik itsasoko uretan dauden DNA zatiak iragazi eta atxiki ditzaketen ikertu genuen.Zati horiek beren sistema linfatiko erdi irekian pilatzen diren ala ez ere interesatzen zitzaigun.Arazo hau esperimentalki ebatzi dugu muskuilu urdinen deposituetan gehitutako DNA zati disolbagarrien patua trazatuz.DNA zatien jarraipena errazteko, giza galectin-7 genea duen DNA plasmido arrotza erabili dugu (ez norberak).ddPCR-k itsas uretan eta muskuiluetan DNA plasmidoaren zatiak aurkitzen ditu.Gure emaitzek erakusten dutenez, muskuilurik ezean itsasoko uretan dagoen DNA zatien kopurua nahiko konstante mantendu bazen denboran (7 egun arte), muskuilurik ezean maila hori ia erabat desagertu zen 8 orduren buruan (1a,b irudiak).DNA exogenoaren zatiak erraz detektatu ziren 15 minutuko epean balbula barneko fluidoan eta hemolinfan (1c. irudia).Zati hauek oraindik ere detekta litezke esposizioaren ondoren 4 ordura arte.DNA zatiekiko iragazketa-jarduera hau bakterioen eta algen iragazketa-jardueraren parekoa da [31].Emaitza hauek iradokitzen dute muskuiluek ADN arrotza iragazi eta meta dezaketela euren likido-konpartimentuetan.
ADN plasmidoaren kontzentrazio erlatiboak itsasoko uretan muskuiluen presentzian (A) edo ezean (B), ddPCR bidez neurtuta.A-n, emaitzak ehunekotan adierazten dira, koadroen ertzak 75. eta 25. pertzentilak adierazten dituztelarik.Egokitutako kurba logaritmikoa gorriz agertzen da, eta grisez itzalduta dagoen eremuak %95eko konfiantza-tartea adierazten du.B-n, marra gorriak batez bestekoa adierazten du eta marra urdinak kontzentraziorako %95eko konfiantza-tartea adierazten du.C ADN plasmidoaren metaketa muskuiluetako hemolinfan eta balbula-fluidoan une ezberdinetan DNA plasmidoa gehitu ondoren.Emaitzak atzemandako kopia absolutu gisa aurkezten dira/mL (±SE).
Ondoren, Kerguelen uharteetako muskuiluetan bildutako muskuiluetan ccfDNAren jatorria ikertu dugu, eragin antropiko mugatua duen uharte-talde urrun batean.Horretarako, muskuilu-hemolinfaren cccDNA giza cccDNA arazteko erabili ohi diren metodoen bidez isolatu eta araztu zen [32, 33].Muskuiluetan hemolinfa ccfDNAren batez besteko kontzentrazioa ml hemolinfa tarteko mikrogramo baxuetan dagoela ikusi dugu (ikus S2 taula, Informazio osagarria).Kontzentrazio-tarte hori pertsona osasuntsuetan baino askoz handiagoa da (nanogramo baxuak mililitro bakoitzeko), baina kasu bakanetan, minbiziaren gaixoetan, ccfDNA maila mililitroko hainbat mikrogramo irits daiteke [34, 35].Hemolinfaren ccfDNAren tamaina-banaketaren azterketak erakutsi zuen zati hauek tamainaz asko aldatzen direla, 1000 bp-tik 1000 bp-ra bitartekoak direla.5000 bp arte (2. irudia).Antzeko emaitzak lortu ziren silizean oinarritutako QIAamp Investigator Kit-a erabiliz, auzitegi-zientzian erabili ohi den metodo bat kontzentrazio baxuko DNA laginetatik DNA genomikoa azkar isolatzeko eta arazteko, barne ccfDNA [36].
Muskuiluaren hemolinfaren ccfDNA elektroforegrama adierazgarria.NucleoSnap Plasma Kit (goian) eta QIAamp DNA Investigator Kit-ekin ateratakoa.B Biolinen diagrama hemolinfaren ccfDNA-ren kontzentrazioen (±SE) muskuiluen banaketa erakusten duena.Lerro beltzak eta gorriak mediana eta lehenengo eta hirugarren kuartilak adierazten dituzte, hurrenez hurren.
Gizakietan eta primateetan ccfDNAren %1 inguruk iturri arrotz bat du [21, 37].Bibalbioen zirkulazio-sistema erdi irekia, mikrobio-aberastutako itsasoko uraren eta muskuiluaren ccfDNAren tamainaren banaketa kontuan hartuta, hipotesia genuen muskuiluaren hemolinfa ccfDNA mikrobio-DNA aberats eta anitza izan dezakeela.Hipotesi hori egiaztatzeko, Kerguelen uharteetan jasotako Aulacomya atra laginetatik hemolinfa ccfDNA sekuentziatu genuen, 10 milioi irakurketa baino gehiago lortuz, eta horietatik % 97,6k kalitate kontrola gainditu zuen.Ondoren, irakurketak norberaren eta norberaren iturrien arabera sailkatu ziren BLASTN eta NCBI bibalbioen datu-baseak erabiliz (S1 irudia, Informazio osagarria).
Gizakietan, DNA nuklearra zein mitokondriala odolera askatu daiteke [38].Hala ere, ikerketa honetan ezin izan da muskuiluaren DNA genomiko nuklearra zehatz-mehatz deskribatu, izan ere, A. atra genoma ez da sekuentziatu edo deskribatu.Hala ere, gure jatorriko ccfDNA zati batzuk identifikatu ahal izan genituen bibalbioen liburutegia erabiliz (S2 irudia, Informazio osagarria).Gainera, gure jatorriko DNA zatien presentzia baieztatu genuen sekuentziatu ziren A. atra gene horien PCR anplifikazio zuzenduaren bidez (3. irudia).Era berean, A. atraren genoma mitokondriala datu-base publikoetan eskuragarri dagoela kontuan hartuta, A. atraren hemolinfan ccfDNA mitokondrialaren zatiak egotearen froga aurki daiteke.ADN mitokondrialaren zatien presentzia PCR anplifikazioaren bidez baieztatu zen (3. irudia).
Hainbat gene mitokondrial zeuden A. atraren (puntu gorriak – stock zenbakia: SRX5705969) eta M. platensis (puntu urdinak – stock zenbakia: SRX5705968) hemolinfan PCR bidez anplifikatuta.Breton et al.-tik egokitutako irudia, 2011 B A. atraren hemolinfa gainditzailearen anplifikazioa FTA paperean gordeta.Erabili 3 mm-ko puntzoia PCR nahasketa duen PCR tutuari zuzenean gehitzeko.
Itsasoko uretan mikrobio-eduki ugaria dela ikusita, hasieran hemolinfan mikrobioen DNA-sekuentzien karakterizazioan zentratu ginen.Horretarako, bi estrategia ezberdin erabiltzen ditugu.Lehenengo estrategiak Kraken2 erabili zuen, algoritmoetan oinarritutako sekuentziak sailkatzeko programa bat, mikrobioen sekuentziak identifikatzeko BLAST eta beste tresnekin pareko zehaztasunarekin [28].6719 irakurketa baino gehiago bakterio jatorrikoak zirela zehaztu zen, eta 124 eta 64, berriz, arkeo eta birusetakoak ziren, hurrenez hurren (4. irudia).Bakterioen DNA zati ugarienak Firmicutes (%46), Proteobacteria (%27) eta Bacteroidetes (%17) izan ziren (4a. irudia).Banaketa hori bat dator itsas muskuilu urdinaren mikrobiomaren aurreko ikerketekin [39, 40].Gammaproteobacteria Proteobacteria klase nagusia izan zen (%44), Vibronales asko barne (4b. irudia).ddPCR metodoak A. atra hemolinfaren ccfDNAn Vibrio DNA zatiak daudela baieztatu zuen (4c. irudia) [41].ccfDNA-ren bakterio-jatorriari buruzko informazio gehiago lortzeko, hurbilketa osagarri bat egin zen (S2. irudia, Informazio osagarria). Kasu honetan, gainjarritako irakurketak pareka-muturreko irakurketa gisa muntatu ziren eta norberaren jatorria (bibalbioak) edo norberaren jatorria ez den bezala sailkatu ziren BLASTN eta 1e−3 e balioa eta %90eko homologia duen ebakidura erabiliz. Kasu honetan, gainjarritako irakurketak pareka-muturreko irakurketa gisa muntatu ziren eta norberaren jatorria (bibalbioak) edo norberaren jatorria ez den bezala sailkatu ziren BLASTN eta 1e−3 e balioa eta %90eko homologia duen ebakidura erabiliz. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и 1e-3син и 1e ждению с гомологией> %90. Kasu honetan, gainjarritako irakurketak pareka-muturreko irakurketa gisa bildu ziren eta bertakoak (bibalbioak) edo ez-jatorrizko gisa sailkatu ziren BLASTN eta 1e-3-ren e balioa eta %90eko homologiarekin ebakidura erabiliz.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倐 倢 倢 末端读数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 用 blast和> % 90 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и концами и классиЄи классибраны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зованием зованием зернач знач происхождению мологии> %90. Kasu honetan, gainjartzen diren irakurketak pareka-bukatu gisa bildu eta berezkoak (bibalbioak) edo ez-original gisa sailkatu ziren e BLASTN eta 1e-3 balioak eta homologia-atalasea >% 90 erabiliz.A. atra genoma oraindik sekuentziatu ez denez, MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) mihiztagailuaren de novo muntaketa estrategia erabili dugu.Guztira 147.188 kontig identifikatu dira jatorriko mendeko (bibalbio) gisa.Ondoren, kontig hauek 1e-10 e-balioekin lehertu ziren BLASTN eta BLASTX erabiliz.Estrategia horri esker, A. atra ccfDNAn dauden 482 zati ez-bibalbio identifikatu ahal izan ditugu.DNA zati horien erdia baino gehiago (% 57) bakterioetatik lortu dira, batez ere brankietako sinbionteetatik, sinbionte sulfotrofoetatik barne, eta brankietako sinbionteetatik Solemya velumetatik (5. irudia).
Ugaritasun erlatiboa mota mailan.B Bi phyla nagusiren mikrobio-aniztasuna (Firmicutes eta Proteobacteria).ddPCR C Vibrio spp-en anplifikazio adierazgarria.A. 16S rRNA genearen zatiak (urdina) hiru atra hemolinfatan.
Guztira, bildutako 482 kontig aztertu dira.Kontu-nota metagenomikoen (prokariotoak eta eukariotoak) banaketa taxonomikoaren profil orokorra.B BLASTN eta BLASTX-ek identifikatutako bakterioen DNA zatien banaketa zehatza.
Kraken2 analisiak ere erakutsi zuen muskuiluaren ccfDNAk DNA zati arkealak zituela, Euryarchaeota (%65), Crenarchaeota (%24) eta Thaurmarcheota (%11) DNA zatiak barne (6a. irudia).Lehen Kaliforniako muskuiluen mikrobioen komunitatean aurkitutako Euryarchaeota eta Crenarchaeota-tik eratorritako DNA zatien presentzia ez da harritu behar [42].Euryarchaeota sarritan muturreko baldintzekin lotzen den arren, gaur egun aitortzen da bai Euryarchaeota eta bai Crenarcheota itsas ingurune kriogenikoko prokarioto ohikoenetakoak direla [43, 44].Muskuiluetan mikroorganismo metanogenoen presentzia ez da harritzekoa, Kerguelen goi-ordokiko hondoko isurietatik metano-ihes handien berri eman duten azken txostenak [45] eta Kerguelen uharteetako kostaldean ikusitako metano mikrobioen ekoizpen posiblea [46].
Orduan, gure arreta DNA birusen irakurketetara bideratu zen.Dakigunez, hau da muskuiluen birus-edukiaren helburuz kanpoko lehen azterketa.Espero bezala, bakteriofagoen (Caudovirales) DNA zatiak aurkitu genituen (6b. irudia).Hala ere, DNA birikoa ohikoena nukleozitobirusen filum batetik dator, zeina birusen artean genomarik handiena duen zitoplasma nuklear handi DNA birus (NCLDV) izenez ere ezaguna.Filum honen barruan, DNA-sekuentzia gehienak Mimimidoviridae (%58) eta Poxviridae (%21) familietakoak dira, eta horien ostalari naturalak ornodunak eta artropodoak dira, eta DNA-sekuentzia horien zati txiki bat alga birologiko ezagunak dira.Itsasoko alga eukariotoak infektatzen ditu.Pandora birusetik ere lortu ziren sekuentziak, ezagutzen diren edozein genero birusen artean genoma tamaina handiena duen birus erraldoitik.Interesgarria da, birusarekin infektatuta zeuden ostalari sorta, hemolinfaren ccfDNA sekuentziazioaren arabera zehaztuta, nahiko handia izan zen (S3 irudia, Informazio osagarria).Baculoviridae eta Iridoviridae bezalako intsektuak infektatzen dituzten birusak biltzen ditu, baita ameba, algak eta ornodunak infektatzen dituzten birusak ere.Pithovirus sibericum genomarekin bat datozen sekuentziak ere aurkitu ditugu.Pitobirusak ("zonbi birusak") lehen aldiz isolatu ziren Siberiako 30.000 urteko permafrost batetik [47].Beraz, gure emaitzak bat datoz aurreko txostenekin, birus horien espezie moderno guztiak ez direla desagertuta [48] eta birus hauek urruneko itsas ekosistema subartikoetan egon daitezkeela erakusten dutenekin.
Azkenik, beste animalia zelulaniztun batzuen ADN zatiak aurki genitzakeen proba egin genuen.Guztira 482 atzerriko kontig identifikatu zituzten BLASTN eta BLASTX-ek nt, nr eta RefSeq liburutegiekin (genomikoak eta proteinak).Gure emaitzek erakusten dute animalia zelulaniztunen ccfDNA zati arrotzen artean hezur hezurren DNA nagusi dela (5. irudia).Intsektuen eta beste espezie batzuen DNA zatiak ere aurkitu dira.DNA zatien zati handi samarra ez da identifikatu, ziurrenik, datu-base genomikoetan itsas espezie kopuru handi bat lur-espezieekin alderatuta ordezkapen gutxi dagoelako [49].
Artikulu honetan, LB kontzeptua muskuiluei aplikatzen diegu, hemolinfaren ccfDNA jaurtiketa sekuentziatzeak itsas kostaldeko ekosistemen konposizioari buruzko ikuspegia eman dezakeela argudiatuta.Bereziki, aurkitu dugu 1) muskuiluaren hemolinfa zirkulatzen duten DNA zati handi samarrak (~1-5 kb) kontzentrazio altu samarrak (mikrogramo-maila) dituela;2) DNA zati hauek independenteak eta ez-independenteak dira 3) DNA zati horien iturri arrotzen artean, bakterio, arkeo eta biriko DNA aurkitu dugu, baita beste animalia zelulaniztun batzuen DNA ere;4) Atzerriko ccfDNA zati hauek hemolinfan metatzea azkar gertatzen da eta muskuiluen barne-iragazte-jardueran laguntzen du.Amaitzeko, gure ikerketak frogatzen du orain arte batez ere biomedikuntzaren alorrean aplikatu izan den LB kontzeptuak ezagutza-iturri aberatsa baina esploratu gabea kodetzen duela, espezie sentinelaren eta haien ingurunearen arteko elkarrekintza hobeto ulertzeko erabil daitekeena.
Primateez gain, ccfDNA isolamendua jakinarazi da ugaztunetan, saguetan, txakurrak, katuak eta zaldiak barne [50, 51, 52].Hala ere, dakigunez, gure ikerketa zirkulazio sistema irekia duten itsas espezieetan ccfDNA detektatu eta sekuentziatu izanaren berri ematen duen lehena da.Muskuiluek duten ezaugarri anatomiko eta iragazteko gaitasun horrek, neurri batean behintzat, zirkulatzen duten DNA zatien tamaina-ezaugarri desberdinak azal ditzakete beste espezie batzuekin alderatuta.Gizakietan, odolean zirkulatzen duten DNA zati gehienak 150 eta 200 bp bitarteko tamainako zati txikiak dira.167 bp-ko maximoarekin [34, 53].DNA zatien zati txiki baina esanguratsu bat 300 eta 500 bp bitartekoa da, eta %5 inguru 900 bp baino luzeagoa da.[54].Tamaina-banaketaren arrazoia da plasmako ccfDNA-ren iturri nagusia zelulen heriotzaren ondorioz gertatzen dela, zelulen heriotzaren ondorioz edo zirkulazioko zelula hematopoietikoen nekrosiaren ondorioz, pertsona osasuntsuetan edo minbizi-gaixoetan tumore-zelulen apoptosiaren ondorioz (tumorearen DNA zirkulatzailea deritzona)., ctDNA).Muskuiluetan aurkitu dugun hemolinfaren ccfDNAren tamaina-banaketa 1000 eta 5000 bp bitartekoa zen, eta horrek iradokitzen du muskuiluaren ccfDNA jatorri ezberdina duela.Hipotesi logikoa da, muskuiluek sistema baskular erdi irekia baitute eta mikrobioen DNA genomikoaren kontzentrazio handiak dituzten itsas ingurune uretan bizi baitira.Izan ere, DNA exogenoa erabiliz egin ditugun laborategiko esperimentuek frogatu dute muskuiluek ADN zatiak pilatzen dituztela itsasoko uretan, ordu batzuen buruan behintzat degradatu egiten direla zelulak hartu eta/edo askatu eta/edo hainbat erakundetan gorde ondoren.Zelulen arraroa (prokariotoak zein eukariotoak) kontuan hartuta, balbula barneko konpartimentuen erabilerak auto-iturrietako zein atzerriko iturrietako ccfDNA kopurua murriztuko du.Bibalbioen berezko immunitatearen garrantzia eta zirkulatzen duten fagozito kopuru handia kontuan hartuta, hipotesia ere planteatu dugu atzerriko ccfDNA ere mikroorganismoak eta/edo zelula-hondakinak irenstean DNA arrotza metatzen duten fagozito zirkulatzaileetan aberasten dela.Batera hartuta, gure emaitzek erakusten dute hemolinfa ccfDNA bibalbioa informazio molekularraren biltegi bakarra dela eta espezie sentinel gisa duten estatusa indartzen duela.
Gure datuek adierazten dute bakterioetatik eratorritako hemolinfa ccfDNA zatien sekuentziazioak eta analisiak ostalari-flora bakterianoari eta inguruko itsas ekosisteman dauden bakterioei buruzko funtsezko informazioa eman dezaketela.Tiro-sekuentziazio-teknikek 16S rRNA identifikazio-metodo konbentzionalak erabili izan balira galduko liratekeen A. atra gill bakterio komensalaren sekuentziak agerian utzi dituzte, hein batean erreferentziazko liburutegi-alborapenagatik.Izan ere, Kerguelen-eko muskuilu-geruza berean M. platensis-etik bildutako LB datuen erabilerak erakutsi zuen zakatekin lotutako bakterio-sinbionteen konposizioa berdina zela bi muskuilu-espezieentzat (S4. irudia, Informazio osagarria).Bi muskuilu genetikoki ezberdinen antzekotasun horrek Kerguelengo hotzetan, sulfurotsuetan eta sumendietan dauden bakterio-komunitateen osaera isla dezake [55, 56, 57, 58].Sufre murrizten duten mikroorganismo maila altuagoak ondo deskribatu dira kostaldeko eremu bioturbatuak diren muskuiluak biltzean [59], Port-au-Franceko kostaldean adibidez.Beste aukera bat da muskuilu-flora komensala transmisio horizontalaren eraginpean egotea [60, 61].Ikerketa gehiago behar dira itsas ingurunearen, hondoko gainazalaren eta muskuiluetako bakterio sinbiotikoen konposizioaren arteko korrelazioa zehazteko.Ikasketa hauek abian dira gaur egun.
Hemolinfaren ccfDNAren luzera eta kontzentrazioa, bere arazteko erraztasuna eta kalitate handia eskopeta azkarraren sekuentziazioa ahalbidetzeko dira muskuiluaren ccfDNA itsas kostaldeko ekosistemetako biodibertsitatea ebaluatzeko erabiltzearen abantaila ugarietako batzuk.Ikuspegi hau bereziki eraginkorra da ekosistema jakin bateko komunitate birikoak (viromes) karakterizatzeko [62, 63].Bakterioek, arkeoek eta eukariotoek ez bezala, genomek ez dute filogenetikoki kontserbatutako generik, hala nola 16S sekuentziak.Gure emaitzek adierazten dutenez, muskuiluak bezalako espezie adierazleen biopsia likidoak erabil daitezkeela kostaldeko itsas ekosistemetan bizi ohi diren ostalariak infektatzen ezagutzen diren ccfDNA birus zati kopuru handi samarra identifikatzeko.Protozooak, artropodoak, intsektuak, landareak eta bakterio birusak (adibidez, bakteriofagoak) infektatzen dituzten birusak barne hartzen ditu.Antzeko banaketa aurkitu zen Kerguelenen muskuilu geruza berean bildutako muskuilu urdinen (M. platensis) hemolinfa ccfDNA viroma aztertu genuenean (S2 taula, Informazio osagarria).CcfDNAren eskopetaren sekuentziazioa gizakien edo beste espezie batzuen viromaren azterketan indarra hartzen duen ikuspegi berria da [21, 37, 64].Ikuspegi hau bereziki erabilgarria da kate bikoitzeko DNA birusak aztertzeko, izan ere ez baita gene bakarra kontserbatzen kate bikoitzeko DNA birus guztien artean, Baltimoreko birusen klase anitz eta zabalena ordezkatzen baitu [65].Birus horietako gehienak sailkatu gabe jarraitzen badute ere eta mundu biralaren zati guztiz ezezagun bateko birusak izan ditzaketen arren [66], aurkitu dugu A. atra eta M. platensis muskuiluen viromak eta ostalari sortak bi espezieen artean kokatzen direla.era berean (ikus S3 irudia, informazio gehigarria).Antzekotasun hori ez da harritzekoa, ingurunean dagoen DNAren tentsioan selektibitate falta isla baitaiteke.RNA araztua erabiliz geroko ikerketak behar dira gaur egun RNA viroma karakterizatzeko.
Gure ikerketan, Kowarski eta lankideen [37] lanetik egokitutako kanalizazio oso zorrotza erabili dugu, irakurketa eta kontig-en bi urratseko ezabaketa erabili zuten jatorrizko ccfDNA muntatu aurretik eta ondoren, mapatu gabeko irakurketen proportzio altua lortuz.Horregatik, ezin dugu baztertu mapatu gabeko irakurketa horietako batzuek beren jatorria izan dezaketela oraindik, batez ere muskuilu espezie honen erreferentziazko genomarik ez dugulako.Era berean, kanalizazio hau erabili dugu, norberaren eta norberaren irakurketen arteko kimerek eta Illumina MiSeq PE75-ek sortutako irakurketa-luzerek kezkatzen gintuztelako.Aztertu gabeko irakurketa gehienen beste arrazoi bat itsas mikrobio asko, batez ere Kerguelen bezalako urruneko eremuetan, ez direla ohartaraziak izan.Illumina MiSeq PE75 erabili dugu, ccfDNA zatien luzera giza ccfDNAren antzekoa suposatuz.Etorkizuneko ikerketetarako, hemolinfak ccfDNAk gizakiak eta/edo ugaztunak baino irakurketa luzeagoak dituela erakusten duten emaitzek, sekuentziazio plataforma egokiago bat erabiltzea gomendatzen dugu ccfDNA zati luzeetarako.Praktika honek askoz errazagoa izango du analisi sakonagorako zantzu gehiago identifikatzea.Gaur egun erabilgarri ez dagoen A. atra genoma nuklearraren sekuentzia osoa lortzeak ere asko erraztuko luke ccfDNA bereiztea norberaren iturrietatik eta ez norberarengandik.Gure ikerketak muskuiluetan biopsia likidoaren kontzeptua aplikatzeko aukeran zentratu dela kontuan hartuta, espero dugu etorkizuneko ikerketetan kontzeptu hori erabili ahala, tresna eta kanalizazio berriak garatuko direla, metodo honek muskuiluaren mikrobio-aniztasuna aztertzeko duen ahalmena areagotzeko.itsas ekosistema.
Biomarkatzaile kliniko ez inbaditzaile gisa, giza plasmako ccfDNA maila altuak hainbat gaixotasun, ehunen kalte eta estres-baldintzekin lotzen dira [67,68,69].Igoera hori ehunen kaltearen ondoren bere jatorriko DNA zatiak askatzearekin lotuta dago.Gai hau estres termiko akutua erabiliz jorratu genuen, muskuiluak 30 °C-ko tenperaturaren eraginpean egon baitziren laburki.Analisi hau hiru muskuilu mota ezberdinetan egin dugu hiru esperimentu independentetan.Hala ere, ez dugu aldaketarik aurkitu ccfDNA mailetan estres termiko akutuaren ondoren (ikus S5 irudia, informazio gehigarria).Aurkikuntza horrek azal dezake, neurri batean behintzat, muskuiluek zirkulazio-aparatu erdi irekia dutela eta iragazte-jarduera handia dela-eta ADN arrotz kantitate handiak pilatzea.Bestalde, muskuiluak, ornogabe asko bezala, estresak eragindako ehunen kaltearen aurrean erresistenteagoak izan daitezke, eta, ondorioz, hemolinfan ccfDNA askatzea mugatzen du [70, 71].
Orain arte, uretako ekosistemetako biodibertsitatearen DNAren analisiak ingurumeneko DNAren (eDNA) metabarkodearen inguruan jarri du arreta batez ere.Dena den, metodo hau normalean biodibertsitatearen analisian mugatua izan ohi da primerak erabiltzen direnean.Eskopeta-sekuentziazioaren erabilerak PCRren mugak eta lehen multzoen hautaketa alboratuak saihesten ditu.Horrela, nolabait, gure metodoa orain dela gutxi erabili den eDNA Shotgun sekuentziazio metodotik hurbilago dago, zatitutako DNA zuzenean sekuentziatzeko eta ia organismo guztiak aztertzeko gai dena [72, 73].Hala ere, LB eDNA metodo estandarretik bereizten duten oinarrizko arazo batzuk daude.Jakina, eDNA eta LBren arteko desberdintasun nagusia iragazki-ostalari naturalak erabiltzea da.Belakiak eta bibalbioak (Dresseina spp.) bezalako itsas espezieak eDNA aztertzeko iragazki natural gisa erabiltzen direla jakinarazi da [74, 75].Hala ere, Dreissenaren ikerketak DNA ateratzeko ehunen biopsiak erabili zituen.LBko ccfDNAren analisiak ez du ehunen biopsiarik behar, ekipamendu espezializatua eta batzuetan garestia eta eDNArekin edo ehunen biopsiarekin lotutako logistika.Izan ere, duela gutxi jakinarazi dugu LBko ccfDNA FTA laguntzarekin gorde eta aztertu daitekeela hotz-kate bat mantendu gabe, eta hori urruneko eremuetan ikertzeko erronka handia da [76].Biopsia likidoetatik ccfDNA ateratzea ere erraza da eta kalitate handiko DNA eskaintzen du eskopeta sekuentziatzeko eta PCR analisirako.Abantaila handia da eDNAren analisiarekin lotutako muga tekniko batzuk ikusita [77].Laginketa metodoaren sinpletasuna eta kostu baxua ere bereziki egokia da epe luzerako monitorizazio programetarako.Iragazte-gaitasun handiaz gain, bibalbioen beste ezaugarri ezagun bat haien mukiaren mukopolisakaridoen konposizio kimikoa da, birusen xurgapena sustatzen duena [78, 79].Horrek bibalbioak iragazki natural aproposa bihurtzen ditu biodibertsitatea eta klima-aldaketak ur-ekosistema jakin batean duen eragina ezaugarritzeko.Ostalaritik eratorritako DNA zatien presentzia eDNArekin alderatuta metodoaren muga gisa ikus daitekeen arren, eDNArekin alderatuta ccfDNA bertakoa izatearekin lotutako kostua aldi berean ulergarria da osasun-azterketetarako eskuragarri dagoen informazio kopuru handiagatik.desplazamendu ostalari.Honen barruan sartzen da ostalariaren genoman integratutako sekuentzia birikoen presentzia.Hau bereziki garrantzitsua da muskuiluentzat, bibalbioetan horizontalki transmititzen diren erretrobirus leuzemikoak daudela kontuan hartuta [80, 81].LBren beste abantaila bat eDNAren aldean hemolinfa zirkulatzen duten odol-zelulen jarduera fagozitikoa ustiatzen duela da, mikroorganismoak (eta haien genomak) irensten dituena.Fagozitosia bibalbioetako odol-zelulen funtzio nagusia da [82].Azkenik, metodoak muskuiluen iragazteko ahalmen handia (batez beste 1,5 l/h itsasoko uraren) eta bi eguneko zirkulazioa aprobetxatzen du, itsasoko geruza ezberdinen nahasketa areagotzen baitute, eDNA heterologoa harrapatzea ahalbidetuz.[83, 84].Beraz, muskuiluaren ccfDNA analisia bide interesgarria da muskuiluen nutrizio, ekonomia eta ingurumen eraginak kontuan hartuta.Gizakiengandik jasotako LBren analisiaren antzera, metodo honek ostalariaren DNAren aldaketa genetikoak eta epigenetikoak neurtzeko aukera ere zabaltzen du substantzia exogenoei erantzunez.Esaterako, hirugarren belaunaldiko sekuentziazio-teknologiak aurreikus daitezke genoma osoko metilazio-analisia egiteko ccfDNA natiboan nanoporoen sekuentziazioa erabiliz.Prozesu hori erraztu beharko litzateke muskuiluaren ccfDNA zatien luzera ezin hobea dela irakurketa luzeko sekuentziazio plataformekin, genoma osoko DNAren metilazioa aztertzea ahalbidetzen dutenak, sekuentziazio-prozesu bakarretik sekuentziazio kimikoen eraldaketarik egin gabe.85,86] Aukera interesgarria da, frogatu baita DNA metilazio-ereduek ingurumen-belaunaldi askoren estresaren aurrean erantzuna islatzen dutela eta.Hori dela eta, klima-aldaketaren edo kutsatzaileen eraginpean egon ondoren erantzuna arautzen duten mekanismoei buruzko informazio baliotsua eman dezake [87].Hala ere, LBren erabilera ez da mugarik gabea.Esan beharrik ez dago horrek ekosisteman espezie adierazleen presentzia eskatzen duela.Goian esan bezala, ekosistema jakin baten biodibertsitatea ebaluatzeko LB erabiltzeak iturriko DNA zatien presentzia kontuan hartzen duen kanalizazio bioinformatiko zorrotz bat ere eskatzen du.Beste arazo handi bat itsas espezieentzako erreferentziazko genomak eskuragarri egotea da.Espero da Marine Mammal Genomes Project eta duela gutxi sortu den Fish10k proiektua [88] bezalako ekimenek analisi hori erraztuko dutela etorkizunean.LB kontzeptua itsas iragazki-elikadura-organismoei aplikatzea ere bateragarria da sekuentziazio-teknologiaren azken aurrerapenekin, eta ohm anitzeko biomarkatzaileen garapenerako oso egokia da itsas habitaten osasunari buruzko informazio garrantzitsua emateko ingurumen-estresari erantzuteko.
Genomaren sekuentziazio-datuak NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 atalean gorde dira.
Brierley AS, Kingsford MJ Klima-aldaketaren eragina itsas bizitzan eta ekosistemetan.Cole Biologia.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Kontuan izan klima-aldaketak eta tokiko beste estres-eragin batzuek itsas ingurunean dituzten eragin konbinatuak.ingurune zientifiko orokorra.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Martxoaren lehengo zientzia.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Bero-estresaren baldintza errepikakorretan bero-tolerantzia murriztuak azaltzen du muskuilu urdinen udako hilkortasun handia.2019ko txosten zientifikoa;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Animalien heriotzen maiztasunaren, kausen eta hedapenaren azken aldaketak.Proc Natl Acad Sci AEB.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Espezieak ez diren hainbat patogenok Pinna nobilis-en hilkortasun masiboa eragin izana.Bizitza.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Klima-aldaketak Artikoko gaixotasun zoonotikoetan izan dezakeen eragina.Int J Osasun zirkunpolarra.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Muskuilu urdina (Mytilus edulis spp.) kostaldeko kutsaduraren jarraipenean organismo seinale gisa: berrikuspena.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Biopsia likidoaren integrazioa minbiziaren tratamenduan.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Biopsiaren heltze likidoa: tumorearen DNA zirkulatzen uzten du.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Azido nukleikoak giza plasman.Soc Biol filialen bilera-akta.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Zelularik gabeko DNAren rol berria minbiziaren tratamendurako markatzaile molekular gisa.Analisi biomolarraren kuantifikazioa.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia likidoa klinikan sartzen da - ezarpen-arazoak eta etorkizuneko erronkak.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW eta beste.Fetuaren DNA amaren plasman eta serumean dago.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Haurdunaldiko zelulaz kanpoko RNA zirkulatzailea erabiliz haurdunaldian zehar haurdunaldiaren eta haren konplikazioen azterketa.Dopediatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsia likidoa: emaile zelularik gabeko DNA erabiltzen da giltzurruneko injerto batean lesio alogenikoak detektatzeko.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Jaio aurreko diagnostikoan berrikuntzak: amaren plasma genomaren sekuentziazioa.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Patogenoen detekzio azkarra infektatutako gorputz-fluidoen hurrengo belaunaldiko sekuentziazio metagenomikoarekin.Nat Medikuntza.2021;27:115-24.