Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilo eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Hegaztien ugalkortasuna espermatozoideen biltegiratze-hodietan (SST) denbora luzez esperma bideragarri nahikoa gordetzeko duten gaitasunaren araberakoa da. Espermatozoideak SSTra sartzeko, bertan egoteko eta bertan irteteko mekanismo zehatza eztabaidagarria da oraindik. Sharkasi oiloen espermatozoideek aglutinazio-joera handia erakutsi zuten, zelula asko dituzten harizpi-sorta mugikorrak sortuz. Falopioren tronpa opako batean espermatozoideen mugikortasuna eta portaera behatzea zaila denez, espermatozoideen antzeko mikrokanal-sekzioa zuen mikrofluido-gailu bat erabili genuen espermatozoideen aglutinazioa eta mugikortasuna aztertzeko. Ikerketa honek espermatozoide-sortak nola eratzen diren, nola mugitzen diren eta SSTn espermatozoideen bizilekua luzatzeko duten eginkizuna aztertzen du. Espermatozoideen abiadura eta portaera erreologikoa ikertu genituen fluido-fluxua kanal mikrofluidiko batean presio hidrostatikoaren bidez sortzen zenean (fluxu-tasa = 33 µm/s). Espermatozoideek korrontearen aurka igeri egiteko joera dute (erreologia positiboa) eta espermatozoide-sortaren abiadura nabarmen murrizten da espermatozoide bakarrekin alderatuta. Espermatozoide-sortak espiralean mugitzen direla eta luzera eta lodiera handitzen direla ikusi da espermatozoide gehiago errekrutatzen diren heinean. Espermatozoide-sortak mikrofluido-kanalen alboko paretetara hurbiltzen eta itsasten zirela ikusi zen, 33 µm/s-tik gorako fluido-fluxu-abiadurarekin ez eramateko. Espermatozoide-sortak mikrofluido-kanalen alboko paretetara hurbiltzen eta itsasten zirela ikusi zen, 33 µm/s-tik gorako fluido-fluxu-abiadurarekin ez eramateko. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенюрам стенкам стенкам каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Espermatozoide-sortak mikrofluido-kanalen alboko paretetara hurbiltzen eta itsasten direla ikusi da, 33 µm/s-tik gorako fluido-fluxu-abiaduretan eramatea saihesteko.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33。扫观33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкрам стенкром замечено канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Espermatozoide-sortak mikrofluido-kanalaren alboko paretetara hurbildu eta itsasten direla ikusi da, 33 µm/s-tik gorako fluido-fluxuak eramatea saihesteko.Eskaneatze eta transmisio mikroskopia elektronikoak agerian utzi zuen espermatozoide-sortak material trinko ugariz eusten zirela. Lortutako datuek Sharkaziko oilasko-espermatozoideen mugikortasun berezia erakusten dute, baita espermatozoideek aglutinatzeko eta sorta mugikorrak osatzeko duten gaitasuna ere, eta horrek SMT-n espermatozoideen epe luzeko biltegiratzea hobeto ulertzen laguntzen du.
Gizakietan eta animalia gehienetan ernalketa lortzeko, espermatozoideak eta obuluak ernalketa-gunera une egokian iritsi behar dira. Beraz, estalketa obulatu aurretik edo une berean gertatu behar da. Bestalde, ugaztun batzuek, hala nola txakurrek, baita ugaztun ez diren espezieek ere, hala nola intsektuek, arrainek, narrastiek eta hegaztiek, espermatozoideak gordetzen dituzte ugalketa-organoetan denbora luzez, obuluak ernaltzeko prest egon arte (ernalketa asinkronoa 1 ). Hegaztiek gai dira obuluak ernaltzeko gai diren espermatozoideen bideragarritasuna 2-10 astez mantentzeko2.
Ezaugarri berezi hau hegaztiak beste animalietatik bereizten dituena da, ernalketa-probabilitate handia ematen baitu hainbat astez intseminazio bakar baten ondoren, aldi berean parekatu eta obulatu gabe. Esperma gordetzeko organo nagusia, esperma gordetzeko tubulua (SST) deritzona, uterobaginako loturan dauden barne mukosa-tolesturetan dago. Gaur egun arte, espermatozoideak esperma-bankuan sartzeko, bertan egoteko eta bertan irteteko mekanismoak ez dira guztiz ulertzen. Aurreko ikerketetan oinarrituta, hipotesi asko proposatu dira, baina horietako bat ere ez da baieztatu.
Forman4-k hipotesi bat egin zuen: espermatozoideek SST barrunbean mantentzen dute beren bizilekua, fluidoen fluxuaren norabidearen aurkako etengabeko mugimendu oszilatorioaren bidez, SST epitelio-zeluletan kokatutako proteina-kanalen bidez (erreologia). ATP agortzen da espermatozoideak SST lumenean mantentzeko beharrezkoa den flagelo-jarduera konstantearen ondorioz, eta mugikortasuna azkenean gutxitzen da, espermatozoideak fluido-fluxuaren bidez espermatozoide-bankutik atera eta Falopioren tronpa goranzko bidaia berri bat hasi arte espermatozoideak ernaltzeko. Obulua (Forman4). Espermatozoideen biltegiratze-eredu hau SST epitelio-zeluletan dauden 2, 3 eta 9 akuaporinen detekzioak babesten du immunozitokimikaren bidez. Gaur egun arte, oilaskoen semenaren erreologiari eta SST biltegiratzean, baginako espermatozoideen hautaketan eta espermatozoideen lehiaketan duen eginkizunari buruzko ikerketak falta dira. Oilaskoetan, espermatozoideak baginan sartzen dira estaltze naturalaren ondoren, baina espermatozoideen % 80 baino gehiago baginatik kanporatzen dira estaltzearen ondoren. Horrek iradokitzen du bagina dela hegaztietan espermatozoideen hautaketarako gune nagusia. Gainera, jakinarazi da baginan ernaldutako espermatozoideen % 1 baino gutxiago amaitzen direla SST-etan2. Txitoen baginako intseminazio artifizialean, SST-ra iristen diren espermatozoideen kopurua handitzen da intseminazioaren ondorengo 24 orduetan. Orain arte, prozesu honetan espermatozoideen hautaketa mekanismoa ez dago argi, eta espermatozoideen mugikortasunak zeregin garrantzitsua izan dezake SST espermatozoideen xurgapenean. Falopioren tronpen horma lodi eta opakuak direla eta, zaila da hegaztien Falopioren tronpen espermatozoideen mugikortasuna zuzenean kontrolatzea. Hori dela eta, ez dugu oinarrizko ezagutzarik espermatozoideak ernalketaren ondoren SST-ra nola igarotzen diren jakiteko.
Duela gutxi aitortu da erreologia ugaztunen genitaletan espermatozoideen garraioa kontrolatzen duen faktore garrantzitsu gisa. Espermatozoide mugikorrek kontrakorrontean migratzeko duten gaitasunean oinarrituta, Zaferani et al.8-k corra sistema mikrofluidiko bat erabili zuten espermatozoide mugikorrak pasiboki isolatzeko espermatozoide laginetatik. Espermaren sailkapen mota hau ezinbestekoa da antzutasun medikorako eta ikerketa klinikorako, eta denbora eta lan asko eskatzen duten eta espermatozoideen morfologia eta egitura-osotasuna arriskuan jar ditzaketen metodo tradizionalen aldean nahiago da. Hala ere, gaur egun arte, ez da ikerketarik egin oiloen genitalen jariakinek espermatozoideen mugikortasunean duten eraginari buruz.
Espermatozoideak SSTn gordeta mantentzen dituen mekanismoa edozein dela ere, ikertzaile askok ikusi dute espermatozoide egoiliarrak buruz buru aglutinatzen direla 9, 10 oiloen, 2 galeperren eta 11 indioilarren SSTn, espermatozoide-sorta aglutinatuak osatzeko. Egileek iradokitzen dute lotura dagoela aglutinazio honen eta espermatozoideak SSTn epe luzera gordetzearen artean.
Tingari eta Lake12-k oilaskoen espermatozoideen arteko lotura sendoa jakinarazi zuten, eta zalantzan jarri zuten ea hegaztien espermatozoideek ugaztunen espermatozoideek bezala aglutinatzen diren. Uste dute espermatozoideen arteko lotura sakonak espazio txiki batean espermatozoide kopuru handia egoteak eragindako estresaren ondorio izan daitezkeela.
Espermatozoideen portaera beirazko laminetan ebaluatzerakoan, aglutinazio zantzu iragankorrak ikus daitezke, batez ere semen tanten ertzetan. Hala ere, aglutinazioa askotan mugimendu jarraituarekin lotutako errotazio ekintzak asaldatzen zuen, eta horrek azaltzen du fenomeno honen izaera iragankorra. Ikertzaileek ohartu ziren, halaber, diluentea semenari gehitzean, "hari itxurako" zelula agregatu luzangak agertzen zirela.
Espermatozoide bat imitatzeko lehen saiakerak tanta zintzilik batetik alanbre mehe bat kenduz egin ziren, eta horren ondorioz, espermatozoide itxurako besikula luzanga bat atera zen semen tantatik. Espermatozoideak berehala lerrokatu ziren besikularen barruan modu paraleloan, baina unitate osoa azkar desagertu zen 3D mugaren ondorioz. Beraz, espermatozoideen aglutinazioa aztertzeko, beharrezkoa da espermatozoideen mugikortasuna eta portaera zuzenean behatzea espermatozoideen biltegiratze-hodi isolatuetan, eta hori zaila da lortzea. Horregatik, beharrezkoa da espermatozoideak imitatzen dituen tresna bat garatzea espermatozoideen mugikortasunaren eta aglutinazio-portaeraren ikerketak laguntzeko. Brillard et al13-k jakinarazi zuten txita helduen espermatozoideen biltegiratze-hodien batez besteko luzera 400-600 µm dela, baina SST batzuk 2000 µm-koak izan daitezkeela. Mero eta Ogasawara14-k seminifero guruinak espermatozoideak gordetzeko tubulu handituetan eta handitu gabeetan banatu zituzten, biak luzera berekoak (~500 µm) eta lepo zabalera berekoak (~38 µm), baina tubuluen batez besteko lumen diametroa 56,6 eta 56,6 µm-koa zen, hurrenez hurren, 11,2 μm-koa. Oraingo ikerketan, 200 µm × 20 µm-ko (Z × A) kanal-tamaina zuen mikrofluido-gailu bat erabili dugu, zeinaren zeharkako sekzioa anplifikatutako SST-arenaren antzekoa den. Horrez gain, espermatozoideen mugikortasuna eta aglutinazio-portaera aztertu ditugu fluido isurtzailean, eta hori bat dator Foremanen hipotesiarekin, zeinaren arabera SST epitelio-zelulek sortutako fluidoak espermatozoideak lumenean mantentzen dituen kontrakorrontearen (erreologikoaren) norabidean.
Ikerketa honen helburua Falopioren tronpetan espermatozoideen mugikortasuna behatzeko arazoak gainditzea eta ingurune dinamiko batean espermatozoideen erreologia eta portaera aztertzeko zailtasunak saihestea izan zen. Oilasko baten genitaletan espermatozoideen mugikortasuna simulatzeko presio hidrostatikoa sortzen duen gailu mikrofluidiko bat erabili zen.
Espermatozoide lagin diluitu tanta bat (1:40) mikrokanal gailuan sartu zenean, bi espermatozoideen mugikortasun mota identifikatu ahal izan ziren (espermatozoide isolatua eta espermatozoide lotutakoa). Gainera, espermatozoideek korrontearen aurka igeri egiteko joera zuten (erreologia positiboa; 1, 2 bideoa). Esperma-sortek espermatozoide bakartiena baino abiadura txikiagoa izan bazuten ere (p < 0,001), erreotaxia positiboa erakutsi zuten espermatozoideen ehunekoa handitu zuten (p < 0,001; 2. taula). Esperma-sortek espermatozoide bakartiena baino abiadura txikiagoa izan bazuten ere (p < 0,001), erreotaxia positiboa erakutsi zuten espermatozoideen ehunekoa handitu zuten (p < 0,001; 2. taula). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматочных сперматозо1 (), < 0, низкую скорость увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; цтал). Espermatozoide-sortek espermatozoide bakarrek baino abiadura txikiagoa izan bazuten ere (p < 0,001), erreotaxia positiboa erakutsi zuten espermatozoideen ehunekoa handitu zuten (p < 0,001; 2. taula).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显礏 昧座 昳怏 昀百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Espermatozoide-sorten abiadura espermatozoide bakarrena baino txikiagoa izan arren (p < 0,001), erreologia positiboa zuten espermatozoideen ehunekoa handitu zuten (p < 0,001; 2. taula).Espermatozoide bakar baten eta kimu-multzo baten erreologia positiboa % 53 eta % 85 ingurukoa dela kalkulatzen da, hurrenez hurren.
Sharkashi oilaskoen espermatozoideek, eiakulazioaren ondoren, dozenaka banakoz osatutako sorta linealak eratzen dituztela ikusi da. Sorta hauek denborarekin luzera eta lodiera handitzen dira eta in vitro ordu batzuetan egon daitezke desagertu aurretik (3. bideoa). Sorta filamentotsu hauek epididimoaren amaieran sortzen diren ekidna espermatozoideen itxura dute. Sharkashi oilaskoen semenak joera handia duela ikusi da aglutinatzeko eta sorta erretikulatu bat osatzeko bildu eta minutu bat baino gutxiagora. Sorta hauek dinamikoak dira eta inguruko edozein horma edo objektu estatikori itsatsi daitezke. Esperma-sortek esperma-zelulen abiadura murrizten duten arren, argi dago makroskopikoki haien linealtasuna handitzen dutela. Sorten luzera sortatan bildutako espermatozoide kopuruaren araberakoa da. Sortaren bi zati isolatu ziren: hasierako zatia, aglutinatutako espermatozoidearen buru librea barne, eta amaierako zatia, espermatozoidearen isatsa eta mutur distal osoa barne. Abiadura handiko kamera bat erabiliz (950 fps), espermatozoide aglutinatuen buru askeak ikusi ziren multzoaren hasierako zatian, multzoaren mugimenduaren erantzule direnak beren mugimendu oszilatorioagatik, gainerakoak multzoaren barrura arrastaka eramanez mugimendu helikoidal batekin (4. bideoa). Hala ere, multzo luzeetan, ikusi da espermatozoide-buru aske batzuk gorputzari itsatsita daudela eta multzoaren amaierako zatiak palen gisa jokatzen duela multzoa bultzatzen laguntzeko.
Fluido-fluxu motelean dauden bitartean, espermatozoide-sortak elkarren paraleloan mugitzen dira, baina gainjartzen eta geldirik dagoen guztiari itsasten hasten dira, fluxuaren abiadura handitzen den heinean korronte-fluxuak ez eramateko. Sortak espermatozoide-zelula batzuk elkarrengana hurbiltzen direnean sortzen dira, sinkronizatuan mugitzen eta elkarren inguruan biltzen hasten dira, eta gero substantzia itsaskor bati itsasten zaizkio. 1. eta 2. irudiek espermatozoideak elkarrengana nola hurbiltzen diren erakusten dute, lotura bat osatuz isatsak elkarren inguruan biltzen diren heinean.
Ikertzaileek presio hidrostatikoa aplikatu zuten espermatozoideen erreologia aztertzeko mikrokanal batean fluido-fluxua sortzeko. 200 µm × 20 µm (Z × A) tamainako eta 3,6 µm-ko luzerako mikrokanal bat erabili zen. Erabili mikrokanalak ontzien artean, muturretan xiringak jarrita. Elikagai-koloratzailea erabili zen kanalak ikusgarriagoak egiteko.
Lotu interkonexio kableak eta osagarriak horman. Bideoa fase-kontraste mikroskopio batekin grabatu zen. Irudi bakoitzarekin, fase-kontraste mikroskopioa eta mapaketa irudiak aurkezten dira. (A) Bi jarioen arteko konexioak fluxuari eusten dio mugimendu helikoidalari esker (gezi gorria). (B) Hodi-sortaren eta kanalaren hormaren arteko konexioa (gezi gorriak), aldi berean beste bi sortatara konektatuta daude (gezi horiak). (C) Mikrofluidoen kanaleko espermatozoide-sortak elkarren artean konektatzen hasten dira (gezi gorriak), espermatozoide-sorten sare bat osatuz. (D) Espermatozoide-sorten sare baten eraketa.
Espermatozoide diluituen tanta bat mikrofluido-gailura sartu eta fluxu bat sortu zenean, esperma-sorta fluxuaren norabidearen aurka mugitzen zela ikusi zen. Multzoak mikrokanalen paretetan ondo egokitzen dira, eta multzoen hasierako zatiko buru libreak haien kontra ondo egokitzen dira (5. bideoa). Gainera, bidean dauden partikula geldikorrei itsasten zaizkie, hala nola hondakinei, korronteak eramatea saihesteko. Denborarekin, sorta hauek harizpi luze bihurtzen dira, beste espermatozoide bakun batzuk eta sorta laburragoak harrapatzen dituztenak (6. bideoa). Fluxua moteltzen hasten den heinean, espermatozoide-lerro luzeek esperma-lerroen sare bat osatzen hasten dira (7. bideoa; 2. irudia).
Fluxu-abiadura handian (V > 33 µm/s), hari-mugimendu espiralak handitu egiten dira espermatozoide asko harrapatzeko eta multzoak eratzeko, fluxuaren noraezean jartzeko indarra hobeto eutsi ahal izateko. Fluxu-abiadura handian (V > 33 µm/s), hari-mugimendu espiralak handitu egiten dira espermatozoide asko harrapatzeko eta multzoak eratzeko, fluxuaren noraezean jartzeko indarra hobeto eutsi ahal izateko. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постоньькпы поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше прототив спротщих силе потока. Emari-abiadura handietan (V > 33 µm/s), harien mugimendu helikoidalak handitu egiten dira espermatozoide asko harrapatzen saiatzen diren heinean, fluxuaren higidura-indarrari hobeto eutsi diezaioketen multzoak eratuz.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 形成 束 形 束 动 增加 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в позтатка множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивлятьа сопротивлятьа пучки. Emari-abiadura handietan (V > 33 µm/s), harizpien mugimendu helikoidala handitu egiten da espermatozoide asko eratzen dituzten multzoak harrapatzeko ahaleginean, fluxuaren higidura-indarrei hobeto eusteko.Mikrokanalak alboko paretetara lotzen ere saiatu ziren.
Espermatozoide-sortak espermatozoide-buruen multzo eta isats kiribildu gisa identifikatu ziren argi-mikroskopia (LM) erabiliz. Agregatu desberdinak dituzten espermatozoide-sortak buru bihurritu eta flagelarrezko agregatu gisa, espermatozoide-isats fusionatu anitz gisa, isats bati lotutako espermatozoide-buruak eta nukleo okertuak dituzten espermatozoide-buruak nukleo fusionatu anitz gisa ere identifikatu dira. transmisio-mikroskopia elektronikoa (TEM). Eskaneatze-mikroskopia elektronikoak (SEM) erakutsi zuen espermatozoide-sortak espermatozoide-buruen agregatu zorroztuak zirela eta espermatozoide-agregatuek isats bilduen sare atxiki bat erakusten zutela.
Espermatozoideen morfologia eta ultraegitura, espermatozoide-sorten eraketa mikroskopia optiko (erdi-sekzio), eskaneatze-mikroskopia elektronikoa (SEM) eta transmisio-mikroskopia elektronikoa (TEM) erabiliz aztertu ziren, espermatozoide-laginak akridina laranjarekin tindatu eta epifluoreszentzia-mikroskopia erabiliz aztertu ziren.
Espermatozoideen zipriztinak akridina laranjarekin tindatzeak (3B irudia) erakutsi zuen espermatozoide-buruak elkarri itsatsita eta jariatze-materialez estalita zeudela, eta horrek multzo handiak eratzea eragin zuen (3D irudia). Espermatozoide-sortak espermatozoide-agregazioz osatuta zeuden, isats-sare batekin lotuta (4A-C irudiak). Espermatozoide-sortak espermatozoide askoren isats itsatsiez osatuta daude (4D irudia). Sekretuek (4E eta F irudiak) espermatozoide-sorten buruak estaltzen zituzten.
Espermatozoide-sortaren eraketa Fase-kontraste mikroskopia eta akridina laranjaz tindatutako espermatozoide-laginak erabiliz, espermatozoideen buruak elkarri itsasten zaizkiola erakutsi zen. (A) Espermatozoide-multzoen hasierako eraketa espermatozoide batekin (zirkulu zuria) eta hiru espermatozoiderekin (zirkulu horia) hasten da, espirala isatsean hasi eta buruan amaitzen delarik. (B) Akridina laranjaz tindatutako espermatozoide-lagin baten fotomikrografia, espermatozoide-buru itsasgarriak erakusten dituena (geziak). Isuriak burua(k) estaltzen ditu. Handitzea × 1000. (C) Mikrofluido-kanal batean fluxu bidez garraiatutako sorta handi baten garapena (950 fps-tan abiadura handiko kamera bat erabiliz). (D) Akridina laranjaz tindatutako espermatozoide-lagin baten mikrografia, multzo handiak erakusten dituena (geziak). Handitzea: ×200.
Espermatozoide-sorta baten eta akridina laranjaz tindatutako esperma-lauso baten eskaneatze-mikrografia elektronikoa. (A, B, D, E) espermatozoideen koloretako eskaneatze-mikrografia elektroniko digitalak dira, eta C eta F akridina laranjaz tindatutako esperma-lausoen mikrografiak dira, hainbat espermatozoide isats-sarea inguratzen duten atxikimendua erakusten dutenak. (AC) Espermatozoide-agregazioak isatsari lotutako sare gisa erakusten dira (geziak). (D) Hainbat espermatozoideren atxikimendua (itsasgarriarekin, arrosa koloreko ertza, gezia) isatsaren inguruan bilduta. (E eta F) Espermatozoide-buruaren agregazioak (erakusleak) itsasgarri-materialez estalita (erakusleak). Espermatozoideek hainbat zurrunbilo-itxurako egitura zituzten multzoak eratu zituzten (F). (C) ×400 eta (F) ×200 handitze.
Transmisio-mikroskopia elektronikoa erabiliz, espermatozoide-sortek isatsak zituztela ikusi genuen (6A eta C irudiak), buruak isatsei lotuta (6B irudia) edo buruak isatsei lotuta (6D irudia). Sortan dauden espermatozoideen buruak kurbatuak dira, sekzioan bi eskualde nuklear aurkeztuz (6D irudia). Ebaki-sortan, espermatozoideek buru bihurritua zuten, bi eskualde nuklear eta hainbat eskualde flagelarrekin (5A irudia).
Espermatozoide-sortaren arteko lotura-buztanak eta espermatozoide-buruak lotzen dituen aglutinatzaile-materiala erakusten dituen koloretako mikrografia elektroniko digitala. (A) Espermatozoide kopuru handi baten isats atxikia. Ikusi nola ikusten den isatsa erretratu-proiekzioetan (gezia) eta paisaia-proiekzioetan (gezia). (B) Espermatozoidearen burua (gezia) isatsari (gezia) lotuta dago. (C) Hainbat espermatozoide-isats (geziak) lotuta daude. (D) Aglutinatzaile-materialak (AS, urdina) lau espermatozoide-buru lotzen ditu (morea).
Eskaneatze-mikroskopia elektronikoa erabili zen jariapen edo mintzez estalitako esperma-sortetan espermatozoide-buruak detektatzeko (6B irudia), eta horrek adierazten du espermatozoide-sortak zelulaz kanpoko materialez ainguratuta zeudela. Aglutinatutako materiala espermatozoide-buruan kontzentratu zen (medusa-buru itxurako multzoa; 5B irudia) eta distalki hedatu zen, itxura hori distiratsua emanez fluoreszentzia-mikroskopian akridina laranjaz tindatzean (6C irudia). Substantzia hau argi ikusten da eskaneatze-mikroskopioan eta aglutinatzailetzat hartzen da. Atal erdi-meheek (5C irudia) eta akridina laranjaz tindatutako esperma-laginetan espermatozoide-sortak buru trinkoak eta isats kizkurrak zituztenak erakutsi ziren (5D irudia).
Hainbat fotomikrografia, espermatozoide-buruen eta tolestutako isatsen agregazioa erakusten dutenak, hainbat metodo erabiliz. (A) Espermatozoide-sorta baten zeharkako koloretako transmisio-elektroi-mikrografia digitala, bi zatitan banatutako nukleoa (urdina) eta hainbat flagelo-zati (berdea) dituen espermatozoide-buru kiribildu bat erakusten duena. (B) Koloretako eskaneatze-elektroi-mikrografia digitala, estalita dauden marmoka itxurako espermatozoide-buru multzo bat (geziak) erakusten duena. (C) Espermatozoide-buru agregatuak (geziak) eta isats kiribilduak (geziak) erakusten dituen ebaki erdi-mehea. (D) Akridina laranjaz tindatutako espermatozoide-lauso baten mikrografia, espermatozoide-buruen agregatuak (geziak) eta isats itsaskor kiribilduak (geziak) erakusten dituena. Kontuan izan substantzia itsaskor batek (S) espermatozoidearen burua estaltzen duela. (D) × 1000 handitzea.
Transmisio-mikroskopia elektronikoa erabiliz (7A irudia), espermatozoideen buruak bihurrituta zeudela eta nukleoek espiral forma zutela ere ikusi zen, akridina laranjaz tindatutako eta fluoreszentzia-mikroskopia erabiliz aztertutako esperma-laginetan baieztatu zenez (7B irudia).
(A) Kolore digitaleko transmisio-mikroskopio elektronikoa eta (B) Akridina laranjaz tindatutako espermatozoide-lausoa, buru kiribilduak eta espermatozoideen buruen eta isatsen lotura erakusten dituena (geziak). (B) × 1000 handitzea.
Aurkikuntza interesgarri bat da Sharkazien espermatozoideak multzokatzen direla mugikorreko harizpi-sortak osatzeko. Sorta horien propietateek aukera ematen digute ulertzeko zein izan daitekeen haien eginkizuna SST-n espermatozoideen xurgapenean eta biltegiratzean.
Estalketaren ondoren, espermatozoideak baginan sartzen dira eta hautaketa prozesu bizi bat jasaten dute, eta ondorioz, espermatozoide kopuru mugatu bat sartzen da SST-n15,16. Gaur egun arte, espermatozoideak SST-tik sartzeko eta irteteko mekanismoak ez daude argi. Hegaztietan, espermatozoideak SST-n gordetzen dira 2 eta 10 aste bitarteko denbora luzez, espeziearen arabera6. Eztabaida dago oraindik semenaren egoerari buruz SST-n gordetzean. Mugimenduan ala geldirik daude? Beste era batera esanda, nola mantentzen dute espermatozoideek beren posizioa hainbeste denboraz SST-n?
Forman4-k iradoki zuen SSTren bizilekua eta kanporatzea espermatozoideen mugikortasunaren arabera azal zitezkeela. Egileek hipotesi hau dute: espermatozoideek beren posizioa mantentzen dute SST epitelioak sortutako fluido-fluxuaren aurka igeri eginez, eta espermatozoideak SSTtik kanporatzen dira beren abiadura energia faltagatik atzera mugitzen hasten diren puntutik behera jaisten denean. Zaniboni5-ek baieztatu zuen 2, 3 eta 9 akuaporinen presentzia SST epitelio-zelulen zati apikalean, eta horrek zeharka babestu dezake Foreman-en espermatozoideen biltegiratze-eredua. Oraingo ikerketan, ikusi dugu Sharkashiren espermatozoideen ia erdiek erreologia positiboa erakusten dutela fluido isurtzailean, eta aglutinatutako espermatozoide-sortek erreologia positiboa erakusten duten espermatozoideen kopurua handitzen dutela, nahiz eta aglutinazioak moteldu. Ez da guztiz ulertzen nola bidaiatzen duten espermatozoideek hegaztiaren Falopioren tronpatik ernalketa-gunera. Ugaztunetan, fluido folikularrak espermatozoideak erakartzen ditu. Hala ere, uste da erakarle kimikoek espermatozoideak distantzia luzeetara hurbiltzera bideratzen dituztela7. Beraz, beste mekanismo batzuk dira espermatozoideen garraioaren arduradunak. Espermatozoideek estalketaren ondoren askatzen den Falopioren tronparen fluidoaren aurka orientatzeko eta isurtzeko duten gaitasuna faktore garrantzitsua dela jakinarazi da saguen espermatozoideak bideratzeko. Parker 17-k iradoki zuen espermatozoideek obiduktuak zeharkatzen dituztela hegaztietan eta narrastietan korronte ziliarren aurka igeri eginez. Hegaztietan esperimentalki frogatu ez den arren, Adolphi 18 izan zen lehena aurkitu zuena hegaztien espermatozoideek emaitza positiboak ematen dituztela iragazki-paper zerrenda batekin estalki baten eta laminaren artean likido geruza fin bat sortzen denean. Erreologia. Hino eta Yanagimachi-k [19] saguaren obulutegi-tronpa-umetoki konplexu bat jarri zuten perfusio-eraztun batean eta 1 µl tinta injektatu zuten istmoan Falopioren tronpetan fluido-fluxua bistaratzeko. Uzkurdura eta erlaxazio mugimendu oso aktibo bat nabaritu zuten Falopioren tronpan, non tinta-bola guztiak etengabe mugitzen ziren Falopioren tronparen anpulurantz. Egileek azpimarratzen dute beheko Falopioren tronpetatik goikoetara tronpa-fluido-fluxuaren garrantzia espermatozoideak altxatzeko eta ernaltzeko. Brillard20-k jakinarazi zuen oiloetan eta indioilarretan espermatozoideak mugimendu aktiboaren bidez migratzen direla baginako sarreratik, non gordetzen diren, utero-baginako junturara, non gordetzen diren. Hala ere, mugimendu hori ez da beharrezkoa uterobaginako juntura eta infundibuluaren artean, espermatozoideak desplazamendu pasiboaren bidez garraiatzen baitira. Aurreko gomendio hauek eta egungo ikerketan lortutako emaitzak ezagututa, ondoriozta daiteke espermatozoideek gora mugitzeko duten gaitasuna (erreologia) dela hautaketa prozesua oinarritzen den propietateetako bat. Horrek zehazten du espermatozoideak baginatik igarotzea eta CCT-ra sartzea biltegiratzeko. Forman4-k iradoki zuen bezala, honek ere erraztu dezake espermatozoideak SST-ra eta bere habitatera denbora batez sartzeko prozesua, eta gero irteteko abiadura moteltzen hasten denean.
Bestalde, Matsuzaki eta Sasanamik 21 iradoki zuten hegazti-espermatozoideek mugikortasun-aldaketak jasaten dituztela lozorrotik mugikortasunera, gizonezkoen eta emakumezkoen ugalketa-aparatuetan. SST-n egoiliarren espermatozoideen mugikortasunaren inhibizioa proposatu da espermatozoideen biltegiratze-denbora luzea eta gero SST-tik irten ondoren gaztetzea azaltzeko. Baldintza hipoxikoetan, Matsuzaki et al. 1-ek SST-n laktatoaren ekoizpen eta askapen handia jakinarazi zuten, eta horrek egoiliarren espermatozoideen mugikortasunaren inhibizioa ekar dezake. Kasu honetan, espermatozoideen erreologiaren garrantzia espermatozoideen hautaketan eta xurgapenean islatzen da, eta ez haien biltegiratzean.
Espermatozoideen aglutinazio-eredua azalpen sinesgarritzat jotzen da SSTn espermatozoideak denbora luzez gordetzeko, hegaztietan espermatozoideen atxikipen-eredu ohikoa baita hau2,22,23. Bakst et al. 2-k ikusi zuten espermatozoide gehienak elkarri itsasten zirela, multzo faszikularrak eratuz, eta espermatozoide bakarrak gutxitan aurkitzen zirela galeperren CCM-n. Bestalde, Wen et al. 24-k espermatozoide sakabanatuagoak eta espermatozoide-multzo gutxiago ikusi zituzten oilaskoetan SSTren lumenean. Behaketa hauetan oinarrituta, ondoriozta daiteke espermatozoideen aglutinaziorako joera desberdina dela hegaztien artean eta eiakulatu bereko espermatozoideen artean. Horrez gain, Van Krey et al. 9-k iradoki zuten aglutinatutako espermatozoideen disoziazio ausazkoa dela espermatozoideak Falopioren tronparen lumenean pixkanaka sartzearen erantzule. Hipotesi honen arabera, aglutinazio-ahalmen txikiagoa duten espermatozoideak lehenik SSTtik kanporatu behar dira. Testuinguru honetan, espermatozoideen aglutinatzeko gaitasuna hegazti zikinen esperma-lehiaketaren emaitzan eragina duen faktore bat izan daiteke. Gainera, zenbat eta denbora gehiago disoziatu aglutinatutako espermatozoideak, orduan eta denbora gehiago mantentzen da emankortasuna.
Espermatozoideen agregazioa eta multzotan agregatzea hainbat ikerketatan ikusi den arren2,22,24, ez dira xehetasunez deskribatu SST barruan duten behaketa zinematikoaren konplexutasunagatik. Hainbat saiakera egin dira espermatozoideen aglutinazioa in vitro aztertzeko. Agregazio zabala baina iragankorra ikusi zen hazi-tanta zintzilik zegoen alanbre mehea kendu zenean. Horrek burbuila luzanga bat tantatik irteten izatera eramaten du, guruin seminalaren antzera. 3D mugak eta tantaka lehortzeko denbora laburrak direla eta, bloke osoa azkar hondatu zen9. Oraingo ikerketan, Sharkashi oilaskoak eta txip mikrofluidikoak erabiliz, multzo hauek nola sortzen diren eta nola mugitzen diren deskribatu ahal izan dugu. Espermatozoide-multzoak semena bildu ondoren sortu ziren eta espiral batean mugitzen zirela ikusi zen, erreologia positiboa erakutsiz fluxuan daudenean. Gainera, makroskopikoki ikusita, espermatozoide-multzoak mugikortasunaren linealtasuna handitzen dutela ikusi da espermatozoide isolatuekin alderatuta. Horrek iradokitzen du espermatozoideen aglutinazioa SSTren penetrazioaren aurretik gerta daitekeela eta espermatozoideen ekoizpena ez dagoela estresaren ondorioz eremu txiki batera mugatuta, lehenago iradoki zen bezala (Tingari eta Lake12). Iltzeen eraketan, espermatozoideak sinkronizatuan igeri egiten dute lotura bat osatu arte, gero isatsak elkarren inguruan biltzen dira eta espermatozoidearen burua libre geratzen da, baina espermatozoidearen isatsa eta zati distala substantzia itsaskor batekin itsasten dira. Beraz, lotailuaren buru librea da mugimenduaren arduraduna, lotailuaren gainerakoa arrastaka eramanez. Espermatozoide-sorten eskaneatze-mikroskopia elektronikoak espermatozoide-buru atxikiak erakutsi zituen, material itsaskor askorekin estalita, eta horrek iradokitzen du espermatozoide-buruak atseden-sortetan lotuta zeudela, eta hori biltegiratze-gunera (SST) iritsi ondoren gertatu zela.
Espermatozoide-lagin bat akridina laranjaz tindatzen denean, espermatozoideen inguruko itsasgarri estrazelularra ikus daiteke mikroskopio fluoreszente batean. Substantzia honek espermatozoide-sortak inguruko gainazal edo partikuletara itsastea eta itsastea ahalbidetzen du, inguruko korrontearekin batera ez mugitzeko. Beraz, gure behaketek espermatozoideen atxikimenduaren zeregina erakusten dute, multzo mugikorren moduan. Korrontearen aurka igeri egiteko eta inguruko gainazaletara itsasteko duten gaitasunak espermatozoideak denbora gehiagoz egoteko aukera ematen du SSTn.
Rothschild25-ek hemozitometria kamera bat erabili zuen behi-haziaren banaketa flotatzailea aztertzeko esekidura tanta batean, mikroskopioaren ardatz optiko bertikala eta horizontala zuen kamera baten bidez mikrofotografioak eginez. Emaitzek erakutsi zuten espermatozoideak ganberaren gainazalera erakartzen zirela. Egileek iradokitzen dute espermatozoideen eta gainazalaren artean elkarrekintza hidrodinamikoak egon daitezkeela. Hori kontuan hartuta, Sharkashi txitoen haziek itsaskorrak osatzeko duten gaitasunarekin batera, handitu egin daiteke hazia SST horman itsasteko eta denbora luzez gordetzeko probabilitatea.
Bccetti eta Afzeliu26-k jakinarazi zuten espermatozoideen glikokalixa beharrezkoa dela gametoen ezagutzarako eta aglutinaziorako. Forman10-ek ikusi zuen glikoproteina-glikolipidoen estaldurako α-glikosidiko loturak hidrolisian neuraminidasarekin tratatzean, espermatozoideen mugikortasunari eragin gabe emankortasuna murriztu egiten zela. Egileek iradokitzen dute neuraminidasak glikokalixan duen eraginak espermatozoideen sekuestrazioa kaltetzen duela umetoki-baginako loturan, eta horrela emankortasuna murriztuz. Haien behaketek ezin dute alde batera utzi neuraminidasa tratamenduak espermatozoideen eta obozitoen ezagutza murriztu dezakeen aukera. Forman eta Engel10-ek aurkitu zuten emankortasuna murriztu egiten zela oiloak neuraminidasarekin tratatutako espermarekin baginan inseminatzen zirenean. Hala ere, neuraminidasarekin tratatutako espermatozoideekin egindako IVF-ak ez zuen emankortasunik eragin kontrol-oiloekin alderatuta. Egileek ondorioztatu zuten espermatozoideen mintzaren inguruko glikoproteina-glikolipidoen estalduraren aldaketek espermatozoideen ernaltzeko gaitasuna murriztu zutela utero-baginako loturetan espermatozoideen sekuestrazioa kaltetuz, eta horrek, aldi berean, espermatozoideen galera handitu zuela utero-baginako loturaren abiaduragatik, baina ez zuela eragiten espermatozoideen eta obuluen ezagutzan.
Indioilarretan, Bakst eta Bauchanek 11 besikula txikiak eta mintz zatiak aurkitu zituzten SSTren lumenean, eta granulu horietako batzuk espermatozoideen mintzarekin fusionatu zirela ikusi zuten. Egileek iradokitzen dute harreman hauek espermatozoideen epe luzeko biltegiratzean eragina izan dezaketela SSTn. Hala ere, ikertzaileek ez zuten zehaztu partikula hauen iturria, CCT zelula epitelialek jariatzen dituzten, gizonezkoen ugalketa-sistemak ekoitzi eta jariatzen dituzten edo espermatozoideak berak ekoitzitako. Gainera, partikula hauek aglutinazioaren arduradunak dira. Grützner et al27-k jakinarazi zuten epididimoko zelula epitelialek proteina espezifiko bat ekoizten eta jariatzen dutela, poro bakarreko traktu seminalak eratzeko beharrezkoa dena. Egileek ere jakinarazi dute sorta hauen sakabanaketa epididimoko proteinen elkarrekintzaren araberakoa dela. Nixon et al28-k aurkitu zuten eranskinek proteina bat jariatzen dutela, zisteinaz aberatsa den osteonektina azidoa; SPARC espermatozoide-multzoen eraketan parte hartzen du moko-ekidnetan eta ornitorrinkoetan. Izpi hauen sakabanaketa proteina honen galerarekin lotuta dago.
Oraingo ikerketan, mikroskopia elektroniko bidezko ultraegitura-analisiak erakutsi zuen espermatozoideak material trinko kantitate handi bati atxikita zeudela. Substantzia hauek buru itsasgarrien artean eta inguruan kondentsatzen den aglutinazioaren erantzule direla uste da, baina kontzentrazio txikiagoetan isatsaren eskualdean. Suposatzen dugu aglutinatzaile substantzia hau gizonezkoen ugalketa-aparatutik (epididimotik edo hodi deferenteetatik) kanporatzen dela semenarekin batera, askotan semena linfatik eta plasma seminaletik bereizten ikusten baitugu eiakulazioan zehar. Jakinarazi da hegaztien espermatozoideak epididimotik eta hodi deferenteetatik igarotzean, heltze-aldaketak jasaten dituztela, eta horrek proteinak lotzeko eta plasma-lemarekin lotutako glikoproteinak eskuratzeko gaitasuna laguntzen diela. Proteina hauen iraunkortasunak SST-ko espermatozoideen mintzetan iradokitzen du proteina hauek espermatozoideen mintzaren egonkortasunaren eskurapenean eragina izan dezaketela 30 eta haien ugalkortasuna zehaztu dezaketela 31. Ahammad et al.32-k jakinarazi zuten gizonezkoen ugalketa-aparatuaren hainbat ataletatik (barraskiluetatik hodi deferente distaletaraino) lortutako espermatozoideek bideragarritasun progresiboa erakusten zutela biltegiratze-baldintza likidoetan, biltegiratze-tenperatura edozein dela ere, eta oilaskoen bideragarritasuna ere handitzen zela Falopioren tronpetan intseminazio artifizialaren ondoren.
Sharkashi oilaskoen esperma-multzoek ezaugarri eta funtzio desberdinak dituzte ekidna, ornitorrinko, egur-sagu, orein-arratoi eta kobaya bezalako beste espezie batzuekin alderatuta. Sharkasi oilaskoetan, espermatozoide-sorten eraketak haien igeriketa-abiadura murriztu zuen espermatozoide bakarrekin alderatuta. Hala ere, sorta hauek espermatozoide erreologikoki positiboen ehunekoa handitu zuten eta espermatozoideek ingurune dinamiko batean egonkortzeko duten gaitasuna handitu zuten. Beraz, gure emaitzek aurreko iradokizuna berresten dute, hau da, SST-n espermatozoideen aglutinazioa epe luzerako espermatozoideen biltegiratzearekin lotuta dagoela. Hipotesi bat ere egiten dugu: espermatozoideek multzoak sortzeko duten joerak SST-n espermatozoideen galera-tasa kontrola dezakeela, eta horrek espermatozoideen lehiaketaren emaitza alda dezakeela. Suposizio honen arabera, aglutinazio-ahalmen txikia duten espermatozoideek SST askatzen dute lehenengo, eta aglutinazio-ahalmen handia dutenek, berriz, ondorengo gehienak sortzen dituzte. Poro bakarreko espermatozoide-sorten eraketa onuragarria da eta guraso-seme-alaben ratioan eragiten du, baina mekanismo desberdina erabiltzen du. Ekidnetan eta ornitorrinkoetan, espermatozoideak elkarren paraleloan antolatzen dira habearen aurreranzko abiadura handitzeko. Ekidna-sortak espermatozoide bakarrak baino hiru aldiz azkarrago mugitzen dira. Uste da ekidnetan esperma-multzo horien eraketa nagusitasuna mantentzeko eboluzio-egokitzapena dela, emeak promiskuoak baitira eta normalean hainbat arrekin ugaltzen baitira. Beraz, eiakulatu desberdinetako espermatozoideek gogor lehiatzen dira obulua ernaltzeko.
Sharkasi oilaskoen espermatozoide aglutinatuak erraz ikus daitezke fase-kontraste mikroskopia erabiliz, eta hori abantailagarritzat jotzen da in vitro espermatozoideen portaera erraz aztertzeko aukera ematen duelako. Sharkasi oilaskoetan esperma-multzoen eraketak ugalketa sustatzen duen mekanismoa ere desberdina da esperma-portaera kooperatiboa irudikatzen duten ugaztun plazentario batzuetan ikusten denarekin alderatuta, hala nola egur-saguetan, non espermatozoide batzuk arrautzetara iristen diren, beste banako ahaide batzuei arrautzak iristen eta kaltetzen lagunduz. Zeure burua frogatzeko. Portaera altruista. Autoernalketa 34. Espermatozoideen portaera kooperatiboaren beste adibide bat orein-saguetan aurkitu zen, non espermatozoideek genetikoki ahaidetuen zeuden espermatozoideak identifikatu eta haiekin konbinatu eta talde kooperatiboak osatzeko gai izan ziren, ahaidetasunik gabeko espermatozoideekin alderatuta abiadura handitzeko35.
Ikerketa honetan lortutako emaitzek ez dute Fomanen SWS-n espermatozoideen epe luzeko biltegiratzearen teoriarekin bat egiten. Ikertzaileek jakinarazi dute espermatozoideak SST estaltzen duten zelula epitelialen fluxuan mugitzen jarraitzen dutela denbora luzez, eta denbora-tarte jakin baten ondoren, espermatozoideen energia-erreserbak agortu egiten direla, eta horrek abiadura gutxitzea eragiten du, eta horrek pisu molekular txikiko substantziak kanporatzea ahalbidetzen du. Espermatozoideen energia SST-ren lumenetik fluidoaren fluxuarekin Falopioren tronparen barrunbearekin. Oraingo ikerketan, ikusi dugu espermatozoide bakarreko erdiak fluidoen aurka igeri egiteko gaitasuna erakutsi zuela, eta multzoan zuten atxikimenduak erreologia positiboa erakusteko gaitasuna handitu zuela. Gainera, gure datuak bat datoz Matsuzaki et al.-enekin. 1, zeinek jakinarazi zuten SST-n laktatoaren jariapenaren igoerak espermatozoide egoiliarren mugikortasuna inhibi dezakeela. Hala ere, gure emaitzek espermatozoideen lotailu mugikorren eraketa eta haien portaera erreologikoa deskribatzen dituzte mikrokanal baten barruko ingurune dinamiko baten aurrean, SST-n duten portaera argitzeko ahaleginean. Etorkizuneko ikerketak aglutinatzaile-agentearen osaera kimikoa eta jatorria zehaztean zentratu daitezke, eta horrek, zalantzarik gabe, ikertzaileei lagunduko die esperma likidoa gordetzeko eta ugalkortasunaren iraupena handitzeko modu berriak garatzen.
Ikerketan, hamabost sharkasi ar (homozigoto dominante; Na Na) lepo biluzik eta 30 astekoak hautatu ziren esperma-emaile gisa. Hegaztiak Nekazaritza Fakultateko Ikerketa Hegazti-Ustiategian hazi ziren, Ashit Unibertsitatean, Ashit Gobernaziora, Egipto. Hegaztiak kaiola indibidualetan (30 x 40 x 40 cm) eduki zituzten, argi-programa baten menpe (16 orduko argia eta 8 orduko iluntasuna) eta 160 g proteina gordin, 2800 kcal energia metabolizagarri eta 35 g kaltzio zituen dieta bat eman zieten. Kilogramo dieta bakoitzeko 5 gramo fosforo erabilgarri.
36, 37 datuen arabera, gizonezkoen esperma bildu zen sabeleko masaje bidez. Guztira 45 esperma lagin bildu ziren 15 gizonengandik 3 egunetan zehar. Esperma (n = 15/egun) berehala diluitu zen 1:1 (v:v) Belsville Poultry Semen Diluent-ekin, eta honek potasio difosfatoa (1,27 g), sodio glutamato monohidratoa (0,867 g), fruktosa (0,5 d), sodio azetato anhidroa (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometanoa (0,195 g), potasio zitrato monohidratoa (0,064 g), potasio monofosfatoa (0,065 g), magnesio kloruroa (0,034 g) eta H2O (100 ml) ditu, pH = 7,5, osmolaritatea 333 mOsm/kg38. Semen lagin diluituak lehenik mikroskopio optiko batean aztertu ziren semenaren kalitate ona (hezetasuna) ziurtatzeko, eta ondoren 37 °C-tan ur-bainu batean gorde ziren, bildu eta ordu erdira erabili arte.
Espermatozoideen zinematika eta erreologia gailu mikrofluidikoen sistema bat erabiliz deskribatzen dira. Semen laginak 1:40ra diluitu ziren Beltsville Avian Semen Diluent-ean, gailu mikrofluidiko batean sartu (ikus behean), eta parametro zinetikoak mikrofluidikako karakterizaziorako aurretik garatutako Semen Analisi Konputatudun (CASA) sistema bat erabiliz zehaztu ziren. Espermatozoideen mugikortasunari buruzko ikerketak ingurune likidoetan (Ingeniaritza Mekanikoko Saila, Ingeniaritza Fakultatea, Assiut Unibertsitatea, Egipto). Plugina hemen deskargatu daiteke: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Kurba-abiadura (VCL, μm/s), abiadura lineala (VSL, μm/s) eta batez besteko ibilbide-abiadura (VAP, μm/s) neurtu ziren. Espermatozoideen bideoak Optika XDS-3 fase-kontraste mikroskopio alderantzikatu bat erabiliz (40x objektiboarekin) grabatu ziren, Tucson ISH1000 kamera batera konektatuta 30 fps-tan 3 segundoz. Erabili CASA softwarea gutxienez hiru eremu eta lagin bakoitzeko 500 espermatozoide-ibilbide aztertzeko. Grabatutako bideoa etxeko CASA bat erabiliz prozesatu zen. CASA plugin-ean mugikortasunaren definizioa espermatozoideen igeriketa-abiaduran oinarritzen da, fluxu-tasarekin alderatuta, eta ez ditu beste parametro batzuk barne hartzen, hala nola albotik alboko mugimendua, fluidoen fluxuan fidagarriagoa dela ikusi baita. Mugimendu erreologikoa espermatozoideen mugimendu gisa deskribatzen da fluidoen fluxuaren norabidearen aurka. Ezaugarri erreologikoak zituzten espermatozoideak espermatozoide mugikor kopuruarekin zatitu ziren; geldirik zeuden eta konbekzioz mugitzen ziren espermatozoideak zenbaketatik kanpo utzi ziren.
Erabilitako produktu kimiko guztiak Elgomhoria Pharmaceuticals-etik (Kairo, Egipto) lortu ziren, bestelakorik adierazi ezean. Gailua El-sherry et al.-ek deskribatutako moduan fabrikatu zen. 40, aldaketa batzuekin. Mikrokanalak fabrikatzeko erabilitako materialen artean beirazko plakak (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 erresistentzia negatiboa (MicroChem, Newton, CA), diazetona alkohola (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) eta poliazetona zeuden. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalak litografia biguna erabiliz fabrikatzen dira. Lehenik eta behin, nahi zen mikrokanal diseinua zuen aurpegi-maskara babesgarri garden bat inprimatu zen bereizmen handiko inprimagailu batean (Prismatic, Kairo, Egipto eta Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masterrak beirazko plakak substratu gisa erabiliz egin ziren. Plakak azetona, isopropanol eta ur desionizatuan garbitu ziren eta ondoren 20 µm-ko SU8-25 geruza batekin estali ziren biraketa-estaldura bidez (3000 rpm, 1 min). SU-8 geruzak astiro lehortu ziren (65 °C-tan, 2 minutu eta 95 °C-tan, 10 minutu) eta UV erradiaziopean jarri ziren 50 segundoz. Esposizio osteko labea 65 °C-tan eta 95 °C-tan 1 minutuz eta 4 minutuz, agerian geratu ziren SU-8 geruzak gurutzatzeko, eta ondoren diazetona alkoholean garatu ziren 6,5 minutuz. Gofreak gogor labean eduki (200 °C-tan 15 minutuz) SU-8 geruza gehiago solidotzeko.
PDMS monomeroa eta gogortzailea 10:1eko pisu-erlazioan nahastuz prestatu zen, ondoren hutsean lehorgailu batean gasik gabe garbitu eta SU-8 marko nagusira isuri zen. PDMS labe batean sendatu zen (120 °C, 30 min), ondoren kanalak moztu, maisutik bereizi eta zulatu ziren mikrokanalaren sarreran eta irteeran hodiak lotu ahal izateko. Azkenik, PDMS mikrokanalak mikroskopioko portaobjektuei behin betiko lotu zitzaizkien korona-prozesadore eramangarri bat erabiliz (Electro-Technic Products, Chicago, IL), beste nonbait deskribatu bezala. Ikerketa honetan erabilitako mikrokanalak 200 µm × 20 µm (Z × A) neurtzen du eta 3,6 cm luze da.
Mikrokanalaren barruan presio hidrostatikoak eragindako fluido-fluxua sarrera-biltegiko fluido-maila irteera-biltegiko Δh39 altuera-diferentziaren gainetik mantenduz lortzen da (1. irudia).
non f marruskadura-koefizientea den, f = C/Re gisa definitua kanal angeluzuzen bateko fluxu laminarrarentzat, non C kanalaren alderdi-erlazioaren araberako konstantea den, L mikrokanalaren luzera den, Vav mikrokanalaren barruko batez besteko abiadura den, Dh kanalaren diametro hidraulikoa den, g – grabitatearen azelerazioa. Ekuazio hau erabiliz, kanalaren batez besteko abiadura kalkula daiteke ekuazio hau erabiliz: