Eskerrik asko Nature.com webgunea bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakutsiko dugu.
Silize partikula porotsuak sol-gel metodo baten bidez prestatu ziren, makroporotsuak diren partikulak lortzeko zenbait aldaketarekin. Partikula hauek N-fenilmaleimida-metilbinilisozianatoarekin (PMI) eta estirenoarekin batera egindako gehikuntza-zatiketa-katearen transferentzia (RAFT) polimerizazioaren bidez deribatu ziren, poliestireno (PMP) fase geldikorraren N-fenilmaleimida interkalazioa prestatzeko. Altzairu herdoilgaitzezko zutabe estuak (100 × 1,8 mm diametroa) lohi-ontziratze bidez bete ziren. Bost peptidoz (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leuzina entzefalina) osatutako peptido nahasketa baten PMP zutabearen bereizketa ebaluatu zen (errendimendu kromatografikoa) eta giza serumeko albuminaren (HAS) tripsina digestioa). Eluzio-baldintza optimoetan, peptido nahasketaren plaka-kopuru teorikoa 280.000 plaka/m²-koa da. Garatutako zutabearen bereizketa-errendimendua merkataritzakoarekin alderatuz... Ascentis Express RP-Amida zutabearekin, ikusi zen PMP zutabearen bereizketa-errendimendua zutabe komertziala baino hobea zela bereizketa-eraginkortasunari eta bereizmenari dagokionez.
Azken urteotan, industria biofarmazeutikoa merkatu global hedatzaile bihurtu da, merkatu-kuotaren igoera nabarmenarekin. Industria biofarmazeutikoaren hazkunde lehergarriarekin1,2,3, peptidoen eta proteinen analisia oso desiragarria da. Helburu-peptidoaz gain, hainbat ezpurutasun sortzen dira peptidoen sintesian zehar, eta, beraz, nahi den purutasuneko peptidoak lortzeko kromatografia-purifikazioa behar da. Gorputzeko fluidoetan, ehunetan eta zeluletan proteinen analisia eta karakterizazioa oso zeregin zaila da, lagin bakar batean detekta daitezkeen espezie kopuru handia dela eta. Masa-espektrometria tresna eraginkorra den arren peptidoen eta proteinen sekuentziaziorako, lagin horiek masa-espektrometroan pase bakarrean injektatzen badira, bereizketa ez da aproposa izango. Arazo hau arindu daiteke kromatografia likidoaren (LC) bereizketak MS analisia baino lehen ezarriz, eta horrek masa-espektrometroan sartzen diren analitoen kopurua murriztuko du une jakin batean4,5,6. Gainera, fase likidoaren bereizketan zehar, analitoak eskualde estuetan fokatu daitezke, horrela analito horiek kontzentratzen eta MS detekzio-sentsibilitatea hobetzen. Kromatografia likidoa (LC) nabarmen aurreratu da azken hamarkadan eta bihurtu da... proteomikako analisian teknika ezaguna7,8,9,10.
Alderantzizko faseko likido kromatografia (RP-LC) oso erabilia da peptido nahasketen purifikazio eta bereizketarako, oktadezil-modifikatutako silizea (ODS) erabiliz fase geldikor gisa11,12,13. Hala ere, RP fase geldikorrek ez dute peptidoen eta proteinen bereizketa egokia ematen, haien egitura konplexua eta izaera anfifilikoa direla eta 14,15. Beraz, bereziki diseinatutako fase geldikorrak behar dira peptidoak eta proteinak aztertzeko, zati polarrak eta ez-polarrak dituztenak, analito hauekin elkarreragin eta atxikitzeko16. Modu mistoko kromatografia, elkarrekintza multimodalak eskaintzen dituena, RP-LCren alternatiba izan daiteke peptidoak, proteinak eta beste nahaste konplexu batzuk bereizteko. Hainbat modu mistoko fase geldikorrak prestatu dira, eta fase hauekin betetako zutabeak erabili dira peptido eta proteina bereizketarako17,18,19,20,21. Modu mistoko fase geldikorrak (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalazio polarra/RPLC) egokiak dira peptido eta proteinen bereizketarako, bi nahaste polarrak eta ez-polarrak daudelako. taldeak22,23,24,25,26,27,28. Era berean, lotura kobalenteak dituzten talde polarrak dituzten fase geldikor interkalatzaile polarrek bereizketa-ahalmen ona eta selektibitate berezia erakusten dute analito polar eta ez-polarrentzat, bereizketa analitoaren eta fase geldikorraren arteko elkarrekintzaren araberakoa baita. Elkarrekintza multimodalak 29, 30, 31, 32. Duela gutxi, Zhang et al. 30-ek dodeziloz amaitutako poliamina fase geldikor bat prestatu zuten eta hidrokarburoak, antidepresiboak, flavonoideak, nukleosidoak, estrogenoak eta beste hainbat analito arrakastaz bereizi zituzten. Interkalatzaile polarrak talde polarrak eta ez-polarrak ditu, beraz, peptidoak eta proteinak bereizteko erabil daiteke, bai zati hidrofoboak bai hidrofiloak dituztenak. Zutabe polarrak (adibidez, amida-txertatutako C18 zutabeak) komertzialki eskuragarri daude Ascentis Express RP-Amide zutabeen izen komertzialarekin, baina zutabe hauek 33 aminaren analisirako soilik erabiltzen dira.
Oraingo ikerketan, fase geldikor polarra (N-fenilmaleimidaz txertatutako poliestirenoa) prestatu eta ebaluatu zen HSAren peptidoak eta tripsina digerituak bereizteko. Fase geldikorra estrategia hau erabiliz prestatu zen. Silize partikula porotsuak aurreko argitalpenean emandako prozeduraren arabera prestatu ziren, prestaketa protokoloan aldaketa batzuk eginez. Urea, polietilen glikola (PEG), TMOS, ur eta azido azetikoaren erlazioa egokitu zen poro-tamaina handiko silize partikulak prestatzeko. Bigarrenik, ligando berri bat, fenilmaleimida-metil binil isozianatoa, sintetizatu eta silize partikulak deribatzeko erabili zen fase geldikor polarra prestatzeko. Sortutako fase geldikorra altzairu herdoilgaitzezko zutabe batean (100 × 1,8 mm diametroa) sartu zen, ontziratze-eskema optimizatua erabiliz. Zutabearen ontziratzea bibrazio mekanikoarekin laguntzen da zutabearen barruan ohe homogeneoa sortzen dela ziurtatzeko. Bost peptidoz osatutako peptido-nahasteen zutabe-banaketa ebaluatu; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leuzina Entzefalina) eta giza serumeko albuminaren tripsina digeritua (HAS). HSAren peptido nahasketa eta tripsina digeritua bereizmen eta eraginkortasun onarekin bereizten zirela ikusi zen. PMP zutabearen bereizketa-errendimendua Ascentis Express RP-Amide zutabearenarekin alderatu zen. Bai peptidoak bai proteinak ondo bereizita eta eraginkorrak zirela ikusi zen PMP zutabean, eta hau Ascentis Express RP-Amide zutabea baino eraginkorragoa izan zen.
PEG (polietilenglikola), urea, azido azetikoa, trimetoxi ortosilikatoa (TMOS), trimetil klorosilanoa (TMCS), tripsina, giza serumeko albumina (HSA), amonio kloruroa, urea, hexano metildisilazanoa (HMDS), metakriloil kloruroa (MC), estirenoa, 4-hidroxi-TEMPO, bentzoil peroxidoa (BPO), HPLC mailako azetonitriloa (ACN), metanola, 2-propanola eta azetona. Sigma-Aldrich-etik erosiak (St. Louis, MO, AEB).
Urea (8 g), polietilen glikola (8 g) eta 8 mL 0,01 N azido azetikoren nahasketa bat 10 minutuz irabiatu zen, eta ondoren 24 mL TMOS gehitu zitzaizkion izotzez betetako baldintzetan. Erreakzio-nahasketa 40 °C-tan berotu zen 6 orduz eta gero 120 °C-tan 8 orduz altzairu herdoilgaitzezko autoklabe batean. Ura isuri eta hondar-materiala 70 °C-tan lehortu zen 12 orduz. Masa bigun lehortua labean leundu eta 550 °C-tan kalsinkatu zen 12 orduz. Hiru lote prestatu eta karakterizatu ziren partikulen tamainan, poroen tamainan eta azaleran erreproduzigarritasuna aztertzeko.
Silize partikulen gainazala aldez aurretik sintetizatutako fenilmaleimida-metilbinilisozianato ligandoarekin (PCMP) aldatuz eta ondoren estirenoarekin erradialki polimerizatuz, talde polarrak dituen konposatu bat prestatu zen. Agregatu eta poliestireno kateetarako fase geldikorra. Prestaketa prozesua jarraian deskribatzen da.
N-fenilmaleimida (200 mg) eta metil binil isozianatoa (100 mg) tolueno lehorrean disolbatu ziren, eta 0,1 mL 2,2′-azoisobutironitrilo (AIBN) gehitu ziren erreakzio-matrazean fenilmaleimida-metil binil isozianato kopolimeroa (PMCP) prestatzeko. Nahastea 60 °C-tan berotu zen 3 orduz, iragazi eta labean lehortu zen 40 °C-tan 3 orduz.
Silize partikula lehorrak (2 g) tolueno lehorrean (100 mL) barreiatu ziren, irabiatu eta 500 mL-ko hondo biribileko matraze batean sonikatu ziren 10 minutuz. PMCP (10 mg) toluenoan disolbatu eta tantaka gehitu zen erreakzio-matrazera tantaka-inbutu baten bidez. Nahastea 100 °C-tan errefluxatu zen 8 orduz, iragazi eta azetonarekin garbitu eta 60 °C-tan lehortu zen 3 orduz. Ondoren, PMCPri lotutako silize partikulak (100 g) toluenoan (200 ml) disolbatu ziren eta 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) gehitu zen 100 µL dibutil-estainu dilaurato katalizatzaile gisa. Nahastea 50 °C-tan irabiatu zen 8 orduz, iragazi eta 50 °C-tan lehortu zen 3 orduz.
Estirenoa (1 mL), bentzoil peroxidoa BPO (0,5 mL) eta TEMPO-PMCPri lotutako silize partikulak (1,5 g) toluenoan barreiatu eta nitrogenoarekin garbitu ziren. Estirenoaren polimerizazioa 100 °C-tan egin zen 12 orduz. Emaitza den produktua metanolarekin garbitu eta 60 °C-tan lehortu zen gau osoan. Erreakzio eskema orokorra 1. irudian ageri da.
Laginak 393 K-tan desgasifikatu ziren ordubetez, 10-3 Torr baino gutxiagoko hondar-presioa lortzeko. P/P0 = 0,99 presio erlatibo batean adsorbatutako N2 kantitatea erabili zen poro-bolumen osoa zehazteko. Silize partikula biluzien eta ligandoekin lotutakoen morfologia aztertu zen eskaneatze-mikroskopia elektronikoarekin (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). Lagin lehorrak (silize biluzi eta ligandoekin lotutako silize partikulak) aluminiozko zutabe batean jarri ziren karbono-zinta itsasgarria erabiliz. Urrea estali zitzaien laginei Q150T sputtering estaldura bat erabiliz, eta 5 nm-ko Au geruza bat jarri zen laginen gainean. Horrek prozesuaren eraginkortasuna hobetzen du tentsio baxuak erabiliz eta ale fineko sputtering hotza eskaintzen du. Thermo Electron (Waltham, MA, AEB) Flash EA1112 analizatzaile elementala erabili zen analisi elementalerako. Malvern (Worcestershire, Erresuma Batua) Mastersizer 2000 partikula-tamaina analizatzaile bat erabili zen partikula-tamainaren banaketa lortzeko. Silize partikula biluziek eta Ligandoei lotutako silize partikulak (5 mg bakoitza) 5 mL isopropanoletan barreiatu ziren, 10 minutuz sonikatu, 5 minutuz zurrunbiloan irabiatu eta Mastersizer-en mahai optikoan jarri ziren. Analisi termograbimetrikoa minutuko 5 °C-ko abiaduran egin zen, 30 eta 800 °C arteko tenperatura-tarte batean.
100 × 1,8 mm-ko diametroa zuten altzairu herdoilgaitzezko zutabe estuak, beiraz estaliak, lohi-paketatze metodoa erabiliz bete ziren, 1. erreferentzian erabilitako prozedura bera aplikatuz. 31. Altzairu herdoilgaitzezko zutabe bat (beira-estaldura, 100 × 1,8 mm-ko diametroa), 1 µm-ko frita duen irteera-konexio batekin, lohi-ontziratzaile batera konektatu zen (Alltech Deerfield, IL, AEB). Fase geldikorreko lohi bat prestatu, 150 mg fase geldikorreko 1,2 mL metanoletan esekiz eta biltegiratze-zutabera bidaliz. Metanola erabili zen lohi-ontziaren disolbatzaile gisa eta disolbatzaile propultsatzaile gisa. Zutabea sekuentzialki bete, 100 MP-ko presioak aplikatuz 10 minutuz, 80 MP-ko 15 minutuz eta 60 MP-ko 30 minutuz. Ontziratzean, bibrazio mekanikoa aplikatu zen bi GC zutabe-astintzailerekin (Alltech, Deerfield, IL, AEB), zutabearen ontziratze uniformea ​​bermatzeko. Itxi lohi-ontziratzailea eta askatu presioa poliki-poliki zutabean kalterik ez gertatzeko. Deskonektatu zutabea lohi-ontziratze-unitatetik eta konektatu beste konexio bat sarrerara eta LC sistemara bere errendimendua egiaztatzeko.
LC ponpa bat (10AD Shimadzu, Japonia), injektore bat (Valco (AEB) C14 W.05) 50nL-ko injekzio begizta batekin, mintz-desgasifikatzaile bat (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilar leiho bat eraiki ziren. µLC detektagailu berezi bat (UV-2075) eta beira-estaldurako mikrozutabeak erabili ziren. Lotura-hodi oso estuak eta laburrak erabili ziren zutabe-bandaren zabalera gehigarriaren eragina minimizatzeko. Ontziratu ondoren, kapilarrak (50 μm id 365) eta erredukzio-unitate kapilarrak (50 μm) instalatu ziren erredukzio-unitatearen 1/16″-ko irteeran. Datuen bilketa eta kromatografia-prozesamendua Multichro 2000 softwarea erabiliz egin ziren. 254 nm-tan monitorizazioa. Analitoak UV xurgapenaren arabera probatu ziren. Datu kromatografikoak OriginPro8-k (Northampton, MA) aztertu zituen.
Giza serumeko albumina, hauts liofilizatua, ≥ % 96 (agarosa gel elektroforesia) 3 mg tripsinarekin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 mL) eta 0,2 M amonio bikarbonatoarekin (1 mL) nahastuta. Disoluzioa 10 minutuz irabiatu eta ur-bainu batean mantendu zen 37 °C-tan 6 orduz, eta ondoren 1 mL % 0,1 TFArekin itzali zen. Iragazi disoluzioa eta gorde 4 °C-tik behera.
Peptido nahasketen eta HSA tripsina digerituen bereizketa PMP zutabeetan ebaluatu zen bereizita. Egiaztatu HSAren peptido nahasketaren eta tripsina digerituaren bereizketa PMP zutabearen bidez eta alderatu emaitzak Ascentis Express RP-Amide zutabearekin. Plaka teorikoaren zenbakia honela kalkulatzen da:
Silize partikula biluzien eta ligandoekin lotutako silize partikulen SEM irudiak 2. IRUDIAN ageri dira. Silize partikula biluzien (A, B) SEM irudiek erakusten dute, aurreko ikerketekin alderatuta, partikula hauek esferikoak direla, hau da, luzangak edo simetria irregularra dutela. Ligandoekin lotutako silize partikulen (C, D) gainazala silize partikula biluziena baino leunagoa da, eta hori silize partikulen gainazalean poliestireno kateen estalduragatik izan daiteke.
Silize partikula biluzien (A, B) eta ligandoekin lotutako silize partikulen (C, D) eskaneatze-mikroskopio elektronikoaren irudiak.
Silize partikula biluzien eta ligandoekin lotutako silize partikulen partikula-tamainaren banaketak 3(A) irudian ageri dira. Bolumen-oinarritutako partikula-tamainaren banaketa-kurbek erakutsi zuten silize partikulen tamaina handitu egin zela aldaketa kimikoaren ondoren (3A irudia). Oraingo ikerketako eta aurreko ikerketako silize partikulen partikula-tamainaren banaketa-datuak 1(A) taulan alderatzen dira. PMPren bolumen-oinarritutako partikula-tamaina, d(0,5), 3,36 μm da, aurreko ikerketarekin alderatuta, 3,05 μm-ko ad(0,5) balioarekin (poliestirenoari lotutako silize partikulak)34. Multzo honek partikula-tamainaren banaketa estuagoa zuen gure aurreko ikerketarekin alderatuta, erreakzio-nahastean PEG, urea, TMOS eta azido azetikoaren proportzio aldakorren ondorioz. PMP fasearen partikula-tamaina lehenago aztertu genuen poliestirenoari lotutako silize partikula fasearena baino zertxobait handiagoa da. Horrek esan nahi du silize partikulen gainazaleko funtzionalizazioak estirenoarekin poliestireno geruza bat (0,97 µm) bakarrik utzi zuela silize gainazalean, eta PMP fasean... geruzaren lodiera 1,38 µm-koa zen.
Silize partikula biluzien eta ligandoei lotutako silize partikulen partikula-tamainaren banaketa (A) eta poro-tamainaren banaketa (B).
Oraingo ikerketako silize partikulen poroen tamaina, poroen bolumena eta azalera 1(B) taulan ageri dira. Silize partikula biluzien eta ligandoekin lotutako silize partikulen PSD profilak 3(B) irudian ageri dira. Emaitzak aurreko ikerketarekin alderagarriak dira. Silize partikula biluzien eta ligandoekin lotutakoen poroen tamainak 310 eta 241 dira, hurrenez hurren, eta horrek adierazten du poroen tamaina 69 aldiz txikitzen dela aldaketa kimikoaren ondoren, 1(B) taulan erakusten den bezala, eta kurbaren aldaketa 3(B) irudian ageri da. Era berean, silize partikulen poroen bolumena 0,67tik 0,58 cm3/g-ra jaitsi zen aldaketa kimikoaren ondoren. Gaur egun aztertutako silize partikulen azalera espezifikoa 116 m2/g da, aurreko ikerketaren (124 m2/g) parekoa. 1(B) taulan erakusten den bezala, silize partikulen azalera (m2/g) ere 116 m2/g-tik 105 m2/g-ra jaitsi zen aldaketa kimikoaren ondoren. aldaketa.
Fase geldikorraren analisi elementalaren emaitzak 2. taulan ageri dira. Uneko fase geldikorraren karbono-karga % 6,35ekoa da, aurreko ikerketako karbono-karga baino txikiagoa (poliestirenozko silize-partikulak, % 7,9335 eta % 10,21, hurrenez hurren) 42. Uneko fase geldikorraren karbono-karga baxua da, uneko SP prestatzean, estirenoaz gain, fenilmaleimida-metilbinilisozianatoa (PCMP) eta 4-hidroxi-TEMPO bezalako ligando polar batzuk erabili baitziren. Uneko fase geldikorraren nitrogeno-pisu ehunekoa % 2,21ekoa da, aurreko ikerketetako nitrogenoaren pisuaren % 0,1735 eta % 0,85ekin alderatuta, hurrenez hurren. Horrek esan nahi du nitrogenoaren pisu-ehunekoa handiagoa dela uneko fase geldikorrean fenilmaleimida dela eta. Era berean, (4) eta (5) produktuen karbono-kargak % 2,7 eta % 2,9 izan ziren, hurrenez hurren, eta azken fasearen karbono-karga (6) produktua % 6,35ekoa izan zen, 2. taulan erakusten den bezala. Pisu-galera PMP fase geldikorrarekin egiaztatu zen, eta TGA kurba 4. irudian ageri da. TGA kurbak % 8,6ko pisu-galera erakusten du, eta hori bat dator karbono-kargarekin (% 6,35), ligandoek ez baitute C bakarrik, baita N, O eta H ere.
Fenilmaleimida-metilbinilisozianato ligandoa aukeratu zen silize partikulen gainazaleko aldaketarako, fenilmaleimida talde polarrak eta vinilisozianato taldeak dituelako. Binil isozianato taldeek estirenoarekin erreakziona dezakete erradikal bizien polimerizazioaren bidez. Bigarren arrazoia analitoarekin interakzio moderatua duen talde bat txertatzea da, eta analitoaren eta fase geldikorraren artean interakzio elektrostatiko sendorik ez dagoena, fenilmaleimida zatiak ez baitu karga birtualik pH normalean. Fase geldikorraren polaritatea estireno kantitate optimoaren eta erradikal askeen polimerizazioaren erreakzio-denboraren bidez kontrola daiteke. Erreakzioaren azken urratsa (erradikal askeen polimerizazioa) kritikoa da eta fase geldikorraren polaritatea alda dezake. Elementuen analisia egin zen fase geldikorraren karbono-karga egiaztatzeko. Estireno kopurua eta erreakzio-denbora handitzeak fase geldikorraren karbono-karga handitzen zuela ikusi zen, eta alderantziz. Estireno kontzentrazio desberdinekin prestatutako SP-ek karbono-karga desberdinak dituzte. Berriz ere, kargatu fase geldikorrak altzairu herdoilgaitzezko zutabeetan eta egiaztatu haien kromatografia-egoeran. errendimendua (hautakortasuna, bereizmena, N balioa, etab.). Esperimentu hauetan oinarrituta, formulazio optimizatu bat hautatu zen PMP fase geldikorra prestatzeko, polaritate kontrolatua eta analitoen atxikipen ona bermatzeko.
Bost peptido nahasketa (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leuzina entzefalina) ere ebaluatu ziren PMP zutabe bat erabiliz fase mugikor bat erabiliz; 60/40 (v/v) azetonitrilo/ura (% 0,1 TFA) 80 μL/min-ko emarian. Eluzio-baldintza optimoetan, zutabe bakoitzeko plaka-zenbaki teorikoa (N) (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100 da (200.000 plaka/m²). 3. taulan hiru PMP zutabeen N balioak agertzen dira eta kromatogramak 5A irudian ageri dira. PMP zutabe batean analisi azkarra emarian (700 μL/min), bost peptido minutu batean eluitu ziren, N balioak oso onak izan ziren, 13.500 ± 330 zutabe bakoitzeko (100 × 1,8 mm id), 135.000 plaka/m-ri dagokio (5B irudia). Hiru zutabe tamaina berdinekoak (100 × 1,8 mm id) hiru PMP fase geldikorreko lote ezberdinekin bete ziren erreproduzigarritasuna egiaztatzeko. Zutabe bakoitzeko analitoen kontzentrazioa eluzio-baldintza optimoak eta N plaka teorikoen kopurua eta atxikipen-denbora erabiliz erregistratu zen, zutabe bakoitzean proba-nahaste bera bereizteko. PMP zutabeen erreproduzigarritasun-datuak 4. taulan ageri dira. PMP zutabearen erreproduzigarritasuna ondo korrelazionatzen da %RSD balio oso baxuekin, 3. taulan ageri den bezala.
Peptido nahastearen bereizketa PMP zutabean (B) eta Ascentis Express RP-Amida zutabean (A); fase mugikorra 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP zutabearen neurriak (100 × 1,8 mm id); analitikoa Konposatuen eluzio ordena: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) eta 5 (leuzina) azido entzefalina).
PMP zutabe bat (100 × 1,8 mm di) ebaluatu zen giza serumeko albuminaren digeritu triptikoen bereizketa errendimendu handiko likido kromatografian. 6. irudiko kromatogramak erakusten du lagina ondo bereizita dagoela eta bereizmena oso ona dela. HSA digerituak 100 µL/min-ko emaria, 70/30 azetonitrilo/ura fase mugikorra eta % 0,1 TFA erabiliz aztertu ziren. Kromatogramak (6. irudia) erakusten duen bezala, HSA digestioa 17 peptidori dagozkien 17 gailurretan banatu da. HSA digestioko gailur bakoitzaren bereizketa-eraginkortasuna kalkulatu zen eta balioak 5. taulan ematen dira.
HSAren digeritu triptiko bat (100 × 1,8 mm diametroa) PMP zutabe batean bereizi zen; emari-abiadura (100 µL/min), fase mugikorra 60/40 azetonitrilo/ura % 0,1 TFArekin.
non L zutabearen luzera den, η fase mugikorraren biskositatea, ΔP zutabearen kontrapresioa eta u fase mugikorraren abiadura lineala. PMP zutabearen iragazkortasuna 2,5 × 10-14 m2 izan zen, emaria 25 μL/min izan zen, eta 60/40 v/v ACN/ura erabili zen. PMP zutabearen iragazkortasuna (100 × 1,8 mm id) aurreko 34. erreferentziakoaren antzekoa izan zen. Gainazaleko partikula porotsuekin betetako zutabearen iragazkortasuna hau da: 1,7 × 10-15 1,3 μm-ko partikulentzat, 3,1 × 10-15 1,7 μm-ko partikulentzat, 5,2 × 10-15 eta 2,5 × 10-14 m2 2,6 μm-ko partikulentzat. 5 μm-ko partikulentzat 43. Beraz, PMP fasearen iragazkortasuna 5 μm-ko nukleo-oskola partikulen antzekoa da.
non Wx kloroformoz betetako zutabearen pisua den, Wy metanolez betetako zutabearen pisua den eta ρ disolbatzailearen dentsitatea den.Metanolaren (ρ = 0,7866) eta kloroformoaren (ρ = 1,484) dentsitateak.Aurretik aztertu ditugun SILIZE PARTIKULAK-C18 zutabeen (100 × 1,8 mm id) 34 eta C18-Urea zutabeen 31 porositate osoa 0,63 eta 0,55 izan zen, hurrenez hurren.Horrek esan nahi du urea ligandoen presentziak fase geldikorraren iragazkortasuna murrizten duela.Bestalde, PMP zutabearen (100 × 1,8 mm id) porositate osoa 0,60 da.PMP zutabeen iragazkortasuna C18 lotura duten silize partikulez betetako zutabeena baino txikiagoa da, C18 motako fase geldikorretan C18 ligandoak silize partikulei kate lineal gisa lotuta baitaude, eta poliestireno motako fase geldikorretan, berriz, polimero geruza nahiko lodia da inguruan eratu zen. Esperimentu tipiko batean, zutabearen porositatea honela kalkulatzen da:
7A eta 7B irudiek PMP zutabea (100 × 1,8 mm diametroa) eta Ascentis Express RP-Amida zutabea (100 × 1,8 mm diametroa) erakusten dituzte, eluzio-baldintza berdinak erabiliz (hau da, 60/40 ACN/H2O eta % 0,1 TFA). Hautatutako peptido nahasketak (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leuzina Entzefalina) 20 µL-tan prestatu ziren. Bi zutabeen gutxieneko emaria 800 µL/min da. PMP zutabearentzat eta Ascentis Express RP-Amida zutabearentzat emaria optimoan (80 µL/min) HETP balio minimoak 2,6 µm eta 3,9 µm izan ziren, hurrenez hurren. HETP balioek adierazten dute PMP zutabearen (100 × 1,8 mm id) bereizketa-eraginkortasuna askoz hobea dela merkataritzan eskuragarri dagoen Ascentis Express RP-Amida zutabearen (100 × 1,8 mm id) baino. 7(A) irudiko van Deemter grafikoak erakusten du N balioaren jaitsiera fluxua handitzen den heinean ez dela esanguratsua gure aurreko ikerketarekin alderatuta. PMP zutabearen (100 × 1,8 mm id) bereizketa-eraginkortasun handiagoa... Ascentis Express RP-Amida zutabeari egindako aplikazioa egungo lanean erabilitako partikulen forman, tamainan eta zutabeen paketatze-prozedura konplexuetan izandako hobekuntzetan oinarritzen da34.
(A) van Deemter grafikoa (HETP fase mugikorreko abiadura linealaren arabera), 60/40 ACN/H2O-tan % 0,1 TFA duen PMP zutabe bat (100 × 1,8 mm id) erabiliz lortua.(B) van Deemter grafikoa (HETP fase mugikorreko abiadura linealaren arabera), 60/40 ACN/H2O-tan % 0,1 TFA duen Ascentis Express RP-Amida zutabe bat (100 × 1,8 mm id) erabiliz lortua.
Poliestirenozko fase geldikor polarra prestatu eta ebaluatu zen peptido nahaste sintetikoak eta giza serumeko albuminaren (HAS) tripsina digerituak bereizteko errendimendu handiko likido kromatografian. PMP zutabeen errendimendu kromatografikoa peptido nahasteetarako bikaina da bereizketa-eraginkortasunean eta bereizmenean. PMP zutabeen bereizketa-errendimendu hobetua hainbat arrazoirengatik da, hala nola silize partikulen partikula-tamaina eta poro-tamaina, fase geldikorraren sintesi kontrolatua eta zutabeen paketatze konplexua. Banaketa-eraginkortasun handiaz gain, zutabearen kontrako presio baxua fluxu-tasa handietan fase geldikor honen beste abantaila bat da. PMP zutabeek erreproduzigarritasun ona erakusten dute eta peptido nahasteen analisietarako eta hainbat proteinaren tripsina digeritzeko erabil daitezke. Zutabe hau produktu naturalak, landare sendagarrietako konposatu bioaktiboak eta onddoen erauzkinak kromatografian bereizteko erabiltzea dugu helburu. Etorkizunean, PMP zutabeak proteinak eta antigorputz monoklonalak bereizteko ere ebaluatuko dira.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. eta Petersson, P. Alderantzizko Fase Kromatografiaren bidezko Peptidoen Banaketa Sistemei buruzko Ikerketa I. Zatia: Zutabeen Karakterizazio Protokolo baten Garapena. J. Chromatography.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Gaixotasun infekziosoen tratamendurako diseinatutako peptido aktibo hobetuak. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. eta Khrestchatisky, M. Peptido terapeutiko sintetikoak: zientzia eta merkatua. Drug discovery. 15 (1-2) gaur, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD eta Shen, Y. Kromatografia Likido Proteomiko Aurreratua. J. Kromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografia likido-masa espektrometria aurreratuak metabolomika eta proteomika helburu zabalekoak txertatzea ahalbidetzen du. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM eta Salisbury, JJ UHPLC-ren eginkizuna sendagaien garapenean. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. eta Clausen, AM Ultra-presioko likido-kromatografiaren oinarrizko eta alderdi praktikoak bereizketa azkarretarako. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA eta Tchelitcheff, P. Errendimendu ultra-handiko kromatografia likidoaren aplikazioa sendagaien garapenean. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Enterobirusen purifikazio eraginkorrerako barne-fase handiko olio-ur emultsioetatik prestatutako hidrogel makroporotsu monolitikoak. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. eta Wilkins, JA Kromatografia likidoaren eginkizuna proteomikan. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. eta Guillarme, D. Peptido eta proteinen alderantzizko faseko kromatografia likidoaren bereizketan sortzen ari diren joerak: teoria eta aplikazioak. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE eta Gebler, JC Peptidoen bi dimentsioko bereizketa RP-RP-HPLC sistema bat erabiliz, lehen eta bigarren bereizketa dimentsioetan pH balio desberdinak erabiliz. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. C18 2 μm-tik beherako partikula guztiz eta gainazalki porotsuekin betetako eraginkortasun handiko kromatografia-zutabeen masa-transferentziaren ezaugarriak eta errendimendu zinetikoa ikertu ziren. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Landareen peptido bioaktiboen isolamendu, identifikazio eta baliozkotzean azken joerak eta analisi-erronkak. anus. anus biologikoa. kimikoa. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Bizitzaren erreinuko paisaia proteomikoa. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Peptido terapeutikoen beheranzko prozesamendua kromatografia likido prestatzailearen bidez. Molecule (Basel, Suitza) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. eta Geng, X. Modu mistoko kromatografia eta biopolimeroetan duen aplikazioa. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. eta Sun, Y. Ligandoak proteina kromatografia modu mistorako: printzipioa, karakterizazioa eta diseinua. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).