Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. CSS euskarri mugatua duen arakatzailearen bertsio bat erabiltzen ari zara. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratu bat erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Gainera, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakusten dugu.
Hiru diapositiba aldi berean dituen karrusel bat erakusten du. Erabili Aurrekoa eta Hurrengoa botoiak hiru diapositiba aldi berean mugitzeko, edo erabili amaierako graduatzaile botoiak hiru diapositiba aldi berean mugitzeko.
Silize partikula porotsuak sol-gel metodoaren bidez prestatu ziren, aldaketa batzuekin poro zabaleko partikulak lortzeko. Partikula hauek N-fenilmaleimida-metilbinil isozianatoarekin (PMI) eta estirenoarekin deribatu ziren alderantzizko kate-transferentzia-zatiketa (RAFT) polimerizazioaren bidez, N-fenilmaleimida tartekatutako poliamidak ekoizteko. Estireno (PMP) fase geldikorra. Altzairu herdoilgaitzezko zutabe estuak (100 × 1,8 mm-ko barne-diametroa) lohi-ontzi batekin bete ziren. PMP zutabearen errendimendu kromatografikoa ebaluatu zen bost peptidoz (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoazido entzefalina) eta giza serumeko albuminaren (HAS) triptiko hidrolizatuz osatutako peptido sintetikoen nahasketa bat bereizteko. Eluzio-baldintza optimoetan, peptidoen nahasketa zuten plaken kopuru teorikoa 280.000 plaka/m²-ra iritsi zen. Garatutako zutabearen bereizketa-errendimendua Ascentis Express RP-Amide zutabe komertzialarekin alderatuta, ikusi zen PMP zutabearen bereizketa-eraginkortasuna zutabe komertziala baino handiagoa zela bereizketa-eraginkortasunari eta bereizmenari dagokionez.
Biofarmazia-industria merkatu global hedatzaile bihurtu da, azken urteotan merkatu-kuota nabarmen handitu baita. Biofarmazia-industriaren hazkunde lehergarriarekin1,2,3 peptido eta proteinen analisiak egiteko behar handia dago. Helburu-peptidoaz gain, hainbat ezpurutasun sortzen dira peptidoen sintesian zehar, beraz, kromatografia-purifikazioa beharrezkoa da peptidoaren nahi den purutasuna lortzeko. Gorputzeko fluidoetan, ehunetan eta zeluletan proteinen analisia eta karakterizazioa oso zeregin erronka bat da, lagin bakar batean detekta daitezkeen espezie kopuru handia dela eta. Masa-espektrometria tresna eraginkorra den arren peptidoak eta proteinak sekuentziatzeko, lagin horiek zuzenean masa-espektrometroan sartzen badira, bereizketa ez da asegarria izango. Arazo hau MS analisia baino lehen kromatografia likidoa (LC) eginez konpondu daiteke, eta horrek masa-espektrometroan sartzen diren analitoen kopurua murriztuko du une jakin batean4,5,6. Gainera, analitoak eskualde estu batean kontzentratu daitezke fase likidoaren bereizketan zehar, eta horrela analito horiek kontzentratzen dira eta MS detekzioan sentikortasuna handitzen da. Kromatografia likidoak (LC) aurrerapen handiak egin ditu azken hamarkadan eta proteomikako analisietarako oso erabilia den metodo bihurtu da7,8,9,10.
Alderantzizko faseko likido-kromatografia (RP-LC) oso erabilia da peptidoen nahasteak purifikatzeko eta bereizteko, oktadezil-modifikatutako silizea (ODS) fase geldikor gisa erabiliz11,12,13. Hala ere, haien egitura konplexua eta izaera anfoteroa direla eta,14,15 RP fase geldikorrek ezin dute peptidoen eta proteinen bereizketa egokia eman. Beraz, zati polarrak eta ez-polarrak dituzten peptidoen eta proteinen analisiak bereziki diseinatutako fase geldikorrak behar ditu analito hauekin elkarreragin eta atxikitzeko16. Kromatografia mistoa, elkarrekintza multimodalak eskaintzen dituena, RP-LCren alternatiba izan daiteke peptidoak, proteinak eta beste nahaste konplexu batzuk bereizteko. Hainbat fase geldikor mota misto prestatu ziren eta fase geldikor hauekin betetako zutabeak erabili ziren peptidoak eta proteinak bereizteko17,18,19,20,21. Talde polarrak eta ez-polarrak daudenez, modu mistoko fase geldikorrak (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalazio polarra/RPLC) egokiak dira peptidoak eta proteinak bereizteko22,23,24,25,26,27,28. Lotura kobalenteak dituzten fase geldikorrak, tartekatutako fase geldikorrek, bereizketa gaitasun onak eta selektibitate berezia erakusten dituzte analito polar eta ez-polarrentzat, bereizketa analitoaren eta fase geldikorraren arteko elkarrekintzaren araberakoa baita. Elkarrekintza multimodalak29,30,31,32. Duela gutxi, Zhang et al.30 poliaminen behenil-amaieradun fase geldikorrak lortu zituzten eta hidrokarburoak, antidepresiboak, flavonoideak, nukleosidoak, estrogenoak eta beste analito batzuk arrakastaz bereizi zituzten. Txertatutako material geldikorrak talde polarrak eta ez-polarrak ditu, beraz, peptidoak eta proteinak zati hidrofobo eta hidrofilikoetan bereizteko erabil daiteke. Lerro polarreko zutabeak (adibidez, amida lerroan duten C18 zutabeak) Ascentis Express RP-Amide zutabeen izen komertzialarekin daude eskuragarri, baina zutabe hauek 33 amina aztertzeko bakarrik erabili dira.
Oraingo ikerketan, fase geldikor polarra txertatzeko bat (N-fenilmaleimida, poliestireno txertatzailea) prestatu eta ebaluatu zen peptidoen bereizketa eta HSA triptikoaren ebakidura ikusteko. Hurrengo estrategia erabili zen fase geldikorra prestatzeko. Silize partikula porotsuak aurreko argitalpenetan deskribatutako prozeduren arabera prestatu ziren, prestaketa-eskemetan aldaketa batzuk eginda 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Urea, polietilen glikola (PEG), TMOS eta azido urtsu-azetikoaren proportzioak egokitu ziren poro-tamaina handiko silize partikulak lortzeko. Bigarrenik, fenilmaleimida-metilbinil isozianato ligando berri bat sintetizatu zen eta bere silize partikula deribatuek erabili ziren fase geldikor polarrak txertatzeko prestatzeko. Lortutako fase geldikorra altzairu herdoilgaitzezko zutabe batean ontziratu zen (100 × 1,8 mm-ko barne-diametroa) ontziratze-eskema optimizatu baten arabera. Zutabearen ontziratzea bibrazio mekanikoaren bidez laguntzen da zutabearen barruan geruza uniforme bat bermatzeko. Zutabe betea ebaluatu zen bost peptidoz (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leuzina-entzefalina peptidoa) eta giza serumeko albuminaren (HSA) triptiko hidrolizatuak bereizteko. Ikusi zen peptido nahasketa eta HSA triptiko digeritua bereizmen eta eraginkortasun onarekin bereizi zirela. PMP zutabearen bereizketa-eraginkortasuna Ascentis Express RP-Amide zutabearenarekin alderatu zen. Ikusi zen peptidoek eta proteinek bereizmen ona eta bereizketa-eraginkortasun handia dutela PMP zutabean, eta PMP zutabearen bereizketa-eraginkortasuna Ascentis Express RP-Amide zutabearena baino handiagoa dela.
PEG (polietilen glikola), urea, azido azetikoa, trimetoxiortosilikatoa (TMOS), trimetilklorosilanoa (TMCS), tripsina, giza serumeko albumina (HSA), amonio kloruroa, urea, hexametilmetakriloildisilazanoa (HMDS), metakriloil kloruroa (MC), estirenoa, 4-hidroxi-TEMPO, bentzoil peroxidoa (BPO), azetonitriloa (ACN) HPLCrako, metanola, 2-propanola eta azetona. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, AEB).
Urea (8 g), polietilen glikola (8 g) eta 8 ml 0,01 N azido azetikoren nahasketa bat 10 minutuz irabiatu zen, eta 24 ml TMOS gehitu zitzaizkion izotzez hoztuta. Erreakzio-nahasketa 40 °C-tan berotu zen 6 orduz eta gero 120 °C-tan 8 orduz altzairu herdoilgaitzezko autoklabe batean. Ura dekantatu zen eta hondarra 70 °C-tan lehortu zen 12 orduz. Bloke bigun lehortuak leunki eho eta labe batean 550 °C-tan kalsinkatu ziren 12 orduz. Hiru lote prestatu eta karakterizatu ziren partikulen tamainen, poroen tamainen eta azaleraren erreproduzigarritasuna probatzeko.
Poliestireno kateetarako talde polarra eta fase geldikorra. Prestaketa prozedura jarraian deskribatzen da.
N-fenilmaleimida (200 mg) eta metil binil isozianatoa (100 mg) tolueno anhidroan disolbatu ziren, eta ondoren 0,1 ml 2,2′-azoisobutironitrilo (AIBN) gehitu ziren erreakzio-matrazean fenilmaleimidaren eta metil binil isozianatoaren (PMCP) kopolimero bat lortzeko. ) Nahastea 60 °C-tan berotu zen 3 orduz, iragazi eta labean lehortu zen 40 °C-tan 3 orduz.
Silize partikula lehorrak (2 g) tolueno lehorrean (100 ml) barreiatu ziren, irabiatu eta 10 minutuz sonikatu ziren 500 ml-ko hondo biribileko matraze batean. PMCP (10 mg) toluenoan disolbatu eta tantaka gehitu zen erreakzio-matrazera gehiketa-inbutu baten bidez. Nahastea 100 °C-tan 8 orduz errefluxatu zen, iragazi, azetonarekin garbitu eta 60 °C-tan 3 orduz lehortu zen. Ondoren, PMCP-rekin lotutako silize partikulak (100 g) toluenoan (200 ml) disolbatu ziren, eta 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) gehitu zitzaion 100 μl dibutil-estainu dilaurato katalizatzaile gisa. Nahastea 50 °C-tan 8 orduz irabiatu, iragazi eta 50 °C-tan 3 orduz lehortu zen.
Estirenoa (1 ml), bentzoil peroxidoa BPO (0,5 ml) eta TEMPO-PMCP-ri atxikitako silize partikulak (1,5 g) toluenoan barreiatu eta nitrogenoarekin garbitu ziren. Estirenoaren polimerizazioa 100 °C-tan egin zen 12 orduz. Emaitza den produktua metanolarekin garbitu eta gau osoan 60 °C-tan lehortu zen. Erreakzioaren eskema orokorra lehen irudian ageri da.
Laginak 393 K-tan desgasifikatu ziren ordubetez, 10–3 Torr baino gutxiagoko hondar-presioa lortu arte. P/P0 = 0,99 presio erlatiboan adsorbatutako N2 kantitatea erabili zen poro-bolumen osoa zehazteko. Silize partikula puruen eta ligandoekin lotutakoen morfologia aztertu zen eskaneatze-mikroskopio elektroniko bat erabiliz (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). Lagin lehorrak (silize purua eta ligandoekin lotutako silize partikulak) aluminiozko hagatxoetan jarri ziren karbono-zinta erabiliz. Urrea laginaren gainean jarri zen Q150T sputtering gailu bat erabiliz, eta 5 nm-ko lodierako Au geruza bat jarri zen laginaren gainean. Horrek tentsio baxuko prozesuaren eraginkortasuna hobetzen du eta ihinztadura hotz fina eskaintzen du. Elementuen analisia Thermo Electron (Waltham, MA, AEB) Flash EA1112 elementuen konposizio-analizatzaile bat erabiliz egin zen. Malvern partikula-tamaina analizatzaile bat (Worcestershire, Erresuma Batua) Mastersizer 2000 erabili zen partikula-tamainaren banaketa lortzeko. Estali gabeko silize partikulak eta ligandoei lotutako silize partikulak (5 mg bakoitza) 5 ml isopropanoletan barreiatu ziren, 10 minutuz sonikatu, 5 minutuz astindu eta Mastersizer optiko mahai batean jarri ziren. Analisi termograbimetrikoa minutuko 5 °C-ko abiaduran egiten da, 30 eta 800 °C arteko tenperatura-tartean.
(ID 100 × 1.8 mm) neurriko altzairu herdoilgaitzezko zutabe estuak, beira-zuntzez estaliak, lohi-betetze metodoaren bidez bete ziren, 31. erreferentzian erabilitako prozedura bera jarraituz. Altzairu herdoilgaitzezko zutabea (beira-estaldura, ID 100 × 1.8 mm) eta 1 µm-ko frita bat zuen irteera lohi-ontziratzeko makina batera konektatu ziren (Alltech Deerfield, IL, AEB). Fase geldikorraren esekidura prestatu, fase geldikorraren 150 mg 1.2 ml metanoletan eseki eta biltegi-zutabe batera sartuz. Metanola erabili zen lohi-disolbatzaile eta kontrol-disolbatzaile gisa. Zutabea bete 100 MP-ko presio-sekuentzia aplikatuz 10 minutuz, 80 MP-ko 15 minutuz eta 60 MP-ko 30 minutuz. Ontziratzeko prozesuak bi gas-kromatografia zutabe bibragailu erabili zituen (Alltech, Deerfield, IL, AEB) bibrazio mekanikorako, zutabe-ontziratze uniformea ​​bermatzeko. Itxi lohi-ontziratzailea eta askatu presioa poliki-poliki kateari kalterik ez egiteko. Zutabea lohi-toberatik deskonektatu zen eta beste konexio bat sarrerara lotu eta LC sistemara konektatu zen bere funtzionamendua probatzeko.
MLC pertsonalizatu bat eraiki zen LC ponpa bat (10AD Shimadzu, Japonia), 50 nL-ko injekzio begizta duen lagingailu bat (Valco (AEB) C14 W.05), mintz-desgasifikatzaile bat (Shimadzu DGU-14A) eta UV-VIS kapilar leiho bat erabiliz. Detektagailu gailua (UV-2075) eta esmaltatutako mikrozutabea. Erabili konexio-hodi oso estuak eta laburrak zutabearen hedapen gehigarriaren eragina minimizatzeko. Zutabea bete ondoren, instalatu kapilar bat (50 µm id 365) 1/16″-ko murrizketa-junturaren irteeran eta instalatu murrizketa-junturaren kapilar bat (50 µm). Datuen bilketa eta kromatogramaren prozesamendua Multichro 2000 softwarea erabiliz egiten dira. 254 nm-tan, analitoen UV xurgapena 0-tan kontrolatu zen. Datu kromatografikoak OriginPro8 (Northampton, MA) erabiliz aztertu ziren.
Giza serumeko albumina, hauts liofilizatua, ≥ % 96 (agarosa gel elektroforesia) 3 mg tripsinarekin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) eta 0,2 M amonio bikarbonatoarekin (1 ml) nahastuta. Disoluzioa 10 minutuz irabiatu eta ur-bainu batean mantendu zen 37 °C-tan 6 orduz, eta ondoren 1 ml % 0,1 TFArekin itzali zen. Disoluzioa iragazi eta 4 °C-tik behera gorde.
Peptidoen eta HSA triptiko digerituaren nahasketa baten bereizketa PMP zutabe batean ebaluatu zen bereizita. Egiaztatu PMP zutabe batek bereizitako peptidoen eta HSAren nahasketa baten hidrolisi triptikoa eta alderatu emaitzak Ascentis Express RP-Amida zutabe batekin. Plaka teorikoen kopurua kalkulatzen da ekuazio hau erabiliz:
Silize partikula puruen eta ligandoei lotutako silize partikulen SEM irudiak 2. irudian ageri dira. Silize partikula puruen (A, B) SEM irudiek forma esferikoa erakusten dute, non partikulak luzangak diren edo simetria irregularra duten aurreko ikerketekin alderatuta. Ligandoak (C, D) lotutako silize partikulen gainazala silize partikula puruena baino leunagoa da, eta hori silize partikulen gainazala estaltzen duten poliestireno kateen ondorioz izan daiteke.
Silize partikula puruen (A, B) eta ligandoei lotutako silize partikulen (C, D) eskaneatze-mikrografia elektronikoak.
Silize partikula puruen eta ligandoei lotutako silize partikulen partikula-tamainaren banaketa 2.3(A) irudian ageri da. Partikula-tamainaren banaketa-kurba bolumentrikoek erakutsi zuten silize partikula-tamaina handitu egin zela aldaketa kimikoaren ondoren (3A irudia). Oraingo ikerketako eta aurreko ikerketako silize partikula-tamainaren banaketa-datuak 1(A) taulan alderatzen dira. PMP-ren d(0,5) partikula-tamaina bolumentrikoa 3,36 µm-koa izan zen, aurreko ikerketako (poliestirenozko silize partikulak)34 ad(0,5) balioarekin alderatuta, 3,05 µm-koa. Erreakzio-nahastean PEG, urea, TMOS eta azido azetikoaren arteko erlazioaren aldaketa dela eta, multzo honetako partikula-tamainaren banaketa estuagoa izan zen aurreko ikerketarekin alderatuta. PMP fasearen partikula-tamaina lehenago aztertu genuen poliestirenozko silize partikula-fasearena baino zertxobait handiagoa da. Horrek esan nahi du silize partikulen gainazaleko funtzionalizazioak estirenoarekin poliestireno geruza bat (0,97 µm) baino ez zuela utzi silize gainazalean, PMP fasean geruzaren lodiera 1,38 µm-koa zen bitartean.
Silize partikula puruen eta ligandoei lotutako silize partikulen partikula-tamainaren banaketa (A) eta poro-tamainaren banaketa (B).
Ikerketa honetan erabilitako silize partikulen poroen tamaina, poroen bolumena eta azalera 1 (B) taulan ageri dira. Silize partikula puruen eta ligandoei lotutako silize partikulen PSD profilak 3 (B) irudietan ageri dira. Emaitzak aurreko ikerketarekin alderagarriak izan ziren34. Silize partikula puruen eta ligandoei lotutakoen poroen tamainak 310 Å eta 241 Å izan ziren, hurrenez hurren, eta horrek adierazten du aldaketa kimikoaren ondoren, poroen tamaina 69 Å txikitu zela, 1 (B) taulan ageri den bezala, eta aldaketa kurba 1. irudian ageri da. Silize partikulen azalera espezifikoa egungo ikerketan 116 m2/g da, aurreko ikerketaren parekoa (124 m2/g). 1 (B) taulan ageri den bezala, silize partikulen azalera (m2/g) aldaketa kimikoaren ondoren ere 116 m2/g-tik 105 m2/g-ra jaitsi zen.
Fase geldikorraren elementu-analisiaren emaitzak 2. taulan aurkezten dira. Uneko fase geldikorraren karbono-edukia % 6,35 da, aurreko ikerketakoa baino txikiagoa (polisirenoarekin lotutako silize-partikulak, % 7,9335 eta % 10,21, hurrenez hurren) 42. Uneko fase geldikorraren karbono-edukia behean dago, SP prestatzeko estirenoaz gain fenilmaleimida metil binil isozianatoa (PCMP) eta 4-hidroxi-TEMPO bezalako ligando polar batzuk erabili baitira. Uneko fase geldikorrean nitrogenoaren pisu-ehunekoa % 2,21 da, aurreko ikerketetako % 0,1735 eta % 0,85ekin alderatuta 42. Horrek esan nahi du uneko fase geldikorrak nitrogeno pisu-ehuneko handia duela fenilmaleimida dela eta. Era berean, (4) eta (5) produktuek % 2,7 eta % 2,9ko karbono edukia dute, hurrenez hurren, eta (6) azken produktuak, berriz, % 6,35eko karbono edukia du, 2. taulan erakusten den bezala. PMPren fase geldikorrean analisi termograbimetrikoa (TGA) erabili zen pisu galera probatzeko, eta TGA kurba 4. irudian ageri da. TGA kurbak % 8,6ko pisu galera erakusten du, eta hori bat dator karbono edukiarekin (% 6,35), ligandoek ez baitute C bakarrik, baita N, O eta H ere.
Fenilmaleimida-metilbinil isozianato ligandoa aukeratu zen silize partikulen gainazala aldatzeko, bere fenilmaleimida eta vinilisozianato talde polarrak direla eta. Binil isozianato taldeek estirenoarekin erreakziona dezakete erradikal polimerizazio biziaren bidez. Bigarren arrazoia analitoarekin interakzio moderatuak dituen eta analitoaren eta fase geldikorraren artean interakzio elektrostatiko sendorik ez duen talde bat txertatzea da, fenilmaleimida zatiak ez baitu karga birtualik pH normalean. Fase geldikorraren polaritatea estireno kantitate optimoaren eta erradikal polimerizazioaren erreakzio denboraren bidez kontrola daiteke. Erreakzioaren azken urratsa (erradikal polimerizazioa) kritikoa da, fase geldikorraren polaritatea aldatzen baitu. Elementuen analisia egin zen fase geldikorretan karbono edukia egiaztatzeko. Estireno kantitatea eta erreakzio denbora handitzeak fase geldikorraren karbono edukia handitzen duela ikusi da, eta alderantziz. Estireno kontzentrazio desberdinekin prestatutako SP-ek karbono karga desberdinak dituzte. Era berean, fase geldikor hauek altzairu herdoilgaitzezko zutabeetan jarri ziren eta haien ezaugarri kromatografikoak (selektibotasuna, bereizmena, N balioa, etab.) egiaztatu ziren. Esperimentu hauetan oinarrituta, PMP fase geldikorra prestatzeko konposizio optimizatu bat aukeratu zen, polaritate kontrolatua eta analitoaren atxikipen ona lortzeko.
PMP zutabea ere ebaluatu zen bost peptido nahasketa aztertzeko (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leuzina-entzefalina), fase mugikorraren edukiera erabiliz. 60/40 (v/v) ACN/ura (% 0,1 TFA) 80 µl/min-ko emari-abiaduran. Eluzio-baldintza optimoetan (200.000 plaka/m), zutabe bakoitzeko plaka teorikoen kopurua (N) (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100 da. Hiru PMP zutabeen N balioak 3. taulan ageri dira eta kromatogramak 5A irudian. Analisi azkarra fluxu-abiadura handian (700 µl/min) PMP zutabe batean, bost peptido minutu batean eluitu ziren, 13.500 ± 330eko N balio bikaina zutabe bakoitzeko (100 x 1,8 mm diametroa), 135.000 plaka/m-ren baliokidea (5B irudia). Tamaina bereko hiru zutabe (100 x 1,8 mm barne diametroa) PMP fase geldikorraren hiru multzo ezberdinekin bete ziren erreproduzigarritasuna probatzeko. Analitoak zutabe bakoitzerako erregistratu ziren, proba-nahasketa bera zutabe bakoitzean bereiziz, eluzio-baldintza optimoak, N plaka teorikoen kopurua eta atxikipen-denbora erabiliz. PMP zutabeen erreproduzigarritasun-datuak 4. taulan ageri dira. PMP zutabearen erreproduzigarritasuna ondo korrelazionatu zen %RSD balio oso baxuekin, 3. taulan ageri den bezala.
Peptido nahasteen bereizketa PMP zutabe batean (B) eta Ascentis Express RP-Amida zutabe batean (A), fase mugikorra 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP zutabearen neurriak (100 x 1,8 mm id), analisia Konposatuen eluzio ordena: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) eta 5 (azido leuziko entzefalina).
PMP zutabe bat (100 x 1,8 mm-ko barne diametroa) ebaluatu zen gizakien serumeko albuminaren triptiko hidrolizatua HPLC bidez bereizteko. 6. irudiko kromatogramak erakusten du laginak ondo bereizita daudela, bereizmen oso onarekin. HSA disoluzioak 100 μl/min-ko emaria, 70/30 azetonitrilo/ur fase mugikor bat eta % 0,1 TFA erabiliz aztertu ziren. HSAren zatiketa 17 gailurretan banatu zen, kromatogramak (6. irudia) erakusten duen bezala, 17 peptidori dagozkienak. HSA hidrolizatutik gailur indibidualen bereizketa-eraginkortasunak kalkulatu ziren eta balioak 5. taulan ageri dira.
HSA triptiko hidrolizatuak PMP zutabe batean bereizi ziren (barne diametroa 100 x 1,8 mm), emari-abiadura (100 μl/min), fase mugikorrean 60/40 azetonitrilo/ura eta % 0,1 TFA.
non L zutabearen luzera den, η fase mugikorraren biskositatea, ΔP zutabearen kontrapresioa eta u fase mugikorraren abiadura lineala. PMP zutabearen iragazkortasuna 2,5 × 10–14 m2 izan zen, emaria 25 µl/min izan zen, 60/40 v/v erabili zen. ACN/ura. PMP zutabearen iragazkortasuna (ID 100 × 1,8 mm) gure aurreko Ref.34 ikerketaren antzekoa izan zen. Gainazalki porotsuak diren partikulez betetako zutabe baten iragazkortasuna 1,7×10 ,6 µm da, 2,5×10-14 m2 5 µm-ko partikulentzat43. Beraz, PMP fasearen iragazkortasuna 5 μm-ko tamainako nukleo-oskolaren partikulen iragazkortasunaren antzekoa da.
Non Wx kloroformoz betetako zutabearen masa den, Wy metanoloz betetako zutabearen masa eta ρ disolbatzailearen dentsitatea. Metanolaren dentsitatea (ρ = 0,7866) eta kloroformoarena (ρ = 1,484). Silize-C18 partikula zutabearen (100 × 1,8 mm ID)34 eta aurretik aztertutako C18-urea31 zutabearen porositate osoa 0,63 eta 0,55 izan zen, hurrenez hurren. Horrek esan nahi du urea ligandoen presentziak fase geldikorraren iragazkortasuna murrizten duela. Bestalde, PMP zutabearen porositate osoa (100 × 1,8 mm barne diametroa) 0,60 da. PMP zutabeak C18 lotutako silize partikulekin betetako zutabeak baino iragazkortasun gutxiago dute, C18 motako fase geldikorretan C18 ligandoak silize partikulei kate linealetan lotuta baitaude, eta poliestireno motako fase geldikorretan, berriz, polimero nahiko lodi bat sortzen da partikulen inguruan. A geruza. Esperimentu tipiko batean, zutabearen porositatea honela kalkulatzen da:
7A eta 7B irudietan Van Deemterren grafikoak ageri dira PMP zutabe baterako (id 100 x 1.8 mm) eta Ascentis Express RP-Amida zutabe baterako (id 100 x 1.8 mm), eluzio baldintza berdinetan, 60/40 ACN/H2O eta % 0,1 TFA 20 µl/min-tik 800 µl/min-ra bi zutabeetan. HETP balio minimoak emari optimoan (80 µl/min) 2.6 µm eta 3.9 µm izan ziren PMP zutabearentzat eta Ascentis Express RP-Amida zutabearentzat, hurrenez hurren. HETP balioek erakusten dute PMP zutabearen (100 x 1.8 mm id) bereizketa-eraginkortasuna askoz handiagoa dela merkataritzan eskuragarri dagoen Ascentis Express RP-Amida zutabearen (100 x 1.8 mm id) baino. 7(A) irudiko van Deemter grafikoak erakusten du N balioaren jaitsiera ez dela nabarmen handiagoa fluxua handitzen den heinean, aurreko ikerketarekin alderatuta. PMP zutabearen (id 100 × 1.8 mm) bereizketa-eraginkortasun handiagoa Ascentis Express RP-Amida zutabearekin alderatuta partikula-forma eta -tamaina hobetuan eta egungo lanean erabilitako zutabe-ontziratze-prozedura sofistikatuan oinarritzen da34.
(A) Van Deemter grafikoa (HETP vs. fase mugikorreko abiadura lineala) PMP zutabe batean (id 100 x 1.8 mm) lortua, % 0,1 TFArekin, 60/40 ACN/H2O-tan. (B) Van Deemter grafikoa (HETP vs. fase mugikorreko abiadura lineala) Ascentis Express RP-Amida zutabe batean (id 100 x 1.8 mm) lortua, % 0,1 TFArekin.
Poliestireno tartekatuaren fase polar geldikor bat prestatu eta ebaluatu zen peptido sintetikoen eta giza serumeko albuminaren (HSA) triptiko hidrolizatuaren nahasketa bat errendimendu handiko likido kromatografian bereizteko. PMP zutabeen kromatografia-errendimendua peptido-nahasketetarako bikaina da bereizketa-eraginkortasunari eta bereizmenari dagokionez. PMP zutabeen bereizketa-eraginkortasun hobetua hainbat arrazoirengatik da, hala nola silize partikulen tamaina eta poroen tamaina, fase geldikorren sintesi kontrolatua eta zutabeen paketatze-material konplexuak. Banaketa-eraginkortasun handiaz gain, fase geldikor honen beste abantaila bat zutabearen kontrako presio baxua da emari-tasa handietan. PMP zutabeak oso erreproduzigarriak dira eta peptidoen nahasteak eta hainbat proteinaren triptiko-digestioa aztertzeko erabil daitezke. Zutabe hau produktu naturaletatik, sendabelarren laburpenetatik eta perretxikoetatik konposatu bioaktiboak kromatografia likidoan bereizteko erabiltzea dugu helburu. Etorkizunean, PMP zutabeak proteinak eta antigorputz monoklonalak bereizteko ere ebaluatuko dira.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. eta Petersson, P. Alderantzizko faseko kromatografia peptidoen bereizketa sistemen ikerketa I. zatia: Zutabeen karakterizaziorako protokolo baten garapena. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. eta Petersson, P. Alderantzizko faseko kromatografia peptidoen bereizketa sistemen ikerketa I. zatia: Zutabeen karakterizaziorako protokolo baten garapena.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., eta Petersson, P. Alderantzizko Fase Kromatografiaren bidezko Peptidoen Banaketa Sistemen Ikerketa, I. Zatia: Zutabeen Karakterizaziorako Protokolo Bat Garatzea. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. eta Petersson, P. Alderantzizko faseko kromatografia peptidoen bereizketa sistemen ikerketa I. zatia: Zutabearen ezaugarrietarako protokolo baten garapena. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. eta Petersson, P. Alderantzizko faseko kromatografia peptidoen bereizketa sistemen ikerketa I. zatia: Zutabearen ezaugarrietarako protokolo baten garapena.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., eta Petersson, P. Alderantzizko Fase Kromatografiaren bidezko Peptidoen Banaketa Sistemen Ikerketa, I. Zatia: Zutabeen Karakterizaziorako Protokolo Bat Garatzea.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Gaixotasun infekziosoen tratamendurako peptido aktibo hobetuak sortzeko metodoak. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. eta Khrestchatisky, M. Peptido terapeutiko sintetikoak: Zientzia eta merkatua. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. eta Khrestchatisky, M. Peptido terapeutiko sintetikoak: Zientzia eta merkatua.Vliege P, Lisowski V, Martinez J eta Chreschatyski M. Peptido terapeutiko sintetikoak: zientzia eta merkatua.Vliege P, Lisowski V, Martinez J eta Khreschatsky M. Peptido terapeutiko sintetikoak: zientzia eta merkatua. Drogen aurkikuntza. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD eta Shen, Y. Kromatografia likido proteomiko aurreratua. Xie, F., Smith, RD eta Shen, Y. Kromatografia likido proteomiko aurreratua.Ikus F., Smith RD eta Shen Yu. Kromatografia likido proteomiko aurreratua. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Proteinen konposizio aurreratua 液相色谱。Ikus F., Smith RD eta Shen Yu. Kromatografia likido proteomiko aurreratua.J. Kromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografia likido-masa espektrometria aurreratuak metabolomika eta proteomika oinarri zabalekoak konbinatzeko gai da. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM eta Salisbury, JJ UHPLC-ren eginkizuna garapen farmazeutikoan. Chesnut, SM eta Salisbury, JJ UHPLC-ren eginkizuna garapen farmazeutikoan.Chesnut, SM eta Salisbury, JJ UHPLC-ren eginkizuna garapen farmazeutikoan.Chesnut, SM eta Salisbury, JJ UHPLC-ren eginkizuna sendagaien garapenean. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. eta Clausen, AM Presio ultraaltuko likido-kromatografiaren oinarrizko eta alderdi praktikoak bereizketa azkarretarako. Wu, N. eta Clausen, AM Presio ultraaltuko likido-kromatografiaren oinarrizko eta alderdi praktikoak bereizketa azkarretarako.Wu, N. eta Clausen, AM Presio handiko likido-kromatografiaren oinarrizko eta alderdi praktikoak bereizketa azkarrerako. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. eta Clausen, AM Ultra-presio handiko likido-kromatografiaren oinarrizko eta alderdi praktikoak bereizketa azkarrerako.Wu, N. eta Clausen, AM Presio handiko likido-kromatografiaren oinarrizko eta alderdi praktikoak bereizketa azkarrerako.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA eta Tchelitcheff, P. Kromatografia likido ultra-errendimenduaren erabilera garapen farmazeutikoan. Wren, SA eta Tchelitcheff, P. Kromatografia likido ultra-errendimenduaren erabilera garapen farmazeutikoan.Ren, SA eta Chelischeff, P. Ultra-errendimendu handiko kromatografia likidoaren erabilera garapen farmazeutikoan. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA eta Tchelitcheff, P.Ren, SA eta Chelischeff, P. Ultra-errendimenduko kromatografia likidoaren aplikazioa sendagaien garapenean.J. Kromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. 71. enterobirusaren purifikazio eraginkorrerako barne-fase handiko olio-ur emultsio batetik eratorritako hidrogel makroporotsu monolitiko bat. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. eta Wilkins, JA Kromatografia likidoaren eginkizuna proteomikan. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. eta Wilkins, JA Kromatografia likidoaren eginkizuna proteomikan.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. eta Wilkins, JA Kromatografia likidoaren eginkizuna proteomikan. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. eta Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. eta Wilkins, JA Kromatografia likidoaren eginkizuna proteomikan.J. Kromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Joera berriak alderantzizko faseko kromatografia likido bidezko peptido eta proteinen bereizketan: Teoria eta aplikazioak. & Guillarme, D. Joera berriak alderantzizko faseko kromatografia likido bidezko peptido eta proteinen bereizketan: Teoria eta aplikazioak. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жомощью жимадкосогрифих с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Joera berriak alderantzizko faseko kromatografia likidoaren bidez peptido eta proteina terapeutikoen bereizketan: teoria eta aplikazioak. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.eta Guillarmé, D. Joera berriak peptido eta proteina terapeutikoen bereizketan alderantzizko faseko kromatografia likidoaren bidez: teoria eta aplikazioak.J. Pharm. Zientzia Biomedikoa. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE eta Gebler, JC Peptidoen bi dimentsioko bereizketa RP-RP-HPLC sistema erabiliz, lehen eta bigarren bereizketa dimentsioetan pH desberdinekin. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE eta Gebler, JC Peptidoen bi dimentsioko bereizketa RP-RP-HPLC sistema erabiliz, lehen eta bigarren bereizketa dimentsioetan pH desberdinekin.Gilar M., Olivova P., Dali AE eta Gebler JK Peptidoen bi dimentsioko bereizketa RP-RP-HPLC sistema erabiliz, lehenengo eta bigarren bereizketa dimentsioetan pH desberdinekin.Gilar M., Olivova P., Dali AE eta Gebler JK Peptidoen bi dimentsioko bereizketa pH balio desberdinak erabiliz lehenengo eta bigarren bereizketa dimentsioetan RP-RP-HPLC sistema erabiliz. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. 2 µm baino txikiagoak diren C18 partikula guztiz porotsu eta gainazalki porotsuekin betetako errendimendu handiko kromatografia zutabeen masa-transferentziaren eta ezaugarri zinetikoen ikerketa. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Landareen peptido bioaktiboen isolamendu, identifikazio eta baliozkotzean azken joerak eta analisi-erronkak. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Bizitzaren erreinuko paisaia proteomikoa. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Peptido terapeutikoen ondorengo tratamendua kromatografia likido prestatzailearen bidez. Molecules (Basel, Suitza) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. eta Geng, X. Modu mistoko kromatografia eta bere aplikazioak biopolimeroetan. Yang, Y. eta Geng, X. Modu mistoko kromatografia eta bere aplikazioak biopolimeroetan.Yang, Yu. eta Geng, X. Modu mistoko kromatografia eta bere aplikazioa biopolimeroetan. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. eta Geng, X. Modu mistoko kromatografia eta bere aplikazioa biopolimeroetan.Yang, Yu. eta Gene, X. Modu mistoko kromatografia eta bere aplikazioa biopolimeroetan.J. Kromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).