Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilo eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Angustifolius lupina (NLL, Lupinus angustifolius L.) elikagaiak ekoizteko eta lurzorua hobetzeko erabiltzen den lekale bat da. NLL labore gisa mundu osoan hedatzeak onddo patogeno asko erakarri ditu, besteak beste, lupinaren antraknosa, antraknosi gaixotasun suntsitzailea eragiten duena. Bi alelo, Lanr1 eta AnMan, erresistentzia handiagoa ematen dutenak, erabili dira NLL hazkuntzan, baina azpiko mekanismo molekularrak ezezagunak dira oraindik. Ikerketa honetan, Lanr1 eta AnMan markatzaileak erabili ziren Europako NLL laginak aztertzeko. Txertoa ingurune kontrolatu batean probatzeak bi emaile erresistenteen eraginkortasuna baieztatu zuen. Geneen espresio diferentzialaren profilaketa lerro erresistente eta sentikor adierazgarrietan egin zen. Antraknosarekiko erresistentzia gene ontologia terminoen gehiegizko adierazpenarekin lotuta zegoen "GO:0006952 Defentsa Erantzuna", "GO:0055114 Erredox Prozesua" eta "GO:0015979 Fotosintesia". Gainera, Lanr1(83A:476) lerroak transkriptomaren birprogramazio esanguratsua erakutsi zuen txertaketaren ondoren, beste lerroek erantzun horretan 42 ordu inguruko atzerapena erakutsi zuten bitartean. Defentsa-erantzunak TIR-NBS, CC-NBS-LRR eta NBS-LRR geneekin lotuta daude, patogenesian parte hartzen duten 10 proteina, lipidoen transferentzia-proteinak, endoglukano-1,3-β-glukosidasa, glizinaz aberatsak diren zelula-hormako proteinekin eta oxigenoaren bide erreaktiboaren geneekin. 83A:476-ri emandako lehen erantzunak, fotosintesiarekin lotutako geneen zapalketa zaindua barne, onddoen biologiaren hazkuntza begetatiboaren fasean babes arrakastatsuarekin bat etorri ziren, eta horrek iradokitzen du efektore batek immunitatea eragiten duela. Mandeloop erreakzioa moteldu egiten da, baita marruskadura horizontal orokorra ere.
Lupinu hosto estua (NLL, Lupinus angustifolius L.) proteina asko duen zereal bat da, mendebaldeko Mediterraneoko eskualdean sortua1,2. Gaur egun, animalien eta gizakien elikadura-labore gisa hazten da. Ongarri berde gisa ere hartzen da labore-txandaketa sistemetan, nitrogenoa finkatzen duten bakterio sinbiotikoek nitrogenoa finkatzen dutelako eta lurzoruaren egituraren hobekuntza orokorra dela eta. NLL etxekotze-prozesu azkarra izan du azken mendean eta oraindik ere hazkuntza-presio handiaren menpe dago3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLLren laborantza zabalarekin, onddo patogenoen segidak nekazaritza-nitxo berriak garatu eta uztak suntsitzen dituzten gaixotasun berriak eragin zituen. Lupinen nekazari eta hazleentzat aipagarriena antraknosaren agerpena izan zen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 onddo patogenoak eragindakoa. Lupinen nekazari eta hazleentzat aipagarriena antraknosaren agerpena izan zen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 onddo patogenoak eragindakoa. Наиболее примечательным для фермеров eta селекционеров люпина было появление антракнозова, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupinu-nekazari eta -hazleentzat aipagarriena Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 onddo patogenoak eragindako antraknosaren agerpena izan zen.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是由眗腏眀者目的是炭目的是的出现，它是由真hum Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现Colletohum (Bondar)嵵Haird。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнозогы,вамызакноза патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupinu-nekazari eta -hazleentzat deigarriena Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 onddo patogenoak eragindako antraknosaren agerpena da.Gaixotasunaren lehen txostenak Brasiletik eta Estatu Batuetatik etorri ziren, sintoma tipikoak 1912an eta 1929an agertu zirelarik, hurrenez hurren. Hala ere, 30 urte inguru igaro ondoren, patogenoa Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz bezala izendatu zen. & Sacc., teleomorfoa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfoa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld-en teleomorfoa. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld Morfologia Zuzenduan. eta H. Schrenk. eta H. Schrenk.eta H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。eta H. Schlenk.XX. mendearen erdialdean egindako gaixotasunen aurretiazko fenotipazioek erresistentzia batzuk erakutsi zituzten NLL eta lupino horiaren (L. luteus L.) adarretan, baina aztertutako lupino zuriaren (L. albus L.) ada guztiak oso sentikorrak ziren15,16. Ikerketek erakutsi dute antraknosiaren garapena prezipitazioen (airearen hezetasuna) eta tenperaturaren (12-28 °C-ko tartean) igoerarekin lotuta dagoela, eta horrek erresistentzia urratzea eragiten du tenperatura altuagoetan17, 18. Izan ere, konidioak ernetzeko eta gaixotasuna hasteko behar den denbora lau aldiz laburragoa zen 24 °C-tan (4 ordu) hezetasun handiko baldintzetan 12 °C-tan (16 ordu) baino19. Horrela, etengabeko berotze globalak antraknosiaren hedapena eragin du. Hala ere, gaixotasuna Frantzian (1982) eta Ukrainian (1983) behatu zen mehatxu hurbil baten aitzindari gisa, baina, antza denez, lupinoaren industriak ez zuen kontuan hartu garai hartan20,21. Urte batzuk geroago, gaixotasun suntsitzaile hau mundu osoan zabaldu zen eta lupino ekoizle diren herrialde nagusiak ere kaltetu zituen, hala nola Australia, Polonia eta Alemania22,23,24. 1990eko hamarkadaren erdialdean antraknosi agerraldi baten ondoren, baheketa zabalari esker, hainbat emaile erresistente identifikatu ziren NLL19 laginetan. Antraknosarekiko NLL erresistentzia bi alelo dominantek kontrolatzen dute, germoplasma iturri desberdinetan aurkitutakoak: Lanr1 Tanjil eta Wonga barietateetan eta AnMan Mandalay barietatean 25, 26. Alelo hauek hazkuntza programetan germoplasma erresistentearen hautaketa laguntzen duten markatzaile molekularrak osatzen dituzte25,26,27,28,29,30. Lanr1 aleloa duen 83A:476 hazkuntza-lerro erresistentea P27255 lerro basati sentikorrarekin gurutzatu zen antraknosarekiko erresistentziarako bereizten den RIL populazio bat lortzeko, eta horri esker Lanr1 lokusa NLL-11 kromosomari esleitu ahal izan zitzaion31, 32, 33. Erresistentzia-lokus alboetatik antraknosarekiko lotura-maparen markatzaileen lerrokatzea esparru genomiko batekin, NLL-k hiru aleloen kokapena agerian utzi zuen kromosoma berean (NLL-11), baina posizio desberdinetan29,34,35. Hala ere, RIL kopuru txikia eta markatzaileen eta dagokien aleloen arteko distantzia genetiko handia dela eta, ezin dira ondorio fidagarriak atera haien azpiko geneei buruz. Bestalde, alderantzizko genetika erabiltzea zaila da lupinetan, haien birsorkuntza-potentzial oso txikia dela eta, eta horrek manipulazio genetikoa astun bihurtzen du37.
Etxeko germoplasmaren garapenak, egoera homozigotikoan nahi den aleloa daramanak, hala nola 83A:476 (Lanr1) eta Mandelup (AnMan), ateak ireki ditu antraknosi erresistentzia aztertzeko, populazio basatietan aleloen konbinazio kontrajarriak daudenean. Mekanismo molekularren aukerak. Genotipo espezifikoek sortutako defentsa-erantzunak alderatu. Ikerketa honek NLL-ren transkriptomaren erantzun goiztiarra ebaluatu zuen C. lupini txertoarekiko. Lehenik eta behin, 215 lerro zituen Europako NLL germoplasma-panel bat aztertu zen, Lanr1 eta AnMan aleloak markatzen dituzten markatzaile molekularrak erabiliz. Ondoren, antraknosi fenotipatzea 50 NLL lerrotan egin zen, markatzaile molekularretarako aurretik hautatuta, baldintza kontrolatuetan. Esperimentu hauetan oinarrituta, antraknosi erresistentzian eta Lanr1/AnMan aleloen konposizioan desberdinak ziren lau lerro hautatu ziren defentsa-geneen adierazpen diferentzialaren profilak egiteko, bi ikuspegi osagarri erabiliz: RNA sekuentziazio handikoa eta PCR kuantifikazioa denbora errealean.
NLL germoplasma multzo baten (N = 215) baheketak, Lanr1 (Anseq3 eta Anseq4) eta AnMan (Anseq4) eta AnMan (AnManM1) markatzaileekin, erakutsi zuen lerro bakarrak (95726, Salamanca-b ondoan) "erresistentzia" aleloa anplifikatzen duela markatzaile guztientzat, "'Alelo sentikorren' presentziak" markatzaile guztien proportzioa aurkitu zuen bitartean 158 lerrotan (~% 73,5). Hamahiru lerrok Lanr1 markatzailearen bi alelo "erresistente" sortu zituzten, eta 8 lerrok Lanr1 markatzailearen alelo "erresistenteak". AnMan markatzailearen "erresistentzia" aleloa (S1 taula osagarria). Bi lerro heterozigotoak ziren Anseq3 markatzailearentzat eta batek heterozigotoa AnManM1 markatzailearentzat. 42 lerrok (% 19,5) Anseq3 eta Anseq4 aleloen fase kontrajarriak zituzten, bi lokus hauen arteko birkonbinazio maiztasun handia adieraziz. Kontrolatutako baldintzetan antraknosi fenotipoak (S2 taula osagarria) aztertutako genotipoen erresistentzian aldakortasuna erakutsi zuten, eta hori antraknosiaren larritasunean islatu zen. Batez besteko puntuazioen arteko aldeak 1,8tik (erresistente moderatuan) 6,9ra (sentikorra) bitartekoak izan ziren, eta landareen pisuaren arteko aldeak 0,62tik (sentikorra) 4,45 gra bitartekoak (erresistenteak). Esperimentuaren bi errepikapenetan behatutako balioen artean korrelazio esanguratsua zegoen (0,51 gaixotasunaren larritasun puntuazioetarako, P = 0,00017 eta 0,61 landarearen pisurako, P < 0,0001) baita bi parametro hauen artean ere (− 0,59 eta − 0,77, P < 0,0001). Esperimentuaren bi errepikapenetan behatutako balioen artean korrelazio esanguratsua zegoen (0,51 gaixotasunaren larritasun puntuazioetarako, P = 0,00017 eta 0,61 landarearen pisurako, P < 0,0001) baita bi parametro hauen artean ere (− 0,59 eta − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0кстях э0 баллов тяжести болезни, P = 0,00017 eta 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между между эвтами эрамд (-0,59 eta -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Esperimentuaren bi errepikapenetan behatutako balioen artean korrelazio esanguratsua aurkitu zen (0,51 gaixotasunaren larritasun puntuazioetarako, P = 0,00017 eta 0,61 landarearen pisurako, P < 0,0001), baita bi parametro hauen artean ere (- 0,59 eta -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0.P. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77） P < 0,00,00)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸 庈 诸分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之（ （ 9.–5. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух постенками ( тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 eta масса растения 0,61, P <0,0001), eta между этими двуми двуме пара9ми -0,0001) 0,77, P <0,0001. Korrelazio esanguratsua zegoen bikoiztuta behatutako balioen artean (gaixotasunaren larritasun puntuazioa 0,51, P = 0,00017 eta landarearen pisua 0,61, P < 0,0001) eta bi parametro hauen artean (-0,59 eta -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Landare sentikorretan ikusten diren sintoma tipikoen artean, zurtoinaren okerdura eta bihurdura daude, "artzain-arku" egitura baten antzekoa, eta ondoren laranja/arrosa koloreko esporozoitoak dituzten lesio obalatuak (1. irudi osagarria). Lanr1 (83A:476 eta Tanjil) eta AnMan (Mandelup) geneak dituzten Australiako sarrerak neurriz erresistenteak dira, 0,0331 eta 0,0036). Lanr1 eta/edo AnMan alelo "erresistenteak" ere badituzten lerro batzuek gaixotasunaren sintomak erakusten dituzte.
Interesgarria da, "erresistente" markatzaile alelorik gabeko NLL lerro batzuek antraknosarekiko erresistentzia maila altua erakutsi zutela (Lanr1 edo AnMan genotipoekin alderagarria edo handiagoa), hala nola Boregine (P balioa < 0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P balioa < 0,0001 puntuaziorako eta 0,001 landare pisurako) eta B-549/79b Populazioa (P balioa < 0,0001 puntuaziorako eta ez-esanguratsua pisurako). Interesgarria da, "erresistente" markatzaile alelorik gabeko NLL lerro batzuek antraknosarekiko erresistentzia maila altua erakutsi zutela (Lanr1 edo AnMan genotipoekin alderagarria edo handiagoa), hala nola Boregine (P balioa < 0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P balioa < 0,0001 puntuaziorako eta 0,001 landare pisurako) eta B-549/79b Populazioa (P balioa < 0,0001 puntuaziorako eta ez-esanguratsua pisurako). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокави аллокавы уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи кинх (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) eta популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Interesgarria da, "erresistentzia" markatzaile alelorik gabeko hainbat NLL lerrok antraknosarekiko erresistentzia maila altua erakutsi zutela (Lanr1 edo AnMan genotipoen parekoa edo handiagoa), hala nola Boregine (P balioa < 0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P balioa < 0,0001 ebaluaziorako eta 0,001 landarearen pisurako) eta B-549/79b populazioa (P balioa < 0,0001 ebaluaziorako eta ez da esanguratsua pisurako).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭疽平的炭疽疽的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重显一量一量 Interesgarria da "antigeniko" markatzailerik ez duten NLL sistema batzuek erresistentzia horizontal handia erakustea (Lanr1 edo AnMan geneen baliokidea edo handiagoa), hala nola Boregine (bi parametroak P < 0,0001), Bojar (P balioa < 0,0001, landarearen pisua 0,001) eta B-549/79b anduiak (P balioa < 0,0001, pisua ez da esanguratsua). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», споликва уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие какак Pérégine выше обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) eta популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interesgarria da, 'erresistentzia' markatzaile alelorik gabeko NLL lerro batzuek antraknosarekiko erresistentzia maila altua erakutsi zutela (Lanr1 edo AnMan genotipoen parekoa edo handiagoa), hala nola Boregine (bi parametroetarako P balioa <0,0001), Bojar (P-balioa < 0,0001, landarearen pisua 0,001) eta B-549/79b populazioa (P-balioa < 0,0001, pisua ez da esanguratsua).Fenomeno honek erresistentzia-iturri genetiko berri baten aukera iradokitzen du, markatzaile-genotipoen eta gaixotasunen fenotipoen arteko korrelazio falta azalduz (P balioak ~0,42tik ~0,98ra). Horrela, Kolmogorov-Smirnov probak erakutsi zuen antraknosiarekiko erresistentziari buruzko datuak gutxi gorabehera banaketa normala zutela puntuazioetarako (P balioak 0,25 eta 0,11) eta landare-masarentzat (P balioak 0,47 eta 0,55), eta horrek iradokitzen du Lanr1 eta AnMan baino alelo gehiago daudela inplikatuta.
Antraknosarekiko erresistentziaren baheketaren emaitzetan oinarrituta, 4 lerro hautatu ziren transkriptomaren analisietarako: 83A:476, Boregine, Mandelup eta 22660 populazioa. Lerro hauek berriro aztertu ziren antraxarekiko erresistentzia aztertzeko inokulazio-esperimentuetan RNA sekuentziazioaren bidez, aurreko probako berdinak baziren. Puntuazio-balioak hauek izan ziren: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) eta 22660 populazioa (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 protokoloak batez beste 40,5 Mread bikote lortu zituen lagin bakoitzeko (29,7tik 54,4 Mread) (S3 taula osagarria). Erreferentzia-sekuentziako lerrokatze-puntuazioak % 75,5etik % 88,6ra bitartekoak izan ziren. Erreplika biologikoen arteko aldaera esperimentalen arteko irakurketa-kontaketaren datuen batez besteko korrelazioa 0,812tik 0,997ra bitartekoa izan zen (batez bestekoa 0,959). Aztertutako 35.170 geneetatik, 2917k ez zuten adierazpenik erakutsi, eta beste 4785 geneak maila hutsalean adierazi ziren (oinarrizko batez bestekoa < 5). Aztertutako 35.170 geneetatik, 2917k ez zuten adierazpenik erakutsi, eta beste 4785 geneak maila hutsalean adierazi ziren (oinarrizko batez bestekoa < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов геслсинов экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). Aztertutako 35.170 geneetatik, 2917k ez zuten adierazpenik erakutsi, eta gainerako 4785 geneak maila hutsalean adierazi ziren (oinarrizko batez bestekoa <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелисунч имелись экспрессию (базовое среднее значение <5). Aztertutako 35.170 geneetatik, 2917 ez ziren adierazi eta gainerako 4785 geneek adierazpen hutsala zuten (oinarrizko batez bestekoa <5).Beraz, esperimentuan zehar adierazitako geneen kopurua (oinarrizko batez bestekoa ≥ 5) 27.468 izan zen (% 78,1) (S4 taula osagarria).
Lehenengo denbora-puntutik, NLL lerro guztiek erantzun zioten C. lupiniren (Col-08 anduia) txertaketari transkriptoma birprogramatuz (1. taula), hala ere, desberdintasun esanguratsuak ikusi ziren lerroen artean. Horrela, 83A:476 erresistentzia-lerroak (Lanr1 genea daramana) transkriptoma birprogramazio esanguratsua erakutsi zuen lehenengo denbora-puntuan (6 hpi), isolatutako gora eta beherako geneen kopurua 31-69 aldiz handituz beste denbora-puntuekin alderatuta. Gainera, gailur hau laburra izan zen, gene gutxi batzuen adierazpena nabarmen aldatuta mantendu baitzen bigarren denbora-puntuan (12 hpi). Interesgarria da, txertaketa-proban erresistentzia maila altua erakutsi zuen Boreginak ez zuela transkripzio-birprogramazio masibo hori jasan esperimentuan zehar. Hala ere, modu diferentzialean adierazitako geneen kopurua (DEG) berdina izan zen Boreginak eta 83A:476k 12 HPItan. Bai Mandelup-ek bai 22660 populazioak DEG gailurrak erakutsi zituzten azken denbora-puntuan (48 l/s), defentsa-erantzunen atzerapen erlatibo bat adieraziz.
83A:476-k C. lupini-ri erantzunez transkriptomaren birprogramazio masiboa jasan zuenez, beste lerro guztiekin alderatuta 6 HPI-tan, une horretan behatutako DEGen ~ % 91 lerro-espezifikoak ziren (1. irudia). Hala ere, gainjartze batzuk egon ziren ikerketa-lerroen arteko hasierako erantzunetan, Boregine, Mandelup eta 22660 populazioko DEGen % 68,5, % 50,9 eta % 52,6, hurrenez hurren, 83A:476-n aurkitutakoekin gainjartzen baitziren denbora-tarte jakin batzuetan. Hala ere, DEG hauek 83A:476 erabiliz detektatutako DEG guztien zati txiki bat baino ez ziren (% 0,97–% 1,70). Gainera, lerro guztietako 11 DEG koherenteak ziren une horretan (S4-S6 taula osagarriak), landareen defentsa-erantzunen osagai komunak barne: lipidoen transferentzia-proteina (TanjilG_32225), endoglukano-1,3-β-glukosido entzima (TanjilG_23384), estresak eragindako bi proteina, hala nola SAM22 (TanjilG_31528 eta TanjilG_31531), latex proteina basikoa (TanjilG_32352) eta glizinaz aberatsak diren bi zelula-hormako proteina estruktural (TanjilG_19701 eta TanjilG_19702). Transkriptomaren erantzunetan gainjartze nahiko handia ere bazegoen 83A:476 eta Boregine artean 24 HPI-tan (guztira % 16-38 DEG) eta Mandelup eta 22660 Populazio artean 48 HPI-tan (guztira % 14-20 DEG).
Venn diagrama, Colletotrichum lupini-rekin (Wierzhenice-ko (Polonia, 1999) lupino-soroetatik lortutako Col-08 anduia) inokulatutako hosto estu-lupino (NLL) lerroetan adierazpen diferentzialeko geneen (DEG) kopurua erakusten duena. Aztertutako NLL lerroak hauek izan ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 aleloa duena), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurrizko erresistentea, AnMan aleloa duena) eta 22660 populazioa (oso sentikorra). hpi laburdurak txertoaren ondorengo orduak adierazten ditu. Zero balioak kendu dira grafikoa sinplifikatzeko.
6 hpi-tan gehiegi adierazitako geneen multzoa aztertu zen R gene domeinu kanonikoen presentzia ikusteko (S7 taula osagarria). Ikerketa honek gaixotasunen aurkako erresistentzia gene klasikoen transkriptomaren indukzioa agerian utzi zuen NBS-LRR domeinuekin 83A:476-n bakarrik. Multzo hau TIR-NBS-LRR gene batez (tanjilg_05042), bost CC-NBS-LRR genez (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 eta tanjilg_16162), eta lau NBS-LR, Tanjilg_16162), eta lau NBS-LRREz (tanjilg_16162), baita lau NBS-Lrr (tanjilg_16162) eta lau NBS-LRR (TANJILG_16162) ere osatuta zegoen. Gene hauek guztiek sekuentzia kontserbatuetan antolatutako domeinu kanonikoak dituzte. NBS-LRR domeinu geneez gain, hainbat RLL kinasa aktibatu ziren 6 hpi-tan, bat Boregine-n (TanjilG_19877), bi Mandelup-en (TanjilG_07141 eta TanjilG_19877) eta 22660 populazioan (TanjilG_09014 eta TanjilG_10361) eta bi 83A 27:476-n.
C. lupini-rekin (Col-08 anduia) txertatzean adierazpena nabarmen aldatu zuten geneak Gene Ontology (GO) aberaste-analisi baten menpe jarri ziren (S8 taula osagarria). Gehienetan gehiegi ordezkatutako prozesu biologikoen terminoa “GO:0006952 defentsa erantzuna” izan zen, 16 konbinazioetatik 6tan (denbora × lerroa) agertu zena, esangura handikoa (P balioa < 0,001) (2. irudia). Gehienetan gehiegi ordezkatutako prozesu biologikoen terminoa “GO:0006952 defentsa erantzuna” izan zen, 16 konbinazioetatik 6tan (denbora × lerroa) agertu zena, esangura handikoa (P balioa < 0,001) (2. irudia). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952», 0006952 термином который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значимостью (значимостью) (значение P) (0,ис. Gehienetan gehiegi ordezkatutako prozesu biologikoen terminoa 'GO:0006952 defentsa erantzuna' izan zen, 16 konbinazioetatik 6tan (denbora × leinua) agertu zena esangura handiarekin (P balioa < 0,001) (2. irudia).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Prozesu biologikoen termino adierazgarriena “GO:0006952 defentsa erantzuna” da, 16 (时间×线) konbinazioetatik 6tan agertzen dena, esangura handikoa (P balioa < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defentsa», erantzuna появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис.2). Gehienetan gehiegi ordezkatutako prozesu biologikoen terminoa 'GO:0006952 Defentsa Erantzuna' izan zen, 16 konbinazioetatik 6tan agertu zena (denbora × lerroa) esangura handiarekin (P balioa < 0,001) (2. irudia).Termino hau bi denbora-puntutan gehiegi ordezkatu zen 83A-n: 476 eta Boregine-n (6 eta 24 hpi) eta une batean Mandelup eta 22660 Populazioan (12 eta 6 hpi, hurrenez hurren). Emaitza espero zitekeena da hau, lerro erresistenteen onddoen aurkako erantzuna nabarmentzen baitu. Gainera, 83A:476-k C. lupini-ri erantzun zion "GO:0055114 redox prozesua" terminoak irudikatzen duen eztanda oxidatiboarekin lotutako geneak azkar induzituz, defentsa-erantzun espezifiko bat adieraziz, Boregine-k, berriz, 'GO' terminoarekin lotutako defentsa-erantzun espezifikoak erakutsi zituen bitartean. :0006950 Estres erantzuna”. 22660 populazioak metabolito sekundarioak inplikatzen dituen erresistentzia horizontalaren erantzuna aktibatu zuen, “GO:0016104 Triterpenoen biosintesiaren prozesua” eta “GO:0006722 Triterpenoen metabolismoaren prozesua” terminoen kopuru gehiegi nabarmenduz (bi terminoak gene multzo berekoak dira), GO terminoen aberaste-analisiaren emaitzak kontuan hartuta, Mandelup erreakzioaren egonkortasuna Boregine eta 22660 populazioaren artean zegoen. Horrez gain, 83A:476 erreakzio goiztiarrak (6 hpi) eta Mandelup eta 22660 populazioen erreakzio atzeratuak GO:0015979 'fotosintesia' terminoa eta erlazionatutako beste prozesu biologiko batzuk barne hartzen dituzte.
Karbunko lupinoarekin (1999an Poloniako Wierzheniceko lupino-soroetatik lortutako Col-08 anduia) inokulatutako hosto estuko lupinoaren (NLL) transkriptomaren erantzunen bidez modu desberdinean adierazitako geneen anotazioan hautatutako bioprozesuen geneen ontologia-terminoak oso gehiegizkoak dira. Aztertutako NLL lerroak hauek izan ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetiko ezezaguna), Mandelup (neurrizko erresistentea, AnMan alelo homozigotoa daramana) eta 22660 populazioa (sentikorra).
Ikerketa honek antraknosarekiko erresistentzian laguntzen duten geneak identifikatzea helburu zuenez, "GO: 0006952 Defensive responses" eta "GO: 0055114 Redox processes" terminoei esleitutako geneak aztertu ziren oinarrizko batez bestekoak ≥ 30 zirelako, gutxienez lerro bat × denbora-puntuarekin, log2-ren (tolestura-aldaketa) balio estatistikoki esanguratsuak konbinatuz. Irizpide hauek betetzen zituzten geneen kopurua 65 izan zen GO:0006952rako eta 524 GO:0055114rako.
83A:476-k bi DEG gailur agerian utzi zituen, GO:0006952 terminoarekin anotatuak, lehenengoa hazbeteko 6 geneetan (64 gene, gora eta behera erregulazioa) eta bigarrena hazbeteko 24 geneetan (15 gene, gora erregulazioa bakarrik). Boreginak ere erakutsi zuen GO:0006952-k une berean jo zuela gailurra, baina DEG gutxiagorekin (11 eta 8) eta lehentasunezko aktibazioarekin. Mandeloopek GO:0006952-ren bi gailur erakutsi zituen 12 eta 48 HPI-tan, biek 12 gene zeramatzatela (lehena aktibazio-geneekin, eta bigarrena inhibizio-geneekin bakarrik), eta 6 HPI-tan (13 gene) 22660 populazioak igoera-gailurraren erregulazioaren nagusitasun handiagoa izan zuen. Kontuan izan behar da gailur hauetan GO:0006952 DEG-ren % 96,4k erantzun mota bera izan zutela (gora edo behera), eta horrek defentsa-erantzunen gainjartze esanguratsua adierazten du, inplikatutako gene kopuruaren arteko desberdintasunak egon arren. GO:0006952 terminoarekin lotutako sekuentzia talde handienak Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like) kodetzen du, 10. klaseko patogenesiarekin lotutako proteina (PR-10) proteina kladoari eta latex proteina nagusiari (MLP-like) proteinari dagokiona (3. irudia). Bi taldeek adierazpenaren izaeran eta erantzunaren norabidean desberdinak ziren. SAM22-like proteinak kodetzen dituzten geneek indukzio koherentea eta esanguratsua erakutsi zuten hasierako denbora-puntuetan (6 edo 12 hpi) eta, oro har, ez zuten erantzunik eman esperimentuaren amaieran (48 hpi), MLP-like proteinek, berriz, koordinazioa erakutsi zuten 6 hpi-tan. hpi. 83A:476 eta Mandelup 48 hp/in-tan, gainerako datu-puntu ia guztiak ez ziren erantzunik eman. Gainera, SAM22-like proteina geneen adierazpen-profilen desberdintasunek antraknosiarekiko erresistentzian behatutako aldakortasunari jarraitu zioten, lerro erresistenteagoek gene horiek modu esanguratsuan induzitzen zituzten denbora-puntu gehiago baitzituzten gene sentikorragoek baino. Beste LlR18A/B antzeko PR-10 gene batek SAM22 proteina-genearen antzeko adierazpen-eredua erakutsi zuen.
"GO:0006952 Defentsa Erantzuna" prozesu biologikoaren terminoaren osagai nagusiak eta Lanr1 eta AnMan aleloen gene hautagaien adierazpen-ereduak identifikatu ziren. Log2 eskalak log2 balioak (tolestura-aldaketa) adierazten ditu inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, lupino-soroetatik lortua, Wizhenica, Polonia, 1999) eta kontrol-landareen (txerriketa faltsuak) arteko denbora-puntu berean. Hosto estuko lupino-lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurrizko erresistentea, AnMan alelo homozigotoa daramana) eta 22660 Populazioa (sentikorra).
Horrez gain, Lanr1 (TanjilG_05042) eta AnMan (TanjilG_12861) RNA-seq gene hautagaien adierazpen-profilak ebaluatu ziren (3. irudia). TanjilG_05042 geneak erantzun esanguratsua (aktibazioa) erakutsi zuen 83A:476-n lehenengo denbora-puntuan bakarrik (6 hpi), TanjilG_12861 Mandeloop-en esanguratsua izan zen bitartean bi denbora-puntutan bakarrik: 6 hpi (beherazko erregulazioa) eta 24 hpi (6 hpi). Erregulagarria).
GO:0055114 "erredox prozesua" terminoan gehien gehiegi adierazitako geneak zitokromo P450 proteinak eta peroxidasa kodetzen dituzten geneak izan ziren (4. irudia). 83A:476tik 6 HPI-tan isolatutako laginetan, log2 (tolestura aldaketa) balio maximoak edo minimoak (geneen % 86,6rako) inokulatutako eta kontrol landareen artean ikusi ziren, genotipo honek sexu inokulatzailearekiko duen erantzun handia azpimarratuz. 83A:476k GO:0055114 DEG esanguratsuena erakutsi zuen 6 hpi-tan (503 gene), eta gainerako lerroek 48 hpi-tan (Boregine, 31 gene; Mandelup, 85 gene; eta Population 22660, 78 gene)). GO:0055114 familiako gene gehienetan, txertoarekiko bi erantzun mota ikusi ziren (aktibazioa eta inhibizioa). Interesgarria da, Mandelupe-n GO: 0055114 terminoarentzat identifikatutako DEGen % 97,6 arte 48 hp-tan. Behaketa hauek iradokitzen dute, eskala nabarmen txikiagoa izan arren (hau da, mutatutako redox geneen kopurua, 85 vs 503), mandeloup-en antraknosarekiko transkriptomaren atzeratutako erantzunen eredua 83A:476-ren hasierako erantzunaren antzekoa dela. Boregine eta Population 22660-n, konbergentzia hau txikiagoa da, % 51,6 eta % 75,6, hurrenez hurren.
"GO:0055114 Redox prozesua" prozesu biologikoaren terminoaren osagai nagusien adierazpen-ereduak agerian geratu ziren. Log2 eskalak log2 balioak (tolestura-aldaketa) adierazten ditu inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, lupino-soroetatik lortua, Wizhenica, Polonia, 1999) eta kontrol-landareen (faltsuki inokulatutako) artean, une berean. Hosto estuko lupino-lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotoa duena), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurrizko erresistentea, AnMan alelo homozigotoa duena) eta 22660 Populazioa (sentikorra).
83A:476 C. lupini-rekin (Col-08 anduia) txertaketaren erantzun transkriptomikoek GO:0015979 "fotosintesia" terminoari eta erlazionatutako beste prozesu biologiko batzuei egotzitako geneen isiltze koordinatua ere barne hartu zuten (5. IRUDIA). GO:0015979 DEG multzo honek 105 gene zituen, eta hauek 83A:476-n 6 hpi-tan nabarmen erreprimitu ziren. Azpimultzo honetan, 37 gene ere beherantz erregulatu ziren Mandelup-en 48 HPI-tan eta 35 aldi berean 22660 populazioan, bi genotipoei dagozkien 19 DEG barne. GO:0015979 terminoarekin lotutako DEGrik ez zen nabarmen aktibatu inongo konbinaziotan (lerroa x denbora).
"GO:0015979 Fotosintesia" prozesu biologikoaren terminoaren osagai nagusien adierazpen-ereduak agerian geratu ziren. Log2 eskalak log2 balioak (tolestura-aldaketa) adierazten ditu inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, lupino-soroetatik lortua, Wizhenica, Polonia, 1999) eta kontrol-landareen (faltsuki inokulatutako) artean, une berean. Hosto estuko lupino-lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotoa duena), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurrizko erresistentea, AnMan alelo homozigotoa duena) eta 22660 Populazioa (sentikorra).
Adierazpen diferentzialaren analisi emaitzetan oinarrituta eta onddo patogenoen aurkako defentsa erantzunetan parte hartzen duela ziurrenik, zazpi gene multzo hau hautatu zen denbora errealeko PCR bidezko adierazpen profilak kuantifikatzeko (S9 taula osagarria).
TanjilG_10657 proteina-gene ustezkoa modu esanguratsuan induzitu zen aztertutako lerro eta denbora-puntu guztietan, kontrol-landare (imitaziozko)ekin alderatuta (S10, S11 taula osagarriak). Gainera, TanjilG_10657-ren adierazpen-profilak goranzko joera erakutsi zuen esperimentuan zehar lerro guztietan. 22660 populazioak erakutsi zuen TanjilG_10657-ren sentikortasun handiena txertaketarekiko, 114 aldizko aktibazioarekin eta adierazpen erlatibo maila altuena (4,4 ± 0,4) 24 HPI-tan (6a irudia). PR10 LlR18A proteina-gene TanjilG_27015-k ere aktibazioa erakutsi zuen lerro eta denbora-puntu guztietan, datu-puntu gehienetan esangura estatistikoarekin (6b irudia). TanjilG_10657-ren antzera, TanjilG_27015-ren adierazpen erlatibo maila altuena 22660 txertatutako populazioan ikusi zen 24 HPI-tan (19,5 ± 2,4). TanjilG_04706 azido endokitinasa genea nabarmen goranzko mailara iritsi zen lerro guztietan eta denbora-puntu guztietan, Boregine 6 hpi-n izan ezik (6c irudia). Lehenengo denbora-puntuan (6 HPI) 83A:476-n indarrez induzitu zen (10,5 aldiz) eta beste lerroetan neurriz handitu zen (6,6-7,5 aldiz). Esperimentuan zehar, TanjilG_04706-ren adierazpena antzeko mailan mantendu zen 83A:476 eta Boregine-n, Mandelup eta 22660 populazioan, berriz, nabarmen handitu zen, balio nahiko altuak lortuz (5,9 ± 1,5 eta 6,2 ± 1,5, hurrenez hurren). TanjilG_23384 endoglukano-1,3-β-glukosidasa-antzeko geneak aktibazio handia erakutsi zuen lehenengo bi denbora-puntuetan (6 eta 12 hpi) lerro guztietan, 22660 populazioa izan ezik (6d irudia). TanjilG_23384-ren adierazpen erlatibo maila altuenak bigarren denbora-puntuan (12 hpi) Mandelup-en (2,7 ± 0,3) eta 83A:476-n (1,5 ± 0,1) ikusi ziren. 24 HPI-tan, TanjilG_23384-ren adierazpena nahiko baxua izan zen aztertutako lerro guztietan (0,04 ± 0,009tik 0,44 ± 0,12ra).
Hautatutako geneen (ag) adierazpen-profilak PCR kuantitatiboaren bidez agerian geratu dira. 6, 12 eta 24 zenbakiek txertoaren ondorengo orduak adierazten dituzte. LanDExH7 eta LanTUB6 geneak erabili ziren normalizaziorako eta LanTUB6 serieen arteko kalibraziorako. Errore-barrek hiru errepikapen biologikotan oinarritutako desbideratze estandarra adierazten dute, eta bakoitza hiru errepikapen teknikoen batez bestekoa da. Inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, 1999an Poloniako Wierzenicako lupin-sorotik lortua) eta kontrol-landareen (txertaketa simulatua) arteko adierazpen-mailen arteko desberdintasunen esangura estatistikoa datu-puntuen gainean markatuta dago (*P balioa < 0,05, **P balioa ≤ 0,01, ***P balioa ≤ 0,001). Inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, 1999an Poloniako Wierzenicako lupin-sorotik lortua) eta kontrol-landareen (txertaketa simulatua) arteko adierazpen-mailen arteko desberdintasunen esangura estatistikoa datu-puntuen gainean markatuta dago (*P balioa < 0,05, **P balioa ≤ 0,01, ***P balioa ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum0 lupini,м получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) eta контрольными (ложно инокулимиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Datu-puntuen gainean (*P balioa < 0,05, **P-balioa ≤ 0,01, ***P-balioa ≤ 0,001) txertatutako landareen eta kontrol-landareen (txertaketa faltsuko landareen) arteko adierazpen-mailen arteko alde estatistikoki esanguratsuak adierazten dira (*P balioa < 0,05, **P-balioa ≤ 0,01, ***P-balioa ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数之间表达水平差异的统计学显着性标记在数（在数渍在数渍在数渍0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 (colletotrichum lupini), color-08 株, 1999水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。001)。. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, ш08там полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно ирнокаулистромнокаул) отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Datu-puntuen gainean (*P balioa < 0,05, **P-balioa ≤ 0,01, ***P-balioa ≤ 0,001) txertatutako landareen eta kontrol-landareen (txertaketa faltsuko) arteko adierazpen-mailen arteko alde estatistikoki esanguratsuak agertzen dira (*P balioa < 0,05, **P-balioa ≤ 0,01, ***P-balioa ≤ 0,001).Aztertutako NLL lerroak hauek izan ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotoa duena), Mandelup (erresistente moderatu bat, AnMan alelo homozigotoa duena), Boregine (erresistentea, jatorri genetiko ezezaguna) eta 22660 populazioa (susmagarria).
Lanr1 lokusean dagoen TanjilG_05042 gene hautagaiak adierazpen-eredu nabarmen desberdina erakutsi zuen RNA-seq ikerketetatik lortutako profilekin alderatuta (6e irudia). Gene honen aktibazio esanguratsua ikusi zen Mandelup eta 22660 populazioan (39,7 eta 11,7 aldiz, hurrenez hurren), eta horrek adierazpen-maila nahiko altuak eragin zituen (1,4 ± 0,14 eta 7,2 ± 1,3 aldiz, hurrenez hurren). 83A:476-k TanjilG_05042 genearen goranzko erregulazioa ere erakutsi zuen (3,8 aldiz gehiago), baina lortutako adierazpen-maila erlatiboak (0,044 ± 0,002) Mandelup eta 22660 populazioan ikusitakoak baino 30 aldiz txikiagoak izan ziren. qPCR bidez aztertutako aldaerek txerto simulatuekin (kontrol) egindako genotipoen arteko adierazpen-mailetan alde nabarmenak erakutsi zituzten, 58 aldizko aldea lortuz 22660 eta 83A:476 populazioen artean, baita 22660 eta 22660 populazioen artean ere. Bikoitz aldea lortu zen Boregine eta Mandalup artean.
AnMan lokuseko gene hautagaia, TanjilG_12861, txertoari erantzunez aktibatu zen 83A:476 eta Mandelup-en, neutroa zen 22660 populazioan, eta beheranzko erregulazioa zuen Boregine-n (6f irudia). TanjilG_12861 genearen adierazpen erlatiboa altuena izan zen inokulatutako 83A:476-n (0,14±0,01). TanjilG_05080 HSP17.4 17,4 kDa-ko I. klaseko bero-talka proteina geneak adierazpen erlatibo maila baxuagoak erakutsi zituen aztertutako andui eta denbora-puntu guztietan (6g irudia). Balio altuena 24 HPI-tan ikusi zen 22660 populazioan (0,14 ± 0,02, txertoari erantzunaren zortzi aldiz handiagoa).
Geneen espresio-profilen konparaketak (7. irudia) TanjilG_10657 eta beste lau geneen arteko korrelazio handia agerian utzi zuen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) eta TanjilG_04706 (r = 0,79). Emaitza horiek gene hauen koerregulazioa adieraz dezakete defentsa-erantzunetan. TanjilG_12861 eta TanjilG_23384 geneek espresio-profil desberdinak erakutsi zituzten, Pearson korrelazio-koefizientearen balio txikiagoekin (0,08tik 0,43ra eta -0,19tik 0,28ra, hurrenez hurren), beste geneekin alderatuta.
Geneen espresio-profilen arteko korrelazioak PCR kuantitatiboa erabiliz detektatu ziren. Hosto estuko lupino lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotoa duena), Mandelup (erresistente moderatuan, AnMan alelo homozigotoa duena), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna) eta 22660 Populazioa (sentikorra). Hiru denbora-puntu kalkulatu ziren (txertatu eta 6, 12 eta 24 ordura), txertatutako landareak (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, 1999an Poloniako Wierzheniceko lupino-soroetatik lortua) eta kontrol-landareak (txertatu faltsuki) barne. Eskalak Pearson korrelazio-koefizientearen balioa erakusten du.
Hazbeteko 6 zaldi-potentzian lortutako datuetan oinarrituta, WGCNA 9981 DEG-tan egin zen, txertatutako eta kontrol-landareak alderatuz identifikatuta, hasierako defentsa-erantzunetan arreta jartzeko (S12 taula osagarria). Hogeita bi gene-modulu (kluster) aurkitu ziren genotipoen eta aldaera esperimentalen arteko adierazpen-profil korrelazionatuak (positiboak edo negatiboak) zituztela. Batez beste, geneen espresio mailak beherantz zihoazen ordena honetan: 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populazioa (bi aldaeretan, ordea, joera hau indartsuagoa izan zen kontrol landareetan). Batez beste, geneen espresio mailak beherantz zihoazen ordena honetan: 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populazioa (bi aldaeretan, ordea, joera hau indartsuagoa izan zen kontrol landareetan). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих, ндано эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Batez beste, geneen espresio mailak 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populazioa ordenan jaitsi ziren (bi aldaeretan, ordea, joera hau indartsuagoa izan zen kontrol landareetan).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 biztanle的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> 22660 biztanle在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 biztanle тенденция была сильнее у контрольных растений). Batez beste, geneen adierazpen mailak jaitsi egin ziren 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populazioa seriean (hala ere, bi aldaeretan, joera hau indartsuagoa izan zen kontrol landareetan).Txertoak geneen espresioaren goranzko erregulazioa eragin zuen, batez ere 18, 19, 14, 6 eta 1 moduluetan (efektuaren beheranzko ordenan), erregulazio negatiboa (adibidez, 9 eta 20 moduluak) edo efektu neutroekin (adibidez, 11, 22, 8 eta 13 moduluak). GO terminoen aberastasun-analisiak (S13 taula osagarria) "GO: 0006952 Babes-erantzunak" agerian utzi zituen txertatutako moduluan (18), aktibazio maximoarekin, qPCR bidez aztertutako geneak barne (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 eta TanjilG_27015), baita fotosintesiaren modulu gehien murriztuetan ere (9). 18. moduluko kontzentratzailea (8. irudia) PR-10 antzeko LlR18B proteina kodetzen duen TanjilG_26536 gene gisa identifikatu zen, eta 9. moduluko kontzentratzailea II fotosistemako PsbQ proteina kodetzen duen TanjilG_28955 gene gisa identifikatu zen. Lanr1 antraknosarekiko erresistentzia-gene hautagai bat, TanjilG_05042, 22. moduluan aurkitu zen (9. irudia) eta "GO:0044260 Zelula makromolekularreko prozesu metabolikoak" eta "GO:0006355 Transkripzio-erregulazioa, DNA txantiloiak" terminoekin lotuta dago, TanjilG_01212 gunea dutenak. Geneak bero-estresaren transkripzio-faktorea A-4a (HSFA4a) kodetzen du.
"GO: 0006952 Defentsa erantzunak" prozesu biologikoen terminoak gehiegi ordezkatuta dituzten moduluen geneen ko-adierazpenaren sare haztatuaren analisia. Ligadura sinplifikatu egin zen qPCR bidez aztertutako lau geneak nabarmentzeko (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 eta TanjilG_27015).
"GO: 0006355: Transkripzio-erregulazioa, DNA txantiloiak" prozesu biologikoen terminoa duen eta Lanr1 TanjilG_05042 antraknosarekiko erresistentzia-gene hautagai bat duen modulu baten gene-koespresioaren sare haztatuaren analisia. Ligadura sinplifikatu zen TanjilG_05042 genea eta TanjilG_01212 gene zentrala isolatzeko.
Australian egindako antraknosarekiko erresistentziaren baheketak erakutsi zuen askatu ziren hasierako kultibar gehienak sentikorrak zirela; Kalya, Coromup eta Mandelup erresistentzia ertain gisa deskribatu dira, Wonga, Tanjil eta 83A:476, berriz, oso erresistente gisa deskribatu dira26,27,31. erresistentzia-alelo bera zuten, Lanr1 izendatua, eta Coromup eta Mandelup-ek alelo desberdin bat zuten, AnMan10, 26, 39 izendatua, Kalyak alelo desberdin bat gainditu zuen bitartean. , Lanr2. Alemanian antraknosarekiko erresistentziaren baheketak Bo7212 lerro erresistente bat identifikatu zuen, Lanr1ez besteko alelo hautagai batekin, LanrBo36 izendatua.
Gure ikerketak Lanr1 aleloaren maiztasun oso baxua (% 6 inguru) agerian utzi du aztertutako germoplasman. Behaketa hau bat dator Ekialdeko Europako germoplasma Anseq3 eta Anseq4 markatzaileak erabiliz egindako baheketaren emaitzekin, zeinak erakutsi baitu Lanr1 aleloa bi lerro bielorrusiartan bakarrik dagoela. Horrek iradokitzen du Lanr1 aleloa ez dela oraindik asko erabiltzen tokiko hazkuntza-programetan, Australian ez bezala, non markatzaile bidezko hazkuntzarako alelo gakoetako bat den. Hori izan daiteke Lanr1 aleloak Europako landa-baldintzetan ematen duen erresistentzia-maila txikiagoagatik, Australiako txostenarekin alderatuta. Horrez gain, Australiako euri asko egiten duten eremuetan antraknosiaren ikerketek erakutsi dute Lanr1 aleloak bitartekatutako erresistentzia-erantzunak ez direla eraginkorrak patogenoaren hazkuntza eta garapen azkarra faboratzen duten eguraldi-baldintzetan19,42. Izan ere, egungo ikerketan, antraknosiaren sintoma batzuk ere ikusi ziren Lanr1 aleloa duten genotipoetan, eta horrek iradokitzen du erresistentzia desager daitekeela C. lupini garatzeko baldintza optimoetan. Gainera, Anseq3 eta Anseq4 markatzaileen presentziaren interpretazio faltsu positiboak posible dira, Lanr1 lokusetik 1 cM ingurura daudenak 28,30,43.
Gure ikerketak erakutsi zuen Lanr1 aleloa daraman 83A:476-k C. lupini txertaketari erantzun ziola transkriptomaren birprogramazio eskala handiarekin aztertutako lehen denbora-puntuan (6 hpi), eta Mandelup-en, AnMan aleloa daraman bitartean, erantzun transkriptomikoak askoz beranduago ikusi ziren (24tik 48 hp-ra). Defentsa-erantzunen denbora-aldaera hauek gaixotasunen sintomen arteko desberdintasunekin lotuta daude, eta horrek patogenoen ezagutza goiztiarra nabarmentzen du erresistentziari erantzun arrakastatsua emateko. Landare-ehuna infektatzeko, karbunko-esporak hainbat garapen-etapa igaro behar dituzte ostalariaren gainazalean, besteak beste, ernetzea, zelulen zatiketa eta apresorio baten eraketa. Eranskina ostalariaren gainazalari atxikitzen zaion eta ostalariaren ehunetan sartzea errazten duen egitura infekziosoa da. Horrela, ilar-estraktuko C. gloeosporioides-en esporek nukleoaren lehen zatiketa erakutsi zuten inkubazio-aldiaren 75-90 minutu igaro ondoren, hodi germinatibo baten eraketa 90-120 minutu igaro ondoren, eta errepresioa 4 ordu igaro ondoren. C. gloeosporioides mangoak % 40 baino gehiagoko konidioen ernetzea erakutsi zuen 3 orduko inkubazioaren ondoren, eta apresoreen eraketa % 20 ingurukoa 4 orduren buruan. C. gloeosporioides-en birulentziarekin lotutako CAP20 geneak transkripzio-jarduera erakutsi zuen epifitoak sortzen dituzten konidioetan, aguakatearen gainazaleko argizarian 3,5 orduko inkubazioaren ondoren, CAP20 proteina kontzentrazio altuekin, 4 ordu eta 46 minuturen ondoren. Era berean, C. trifolii-n melanina biosintesi-geneen jarduera 2 orduko inkubazio batean induzitu zen, eta ondoren apresorio bat eratu zen ordubete igaro ondoren. Hosto-ehunen ikerketek erakutsi dute C. acutatum-ekin inokulatutako marrubiek lehen errepresioa 8 hpi-tan dutela, eta C. coccodes-ekin inokulatutako tomateek, berriz, 4 hpi-tan48,49. neurri handi batean bat dator Colletotrichum spp. infekzio-prozesuaren denbora-eskalarekin. 83A:476-ri aurre egiteko defentsa-erantzun azkarrek landareen erresistentzia eta efektoreek eragindako immunitate-genen (ETI) inplikazioa iradokitzen dute lerro honetan, Mandelupen atzeratutako erantzunek mikro-elkartutako eredu molekularrek eragindako immunitate-hipotesia (MTI) babesten duten bitartean 50. 83A: 476 eta Mandelupen aurkako lehen erantzunak. Goranzko edo beheranzko erregulazio-geneen arteko gainjartze partzialak erantzun atzeratuan ere kontzeptu hau babesten du, ETI askotan MTI erantzun azeleratu eta hobetutzat hartzen baita, infekzio-gunean zelula-heriotza programatuan amaitzen dena, shock anafilaktiko gisa ezagutzen dena 51,52.
Gene Ontology GO:0006952 "Defentsa Erantzuna" termino gehiegi ordezkatuari egozten zaizkion gene gehienak estresak eragindako barau mezuaren 22 proteinaren (SAM22ren antzekoa) 11 homologoak eta zazpi latex proteina-antzeko (MLP) nagusienak dira. 31, 34, 43 eta 423 antzeko proteinek sekuentzia-antzekotasuna erakutsi zuten. SAM22 antzeko geneek aktibazio esanguratsua erakutsi zuten, luzeago iraun zuena, antraknosarekiko erresistentzia-maila handituak erakutsiz (83A:476 eta Boregine). Hala ere, MLP antzeko geneak erresistentzia-alelo hautagaia zuten lerroetan bakarrik murriztu ziren (83A:476/Lanr1 6 hpi-tan eta Mandelup/AnMan 24 hpi-tan). Kontuan izan behar da identifikatutako SAM22 antzeko homologo guztiak gutxi gorabehera 105 kb-ko gene-multzo batetik datozela, eta MLP antzeko geneak, berriz, genomaren eskualde bereizietatik datozela. SAM22 antzeko gene horien aktibazio koordinatua Diaporthetoxica txertaketaren aurrean NLL erresistentziari buruzko aurreko ikerketan ere aurkitu zen, eta horrek iradokitzen du defentsa-erantzunaren osagai horizontaletan parte hartzen dutela. Ondorio hau ere babesten dute SAM22 antzeko geneek azido salizilikoarekin, onddoen eragileekin edo hidrogeno peroxidoarekin egindako lesio edo tratamenduarekiko erantzun positiboa izan dutela dioten txostenek.
MLP antzeko geneek hainbat estres abiotiko eta biotikori erantzuten dietela frogatu da, besteak beste, landare-espezie askotan bakterio, biral eta patogeno diren onddoen infekzioei55. Landareen eta patogenoen arteko elkarreragin batzuei emandako erantzunaren norabideak asko handitu ziren (hau da, kotoia Verticillium dahliae-rekin infestatzean) nabarmen gutxitu ziren (hau da, sagarrondoa Alternaria spp.-rekin infektatu ondoren)56,57. MLP antzeko 423 genearen beherakada nabarmena ikusi da F. niger infekzioaren aurkako aguakateen defentsan eta Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola eta Alternaria alternata sagarrondoaren infekzioan sagar patotipoak dira58,59. Gainera, MLP antzeko 423 genea gehiegi adierazten duten sagar-kaliek erresistentziarekin lotutako geneen adierazpen txikiagoa zuten eta onddoen infekzioarekiko sentikorragoak ziren59. Fusarium oxysporum f-ren ondoren, MLP antzeko 423 genea ere kendu egin zen babarrun-germoi-plasma erresistentean. cn. Babarrun-infekzioa 60.
Gure RNA-seq ikerketan identifikatutako PR-10 familiako beste kide batzuk LlR18A eta LlR18B geneak izan ziren, erregulazio goranzkoaren erantzun gisa, baita DIR1 lipidoen transferentzia proteinaren erregulazio goranzko (gene 1) edo beheranzko (3 gene) genea ere. Horrez gain, WGCNAk LlR18B genea nabarmentzen du modulu honetako gune gisa, txertoarekiko oso sentikorra dena eta hainbat babes-erantzun gene dituena. LlR18A eta LlR18B geneak lupino hosto horietan induzitu ziren bakterio patogenoen aurrean, baita NLL zurtoinetan ere D. toxica txertatu ondoren, eta gene hauen arroz homologoa, RSOsPR10, azkar induzitu zen onddoen infekzio batek, ziurrenik azido jasmoniko seinaleztapen bidean parte hartzen duena53,61, 62. DIR1 geneak erresistentzia sistemiko eskuratuaren (SAR) agerpenerako beharrezkoak diren lipidoen garraio proteina ez-espezifikoak kodetzen ditu. Erreakzio babesleak garatzean, DIR1 proteina infekzio-fokutik floema zehar garraiatzen da SAR eragiteko organo urrunetan. Interesgarria da, TanjilG_02313 DIR1 genea modu esanguratsuan induzitu zela lehen unean 84A:476 lerroetan eta 22660 populazioan, baina antraknosarekiko erresistentzia 84A:476 lerroan bakarrik garatu zen arrakastaz. Honek DIR1 genearen azpifuntzionalizazio bat adieraz dezake NLL-n, gainerako hiru homologoek 83A:476 lerroan bakarrik erantzun baitzioten txertaketari 6 hpi-tan, eta erantzun hori beherantz zuzendu baitzen.
Gure ikerketan, "GO:0055114 Redox prozesua" izeneko prozesu biologikoari dagozkion osagai ohikoenak zitokromo P450 proteina, peroxidasa, azido linoleiko 9S-/13S-lipoxigenasa eta 1-aminoziklopropano-1-karboxiliko azido oxidasa izan ziren. Horrez gain, gure WGCNAk HSFA4a homologoa definitzen du Lanr1 erresistentzia gene hautagaia den TanjilG_05042 bezalako moduluak eramaten dituen gune gisa. HSFA4a landareen transkripzio nuklearraren erredox-menpeko erregulazioaren osagaia da.
Zitokromo P450 proteinak oxidorreduktasak dira, NADPH eta/edo O2-menpeko hidroxilazio erreakzioak katalizatzen dituztenak lehen eta bigarren mailako metabolismoan, xenobiotikoen metabolismoa barne, baita hormonak, gantz-azidoak, esterolak, zelula-hormaren osagaiak, biopolimeroak eta babes-konposatuen biosintesia ere 69. Gure ikerketa batean, landareen zitokromo P450 funtzioaren aldakortasuna -10,6 log2-tik (aldaketa) 5,7-ra murriztu zen, homologo aldatu kopuru handia (37) eta gene espezifikoen arteko erantzun-ereduen desberdintasunak direla eta, goranzko berrikuspena islatuz. RNA-seq datuak soilik erabiltzea proteina-superfamilia handi batean NLL geneen ustezko funtzio biologikoa argitzeko oso espekulatiboa litzateke. Hala ere, kontuan izan behar da zitokromo P450 gene batzuk onddo edo bakterio patogenoekiko erresistentzia handiagoarekin lotuta daudela, erreakzio alergikoetan eragina barne69,70,71.
III. klaseko peroxidasak landare-entzima multifuntzionalak dira, landareen hazkuntzan eta garapenean zehar prozesu metaboliko ugaritan parte hartzen dutenak, baita gazitasuna, lehortea, argi-intentsitate handia eta patogenoen erasoa bezalako ingurumen-estresari erantzuten ere72. Peroxidasak hainbat landare-espezieren eta Anthracis-en arteko elkarrekintzan parte hartzen dute, besteak beste, Stylosanthes humilis eta C. gloeosporioides, Lens culinaris eta C. truncatum, Phaseolus vulgaris eta C. lindemuthianum, Cucumis sativus eta C. lagenarium73,74,75,76. Erantzuna oso azkarra da, batzuetan 4 HPI-tan ere, onddoak landare-ehuna zeharkatu aurretik73. Peroxidasa-geneak D. toxica NLL txertaketari ere erantzun zion. Oxidazio-leherketa erregulatzeko edo estres oxidatiboa ezabatzeko dituzten funtzio tipikoez gain, peroxidasek patogenoen hazkuntzan eragin dezakete lignifikazioan, azpiunitatean edo konposatu espezifikoen lotura gurutzatuan zelula-hormaren indartzean oinarritutako hesi fisikoak sortuz. Funtzio hau in silico TanjilG_03329 geneari egotz dakioke, lignina sortzen duen anioi peroxidasa bat kodetzen duena. Genea gure ikerketan nabarmen gora egin zuen 83A:476 erresistentea zen lerroan 6 HPI-tan, baina ez erantzun ez zuten beste andui eta denbora-puntu batzuetan.
Azido linoleikoaren 9S-/13S-lipoxigenasa lipidoen biosintesiaren bide oxidatiboaren lehen urratsa da78. Bide honetako produktuek funtzio ugari dituzte landareen defentsan, besteak beste, zelula-hormak indartzea kalosa eta pektina gordailuak eratuz, eta estres oxidatiboaren erregulazioa oxigeno espezie erreaktiboen ekoizpenaren bidez79,80,81,82,83. Oraingo ikerketan, azido linoleikoaren 9S-/13S-lipoxigenasaren adierazpena aldatu egin zen andui guztietan, baina 22660 populazio sentikorrean, goranzko erregulazioa nagusitu zen denbora-puntu desberdinetan, Lanr1 erresistentea eta AnMan aleloa dituzten anduietan, berriz, oxilipina geruzaren dibertsifikazioa azpimarratzen du genotipo hauen arteko antrax erreakzio babesleetan.
1-aminoziklopropano-1-karboxilato oxidasa (ACO) homologoa nabarmen goranzko (9 gene) edo beheranzko (2 gene) erregulatu zen lupinarekin inokulatu zenean. Bi salbuespenekin, erantzun horiek guztiak 6 hp-tan gertatu ziren 83A:476-n. ACO proteinek bitartekatutako erreakzio entzimatikoa da etilenoaren ekoizpenaren abiadura mugatzen duen urratsa eta, beraz, oso erregulatuta dago84. Etilenoa landare-hormona bat da, landareen garapena eta estres abiotiko eta biotikoen baldintzei erantzutea erregulatzen dituen hainbat rol betetzen dituena. ACO transkripzioaren indukzioa eta etilenoaren seinaleztapen-bidearen aktibazioak arrozak oryzae oryzae onddo hemibiotrofoarekiko duen erresistentzia handitzen dute, oxigeno erreaktiboen espezieen eta fitoalexinen ekoizpena erregulatuz. M. oryzae eta C. lupini88,89 artean aurkitutako hostoen infekzio-prozesu oso antzeko batek, ikerketa honetan aipatutako 83A:476 lerroan ACO homologoen erregulazio nabarmenaren testuinguruan, NLL antraknosi etilenoarekiko erresistentzia emateko aukera aldatzen du, bide molekularretan seinaleztapen-urrats zentral gisa.
Oraingo ikerketan, fotosintesiarekin lotutako gene askoren eskala handiko zapalketa ikusi zen 6 hpi-tan 83A:476-n eta 48 hpi-tan Mandeloop eta 22660 populazioan. Aldaketa hauen hedadura eta progresioa mailaren araberakoa da. Antraknosarekiko erresistentzia ikusi zen esperimentu honetan. Duela gutxi, fotosintesiarekin lotutako transkripzioen errepresio sendo eta goiztiarra jakinarazi da landare-patogeno interakzioen hainbat eredutan, bakterio eta onddo patogenoak barne. Fotosintesiarekin lotutako geneen presak (2 HPI-tik aurrera interakzio batzuetan) eta infekzioari erantzunez globalki zapaltzeak landareen immunitatea eragin dezake, oxigeno erreaktiboen espezieen hedapenean eta azido salizilikoaren bidearekin duten interakzioan oinarrituta erreakzio alergikoak bitartekatzeko 90,94.
Ondorioz, lerro erresistenteenarentzat (83A:476) proposatutako defentsa-erantzun mekanismoek R genearen bidezko patogenoen ezagutza azkarra eta erantzun alergikoak eragindako azido salizilikoa eta etileno seinaleztapena barne hartzen dituzte, ondoren SAR epe luzeko ekintza ezartzea. DIR-1 proteinak babesten du. Kontuan izan behar da C. lupini infekzioaren aldi biotrofikoa oso laburra dela (gutxi gorabehera 2 egun), eta ondoren hazkuntza nekrotikoa95. Etapa hauen arteko trantsizioa nekrosiarekin eta etileno-induzigarri diren proteinen adierazpenarekin lotuta egon daiteke, eta hauek landare ostalarietan hipersentsibilitate-erreakzioen eragile gisa jokatzen dute. Beraz, C. lupini arrakastaz harrapatzeko denbora-leihoa oso estua da fase biotrofikoan. 83A:476an 6 hpi-tan behatutako erredox eta fotosintesiarekin lotutako geneen birprogramazioa onddoen hifen progresioarekin bat dator eta fase biotrofikoan babes-erantzun arrakastatsu baten garapena iragartzen du. Mandelup-en eta 22660 populazioaren erantzun transkriptomikoak gehiegi atzeratu daitezke onddoa harrapatzeko hazkuntza nekrosikora aldatu aurretik, hala ere, Mandelup 22660 populazioa baino eraginkorragoa izan daiteke, PR-10 proteinaren erregulazio nahiko azkarrak erresistentzia horizontala sustatzen duelako.
ETI, R gene kanonikoak bultzatuta, babarrunak antraknosarekiko erresistentziaren mekanismo ohikoa dela dirudi. Horrela, Medicago truncatula lekale ereduan, antraknosarekiko erresistentzia RCT1 geneak ematen du, TIR-NBS-LRR97 landareen R gene klaseko kidea dena. Gene honek espektro zabaleko antraknosarekiko erresistentzia ere ematen dio alpapari, landare sentikorretara transferitzen denean. Babarrun arruntean (P. vulgaris), bi dozena baino gehiagoko antraknosarekiko erresistentzia gene identifikatu dira gaur egun arte. Gene horietako batzuk R gene kanonikorik ez duten eskualdeetan aurkitzen dira, baina beste asko NBS-LRR gene multzoa duten kromosomen ertzetan daude, TIR-NBS-LRRs99 barne. Genoma osoko SSR ikerketak ere baieztatu zuen NBS-LRR genearen eta babarrun arruntaren antraknosarekiko erresistentziaren arteko lotura. R gene kanonikoa lupino zuriaren 101ean antraknosarekiko erresistentzia locus nagusia duen eskualde genomikoan ere aurkitu zen.
Gure lanak erakusten du landareen infekzioaren hasierako fase batean aktibatutako erresistentzia-erreakzio berehalako batek (hobe 12 hpi baino lehen) eraginkortasunez babesten duela hosto estuko lupinoa Collelotrichum lupini onddo patogenoak eragindako antraknositik. Sekuentziazio-errendimendu handikoa erabiliz, Lanr1 eta AnMan erresistentzia-geneek bitartekatutako antraknosi-erresistentzia-geneen adierazpen-profil diferentzialak erakutsi genituen NLL landareetan. Defentsa arrakastatsuak erredox, fotosintesian eta patogenian parte hartzen duten proteinen geneak arretaz diseinatzea dakar, landareak patogeno batekin lehen kontaktua izan eta ordu gutxiren buruan. Antzeko babes-erreakzioek, baina denboran atzeratuek, askoz ere eraginkortasun gutxiago dute landareak gaixotasunetatik babesteko. Lanr1 geneak bitartekatutako antrax-erresistentzia R genearen erantzun azkar tipikoaren antzekoa da (efektoreak eragindako immunitatea), AnMan geneak, berriz, erantzun horizontala ematen duen bitartean (mikrobioekin lotutako eredu molekular batek eragindako immunitatea), iraunkortasun-maila moderatua eskainiz.
Antraknosi markatzaileak detektatzeko erabilitako 215 NLL lerroek 74 kultibar, gurutzaketa edo hazkuntza bidez lortutako 60 lerro, 5 mutante eta 76 germoi-plasma basati edo original zituzten. Lerroak 17 herrialdetatik zetozen, batez ere Poloniatik (58), Espainiatik (47), Alemaniatik (27), Australiatik (26), Errusiatik (19), Bielorrusiatik (7), Italiatik (5) eta beste 10 herrialdetako lerro batzuetatik. Multzoak erreferentziazko lerro erresistenteak ere baditu: 83A:476, Tanjil, Lanr1 aleloa duen Wonga eta AnMan aleloa duen Mandelup. Lerroak Poznań Plant Breeding Ltd.-ek (Wiatrowo, Polonia) mantentzen duen Europako Lupinen Baliabide Genetikoen Datu-basetik lortu ziren (S1 taula osagarria).
Landareak baldintza kontrolatuetan hazi ziren (16 orduko fotoperiodoa, 25 °C-ko tenperatura egunean zehar eta 18 °C-ko tenperatura gauez). Bi errepikapen biologiko aztertu ziren. DNA hiru asteko hostoetatik isolatu zen DNeasy Plant Mini Kit-a erabiliz (Qiagen, Hilden, Alemania), protokoloaren arabera. Isolatutako DNAren kalitatea eta kontzentrazioa metodo espektrofotometrikoen bidez ebaluatu ziren (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AEB). AnMan antraknosiarekiko erresistentzia-genea markatzen duen AnManM1 markatzailea (Mandelup kultibarretik eratorria) eta Lanr1 genea inguratzen duten Anseq3 eta Anseq4 markatzaileak (Tanjil kultibarretik eratorria) aztertu ziren11,26,28. Alelo erresistentearen homozigotoak "1" gisa sailkatu ziren, sentikorrak - "0" bezala, eta heterozigotoak - 0,5 bezala.
AnManM1, AnSeq3 eta AnSeq4 markatzaileen baheketaren emaitzetan eta azken jarraipen-esperimentuetarako hazien eskuragarritasunean oinarrituta, 50 NLL lerro hautatu ziren antraknosarekiko erresistentzia fenotipatzeko. Analisia bikoiztuta egin zen ordenagailuz kontrolatutako negutegi batean, 14 orduko fotoperiodoarekin, egunean zehar 22 °C-ko eta gauez 19 °C-ko tenperatura-tartearekin. Haziak urratuz (enbrioiaren kontrako aldean hazi-estalkia moztuz xafla zorrotz batekin) erein aurretik, hazi-estalkia gogorregia delako lozorroa geratzea saihesteko eta ernetze uniformea ​​bermatzeko. Landareak lorontzietan (11 × 11 × 21 cm) hazi ziren, lur esterilarekin (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovia, Polonia). Inokulazioa Colletotrichum lupini Col-08 anduiarekin egin zen, 1999an hazitakoa Verzhenitsa-ko (Polonia Handia) soro batean (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) hosto estuko lupino landareen zurtoinetatik. Lortu eremu bat. Isolatuak SNA ingurunean landu ziren 20° C-tan, argi beltzean, 21 egunez esporulazioa eragiteko. Erein eta lau astera, landareek 4-6 hosto-fasea lortu zutenean, inokulazioa konidioen suspentsio batekin ihinztatuz egin zen, 0,5 x 106 konidio kontzentrazioan ml-ko. Inokulazioaren ondoren, landareak iluntasunean mantendu ziren 24 orduz, % 98 inguruko hezetasunean eta 25°C-ko tenperaturan, konidioen ernetzea eta infekzio-prozesua errazteko. Ondoren, landareak 14 orduko fotoperiodoan hazi ziren, 22°C egunez/19°C gauez eta % 70eko hezetasunean. Gaixotasunaren puntuazioa txertatu eta 22 egunera egin zen, eta 0tik (immunea) 9ra (oso sentikorra) bitartekoa izan zen, zurtoinetan eta hostoetan lesio nekrotikorik zegoen edo ez zegoen arabera. Gainera, puntuazioa eman ondoren, landareen pisua neurtu zen. Markatzaile genotipoen eta gaixotasun fenotipoen arteko erlazioak puntu-bi sekuentziako korrelazio gisa kalkulatu ziren (antraknosi erresistentzia fenotipoaren analisirako lerro multzoan markatzaile heterozigotoen gabezia).