Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) elikagaiak ekoizteko eta lurzorua hobetzeko erabiltzen den landare lekaduna da.Laborantza gisa NLLren hedapen globalak onddo patogeno asko erakarri ditu, lupino antraknosa barne, antraknosi gaixotasun suntsitzailea eragiten duena.Bi alelo, Lanr1 eta AnMan, erresistentzia handiagoa ematen dutenak, NLL hazkuntzan erabili dira, baina azpian dauden mekanismo molekularrak ezezagunak dira.Ikerketa honetan, Lanr1 eta AnMan markatzaileak erabili ziren Europako NLL laginak aztertzeko.Txertoa ingurune kontrolatu batean probak bi emaile erresistenteen eraginkortasuna baieztatu zuen.Gene-adierazpen diferentziala lerro erresistente eta sentikor adierazgarrietan egin da.Antraknosiaren erresistentzia gene-ontologia terminoen gehiegizko adierazpenarekin lotu zen "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" eta "GO:0015979 Photosynthesis".Horrez gain, Lanr1(83A:476) lerroak transkriptomearen birprogramazio garrantzitsua erakutsi zuen inokulatu ondoren, beste lerroek erantzun horren atzerapena 42 ordu ingurukoa izan zuten bitartean.Defentsa-erantzunak TIR-NBS, CC-NBS-LRR eta NBS-LRR geneekin, patogenian parte hartzen duten 10 proteinekin, lipidoen transferentzia-proteinekin, endoglukan-1,3-β-glukosidasa, glizinan aberatsak diren zelula horma-proteinekin eta oxigenoaren bide erreaktiboko geneekin lotzen dira.83A:476-ren lehen erantzunak, fotosintesiarekin lotutako geneen kenketa zaindua barne, onddoen biologiaren hazkuntza begetatiboko fasean babes arrakastatsuarekin bat egin zuten, efektore batek immunitatea abiarazten duela iradokiz.Mandeloop erreakzioa moteldu egiten da, arrastatze horizontal orokorra baita.
Hosto estuko lupina (NLL, Lupinus angustifolius L.) Mediterraneo mendebaldeko eskualdean jatorria den proteina handiko zereala da1,2.Gaur egun animalientzako eta gizakientzako elikagai-labore gisa hazten da.Era berean, simaurra berdetzat hartzen da laboreen txandaketa sistemetan, nitrogenoa finkatzeko bakterio sinbiotikoek nitrogenoa finkatzeko eta lurzoruaren egitura orokorraren hobekuntzagatik.NLLk etxekotze prozesu azkar bat jasan du azken mendean eta oraindik ugalketa-presio handian dago3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.NLLren laborantza hedatu zenarekin, onddo patogenoen segidak nekazaritza-hobi berriak garatu zituen eta laboreak suntsitzen zituzten gaixotasun berriak eragin zituen. Lupino nekazari eta hazleentzat aipagarriena antraknosiaren agerpena izan zen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn onddo patogenoak eragindakoa13. Lupino nekazari eta hazleentzat aipagarriena antraknosiaren agerpena izan zen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn onddo patogenoak eragindakoa13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза антракнозав, паибонеров люпина ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupino nekazari eta hazleentzat aipagarriena Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn onddo patogenoak eragindako antraknosiaren agerpena izan zen13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由眗真出的是炭目的是炭目现，它是现，它是由眗腏出现，它是由真Humn iler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现它是由眵hum 赱眵hum 豆的是炭目的是炭疽现，它是现d。1 Наиболее поразительным для фермеров eta селекционеров люпина является появление антракного антракнозого неров грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupino nekazari eta hazleentzat deigarriena Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn onddo patogenoak eragindako antraknosiaren agerpena da13.Gaixotasunaren berrienak Brasil eta Estatu Batuetatik etorri ziren, 1912an eta 1929an, hurrenez hurren, sintoma tipikoak agertu zirelarik.Hala ere, 30 urte inguru igaro ondoren, patogenoa Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz izenez izendatu zuten. & Sacc., teleomorfoa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfoa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld-en teleomorfoa. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld Targeted Morphology in. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.eta H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。eta H. Schlenk, .mendearen erdialdean egindako gaixotasunaren aurretiazko fenotipizazioak NLL eta lupino horiaren (L. luteus L.) atxikipenetan nolabaiteko erresistentzia erakutsi zuen, baina probatutako lupino zuriaren (L. albus L.) atzerritasun guztiak oso sentibera izan ziren15,16.Ikerketek frogatu dute antraknosiaren garapena prezipitazio (airearen hezetasuna) eta tenperatura (12-28 °C arteko tartean) areagotzearekin lotuta dagoela, tenperatura altuagoetan erresistentzia urratzea eraginez17, 18. Izan ere, konidioak ernetzeko eta gaixotasuna hasteko behar den denbora lau aldiz laburragoa zen 24 °C (12 ordu) 12 °C hezetasunarekin (12 ordu) 1 (12 ordu) hezetasunarekin baino.Horrela, etengabeko berotze globalak antraknosia hedatzea ekarri du.Hala ere, gaixotasuna Frantzian (1982) eta Ukrainan (1983) ikusi zen mehatxu baten iragarle gisa, baina itxuraz garai hartan lupinoaren industriak ez zuen aintzat hartu20,21.Urte batzuk geroago, gaixotasun suntsitzaile hau mundu osora zabaldu zen eta lupinoa ekoizten duten herrialde nagusiei ere eragin zien, hala nola Australia, Polonia eta Alemania22,23,24.1990eko hamarkadaren erdialdean antraknosi-agerraldi baten ondoren, baheketa zabalak NLL19 laginetan hainbat emaile erresistente identifikatu zituen.Antraknosiarekiko NLLren erresistentzia germoplasma iturri desberdinetan aurkitzen diren bi alelo nagusi bereiziek kontrolatzen dute: Lanr1 Tanjil eta Wonga eta AnMan cultivarean.Mandalay 25, 26. Alelo hauek hazkuntza-programetan germoplasma erresistentearen hautaketa onartzen duten markatzaile molekularrak osatzen dituzte25,26,27,28,29,30.Lanr1 aleloa daraman 83A:476 ugalketa-lerro erresistentea P27255 basa-lerro sentikorrarekin gurutzatu zen antraknosiarekiko erresistentziarako bereizten den RIL populazio bat lortzeko, eta horri esker, Lanr1 locus-a NLL-1131, 32, 33 kromosomari esleitzea ahalbidetu zuen. kromosoma berean hiru aleloen kokapena (NLL-11), baina posizio ezberdinetan29,34,35.Hala ere, RIL kopuru txikia eta markatzaileen eta dagozkien aleloen arteko distantzia genetiko handia dela eta, ezin da haien azpiko geneei buruzko ondorio fidagarririk atera.Bestalde, lupinetan alderantzizko genetika erabiltzea zaila da, oso birsorkuntza ahalmen txikia dutelako, eta horrek manipulazio genetikoa astuna egiten du37.
Egoera homozigotikoan nahi den aleloa daraman etxeko germoplasma garatzeak, hala nola 83A:476 (Lanr1) eta Mandelup (AnMan), antraknosiarekiko erresistentzia aztertzeko ateak ireki ditu populazio basatietan aleloen konbinazio kontrajarriak egotearen aurrean.Mekanismo molekularren aukerak.Konparatu genotipo zehatzek sortutako defentsa-erantzunak.Azterketa honek NLLk C. lupini txertaketari emandako transkriptomearen erantzun goiztiarra ebaluatu du.Lehenik eta behin, 215 lerro zituen Europako NLL germoplasma panel bat aztertu zen Lanr1 eta AnMan aleloak markatzen dituzten markatzaile molekularrak erabiliz.Ondoren, antraknosiaren fenotipizazioa egin zen 50 NLL lerrotan, aurretik markatzaile molekularretarako hautatuak, baldintza kontrolatuetan.Esperimentu hauetan oinarrituta, antraknosiaren erresistentzian eta Lanr1/AnMan konposizio alelikoan desberdinak diren lau lerro aukeratu ziren defentsa geneen adierazpen diferentziala profilatzeko bi ikuspegi osagarri erabiliz: RNAren errendimendu handiko sekuentziazioa eta denbora errealeko PCR kuantifikazioa.
Lanr1 (Anseq3 eta Anseq4) eta AnMan (Anseq4) eta AnMan (AnManM1) markatzaileak dituen NLL germoplasma (N = 215) multzo baten baheketak erakutsi zuen lerro bakarrak (95726, Salamanca-b ondoan) "erresistentzia" aleloa handitzen duela markatzaile guztientzat, "aleleko marka guztien presentzia" (185 marka guztien presentzia) dagoen bitartean. %,5 lerroak.Hamahiru lerrok Lanr1 markatzailearen bi alelo "erresistenteak" sortu zituzten, eta 8 lerrok Lanr1 alelo "erresistenteak".markatzailea.AnMan markatzailearen "erresistentzia" aleloa (S1 taula osagarria).Bi lerro heterozigotoak ziren Anseq3 markatzailearentzat eta heterozigoto bat AnManM1 markatzailearentzat.42 lerrok (% 19,5) Anseq3 eta Anseq4 aleloen kontrako faseak zituzten, bi loci horien arteko birkonbinazio maiztasun handia adieraziz.Antraknosiaren fenotipoek baldintza kontrolatuetan (S2 taula osagarria) frogatutako genotipoen erresistentziaren aldakortasuna agerian utzi zuten, antraknosiaren larritasunean islatu zena.Batez besteko puntuazioen desberdintasunak 1,8 (ertainki erresistentea) 6,9 (susceptiblea) eta landareen pisuaren aldeak 0,62 (sentsegarria) eta 4,45 g (erresistentea) bitartekoak izan dira. Esperimentuaren bi errepliketan ikusitako balioen arteko korrelazio esanguratsua egon zen (0,51 gaixotasunaren larritasunaren puntuazioetarako, P = 0,00017 eta 0,61 landarearen pisurako, P <0,0001), baita bi parametro horien artean ere (−0,59 eta -0,77, P <0,0001). Esperimentuaren bi errepliketan ikusitako balioen arteko korrelazio esanguratsua egon zen (0,51 gaixotasunaren larritasun puntuazioetarako, P = 0,00017 eta 0,61 landarearen pisurako, P <0,0001), baita bi parametro horien artean ere (−0,59 eta -0,77, P <0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями в тяжести болезни, P = 0,00017 eta 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими даву, 7ми даву, 7ми пару, 7ми Р < 0,0001) 0,0001). Korrelazio esanguratsua aurkitu zen esperimentuaren bi errepikapenetan ikusitako balioen artean (0,51 gaixotasunaren larritasunaren puntuazioetarako, P = 0,00017 eta 0,61 landarearen pisurako, P <0,0001), baita bi parametro horien artean ere (-0,59 eta -0,77, P <0,00001) ).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分度评分度评分木显着相关性（疾病严重程度评分1︺00.物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77） P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸 度 在1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（（（２及 两 个 参数 之间 （（（（（（（２59.和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потцторя (значениями) аболевания 0,51, P = 0,00017 eta масса растения 0,61, P <0,0001), eta между этими двумя параметрами параметрами параметрами (-0,00,509) . Bikoiztuta ikusitako balioen arteko korrelazio esanguratsua zegoen (gaixotasunaren larritasunaren puntuazioa 0,51, P = 0,00017 eta landarearen pisua 0,61, P <0,0001) eta bi parametro horien artean (-0,59 eta -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Landare jasangarrietan ikusten diren sintoma tipikoen artean zurtoinaren kinka eta bihurritzea "artzain-arkuaren" egituraren antzekoa da, eta ondoren esporozoito laranja/arrosa duten lesio obalatuak daude (1. irudi osagarria).Lanr1 (83A:476 eta Tanjil) eta AnMan (Mandelup) geneak dituzten Australiako atxikipenak neurrizko erresistenteak dira, 0,0331 eta 0,0036.Lanr1 eta/edo AnMan alelo "erresistenteak" ere daramaten lerro batzuek gaixotasunaren sintomak erakusten dituzte.
Interesgarria da, alelo markatzaile "erresistentea"rik ez duten NLL lerro batzuek antraknosiaren erresistentzia maila altua agerian utzi zuten (Lanr1 edo AnMan genotipoentzat baino konparagarria edo handiagoa), hala nola Boregine (P balioa < 0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P balioa < 0,0001 puntuazioa eta 0,0001 landarearen pisua) eta Populazioa < 0,0001. 001 puntuaziorako eta pisurako ez-esanguratsua). Interesgarria da, alelo markatzaile "erresistentea"rik ez duten NLL lerro batzuek antraknosiaren erresistentzia maila altua agerian utzi zuten (Lanr1 edo AnMan genotipoentzat baino konparagarria edo handiagoa), hala nola Boregine (P balioa < 0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P balioa < 0,0001 puntuazioa eta 0,0001 landarearen pisua) eta Populazioa < 0,0001. 001 puntuaziorako eta pisurako ez-esanguratsua). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокави аллокави аллоного, лишенных какого-либо ь устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таки0 Boregine, таки0 Boregine 1 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для оценки и 0,001 для массы растения) eta по-549ние (P-549ние) ,0001 для оценки и незначимо для массы). Interesgarria da, alelo markatzaile "erresistentea"rik ez duten NLL lerro batzuek antraknosiarekiko erresistentzia maila altua erakutsi zuten (Lanr1 edo AnMan genotipoen parekoa edo handiagoa), hala nola Boregine (P balioa < 0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P balioa < 0,0001 ebaluaziorako eta B-5 P/901 populazioaren balioa eta B-50. 0001 ebaluaziorako eta ez esanguratsua pisurako).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭水平的炭疽AnLan 有趣的是基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<律如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分万0.，分万0.0.0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Interesgarria da markatzaile “antigenikorik” ez duten NLL sistema batzuek erresistentzia horizontal handia erakusten dutela (Lanr1 edo AnMan geneen baliokidea edo handiagoa), hala nola Boregine (bi parametroak P < 0,0001), Bojar (P balioa < 0,0001, landarearen pisua 0,001) eta B-549/0 tentsioaren pisua <, 70b ez. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», спокосува стойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (зна чивости) 0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) eta популяция B-549/79b (оценка P-значение 0,00001 <, масса 0,0001) a). Interesgarria da, "erresistentzia" markatzaileen alelorik ez duten NLL lerro batzuek antraknosiaren erresistentzia maila altua erakutsi zuten (Lanr1 edo AnMan genotipoekin alderatuta edo handiagoak), hala nola Boregine (P balioa <0,0001 bi parametroetarako), Bojar (P-balioa <0,0001, landarearen pisua 0.0001, landarearen pisua 0.70-549) eta populazioa (P-balioa <0.0001). 01, pisua ez da esanguratsua).Fenomeno honek erresistentzia-iturri genetiko berri baten aukera iradokitzen du, markatzaileen genotipoen eta gaixotasunen fenotipoen arteko korrelazio falta ikusita (P balioak ~0,42tik ~0,98ra).Horrela, Kolmogorov-Smirnov probak erakutsi zuen antraknosiaren erresistentziari buruzko datuak normalean banatzen zirela puntuazioetarako (0,25 eta 0,11 P-balioak) eta landare-masa (0,47 eta 0,55 P-balioak), Lanr1 eta AnMan baino alelo gehiago parte hartzen dutela iradokitzen dudala.
Antraknosiarekiko erresistentziaren baheketaren emaitzen arabera, 4 lerro hautatu ziren transkriptomaren analisirako: 83A:476, Boregine, Mandelup eta Population 22660. Lerro hauek antraxarekiko erresistentziari buruz berriro probatu ziren RNA sekuentziazioaren bidez inokulazio esperimentuetan, betiere aurreko probako berdinak zirela.Puntuazio-balioak honako hauek izan ziren: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) eta 22660 biztanle (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 protokoloak lagin bakoitzeko 40,5 Mread bikote lortu ditu batez beste (29,7 eta 54,4 Mreads) (S3 Taula Osagarria).Erreferentzia-sekuentzian lerrokatze puntuazioak %75,5etik %88,6ra bitartekoak izan dira.Erreplika biologikoen arteko aldaera esperimentalen arteko irakurketa zenbaketaren datuen batez besteko korrelazioa 0,812 eta 0,997 bitartekoa izan zen (batez bestekoa 0,959). Aztertutako 35.170 genetatik, 2917k ez zuten adierazpenik agertu, eta beste 4785 geneak maila ahulean adierazi ziren (oinarrizko batez bestekoa < 5). Aztertutako 35.170 genetatik, 2917k ez zuten adierazpenik agertu, eta beste 4785 geneak maila ahulean adierazi ziren (oinarrizko batez bestekoa < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов геслсинов песлсиных начительном уровне (базовое среднее <5). Aztertutako 35.170 genetatik, 2917k ez zuten adierazpenik erakutsi, eta gainontzeko 4785 geneak maila arbuiagarrian adierazi ziren (oinarrizko batez bestekoa <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忨达可以応表达值< 5).35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелсунч имельные прессию (базовое среднее значение <5). Aztertutako 35.170 genetatik, 2917 ez ziren adierazi eta gainerako 4785 geneek adierazpen arbuiagarria izan zuten (oinarrizko batez bestekoa <5).Horrela, adierazitako gene kopurua (oinarrizko batez bestekoa ≥ 5) esperimentuan zehar 27.468 (% 78,1) izan zen (S4 Taula Osagarria).
Lehen unetik, NLL lerro guztiek C. lupini (Col-08 anduia) inokulazioari erantzun zioten transkriptoma birprogramatuz (1. taula), hala ere, lerroen artean desberdintasun handiak ikusi ziren.Horrela, 83A:476 erresistentzia-lerroak (Lanr1 genea daramana) transkriptomaren birprogramazio esanguratsua erakutsi zuen lehen denbora-puntuan (6 hpi) 31-69 aldiz igo zen isolatutako gora-behera-gene-kopurua, une honetan beste denbora-puntu batzuekin alderatuta.Gainera, gailur honek iraupen laburra izan zuen, gene gutxi batzuen adierazpena nabarmen aldatuta geratu baitzen bigarren denbora-puntuan (12 hpi).Interesgarria da Boreginek, injertoaren proban ere erresistentzia maila handia erakutsi zuenak, ez zuen halako transkripzio birprogramazio masiborik jasan esperimentuan zehar.Hala ere, desberdintasunez adierazitako geneen kopurua (DEG) berdina zen Boreginen eta 83A: 476 12 HPI-tan.Bai Mandelupek bai 22660 biztanleek DEG gailurrak erakutsi zituzten azken denboran (48 l/s), defentsako erantzunen atzerapen erlatiboa adieraziz.
83A: 476 transkriptomaren birprogramazio masiboa jasan zuenez C. lupini-ri erantzunez 6 HPI-tan beste lerro guztiekin alderatuta, une honetan ikusitako DEGen % 91 leinuaren espezifikoak ziren (1. irudia).Hala ere, azterketa-lerroen arteko lehen erantzunetan gainjartze batzuk egon ziren, izan ere, % 68,5, % 50,9 eta % 52,6 DEG Boreginen, Mandelup-en eta 22660 populazioan, hurrenez hurren, 83A: 476-n aurkitutakoekin gainjarri ziren denbora jakin batzuetan.Hala ere, DEG hauek 83A:476 erabiliz gaur egun detektatzen diren DEG guztien zati txiki bat (% 0,97-1,70) baino ez zuten hartzen.Horrez gain, lerro guztietako 11 DEG koherenteak ziren momentu honetan (S4-S6 taula osagarriak), landareen defentsako erantzunen osagai arruntak barne: lipidoen transferentziako proteina (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukosido entzima (TanjilG_23384), estres-induzigarriak diren bi proteina (TanjilG_231Tanjil22G_1J31J31) 531), oinarrizko latex proteina (TanjilG_32352) eta glizinan aberatsak diren egitura zelula-hormako bi proteina (TanjilG_19701 eta TanjilG_19702).Transcriptomaren erantzunetan ere gainjartze nahiko altua zegoen 83A: 476 eta Boregine 24 HPI-n (guztira % 16-38 DEG) eta Mandelup eta Population 22660 artean 48 HPI-n (guztira % 14-20 DEG).
Venn diagrama, Colletotrichum lupini (Polonia, Wierzheniceko lupin-soroetatik lortutako Col-08 anduia) inokulatutako hosto estuko lupinen (NLL) lerroetan espresatutako gene kopurua (DEG) kopurua erakusten duena.Aztertutako NLL lerroak hauek izan dira: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 aleloa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (ertain erresistentea, AnMan aleloa daramana) eta 22660 populazioa (oso sentikorra).Hpi laburdura txertoa hartu eta ordu batzuk adierazten du.Zero balioak kendu dira grafikoa sinplifikatzeko.
6 hpi-ko gainespresatutako geneen multzoa R gene domeinu kanonikoen presentzia aztertu zen (S7 taula osagarria).Azterketa honek gaixotasun klasikoen erresistentzia geneen transkriptomaren indukzioa agerian utzi zuen NBS-LRR domeinuekin 83A: 476an soilik.Multzo hau TIR-NBS-LRR gene batek (tanjilg_05042), bost CC-NBS-LRR geneek (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 eta tanjilg_16162), eta Lau NBS-LR 16162), eta Lau LR61 NBS-LR BS-16162) osatzen zuten. jilg_16162) baita Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) eta Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Gene hauek guztiek domeinu kanonikoak dituzte sekuentzia kontserbatuetan antolatuta.NBS-LRR domeinuko geneez gain, RLL kinasa hainbat aktibatu ziren 6 hpi-tan, hau da, bat Boreginen (TanjilG_19877), bi Mandelup-en (TanjilG_07141 eta TanjilG_19877) eta 22660 populazioan (TanjilG_0314 eta TanjilG_0903_1981) 476.
C. lupini (Col-08 anduia) inokulazioari erantzunez adierazpen nabarmen aldatua zuten geneak Gene Ontology (GO) aberasteko analisia egin zuten (S8 Taula osagarria). Gehien ordezkatzen den prozesu biologikoaren terminoa "GO:0006952 defentsa-erantzuna" izan zen, esangura handiko 16 (denbora × lerroa) konbinazioetatik 6tan agertu zen (P balioa < 0.001) (2. irudia). Gehien ordezkatzen den prozesu biologikoaren terminoa "GO:0006952 defentsa-erantzuna" izan zen, esangura handiko 16 (denbora × lerroa) konbinazioetatik 6tan agertu zen (P balioa < 0.001) (2. irudia). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рисокой значимостью). Gehien ordezkatzen den prozesu biologikoaren terminoa "GO:0006952 defentsa-erantzuna" izan zen, esangura handiko 16 (denbora × leinu) konbinazioetan (P balioa < 0,001) konbinazioetan agertu zena (2. irudia).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（縿魗（时魗（旿反应”个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Prozesu biologikoaren termino adierazgarriena "GO:0006952 defentsa-erantzuna" da, 16 (时间×线) konbinazioetatik 6tan agertzen dena, esangura handiko (P balioa < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Erantzuna», 0006952 Erantzuna в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (er. 2). Gehien ordezkatzen den prozesu biologikoaren terminoa 'GO:0006952 Defense Response' izan zen, 16 konbinaziotik 6tan (denbora × lerroa) esangura handiko (P balioa < 0,001) agertu zena (2. irudia).Termino hau 83Ako bi denbora-puntutan ordezkatuta zegoen: 476 eta Boregine (6 eta 24 hpi) eta denbora-puntu batean Mandelup eta Population 22660 (12 eta 6 hpi, hurrenez hurren).Espero den emaitza da, lerro erresistenteen aurkako onddoen erantzuna nabarmenduz.Gainera, 83A:476-k C. lupini-ri erantzun zion "GO:0055114 redox-prozesua" terminoak adierazten duen eztanda oxidatiboarekin lotutako geneak azkar eraginez, defentsa-erantzun zehatz bat adieraziz, eta Boreginek defentsa-erantzun zehatzak agerian utzi zituen, "GO" terminoarekin lotutakoak.:0006950 Estresaren erantzuna”.22660 populazioak bigarren mailako metabolitoen erresistentzia erantzun horizontala aktibatu zuen, "GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis" eta "GO:0006722 Process of triterpene metabolismo" termino kopurua nabarmenduz (bi terminoak gene-multzo berekoak dira), GO: 0016104 Process of triterpene biosynthesis (bi terminoak gene-multzo berekoak dira), Populazio-erreakzioaren analisiaren eta egonkortasunaren aberastasunaren emaitzak kontuan hartuta. 22660. Horrez gain, erreakzio goiztiarra 83A:476 (6 hpi) eta erreakzio atzeratua Mandelup eta Population 22660 GO:0015979 'fotosintesia' terminoa eta erlazionatutako beste prozesu biologiko batzuk barne hartzen ditu.
Antrax lupinarekin (1999an Poloniako Wierzheniceko lupin-eremuetatik lortutako Col-08 anduia) oso gehiegizkoak dira hosto estuko lupinaren (NLL) transkriptoma-erantzunetan modu ezberdinean adierazitako geneen anotazioan aukeratutako bioprozesuen gene ontologia terminoak.Aztertutako NLL lerroak hauek izan dira: 83A:476 (erresistenteak, Lanr1 alelo homozigotoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetiko ezezaguna), Mandelup (neurri erresistentea, AnMan alelo homozigotikoa daramana) eta 22660 populazioa (susceptiblea).
Azterketa honek antraknosiaren erresistentzian laguntzen duten geneak identifikatzea helburu duenez, GO "GO: 0006952 Defensive responses" eta "GO: 0055114 Redox prozesuak" terminoei esleitutako geneak ebakidurarekin aztertu dira, oinarrizko batez besteko batez besteko ≥ 30, gutxienez lerro batekin.× denbora-puntu log2-ren balio estatistiko esanguratsuak konbinatuz (fold aldaketa).Irizpide hauek betetzen zituzten gene kopurua 65 izan zen GO:0006952 eta 524 GO:0055114.
83A:476-k GO:0006952 terminoarekin ohartarazitako bi DEG gailur agerian utzi zituen, lehenengoa 6 gene hazbeteko (64 gene, gora eta behera erregulazioa) eta bigarrena 24 gene hazbeteko (15 gene, gorako erregulazioa soilik).Boreginek ere erakutsi zuen GO: 0006952 gailurra izan zela denbora-puntu berean, baina DEG (11 eta 8) eta lehentasunezko aktibazio gutxiagorekin.Mandeloop-ek GO:0006952 12 eta 48 HPI-ko bi gailur erakutsi zituen, biak 12 gene zeramatzaten (lehena gene aktibatzaileak, eta bigarrena gene zapaltzaileak soilik), 6 HPI-ko 22660 populazioak (13 gene) igoera-gailurraren nagusitasun handiagoa izan zuen bitartean.erregulazioa.Kontuan izan behar da gailur hauetan GO:0006952 DEG-en % 96,4k erantzun mota bera izan zuela (gora edo behera), defentsa-erantzunen gainjartze nabarmena adieraziz inplikatutako gene kopuruan desberdintasunak izan arren.GO:0006952 terminoarekin erlazionatutako sekuentzien talderik handienak Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like) kodetzen du, 10. klaseko patogenesiarekin lotutako proteina (PR-10) proteina kladeari eta core proteina latexari dagokiona.antzeko (MLP antzeko proteina) proteina (3. irudia).Bi taldeek adierazpen izaeran eta erantzunaren norabidean desberdinak ziren.SAM22 antzeko proteinak kodetzen dituzten geneek indukzio koherentea eta esanguratsua erakutsi zuten hasierako uneetan (6 edo 12 hpi) eta, oro har, ez zuten erantzuten esperimentuaren amaieran (48 hpi), MLP antzeko proteinek 6 hpi-tan koordinazioa erakusten zuten bitartean.hpi.83A: 476 eta Mandelup-ek 48 hp/in-n, ia gainerako datu-puntu guztiek ez zuten erantzuten.Horrez gain, SAM22 antzeko proteina-geneen espresio-profilen desberdintasunak antraknosiaren erresistentzian ikusitako aldakortasuna jarraitu zuten, lerro erresistenteek denbora-puntu gehiago baitzituzten gene horiek modu nabarmenean induzitzen zituzten gene sentikorragoak baino.LlR18A/B antzeko PR-10 gene batek SAM22 antzeko proteinaren genearen oso antzeko adierazpen-eredua erakutsi zuen.
Prozesu biologikoaren "GO:0006952 Defense Response" terminoaren osagai nagusiak eta Lanr1 eta AnMan aleloen gene hautagaien adierazpen-ereduak identifikatu ziren.Log2 eskalak inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, lupino-soroetatik lortutakoa, Wizhenica, Polonia, 1999) eta kontroleko (itxuraz inokulatutako) landareen arteko log2 balioak adierazten ditu.Hosto estuko lupino-lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotikoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurri erresistentea, AnMan alelo homozigotoa daramana) eta 22660 populazioa (susceptiblea).
Horrez gain, Lanr1 (TanjilG_05042) eta AnMan (TanjilG_12861) RNA-seq gene hautagaien adierazpen-profilak ebaluatu ziren (3. irudia).TanjilG_05042 geneak erantzun esanguratsua (aktibazioa) erakutsi zuen 83A: 476-n lehen momentuan (6 hpi), eta TanjilG_12861 Mandeloop-en esanguratsua izan zen bi denbora-puntutan soilik: 6 hpi (erregulazioa beherantz) eta 24 hpi (6 hpi).Horrekin.).erregulagarria)).
GO:0055114 "redox-prozesua" terminoan gehiegi adierazitako geneak zitokromo P450 proteinak eta peroxidasa kodetzen zituzten geneak ziren (4. irudia).83A:476tik 6 HPI-tan isolatutako laginetarako, log2 (toleta-aldaketa) gehienezko edo gutxieneko balioak (geneen % 86,6rako) normalean inokulatutako eta kontroleko landareen artean ikusi ziren, genotipo honek sexu inokulazioarekiko duen erantzun handia nabarmenduz.83A:476-k GO esanguratsuena erakutsi zuen: 0055114 DEG 6 hpi-tan (503 gene), gainerako lerroek 48 hpi-n (Boregine, 31 gene; Mandelup, 85 gene; eta Population 22660, 78 gene)).GO:0055114 familiako gene gehienetan, txertoaren aurrean bi erantzun mota ikusi ziren (aktibazioa eta inhibizioa).Interesgarria da GO: 0055114 terminorako identifikatutako DEG-en % 97,6raino Mandelupe-n 48 hp-an. Behaketa hauek iradokitzen dute, eskala nabarmen txikiagoa izan arren (hau da, mutatutako redox geneen kopurua, 85 versus 503), transkriptoma-erantzun atzeratuaren eredua mandeno-ren erantzun goiztiarraren antzekoa dela.Boreginen eta Population 22660n, konbergentzia hori txikiagoa da %51,6 eta %75,6, hurrenez hurren.
"GO:0055114 Redox prozesua" prozesu biologikoaren terminoaren osagai nagusien adierazpen-ereduak agerian utzi ziren.Log2 eskalak inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, lupino-soroetatik lortutakoa, Wizhenica, Polonia, 1999) eta kontroleko (itxuraz inokulatutako) landareen arteko log2 balioak adierazten ditu.Hosto estuko lupino-lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotikoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurri erresistentea, AnMan alelo homozigotoa daramana) eta 22660 populazioa (susceptiblea).
83A:476 C. lupini (Col-08 anduia) inokulazioari emandako erantzun transkriptomikoek GO:0015979 "fotosintesia" terminoari eta erlazionatutako beste prozesu biologiko batzuei egotzitako geneen isiltasun koordinatua ere barne hartzen zuten (5. IRUDIA).GO:0015979 DEG multzo honek 83A:476an 6 hpi-tan nabarmen erreprimitutako 105 gene zituen.Azpimultzo honetan, 37 gene ere jaitsi ziren Mandelup-en 48 HPI-n eta 35 aldi berean 22660 populazioan, bi genotipoetarako komunak diren 19 DEG barne.GO: 0015979 terminoarekin erlazionatutako DEGrik ez zen nabarmen aktibatu edozein konbinaziotan (lerroa x denbora).
"GO:0015979 Fotosintesia" prozesu biologikoaren terminoaren osagai nagusien adierazpen-ereduak agerian utzi ziren.Log2 eskalak inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, lupino-soroetatik lortutakoa, Wizhenica, Polonia, 1999) eta kontroleko (itxuraz inokulatutako) landareen arteko log2 balioak adierazten ditu.Hosto estuko lupino-lerro hauek aztertu ziren: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotikoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna), Mandelup (neurri erresistentea, AnMan alelo homozigotoa daramana) eta 22660 populazioa (susceptiblea).
Adierazpen diferentzialaren analisiaren emaitzetan oinarrituta eta ustez onddo patogenoen aurkako defentsa-erantzunetan parte hartu zuen, zazpi gene-multzo hau denbora errealeko PCR bidez espresio-profilak kuantifikatzeko aukeratu zen (S9 taula osagarria).
TanjilG_10657 ustezko proteina-genea nabarmen eragin zen aztertutako lerro eta denbora-puntu guztietan kontrol (mimika) landareekin alderatuta (S10, S11 taula osagarriak).Horrez gain, TanjilG_10657-ren adierazpen-profilak gero eta joera handiagoa erakutsi zuen esperimentuan zehar lerro guztietan.22660 populazioak TanjilG_10657ren sentsibilitate handiena erakutsi zuen 114 aldiz aktibazioarekin eta adierazpen maila erlatibo altuena (4,4 ± 0,4) 24 HPIrekin (6a. irudia).TanjilG_27015 PR10 LlR18A proteinaren geneak ere lerro eta denbora-puntu guztietan aktibazioa erakutsi zuen, datu-puntu gehienetan esanahi estatistikoarekin (6b. irudia).TanjilG_10657-ren antzera, TanjilG_27015-en adierazpen maila erlatibo altuena 22660 inokulatutako populazioan ikusi zen 24 HPI-n (19,5 ± 2,4).TanjilG_04706 azido endokitinasa genea nabarmen goratu zen lerro guztietan eta denbora-puntu guztietan, Boregine 6 hpi-n izan ezik (6c. irudia).Lehen denbora-puntuan (6 HPI) biziki induzitu zen 83A: 476 (10,5 aldiz) eta neurriz handitu zen beste lerro batzuetan (6,6-7,5 aldiz).Esperimentuan, TanjilG_04706-en adierazpena antzeko mailan mantendu zen 83A:476 eta Boreginen, Mandelup eta Population 22660-n, berriz, nabarmen handitu zen, balio nahiko altuetara iritsiz (5,9 ± 1,5 eta 6,2 ± 1,5, hurrenez hurren).TanjilG_23384 endoglukan-1,3-β-glukosidasa-itxurako geneak aktibazio handia erakutsi zuen lehen bi denbora-puntuetan (6 eta 12 hpi) lerro guztietan 22660 populazioa izan ezik (6d. irudia).TanjilG_23384-ren adierazpen-maila erlatibo altuenak Mandelup-en (2,7 ± 0,3) eta 83A: 476 (1,5 ± 0,1) bigarren denbora puntuan (12 hpi) ikusi dira.24 HPI-n, TanjilG_23384 adierazpena nahiko baxua zen aztertutako lerro guztietan (0,04 ± 0,009tik 0,44 ± 0,12ra).
Hautatutako geneen (ag) adierazpen-profilak PCR kuantitatiboen bidez agerian utzita.6, 12 eta 24 zenbakiek txertoaren ondorengo orduak adierazten dituzte.LanDExH7 eta LanTUB6 geneak normalizaziorako erabili ziren eta LanTUB6 serieen arteko kalibraziorako.Errore-barrak hiru erreplika biologikotan oinarritutako desbideratze estandarra adierazten dute, eta horietako bakoitza hiru erreplika teknikoren batez bestekoa da. Inokulatutako landareen (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, 1999an Wierzenicako lupino eremutik lortutakoa, Polonia) eta kontroleko (faltsuak inokulatutako) landareen arteko desberdintasunen esanahi estatistikoa datu-puntuen gainetik (*P balioa < 0,05, **P balioa ≤ 0,0 P balioa ≤ 0.0 *** 0.00). Inokulatutako landareen (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, 1999an Wierzenicako lupino eremutik lortutakoa, Polonia) eta kontroleko (faltsuak inokulatutako) landareen arteko desberdintasunen esanahi estatistikoa datu-puntuen gainetik (*P balioa < 0,05, **P balioa ≤ 0,0 P balioa ≤ 0.0 *** 0.00). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, мунш прессии 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) eta контрольными (ложно инокулирован ными) расчд мными тач мными и данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Estatistikoki esanguratsuak diren espresio-mailetan inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, 1999an Wierzheniceko lupino-zelai batetik lortutakoa) eta kontroleko (itxuraz inokulatutako) landareen artean adierazten dira datu puntuen gainetik (*P balioa < 0,05, **P-balioa ≤ 0.01, ≤ P-0.0.0.接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟照（模拟掉模拟掉接波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 〼001)接种 (colletotrichum lupini), color-08 株 ， 1999平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, п-лированными, пш08тан олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированы нымито расд ными тон расимы ными) ми данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, Verzheniceko (Polonia, 1999) lupino-soroetatik lortutako) eta kontroleko (itxuraz inokulatutako) landareen arteko espresio-mailen desberdintasun esanguratsuak datu-puntuen gainetik nabarmentzen dira (*P balioa < 0,05, **P-balioa ≤ 0-01, ***0-01e, ***0-01e).Aztertutako NLL lerroak honako hauek izan dira: 83A:476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotikoa daramana), Mandelup (ertain erresistentea, AnMan alelo homozigotikoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna) eta 22660 populazioa (susceptiblea).
Lanr1 locus-eko TanjilG_05042 gene hautagaiak RNA-seq ikerketetatik lortutako profiletatik espresio-eredu nabarmen desberdina erakutsi zuen (6e. irudia).Gene honen aktibazio esanguratsua ikusi zen Mandelup-en eta 22660 populazioan (39,7 eta 11,7 aldiz, hurrenez hurren), eta ondorioz, adierazpen maila nahiko altuak izan dira (1,4 ± 0,14 eta 7,2 ± 1,3 arte, hurrenez hurren).83A: 476-k TanjilG_05042 genearen gorako erregulazioa ere agerian utzi zuen (3,8 bider arte), hala ere, lortutako adierazpen maila erlatiboak (0,044 ± 0,002) Mandelup-en eta 22660 populazioan ikusitakoak baino 30 aldiz txikiagoak izan ziren.qPCR-k aztertutako genotipoen arteko espresio-mailetan desberdintasun esanguratsuak agertu ziren mock-txertatutako (kontroleko) aldaeretan, 22660 eta 83A: 476 populazioen artean 58 bider aldea lortuz, baita 22660 eta 22660 populazioen artean ere. Bi aldiz diferentzia lortu zen Boregine eta Mandalupen artean.
AnMan locuseko gene hautagaia, TanjilG_12861, txertoari erantzunez aktibatu zen 83A: 476 eta Mandelup-en, 22660 populazioan neutroa zen eta Boreginen beherago araututa zegoen (6f. irudia).TanjilG_12861 genearen adierazpen erlatiboa 83A inokulatuan izan zen altuena: 476 (0,14±0,01).TanjilG_05080 HSP17.4 17,4 kDa klaseko I. bero-shock proteinaren geneak espresio-maila erlatibo baxuagoak erakutsi zituen aztertutako andui eta denbora-puntu guztietan (6g. irudia).Baliorik altuena 24 HPI-n ikusi zen 22660 biztanleetan (0,14 ± 0,02, txertoari erantzunez zortzi aldiz gehiago).
Gene-adierazpen-profilen konparaketak (7. irudia) TanjilG_10657 eta beste lau geneen arteko korrelazio handia agerian utzi zuen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80.) eta = 470,60.Emaitza horiek gene horien koerregulazioa adieraz dezakete defentsa-erantzunetan.TanjilG_12861 eta TanjilG_23384 geneek adierazpen profil desberdinak erakutsi zituzten Pearsonen korrelazio koefiziente baxuagoekin (0,08tik 0,43ra eta -0,19tik 0,28ra, hurrenez hurren) beste geneekin alderatuta.
Gene-adierazpen-profilen arteko korrelazioak PCR kuantitatiboa erabiliz detektatu ziren.Hosto estuko lupino lerro hauek aztertu ziren: 83A: 476 (erresistentea, Lanr1 alelo homozigotikoa daramana), Mandelup (neurri erresistentea, AnMan alelo homozigotikoa daramana), Boregine (erresistentea, jatorri genetikoa ezezaguna) eta 22660 populazioa (susceptiblea).Hiru denbora-puntu kalkulatu ziren (inokulatu eta 6, 12 eta 24 ordura), inokulatutako (Colletotrichum lupini, Col-08 anduia, Wierzheniceko (Polonia, 1999) lupino-soroetatik lortutakoa) eta kontroleko (itxuraz inokulatutako) landareak barne.Eskalak Pearsonen korrelazio koefizientearen balioa erakusten du.
Hazbeteko 6 zaldi-potentzian lortutako datuetan oinarrituta, WGCNA inokulatutako eta kontroleko landareak alderatuz identifikatutako 9981 DEG-n egin zen defentsako erantzun goiztiarrei arreta emateko (S12 Taula osagarria).Hogeita bi gene-modulu (kluster) aurkitu ziren genotipoen eta aldaera esperimentalen arteko espresio-profil korrelazionatuekin (positibo edo negatiboekin). Batez beste, gene-adierazpen-mailak behera egiten ari ziren ordenan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (bi aldaeretan, ordea, joera hori indartsuagoa zen kontrol-landareetan). Batez beste, gene-adierazpen-mailak behera egiten ari ziren ordenan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (bi aldaeretan, ordea, joera hori indartsuagoa zen kontrol-landareetan). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 biztanleria нденция была сильнее у контрольных растений). Batez beste, gene-adierazpen-mailak 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 ordenan jaitsi ziren (bi aldaeretan, ordea, joera hori indartsuagoa zen kontrol-landareetan).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 biztanleria势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> 22660 biztanle在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 biztanleria ция была сильнее у контрольных растений). Batez beste, gene-adierazpen mailak 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 seriean gutxitu egin ziren (hala ere, bi aldaeretan, joera hori indartsuagoa zen kontrol-landareetan).Txertaketak geneen adierazpenaren goranzko erregulazioa eragin zuen, batez ere 18., 19., 14., 6. eta 1. moduluetan (efektuaren beheranzko ordenan), erregulazio negatiboan (adibidez, 9. eta 20. moduluak) edo efektu neutroekin (adibidez, 11., 22., 8. eta 13. moduluetan).GO termino aberastearen analisiak (S13 Taula osagarria) "GO: 0006952 babes-erantzunak" agerian utzi zuen inokulatutako modulurako (18) aktibazio maximoarekin, qPCR-k analizatutako geneak barne (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 eta argazki asko kenduta) s moduluak (9).18. modulua kontzentratzailea (8. irudia) PR-10 antzeko LlR18B proteina kodetzen duen TanjilG_26536 gene gisa identifikatu zen, eta 9. modulua kontzentratzailea II PsbQ fotosistemako proteina kodetzen duen TanjilG_28955 gene gisa identifikatu zen.Lanr1 antraknosiarekiko erresistentzia gene hautagai bat, TanjilG_05042, 22. moduluan aurkitu zen (9. irudia) eta TanjilG_01212 hub-a daramaten "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" eta "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" terminoekin lotuta dago.geneak bero estresaren transkripzio faktorea A-4a (HSFA4a) kodetzen du.
Gehiegizko ordezkaritza duten prozesu biologikoko terminoak dituzten moduluen gene-adierazpenaren sare haztatua "GO: 0006952 Defentsa erantzunak".Lotura sinplifikatu zen qPCR-k aztertutako lau geneak nabarmentzeko (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 eta TanjilG_27015).
"GO: 0006355: transkripzio erregulazioa, DNA txantiloia" eta lanr1 TanjilG_05042 antraknosiarekiko erresistentzia gene hautagai bat daraman modulu baten gene-adierazpenaren sare haztatua.Lotura sinplifikatu zen TanjilG_05042 genea eta TanjilG_01212 gene zentrala isolatzeko.
Australian bildutako antraknosiarekiko erresistentzia-baheketak erakutsi zuen hasieran kaleratutako kultivare gehienak jasangarriak zirela;Kalya, Coromup eta Mandelup neurrizko erresistentzia gisa deskribatu dira, Wonga, Tanjil eta 83A:476, berriz, oso erresistenteak direla26,27,31.erresistentzia-alelo bera zuten, Lanr1 izendatua, eta Coromup eta Mandelup-ek beste alelo bat zuten, AnMan10, 26, 39 izendatua, eta Kalyak beste alelo bat pasatu zuen bitartean., Lanr2.Alemanian antraknosiarekiko erresistentziaren baheketak Bo7212 lerro erresistente bat identifikatu zuen Lanr1 ez den beste alelo hautagai batekin, LanrBo36 izendatua.
Gure ikerketak frogatutako germoplasman Lanr1 aleloaren maiztasun oso baxua (% 6 inguru) agerian utzi zuen.Behaketa hau bat dator Anseq3 eta Anseq4 markatzaileak erabiliz Ekialdeko Europako germoplasma bahekatutako emaitzekin, zeinak Lanr1 aleloa bielorrusiako bi lerrotan bakarrik dagoela erakutsi zuen.Horrek iradokitzen du Lanr1 aleloa oraindik ez dela tokiko hazkuntza-programek oso erabilia, Australian ez bezala, non markatzaileek lagundutako hazkuntzarako funtsezko aleloetako bat den.Hau izan daiteke Lanr1 aleloak Europako eremuko baldintzetan ematen duen erresistentzia maila baxuagoa izateagatik, Australiako txostenarekin alderatuta.Gainera, Australiako prezipitazio handiko eremuetan antraknosiari buruzko ikerketek erakutsi dute Lanr1 aleloak eragindako erresistentzia-erantzunak agian ez direla eraginkorrak izan patogenoaren hazkuntza eta garapen azkarra faboratzen duten eguraldi baldintzetan19,42.Izan ere, ikerketa honetan, Lanr1 aleloa daramaten genotipoetan ere antraknosiaren sintoma batzuk ikusi dira, eta horrek erresistentzia C. lupini-ren garapenerako baldintza optimoetan desager daitekeela iradokitzen du.Horrez gain, Anseq3 eta Anseq4 markatzaileen presentziaren interpretazio positibo faltsuak, Lanr1 locusetik gutxi gorabehera 1 cm-ra daudenak, posible dira 28,30,43.
Gure ikerketak erakutsi zuen 83A: 476k, Lanr1 aleloa daramala, C. lupini inokulazioari eskala handiko transkriptomaren birprogramazioarekin erantzun ziola aztertutako lehen denbora-puntuan (6 hpi), Mandelup-en, AnMan aleloa daramala, erantzun transkriptomikoak askoz geroago ikusi ziren.(24tik 48ra).Defentsa-erantzunen denbora-aldaera hauek gaixotasunaren sintomen desberdintasunekin lotzen dira, erresistentziari erantzun arrakastatsu bat izateko patogeno goiztiarraren ezagupenaren garrantzia nabarmenduz.Landare-ehuna infektatzeko, antraxaren esporak ostalariaren gainazalean hainbat garapen-etapa igaro behar dira, ernetzea, zelulen zatiketa eta appressorio baten eraketa barne.Eranskina ostalariaren gainazalean lotzen den eta ostalariaren ehunetan sartzea errazten duen egitura infekzioso bat da.Horrela, ilar-estraktuan C. gloeosporioides-en esporek 75-90 minutuko inkubazioaren ondoren nukleoaren lehen zatiketa erakutsi zuten, 90-120 minuturen buruan germen-hodiaren eraketa eta 4 orduren buruan ezabapena 45 .Mango C. gloeosporioidesek 3 orduko inkubazioaren ondoren konidialaren ernetze % 40 baino gehiago eta 4 orduren buruan appresoren % 20 inguru eratu zuen.C. gloeosporioides-en birulentziari lotutako CAP20 geneak transkripzio-jarduera erakutsi zuen epifitoak eratzen dituzten konidioetan 3,5 orduko inkubazioa egin ostean CAP20 proteinaren kontzentrazio handiarekin aguakatearen gainazaleko argizarian 4 h 46 min igaro ondoren.Era berean, C. trifolii-n melaninaren biosintesi-geneen jarduera 2 orduko inkubazioan induzitu zen, eta ordubeteren buruan appressorio bat sortu zen.Hosto-ehunen ikerketek frogatu dute C. acutatum-ekin inokulatutako marrubiek 8 hpi-tan daukatela lehen ezabapena, eta C. coccodes-ekin inokulatutako tomateek 4 hpi-tan dute lehen ezabapena48,49.neurri handi batean, Colletotrichum spp-en denbora-eskalarekin bat.prozesu infekziosoa.83A:476-ren defentsa-erantzun azkarrek landare-erresistentzia eta efektoreek eragindako immunitatea (ETI) geneen inplikazioa iradokitzen dute lerro honetan, Mandelup-en erantzun atzeratuek, berriz, mikro-lotutako eredu molekularra abiarazitako immunitatea (MTI) hipotesia onartzen dute 50. 83A: 476 eta Mandelup-en lehen erantzunak.Erantzun atzeratuan gora edo behera erregulatutako geneen arteko gainjartze partzialak ere onartzen du kontzeptu hau, izan ere, ETI sarritan MTI erantzun azeleratu eta hobetutzat jotzen da, infekzio-gunean zelula-heriotza programatuan amaitzen dena, shock anafilaktiko gisa ezagutzen dena 51,52.
Gene Ontology GO:0006952 "Defentsa Erantzun" terminoari egozten zaizkion gene gehienak estresak eragindako barau-mezuaren 22 proteinaren 11 homologoak dira (SAM22-ren antzekoa) eta latexaren antzeko proteina (MLP) zazpi nagusienak.31, 34, 43 eta 423 bezalako proteinek sekuentzia antzekotasuna erakutsi zuten.SAM22 antzeko geneek aktibazio esanguratsua erakutsi zuten, luzaroago iraun zuena, antraknosiaren erresistentzia-maila areagotuz (83A:476 eta Boregine).Hala ere, MLP antzeko geneak erresistentzia-alelo hautagaia zeramaten lerroetan soilik erregulatu ziren (83A:476/Lanr1 6 hpi-tan eta Mandelup/AnMan 24 hpi-tan).Kontuan izan behar da identifikatutako SAM22 antzeko homologo guztiak gutxi gorabehera 105 kb-ko gene-multzo batetik sortzen direla, eta MLP antzeko geneak genomaren eskualde bereizietatik sortzen direla.SAM22 antzeko gene horien aktibazio koordinatua ere aurkitu zen Diaporthetoxica inokulazioaren NLL erresistentziari buruzko gure aurreko ikerketan, defentsaren erantzunaren osagai horizontaletan parte hartzen dutela iradokiz.Ondorio hau SAM22 antzeko geneek azido salicilikoarekin, onddoen induzitzaileekin edo hidrogeno peroxidoarekin lesioekin edo tratamenduarekin izandako erantzun positiboaren txostenek ere onartzen dute.
MLP antzeko geneek hainbat estres abiotiko eta biotikori erantzuten dietela frogatu da, landare-espezie askotan onddoen infekzio bakteriano, biral eta patogenoei barne55.Landareen eta patogenoen arteko elkarreragin batzuen erantzunaren nondik norakoak asko handitzen ziren (hau da, kotoia Verticillium dahliae-rekin infestatzean) nabarmen gutxitzen ziren (hau da, sagarrondoa Alternaria spp.-ekin infektatu ondoren)56,57.MLP antzeko 423 genearen beherakada nabarmena ikusi da aguakatearen defentsan F. niger infekzioaren aurrean eta Botryosphaeria berengeriana f sagarrondoaren infekzioan zehar.cn.piricola eta Alternaria alternata sagar patotipoak dira58,59.Horrez gain, MLP antzeko 423 genea gainespresatzen zuten sagar-kaliek erresistentziari lotutako geneen adierazpen txikiagoa zuten eta onddoen infekzioarekiko sentikortasun handiagoa zuten59.Fusarium oxysporum f-ren ondoren, MLP antzeko 423 genea ere kendu egin zen babarrunaren germoplasma arrunt erresistentean.cn.Babarrunaren infekzioa 60.
Gure RNA-seq ikerketan identifikatutako PR-10 familiako beste kideak LlR18A eta LlR18B geneak izan ziren goranzko erregulazioari erantzuteko, bai eta DIR1 lipidoen transferentzia proteinaren gorako (gene 1) edo beherako (3 gene) genea ere..Horrez gain, WGCNA-k LlR18B genea nabarmentzen du modulu honetako ardatz gisa, txertoa hartzeko oso sentikorra dena eta babes-erantzun-gene batzuk dituena.LlR18A eta LlR18B geneak lupin horiko hostoetan induzitu ziren bakterio patogenoei erantzuteko, baita NLL zurtoinetan ere D. toxica inokulatu ondoren, gene horien arroz homologoa, RSOsPR10, onddoen infekzio batek, ustez, azido jasmonikoan parte hartzen zuen seinaleztatzeko bide garraiatzaile ez espezifikoan, DIR1632. Eskuratutako erresistentzia sistemikoa (SAR) agertzeko beharrezkoak direnak.Babes-erreakzioen garapenarekin, DIR1 proteina infekzio-fokutik floemaren bidez garraiatzen da urruneko organoetan SAR eragiteko.Interesgarria da TanjilG_02313 DIR1 genea lehen aldiz 84A: 476 lerroetan eta Population 22660 lerroetan nabarmen induzitu zen, baina antraknosiaren erresistentzia arrakastaz garatu zen 84A: 476 lerroan soilik.Honek DIR1 genearen azpifuntzionalizazioren bat adieraz dezake NLLn, gainerako hiru homologoek 83A:476 lerroan soilik erantzuten baitzuten inokulazioari 6 hpi-tan, eta erantzun hori beherantz zuzendu zen.
Gure ikerketan, "GO:0055114 Redox prozesua" izeneko prozesu biologikoari dagozkion osagai ohikoenak P450 proteina zitokromoa, peroxidasa, azido linoleikoa 9S-/13S-lipoxigenasa eta 1-aminoziklopropano-1-azido karboxiliko oxidasa izan ziren.Horrez gain, gure WGCNAk HSFA4a homologoa TanjilG_05042 TanjilG_05042 bezalako Lanr1 erresistentzia genearen hautagaia bezalako moduluak dituen hub gisa definitzen du.HSFA4a landareen transkripzio nuklearraren erredox-menpeko erregulazioaren osagai bat da.
P450 zitokromoaren proteinak NADPH eta/edo O2-ren menpeko hidroxilazio-erreakzioak katalizatzen dituzten oxidorreduktasak dira metabolismo primarioan eta sekundarioan, xenobiotikoen metabolismoa barne, baita hormonak, gantz-azidoak, esterolak, zelulen hormako osagaiak, biopolimeroak eta babesgarriaren biosintesia. d -10,6 log2 (fold aldaketa) 5,7ra aldatutako homologo kopuru handi baten ondorioz (37) eta gene zehatzen arteko erantzun-ereduen desberdintasunak direla eta, goranzko berrikuspena islatuz..Proteina superfamilia handi batean NLL geneen funtzio biologikoa argitzeko RNA-seq datuak soilik erabiltzea oso espekulatiboa litzateke.Hala ere, nabarmentzekoa da P450 zitokromoaren gene batzuk onddo edo bakterio patogenoekiko erresistentzia areagotzearekin lotuta daudela, erreakzio alergikoei ekarpena barne69,70,71.
III. Klaseko peroxidasak landareen hazkuntzan eta garapenean prozesu metaboliko ugaritan parte hartzen duten funtzio anitzeko entzimak dira, baita inguruneko estresei erantzuten dietenak, hala nola gazitasuna, lehortea, argi-intentsitate handia eta patogenoen erasoa72.Peroxidasak Anthracis-ekin hainbat landare-espezieren elkarrekintzan parte hartzen dute, besteak beste, Stylosanthes humilis eta C. gloeosporioides, Lens culinaris eta C. truncatum, Phaseolus vulgaris eta C. lindemuthianum, Cucumis sativus eta C. lagenarium73,74,75,76.Erantzuna oso azkarra da, batzuetan 4 HPI-koa ere bai, onddoa landare-ehunean sartu aurretik73.Peroxidasa geneak D. toxica NLL inokulazioari ere erantzun zion.Leherketa oxidatiboa erregulatzeko edo estres oxidatiboa kentzeko ohiko funtzioez gain, peroxidasek patogenoen hazkuntza oztopatu dezakete lignifikazioan, azpiunitatean edo konposatu espezifikoen gurutzaduran oinarritutako hesi fisikoak sortuz.Funtzio hau in silico egotzi dakioke TanjilG_03329 geneari, gure azterketan nabarmen gorago erregulatu zen lignina eratzen duen anioi peroxidasa kodetzen duen geneari, 6 HPI-ko 83A:476 lerro erresistentean, baina ez erantzun ez zuten beste andui eta denbora-puntu batzuetan.
Azido linoleikoaren 9S-/13S-lipoxigenasa lipidoen biosintesiaren oxidazio bidearen lehen urratsa da78.Bide honen produktuek funtzio anitz dituzte landareen defentsan, besteak beste, zelula horma sendotzea kalosa eta pektina-gordailuak eratuz, eta estres oxidatiboa erregulatzea oxigeno-espezie erreaktiboen ekoizpenaren bidez79,80,81,82,83.Azterlan honetan, 9S-/13S-lipoxigenasaren azido linoleikoaren adierazpena aldatu egin da andui guztietan, baina 22660 populazio jasangarrian, gorako erregulazioa nagusitu da denbora ezberdinetan, Lanr1 erresistentea eta AnMan aleloa daramaten anduietan, berriz, oxilipina geruza erreakzio babesgarrien arteko oxilipina geruza erreakzio babesgarrien arteko dibertsifikazioa azpimarratzen du.
1-aminocyclopropano-1-carboxylate oxidasa (ACO) homologoa nabarmen goratu zen (9 gene) edo beherantzean (2 gene) lupinarekin inokulatuta zegoenean.Bi salbuespen izan ezik, erantzun horiek guztiak 6 hp-tan gertatu ziren.83A: 476.ACO proteinen bidezko erreakzio entzimatikoa etilenoaren ekoizpenaren abiadura mugatzen duen urratsa da eta, beraz, oso araututa dago84.Etilenoa landare-hormona bat da, eta hainbat eginkizun betetzen ditu landareen garapena eta estres abiotiko eta biotiko-baldintzei erantzuteko.ACO transkripzioaren indukzioa eta etilenoaren seinaleztapen-bidearen aktibazioan parte hartzen dute arrozak oryzae oryzae onddo hemibiotrofoarekiko erresistentzia areagotzeko, oxigeno-espezie erreaktiboen eta fitoalexinen ekoizpena erregulatuz.M. oryzae eta C. lupini-ren artean aurkitutako hosto-infekzio-prozesu oso antzeko batek, ikerketa honetan jakinarazitako 83A:476 lerroko ACO homologoen gorako erregulazio esanguratsu baten atzealdean, NLL antraknosiari erresistentzia emateko aukera aldatzen du Etilenoak bide molekularren seinale-pauso zentral bat.
Oraingo ikerketan, fotosintesiarekin lotutako gene askoren eskala handian ezabatzea 6 hpi-tan ikusi da 83A:476-n eta 48 hpi-n Mandeloopen eta 22660 populazioan.Aldaketa horien hedadura eta progresioa mailaren proportzionala da.Esperimentu honetan antraknosiaren erresistentzia ikusi zen.Berriki, fotosintesiarekin lotutako transkripzioen errepresio indartsua eta goiztiarra izan da landare-patogeno-interakzioen hainbat eredutan, bakterio eta onddo patogenoetan barne.Presa (2 HPI-tik aurrera elkarrekintza batzuetan) eta infekzioari erantzuteko fotosintesiarekin lotutako geneen kentze globalak landareen immunitatea eragin dezakete oxigeno-espezie erreaktiboak hedatzean eta azido salicilikoaren bidearekin duten elkarrekintzan oinarritutako erreakzio alergikoak bideratzeko 90,94.
Ondorioz, leinu erresistenteenarentzat (83A:476) proposatzen diren defentsa-erantzun-mekanismoek R genearen (ustez, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) eta erantzun alergikoaren bidezko azido salicilikoaren eta etilenoaren seinaleztapena, eta jarraian irismen luzeko SAR ezartzea.ekintza DIR-1 proteinak onartzen du.Kontuan izan behar da C. lupini infekzioaren aldi biotrofikoa oso laburra dela (2 egun gutxi gorabehera), eta ondoren hazkunde nekrotikoa95.Etapa hauen arteko trantsizioa landare ostalarien hipersentsibilitate erreakzioen eragile gisa jarduten duten etileno-induzigarriak diren proteinen nekrosiarekin eta adierazpenarekin lotu daiteke.Horregatik, etapa biotrofikoan C. lupini arrakastaz harrapatzeko denbora-leihoa oso estua da.83A:476-n 6 hpi-n ikusitako redox eta fotosintesiarekin lotutako geneen birprogramazioak onddoen hifeen progresioarekin bat dator eta fase biotrofikoan babes-erantzun arrakastatsu baten garapena iragartzen du.Mandelup-en eta 22660 populazioaren erantzun transkriptomikoak atzeratuegiak izan daitezke onddoa harrapatzeko hazkunde nekrotikora aldatu aurretik; hala ere, Mandelup 22660 populazioa baino eraginkorragoa izan daiteke, PR-10 proteinaren erregulazio nahiko azkarrak erresistentzia horizontala sustatzen duelako.
ETI, R gene kanonikoak bultzatuta, babarrunak antraknosiarekiko erresistentziarako mekanismo arrunta dela dirudi.Horrela, Medicago truncatula lekale ereduan, antraknosiarekiko erresistentzia RCT1 geneak ematen du, TIR-NBS-LRR97 landare R gene klaseko kideak.Gene honek espektro zabaleko antraknosiaren erresistentzia ematen dio alfalfan landare sentikorrei transferitzean.Babarrun arruntean (P. vulgaris), antraknosiarekiko erresistentzia-gene bi dozena baino gehiago identifikatu dira orain arte.Gene horietako batzuk R gene kanonikorik ez duten eskualdeetan aurkitzen dira, baina beste asko NBS-LRR gene multzoa daramaten kromosomen ertzetan daude, TIR-NBS-LRRs99 barne.Genoma osoko SSR azterketak NBS-LRR genearen antraknosiarekiko erresistentzia baba arruntean elkartzea ere baieztatu zuen.R gene kanonikoa ere aurkitu zen 101 lupino zurian antraknosiaren erresistentzia locus nagusia daraman eskualde genomikoan.
Gure lanak erakusten du berehalako erresistentzia-erreakzio batek, landare-infekzioaren hasierako fasean aktibatzen den (ahal izanez gero, 12 hpi baino gehiagotan) modu eraginkorrean babesten duela hosto estuko lupina Collelotrichum lupini onddo patogenoak eragindako antraknositik.Errendimendu handiko sekuentziazioa erabiliz, lanr1 eta AnMan erresistentzia geneen bidez NLL landareetan antraknosiaren erresistentzia geneen adierazpen diferentziala erakutsi genuen.Defentsa arrakastatsuak erredox-ean, fotosintesian eta patogenian parte hartzen duten proteinen geneak arretaz diseinatzea dakar landareak patogeno batekin lehen kontaktua izan eta ordu gutxira.Babes-erreakzio antzekoak, baina denboran atzeratuak, askoz eraginkorrak dira landareak gaixotasunetatik babesteko.Lanr1 geneak bideratzen duen antraxaren erresistentzia R genearen ohiko erantzun azkarraren antza du (eragileek abiarazitako immunitatea), eta AnMan geneak ziurrenik erantzun horizontala ematen du (mikrobioekin lotutako eredu molekular batek abiarazitako immunitatea), iraunkortasun maila moderatua eskainiz.
Antraknosiaren markatzaileak aztertzeko erabilitako 215 NLL lerroek 74 kultibatzek, gurutzatu edo ugalketatik lortutako 60 lerrok, 5 mutanteek eta 76 basati edo jatorrizko germoplasmak osatzen zuten.Lineak 17 herrialdetatik zetozen, batez ere Polonia (58), Espainia (47), Alemania (27), Australia (26), Errusia (19), Bielorrusia (7), Italia (5) eta beste linea batzuetatik.10 herrialdetakoak.Multzoak erreferentziazko lerro erresistenteak ere baditu: 83A:476, Tanjil, Wonga Lanr1 aleloa daramana eta Mandelup AnMan aleloa daramana.Lerroak Poznań Plant Breeding Ltd.-k, Wiatrowo, Poloniako Lupine Genetic Resource Databasetik lortu ziren (S1 Taula Osagarria).
Landareak baldintza kontrolatuetan hazi ziren (fotoperiodoa 16 ordu, tenperatura 25 °C egunean eta 18 °C gauez).Bi erreplika biologiko aztertu ziren.DNA hiru asteko hostoetatik isolatu zen DNeasy Plant Mini Kit-a erabiliz (Qiagen, Hilden, Alemania) protokoloaren arabera.Isolatutako DNAren kalitatea eta kontzentrazioa metodo espektrofotometrikoen bidez ebaluatu ziren (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AEB).AnManM1 markatzailea AnMan antraknosiarekiko erresistentzia genea (cv. Mandelup-etik eratorria) eta Lanr1 genea alboan duten Anseq3 eta Anseq4 markatzaileak (cv. Tanjil-etik eratorria) aztertu ziren 11,26,28.Alelo erresistentearen homozigotoak "1" gisa puntuatu ziren, sentikorra - "0" gisa eta heterozigotoak - 0,5 gisa.
AnManM1, AnSeq3 eta AnSeq4 markatzaileen baheketaren emaitzetan eta azken jarraipeneko esperimentuetarako hazien erabilgarritasunaren arabera, 50 NLL lerro hautatu ziren antraknosiarekiko erresistentzia fenotipatzeko.Azterketa bikoiztuta egin da ordenagailuz kontrolatutako negutegi batean, 14 orduko fotoperiodoarekin, egunean 22 °C-ko tenperatura tartearekin eta gauez 19 °C-ko tenperaturarekin.Haziak marrazten dira (enbrioiaren kontrako aldean hazi-geruza moztuz pala zorrotz batekin) erein aurretik, hazien lozorroa saihesteko, hazi-geruza gogorregia delako eta ernetze uniformea ​​bermatzeko.Landareak lorontzietan (11 × 11 × 21 cm) lur antzuarekin hazi ziren (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovia, Polonia).Inokulazioa Colletotrichum lupini Col-08 anduiarekin egin zen, 1999an Verzhenitsa, Polonia Handian (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ) landatutako hosto estuko lupino landareen zurtoinetatik hazi zena.Lortu eremu bat.Isolatuak SNA medioan hazi ziren 20° C-tan argi beltzean 21 egunez esporulazioa eragiteko.Erein eta lau aste igaro ondoren, landareak 4-6 hosto-fasera iritsi zirenean, inokulazioa egin zen konidio suspentsio batekin ihinztatuz, ml bakoitzeko 0,5 x 106 konidioko kontzentrazioan.Inokulatu ondoren, landareak ilunpean eduki zituzten 24 orduz %98 inguruko hezetasunarekin eta 25°C-ko tenperaturan, konidioen ernetzea eta infekzio prozesua errazteko.Ondoren, landareak 14 orduko fotoperiodoan hazi ziren 22 °C egunean/19 °C gauean eta %70eko hezetasunean.Gaixotasunaren puntuazioa inokulatu eta 22 egunetara egin zen eta 0 (immune) eta 9 (oso sentikorra) bitartekoa izan zen, zurtoinetan eta hostoetan lesio nekrotikoen presentziaren edo ezaren arabera.Gainera, puntuatu ondoren, landareen pisua neurtu zen.Markatzaile-genotipoen eta gaixotasun-fenotipoen arteko erlazioak puntu bi sekuentziako korrelazio gisa kalkulatu ziren (markatzaile heterozigotorik eza antraknosiaren erresistentzia fenotipoaren analisirako lerro multzoan).