از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
تکامل انگل‌های میکروبی شامل واکنش متقابلی بین انتخاب طبیعی است که باعث بهبود انگل‌ها می‌شود و رانش ژنتیکی که باعث از دست دادن ژن‌ها و تجمع جهش‌های مضر توسط انگل‌ها می‌شود.در اینجا، به منظور درک چگونگی این واکنش متقابل در مقیاس یک ماکرومولکول منفرد، ساختار cryo-EM ریبوزوم Encephalitozoon cuniculi، یک ارگانیسم یوکاریوتی با یکی از کوچک‌ترین ژنوم‌های موجود در طبیعت را توصیف می‌کنیم.کاهش شدید rRNA در ریبوزوم های E. cuniculi با تغییرات ساختاری بی سابقه ای همراه است، مانند تکامل پیوند دهنده های rRNA ذوب شده قبلی ناشناخته و rRNA بدون برآمدگی.علاوه بر این، ریبوزوم E. cuniculi با توسعه توانایی استفاده از مولکول‌های کوچک به عنوان تقلید ساختاری قطعات و پروتئین‌های rRNA تخریب‌شده، از دست دادن قطعات و پروتئین‌های rRNA جان سالم به در برد.به طور کلی، ما نشان می‌دهیم که ساختارهای مولکولی که مدت‌ها تصور می‌شد کاهش یافته، تخریب می‌شوند و در معرض جهش‌های ناتوان‌کننده هستند، تعدادی مکانیسم جبرانی دارند که آنها را علیرغم انقباضات شدید مولکولی فعال نگه می‌دارد.
از آنجایی که اکثر گروه های انگل های میکروبی ابزارهای مولکولی منحصر به فردی برای بهره برداری از میزبان خود دارند، ما اغلب مجبوریم برای گروه های مختلف انگل ها درمان های مختلفی ایجاد کنیم.با این حال، شواهد جدید نشان می‌دهد که برخی از جنبه‌های تکامل انگل همگرا و تا حد زیادی قابل پیش‌بینی هستند، که نشان‌دهنده مبنایی بالقوه برای مداخلات درمانی گسترده در انگل‌های میکروبی ۳،۴،۵،۶،۷،۸،۹ است.
کار قبلی یک روند تکاملی رایج را در انگل‌های میکروبی به نام کاهش ژنوم یا پوسیدگی ژنوم شناسایی کرده است.تحقیقات کنونی نشان می‌دهد که وقتی میکروارگانیسم‌ها سبک زندگی آزاد خود را رها می‌کنند و به انگل‌های درون سلولی (یا درون همزیستی) تبدیل می‌شوند، ژنوم‌های آن‌ها در طول میلیون‌ها سال دچار دگرگونی‌های آهسته اما شگفت‌انگیز می‌شوند.در فرآیندی به نام فروپاشی ژنوم، انگل‌های میکروبی جهش‌های مضری را انباشته می‌کنند که بسیاری از ژن‌های مهم قبلی را به شبه‌زا تبدیل می‌کند و منجر به از دست دادن تدریجی ژن و فروپاشی جهش می‌شود.این فروپاشی می‌تواند تا 95 درصد از ژن‌ها را در قدیمی‌ترین موجودات درون سلولی در مقایسه با گونه‌های زندگی آزاد نزدیک به هم از بین ببرد.بنابراین، تکامل انگل‌های درون سلولی یک کشمکش بین دو نیروی متضاد است: انتخاب طبیعی داروینی که منجر به بهبود انگل‌ها می‌شود و فروپاشی ژنوم، انگل‌ها را به فراموشی می‌سپارد.اینکه چگونه این انگل توانسته از این طناب کشی بیرون بیاید و فعالیت ساختار مولکولی خود را حفظ کند، هنوز مشخص نیست.
اگرچه مکانیسم پوسیدگی ژنوم به طور کامل شناخته نشده است، به نظر می رسد که عمدتاً به دلیل رانش ژنتیکی مکرر رخ می دهد.از آنجایی که انگل ها در جمعیت های کوچک، غیرجنسی و از نظر ژنتیکی محدود زندگی می کنند، نمی توانند به طور موثر جهش های مضری را که گاهی در حین تکثیر DNA رخ می دهد، از بین ببرند.این منجر به تجمع برگشت ناپذیر جهش های مضر و کاهش ژنوم انگل می شود.در نتیجه، انگل نه تنها ژن هایی را از دست می دهد که دیگر برای بقای آن در محیط درون سلولی ضروری نیستند.این ناتوانی جمعیت های انگل در از بین بردن موثر جهش های مضر پراکنده است که باعث می شود این جهش ها در سراسر ژنوم از جمله مهم ترین ژن های آنها جمع شوند.
بیشتر درک کنونی ما از کاهش ژنوم، صرفاً مبتنی بر مقایسه توالی‌های ژنوم است، با توجه کمتر به تغییرات در مولکول‌های واقعی که عملکردهای خانه‌داری را انجام می‌دهند و به عنوان اهداف دارویی بالقوه عمل می‌کنند.مطالعات مقایسه‌ای نشان داده‌اند که بار جهش‌های میکروبی داخل سلولی مضر به نظر می‌رسد که پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک را مستعد تا شدن و تجمع نادرست می‌کند، و آنها را وابسته‌تر و حساس‌تر به گرما می‌کند.علاوه بر این، انگل‌های مختلف - تکامل مستقلی که گاهی تا 2.5 میلیارد سال از هم جدا می‌شوند - از دست دادن مراکز کنترل کیفیت مشابهی را در سنتز پروتئین و مکانیسم‌های ترمیم DNA خود تجربه کردند.با این حال، اطلاعات کمی در مورد تأثیر سبک زندگی درون سلولی بر سایر ویژگی‌های درشت مولکول‌های سلولی، از جمله سازگاری مولکولی با افزایش بار جهش‌های مضر وجود دارد.
در این کار، به منظور درک بهتر تکامل پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک میکروارگانیسم‌های درون سلولی، ساختار ریبوزوم‌های انگل داخل سلولی Encephalitozoon cuniculi را تعیین کردیم.E. cuniculi یک ارگانیسم قارچ مانند است که متعلق به گروهی از میکروسپوریدی های انگلی است که دارای ژنوم های یوکاریوتی غیرمعمول کوچک هستند و بنابراین به عنوان ارگانیسم های مدل برای مطالعه پوسیدگی ژنوم استفاده می شوند.اخیراً، ساختار ریبوزوم cryo-EM برای ژنوم های نسبتاً کاهش یافته Microsporidia، Paranosema locustae، و Vairimorpha necatrix31،32 (3.2 Mb ژنوم) تعیین شد.این ساختارها نشان می‌دهند که مقداری از دست دادن تقویت rRNA با ایجاد تماس‌های جدید بین پروتئین‌های ریبوزومی همسایه یا کسب پروتئین‌های ریبوزومی جدید msL131،32 جبران می‌شود.گونه‌های Encephalitozoon (ژنوم ~ 2.5 میلیون جفت باز)، همراه با نزدیک‌ترین خویشاوند آنها Ordospora، درجه نهایی کاهش ژنوم را در یوکاریوت‌ها نشان می‌دهند - آنها کمتر از 2000 ژن کدکننده پروتئین دارند، و انتظار می‌رود که ریبوزوم‌های آنها نه تنها فاقد تکه‌های گسترش rRNA باشد، همچنین دارای چهار قطعه پروتئین ریبوبوکاریو ریبوزومال است. به دلیل عدم وجود همولوگ در ژنوم E. cuniculi26,27,28.بنابراین، به این نتیجه رسیدیم که ریبوزوم E. cuniculi می‌تواند استراتژی‌های ناشناخته قبلی را برای سازگاری مولکولی با فروپاشی ژنوم نشان دهد.
ساختار cryo-EM ما نشان‌دهنده کوچک‌ترین ریبوزوم سیتوپلاسمی یوکاریوتی است که باید مشخص شود و بینشی را در مورد اینکه چگونه درجه نهایی کاهش ژنوم بر ساختار، مونتاژ و تکامل ماشین‌های مولکولی جدایی‌ناپذیر سلول تأثیر می‌گذارد، ارائه می‌دهد.ما دریافتیم که ریبوزوم E. cuniculi بسیاری از اصول به‌طور گسترده‌ای حفظ‌شده تا کردن RNA و مونتاژ ریبوزوم را نقض می‌کند و یک پروتئین ریبوزومی ناشناخته جدید کشف کردیم.کاملاً غیرمنتظره، ما نشان می‌دهیم که ریبوزوم‌های میکروسپوریدیا توانایی اتصال مولکول‌های کوچک را تکامل داده‌اند، و فرض می‌کنیم که برش در rRNA و پروتئین‌ها باعث نوآوری‌های تکاملی می‌شوند که در نهایت ممکن است ویژگی‌های مفیدی را به ریبوزوم بدهند.
برای بهبود درک خود از تکامل پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک در موجودات درون سلولی، تصمیم گرفتیم اسپورهای E. cuniculi را از کشت سلول‌های پستانداران آلوده جدا کنیم تا ریبوزوم‌های آنها را خالص کنیم و ساختار این ریبوزوم‌ها را مشخص کنیم.به دست آوردن تعداد زیادی میکروسپوریدی انگلی دشوار است زیرا میکروسپوریدیا را نمی توان در یک محیط غذایی کشت داد.در عوض، آنها فقط در داخل سلول میزبان رشد و تولید مثل می کنند.بنابراین، برای به دست آوردن زیست توده E. cuniculi برای خالص سازی ریبوزوم، ما رده سلولی کلیه پستانداران RK13 را با اسپور E. cuniculi آلوده کردیم و این سلول های آلوده را برای چند هفته کشت دادیم تا E. cuniculi رشد و تکثیر شود.با استفاده از یک تک لایه سلولی آلوده به مساحت حدود نیم متر مربع، توانستیم حدود 300 میلی گرم از هاگ میکروسپوریدیا را خالص کنیم و از آنها برای جداسازی ریبوزوم ها استفاده کنیم.سپس هاگ های خالص شده را با دانه های شیشه ای مختل کردیم و ریبوزوم های خام را با استفاده از تقسیم پله ای پلی اتیلن گلیکول لیزات جدا کردیم.این به ما اجازه داد تا تقریباً 300 میکروگرم ریبوزوم خام E. cuniculi را برای تجزیه و تحلیل ساختاری بدست آوریم.
سپس تصاویر cryo-EM را با استفاده از نمونه های ریبوزوم به دست آمده جمع آوری کردیم و این تصاویر را با استفاده از ماسک های مربوط به زیر واحد ریبوزومی بزرگ، سر زیر واحد کوچک و زیر واحد کوچک پردازش کردیم.در طی این فرآیند، تصاویری از حدود 108000 ذره ریبوزومی جمع آوری کردیم و تصاویر cryo-EM را با وضوح 2.7 Å محاسبه کردیم (شکل های تکمیلی 1-3).سپس از تصاویر cryoEM برای مدلسازی rRNA، پروتئین ریبوزومی و فاکتور خواب زمستانی Mdf1 مرتبط با ریبوزوم های E. cuniculi استفاده کردیم (شکل 1a, b).
ساختار ریبوزوم E. cuniculi در کمپلکس با فاکتور خواب زمستانی Mdf1 (pdb id 7QEP).b نقشه فاکتور خواب زمستانی Mdf1 مرتبط با ریبوزوم E. cuniculi.c نقشه ساختار ثانویه با مقایسه rRNA بازیابی شده در گونه های میکروسپوریدی با ساختارهای ریبوزومی شناخته شده.پانل ها محل قطعات rRNA تقویت شده (ES) و سایت های فعال ریبوزوم، از جمله محل رمزگشایی (DC)، حلقه سارسینیسین (SRL)، و مرکز پپتیدیل ترانسفراز (PTC) را نشان می دهند.d چگالی الکترونی مربوط به مرکز پپتیدیل ترانسفراز ریبوزوم E. cuniculi نشان می دهد که این مکان کاتالیزوری در انگل E. cuniculi و میزبان های آن، از جمله H. sapiens، ساختار مشابهی دارد.e, f چگالی الکترونی متناظر مرکز رمزگشایی (e) و ساختار شماتیک مرکز رمزگشایی (f) نشان می‌دهد که E. cuniculi به جای A1491 (شماره‌گذاری E. coli) در بسیاری از یوکاریوت‌های دیگر دارای باقی‌مانده‌های U1491 است.این تغییر نشان می دهد که E.cuniculi ممکن است به آنتی بیوتیک هایی که این محل فعال را هدف قرار می دهند حساس باشد.
بر خلاف ساختارهای قبلی ایجاد شده ریبوزوم های V. necatrix و P. locustae (هر دو ساختار نشان دهنده همان خانواده میکروسپوریدیا Nosematidae هستند و بسیار شبیه به یکدیگر هستند)، ریبوزوم های E. cuniculi تحت فرآیندهای متعددی از تکه تکه شدن rRNA و پروتئین قرار می گیرند.دناتوره سازی بیشتر (شکل های تکمیلی 4-6).در rRNA، چشمگیرترین تغییرات شامل از دست دادن کامل قطعه 25S rRNA تقویت شده ES12L و دژنراسیون جزئی مارپیچ های h39، h41 و H18 بود (شکل 1c، شکل تکمیلی 4).در میان پروتئین های ریبوزومی، بارزترین تغییرات شامل از دست دادن کامل پروتئین eS30 و کوتاه شدن پروتئین های eL8، eL13، eL18، eL22، eL29، eL40، uS3، uS9، uS14، uS17، و eS7 بود (شکل های تکمیلی 4، 5).
بنابراین، کاهش شدید ژنوم گونه‌های Encephalotozoon/Ordospora در ساختار ریبوزوم آن‌ها منعکس می‌شود: ریبوزوم‌های E. cuniculi بیشترین از دست دادن محتوای پروتئین را در ریبوزوم‌های سیتوپلاسمی یوکاریوتی در معرض خصوصیات ساختاری تجربه می‌کنند، و آن‌ها حتی آن سه قطعه rRNA و پروتئین را که نه تنها در دامنه‌های حیاتی e.ساختار ریبوزوم E. cuniculi اولین مدل مولکولی را برای این تغییرات ارائه می‌کند و رویدادهای تکاملی را نشان می‌دهد که هم توسط ژنومیک مقایسه‌ای و هم مطالعات ساختار بیومولکولی درون سلولی نادیده گرفته شده‌اند (شکل تکمیلی 7).در زیر، ما هر یک از این رویدادها را همراه با منشأ تکاملی احتمالی آنها و تأثیر بالقوه آنها بر عملکرد ریبوزوم توصیف می کنیم.
سپس دریافتیم که، علاوه بر برش های بزرگ rRNA، ریبوزوم های E. cuniculi دارای تغییرات rRNA در یکی از سایت های فعال خود هستند.اگرچه مرکز پپتیدیل ترانسفراز ریبوزوم E. cuniculi ساختاری مشابه سایر ریبوزوم های یوکاریوتی دارد (شکل 1d)، مرکز رمزگشایی به دلیل تنوع توالی در نوکلئوتید 1491 متفاوت است (شماره E. coli، شکل 1e, f).این مشاهدات مهم است زیرا محل رمزگشایی ریبوزوم های یوکاریوتی معمولاً حاوی باقی مانده های G1408 و A1491 در مقایسه با باقی مانده های نوع باکتریایی A1408 و G1491 است.این تنوع زمینه ساز حساسیت متفاوت ریبوزوم های باکتریایی و یوکاریوتی به خانواده آمینوگلیکوزیدهای آنتی بیوتیک های ریبوزومی و سایر مولکول های کوچکی است که محل رمزگشایی را هدف قرار می دهند.در محل رمزگشایی ریبوزوم E. cuniculi، باقیمانده A1491 با U1491 جایگزین شد، که به طور بالقوه یک رابط اتصال منحصر به فرد برای مولکول های کوچکی که این سایت فعال را هدف قرار می دهند ایجاد می کند.همان گونه A14901 در سایر میکروسپوریدی‌ها مانند P. locustae و V. necatrix نیز وجود دارد، که نشان می‌دهد که در بین گونه‌های میکروسپوریدیا گسترده است (شکل 1f).
از آنجایی که نمونه‌های ریبوزوم E. cuniculi ما از هاگ‌های غیرفعال متابولیکی جدا شده بودند، ما نقشه cryo-EM E. cuniculi را برای اتصال ریبوزوم قبلاً توصیف‌شده تحت شرایط استرس یا گرسنگی آزمایش کردیم.عوامل خواب زمستانی 31،32،36،37، 38. ما ساختار قبلی ایجاد شده ریبوزوم خواب زمستانی را با نقشه cryo-EM از ریبوزوم E. cuniculi مطابقت دادیم.برای اتصال، ریبوزوم های S. cerevisiae در کمپلکس با فاکتور خواب زمستانی Stm138، ریبوزوم های ملخ در کمپلکس با فاکتور Lso232 و ریبوزوم های V. necatrix در کمپلکس با فاکتورهای Mdf1 و Mdf231 استفاده شدند.در همان زمان، ما چگالی cryo-EM مربوط به عامل استراحت Mdf1 را پیدا کردیم.مشابه Mdf1 که به ریبوزوم V. necatrix متصل می شود، Mdf1 نیز به ریبوزوم E. cuniculi متصل می شود، جایی که محل E ریبوزوم را مسدود می کند، احتمالاً زمانی که هاگ های انگل پس از غیرفعال شدن بدن از نظر متابولیکی غیر فعال می شوند، به در دسترس قرار گرفتن ریبوزوم ها کمک می کند (شکل 2).).
Mdf1 محل E ریبوزوم را مسدود می‌کند، که به نظر می‌رسد وقتی اسپورهای انگل از نظر متابولیکی غیرفعال می‌شوند، به غیرفعال شدن ریبوزوم کمک می‌کند.در ساختار ریبوزوم E. cuniculi، متوجه شدیم که Mdf1 یک تماس قبلاً ناشناخته با ساقه ریبوزوم L1 ایجاد می کند، بخشی از ریبوزوم که آزاد شدن tRNA دی اسیله شده از ریبوزوم را در طول سنتز پروتئین تسهیل می کند.این تماس‌ها نشان می‌دهد که Mdf1 با استفاده از مکانیسم مشابه tRNA استیله‌شده از ریبوزوم جدا می‌شود و توضیحی ممکن برای چگونگی حذف Mdf1 توسط ریبوزوم برای فعال کردن سنتز پروتئین ارائه می‌دهد.
با این حال، ساختار ما یک تماس ناشناخته بین Mdf1 و پای ریبوزوم L1 (بخشی از ریبوزوم که به آزادسازی tRNA دی اسیله شده از ریبوزوم در طول سنتز پروتئین کمک می‌کند) نشان داد.به طور خاص، Mdf1 از همان تماس هایی استفاده می کند که بخش زانویی مولکول tRNA دی اسیله شده است (شکل 2).این مدل‌سازی مولکولی ناشناخته قبلی نشان داد که Mdf1 با استفاده از مکانیزم مشابه tRNA استیله‌شده از ریبوزوم جدا می‌شود، که توضیح می‌دهد که چگونه ریبوزوم این فاکتور خواب زمستانی را برای فعال کردن دوباره سنتز پروتئین حذف می‌کند.
هنگام ساخت مدل rRNA، متوجه شدیم که ریبوزوم E. cuniculi دارای قطعات rRNA غیرطبیعی چین خورده است که ما آن را rRNA ذوب شده نامیدیم (شکل 3).در ریبوزوم‌هایی که سه حوزه حیات را در بر می‌گیرند، rRNA به ساختارهایی تبدیل می‌شود که در آن بیشتر بازهای rRNA یا با یکدیگر جفت می‌شوند و با یکدیگر تا می‌شوند یا با پروتئین‌های ریبوزومی برهم‌کنش دارند.با این حال، در ریبوزوم های E. cuniculi، به نظر می رسد rRNA ها با تبدیل برخی از مارپیچ های خود به نواحی rRNA بازشده، این اصل تاخوردگی را نقض می کنند.
ساختار مارپیچ rRNA H18 25S در S. cerevisiae، V. necatrix و E. cuniculi.به طور معمول، در ریبوزوم هایی که سه حوزه حیات را در بر می گیرند، این پیوند دهنده به یک مارپیچ RNA که حاوی 24 تا 34 باقیمانده است، می پیچد.در مقابل، در Microsporidia، این پیوند دهنده rRNA به تدریج به دو پیوند دهنده غنی از یوریدین تک رشته ای کاهش می یابد که تنها حاوی 12 باقیمانده است.بیشتر این باقیمانده ها در معرض حلال ها هستند.شکل نشان می‌دهد که به نظر می‌رسد میکروسپوریدی‌های انگلی اصول کلی تاخوردگی rRNA را نقض می‌کنند، جایی که بازهای rRNA معمولاً با سایر پایگاه‌ها جفت می‌شوند یا در تعاملات rRNA-پروتئین نقش دارند.در میکروسپوریدیا، برخی از قطعات rRNA چین نامطلوبی به خود می گیرند، که در آن مارپیچ rRNA قبلی به یک قطعه تک رشته ای تبدیل می شود که تقریباً در یک خط مستقیم کشیده شده است.وجود این مناطق غیرمعمول به microsporidia rRNA اجازه می دهد تا قطعات rRNA دوردست را با استفاده از حداقل تعداد بازهای RNA متصل کند.
بارزترین نمونه از این انتقال تکاملی را می توان در مارپیچ H18 25S rRNA مشاهده کرد (شکل 3).در گونه هایی از E. coli گرفته تا انسان، پایه های این مارپیچ rRNA حاوی 24-32 نوکلئوتید هستند که یک مارپیچ کمی نامنظم را تشکیل می دهند.در ساختارهای ریبوزومی قبلاً شناسایی شده از V. necatrix و P. locustae، 31،32، پایه های مارپیچ H18 تا حدی باز نشده است، اما جفت شدن بازهای نوکلئوتیدی حفظ می شود.با این حال، در E. cuniculi این قطعه rRNA به کوتاه ترین پیوند دهنده 228UUUGU232 و 301UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU تبدیل می شود.برخلاف قطعات rRNA معمولی، این پیوندهای غنی از یوریدین با پروتئین‌های ریبوزومی مارپیچ نمی‌شوند یا تماس گسترده‌ای برقرار نمی‌کنند.در عوض، آنها ساختارهای حلال باز و کاملاً باز شده را اتخاذ می کنند که در آن رشته های rRNA تقریباً مستقیم گسترش یافته اند.این ترکیب کشیده توضیح می‌دهد که چگونه E. cuniculi تنها از 12 باز RNA برای پر کردن شکاف 33 Å بین مارپیچ‌های rRNA H16 و H18 استفاده می‌کند، در حالی که سایر گونه‌ها به حداقل دو برابر تعداد بازهای rRNA برای پر کردن شکاف نیاز دارند.
بنابراین، ما می‌توانیم نشان دهیم که، از طریق چین‌خوردگی نامطلوب انرژی، میکروسپوریدی‌های انگلی راهبردی را برای انقباض حتی بخش‌های rRNA که به طور گسترده در بین گونه‌ها در سه حوزه حیات حفظ می‌شوند، توسعه داده‌اند.ظاهراً، با تجمع جهش‌هایی که مارپیچ‌های rRNA را به پیوند دهنده‌های کوتاه poly-U تبدیل می‌کنند، E. cuniculi می‌تواند قطعات rRNA غیرمعمول حاوی کمترین نوکلئوتید را برای بستن قطعات rRNA دیستال تشکیل دهد.این کمک می کند تا توضیح دهیم که چگونه میکروسپوریدیا به کاهش چشمگیری در ساختار مولکولی پایه خود بدون از دست دادن یکپارچگی ساختاری و عملکردی خود دست یافتند.
یکی دیگر از ویژگی های غیرمعمول rRNA E. cuniculi ظاهر شدن rRNA بدون ضخیم شدن است (شکل 4).برآمدگی ها نوکلئوتیدهایی بدون جفت باز هستند که به جای پنهان شدن در مارپیچ RNA به بیرون می پیچند.اکثر برآمدگی های rRNA به عنوان چسب مولکولی عمل می کنند و به اتصال پروتئین های ریبوزومی مجاور یا سایر قطعات rRNA کمک می کنند.برخی از برآمدگی‌ها به‌عنوان لولا عمل می‌کنند و به مارپیچ rRNA اجازه می‌دهند تا برای سنتز پروتئین تولیدی به‌طور بهینه خم و تا شوند.
a یک برآمدگی rRNA (شماره S. cerevisiae) در ساختار ریبوزوم E. cuniculi وجود ندارد، اما در ریبوزوم های داخلی E. coli، S. cerevisiae، H. sapiens و E. cuniculi وجود دارد.انگل ها فاقد بسیاری از برآمدگی های rRNA باستانی و بسیار حفاظت شده هستند.این ضخیم شدن ساختار ریبوزوم را تثبیت می کند.بنابراین، عدم وجود آنها در میکروسپوریدیا نشان‌دهنده کاهش پایداری تاخوردگی rRNA در انگل‌های میکروسپوریدی است.مقایسه با ساقه های P (ساقه های L7/L12 در باکتری ها) نشان می دهد که از بین رفتن برجستگی های rRNA گاهی با ظهور برجستگی های جدید در کنار برجستگی های از دست رفته همزمان است.مارپیچ H42 در rRNA 23S/28S دارای یک برآمدگی باستانی (U1206 در ساکارومایسس سرویزیه) است که به دلیل محافظت در سه حوزه حیات، حداقل 3.5 میلیارد سال تخمین زده می شود.در میکروسپوریدیا این برآمدگی از بین می رود.با این حال، یک برآمدگی جدید در کنار برآمدگی گم شده ظاهر شد (A1306 در E. cuniculi).
به طور شگفت انگیزی، ما دریافتیم که ریبوزوم های E. cuniculi فاقد اکثر برآمدگی های rRNA موجود در گونه های دیگر هستند، از جمله بیش از 30 برآمدگی حفظ شده در سایر یوکاریوت ها (شکل 4a).این از دست دادن بسیاری از تماس‌های بین زیر واحدهای ریبوزومی و مارپیچ‌های rRNA مجاور را از بین می‌برد، گاهی اوقات حفره‌های توخالی بزرگی در ریبوزوم ایجاد می‌کند و ریبوزوم E. cuniculi را در مقایسه با ریبوزوم‌های سنتی‌تر متخلخل‌تر می‌کند (شکل 4b).قابل ذکر است، ما دریافتیم که بیشتر این برآمدگی‌ها در ساختارهای ریبوزوم V. necatrix و P. locustae که قبلاً شناسایی شده بودند، از بین رفته بودند، که توسط تحلیل‌های ساختاری قبلی نادیده گرفته شدند.
گاهی اوقات از بین رفتن برآمدگی های rRNA با ایجاد برآمدگی های جدید در کنار برآمدگی از دست رفته همراه است.به عنوان مثال، ساقه P ریبوزومی حاوی یک برآمدگی U1208 (در ساکارومایسس سرویزیه) است که از E. coli تا انسان زنده مانده است و بنابراین تخمین زده می شود که 3.5 میلیارد سال سن داشته باشد.در طول سنتز پروتئین، این برآمدگی به ساقه P کمک می کند تا بین ترکیبات باز و بسته حرکت کند تا ریبوزوم بتواند فاکتورهای ترجمه را جذب کرده و آنها را به محل فعال برساند.در ریبوزوم های E. cuniculi، این ضخیم شدن وجود ندارد.با این حال، یک ضخیم شدن جدید (G883) که فقط در سه جفت پایه قرار دارد می تواند به بازیابی انعطاف پذیری بهینه ساقه P کمک کند (شکل 4c).
داده های ما در مورد rRNA بدون برآمدگی نشان می دهد که به حداقل رساندن rRNA به از دست دادن عناصر rRNA در سطح ریبوزوم محدود نمی شود، بلکه ممکن است هسته ریبوزوم را نیز درگیر کند و یک نقص مولکولی خاص انگل ایجاد کند که در سلول های آزاد توصیف نشده است.گونه های زنده مشاهده می شود.
پس از مدل‌سازی پروتئین‌های ریبوزومی متعارف و rRNA، متوجه شدیم که اجزای ریبوزومی معمولی نمی‌توانند سه بخش تصویر cryo-EM را توضیح دهند.دو تا از این قطعات مولکول های کوچکی هستند (شکل 5، شکل تکمیلی 8).بخش اول بین پروتئین های ریبوزومی uL15 و eL18 در موقعیتی قرار می گیرد که معمولاً توسط C-پایانه eL18 اشغال می شود که در E. cuniculi کوتاه شده است.اگرچه ما نمی توانیم هویت این مولکول را تعیین کنیم، اما اندازه و شکل این جزیره چگالی به خوبی با حضور مولکول های اسپرمیدین توضیح داده شده است.اتصال آن به ریبوزوم توسط جهش های اختصاصی میکروسپوریدی در پروتئین های uL15 (Asp51 و Arg56) تثبیت می شود، که به نظر می رسد میل ترکیبی ریبوزوم را برای این مولکول کوچک افزایش می دهد، زیرا به uL15 اجازه می دهد تا مولکول کوچک را در یک ساختار ریبوزومی بپیچد.شکل تکمیلی 2).8، داده های اضافی 1، 2).
تصویربرداری Cryo-EM که حضور نوکلئوتیدها را در خارج از ریبوز متصل به ریبوزوم E. cuniculi نشان می دهد.در ریبوزوم E. cuniculi، این نوکلئوتید همان مکان نوکلئوتید 25S rRNA A3186 (شماره ساکارومایسس سرویزیه) در اکثر ریبوزوم های یوکاریوتی دیگر را اشغال می کند.b در ساختار ریبوزومی E. cuniculi، این نوکلئوتید بین پروتئین های ریبوزومی uL9 و eL20 قرار دارد و در نتیجه تماس بین دو پروتئین را تثبیت می کند.تجزیه و تحلیل حفظ توالی cd eL20 در میان گونه های میکروسپوریدیا.درخت فیلوژنتیک گونه های Microsporidia (c) و هم ترازی توالی چندگانه پروتئین eL20 (d) نشان می دهد که باقیمانده های اتصال به نوکلئوتید F170 و K172 در اکثر میکروسپوریدی های معمولی، به استثنای S. lophii، به استثنای Microsporidia های شاخه دار اولیه، RRNA که ES3 گسترش یافته اند، حفظ شده اند.e این شکل نشان می دهد که باقیمانده های اتصال به نوکلئوتید F170 و K172 فقط در eL20 ژنوم میکروسپوریدیای بسیار کاهش یافته وجود دارد، اما در سایر یوکاریوت ها وجود ندارد.به طور کلی، این داده ها نشان می دهد که ریبوزوم های Microsporidian یک محل اتصال نوکلئوتیدی ایجاد کرده اند که به نظر می رسد مولکول های AMP را متصل می کند و از آنها برای تثبیت برهمکنش های پروتئین-پروتئین در ساختار ریبوزومی استفاده می کند.حفظ بالای این محل اتصال در Microsporidia و عدم وجود آن در سایر یوکاریوت ها نشان می دهد که این سایت ممکن است یک مزیت بقای انتخابی برای Microsporidia فراهم کند.بنابراین، به نظر نمی رسد که محفظه اتصال به نوکلئوتید در ریبوزوم میکروسپوریدیا یک ویژگی منحط یا شکل نهایی تخریب rRNA باشد که قبلاً توضیح داده شد، بلکه یک نوآوری تکاملی مفید است که به ریبوزوم میکروسپوریدی اجازه می دهد مستقیماً مولکول های کوچک را با استفاده از آنها به عنوان بلوک های سازنده مولکولی متصل کند.بلوک های ساختمانی برای ریبوزوم هااین کشف، ریبوزوم میکروسپوریدیا را به تنها ریبوزوم شناخته شده ای تبدیل می کند که از یک نوکلئوتید به عنوان بلوک ساختاری خود استفاده می کند.f مسیر تکاملی فرضی ناشی از اتصال نوکلئوتیدی.
دومین چگالی با وزن مولکولی کم در حد فاصل بین پروتئین های ریبوزومی uL9 و eL30 قرار دارد (شکل 5a).این رابط قبلاً در ساختار ریبوزوم ساکارومایسس سرویزیه به عنوان یک محل اتصال برای نوکلئوتید 25S rRNA A3186 (بخشی از پسوند ES39L rRNA)38 توصیف شده بود.نشان داده شد که در ریبوزوم‌های منحط P. locustae ES39L، این رابط به یک نوکلئوتید مجهول ناشناخته 31 متصل می‌شود، و فرض بر این است که این نوکلئوتید شکل نهایی کاهش‌یافته rRNA است که در آن طول rRNA ~130-230 باز است.ES39L به یک نوکلئوتید منفرد 32.43 کاهش می یابد.تصاویر cryo-EM ما از این ایده پشتیبانی می کنند که چگالی را می توان با نوکلئوتیدها توضیح داد.با این حال، وضوح بالاتر ساختار ما نشان داد که این نوکلئوتید یک مولکول خارج ریبوزومی، احتمالا AMP است (شکل 5a، b).
سپس پرسیدیم که آیا محل اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم E. cuniculi ظاهر شده است یا اینکه قبلا وجود داشته است.از آنجایی که اتصال نوکلئوتیدی عمدتاً توسط باقی مانده‌های Phe170 و Lys172 در پروتئین ریبوزومی eL30 انجام می‌شود، ما حفاظت از این باقی مانده‌ها را در 4396 یوکاریوت نماینده ارزیابی کردیم.همانطور که در مورد uL15 بالا، ما متوجه شدیم که باقیمانده‌های Phe170 و Lys172 فقط در میکروسپوریدی‌های معمولی به شدت حفظ می‌شوند، اما در یوکاریوت‌های دیگر، از جمله Microsporidia Mitosporidium و Amphiamblys که در آن قطعه ES39L rRNA کاهش نمی‌یابد، وجود ندارد (شکل 45,44,6).-ه).
روی هم رفته، این داده‌ها از این ایده حمایت می‌کنند که E. cuniculi و احتمالاً سایر میکروسپوریدی‌های متعارف، توانایی جذب مؤثر تعداد زیادی از متابولیت‌های کوچک در ساختار ریبوزوم را برای جبران کاهش سطوح rRNA و پروتئین، تکامل داده‌اند.با انجام این کار، آنها توانایی منحصر به فردی برای اتصال نوکلئوتیدها به خارج از ریبوزوم ایجاد کردند که نشان می دهد ساختارهای مولکولی انگلی با گرفتن متابولیت های کوچک فراوان و استفاده از آنها به عنوان تقلید ساختاری قطعات RNA و پروتئین تجزیه شده جبران می کنند..
سومین بخش شبیه‌سازی‌نشده از نقشه cryo-EM ما، که در زیر واحد ریبوزومی بزرگ یافت می‌شود.وضوح نسبتاً بالا (2.6 Å) نقشه ما نشان می دهد که این چگالی متعلق به پروتئین هایی با ترکیبات منحصر به فرد باقی مانده های زنجیره جانبی بزرگ است که به ما امکان می دهد این تراکم را به عنوان یک پروتئین ریبوزومی ناشناخته قبلی شناسایی کنیم که به عنوان msL2 (پروتئین L2 مخصوص میکروسپوریدیا) نامگذاری شد (روش ها، شکل 6).جستجوی همسانی ما نشان داد که msL2 در کلاد Microsporidia از جنس Encephaliter و Orosporidium حفظ شده است، اما در گونه‌های دیگر، از جمله سایر Microsporidia وجود ندارد.در ساختار ریبوزومی، msL2 شکافی را اشغال می کند که با از بین رفتن rRNA ES31L گسترش یافته ایجاد شده است.در این فضای خالی، msL2 به تثبیت تا شدن rRNA کمک می کند و می تواند از دست دادن ES31L را جبران کند (شکل 6).
چگالی الکترونی و مدل پروتئین ریبوزومی اختصاصی میکروسپوریدیا msL2 موجود در ریبوزوم های E. cuniculi.b اکثر ریبوزوم های یوکاریوتی، از جمله ریبوزوم 80S ساکارومایسس سرویزیه، دارای تکثیر ES19L rRNA در اکثر گونه های میکروسپوریدی هستند.ساختار قبلی ایجاد شده ریبوزوم V. necatrix microsporidia نشان می دهد که از دست دادن ES19L در این انگل ها با تکامل پروتئین ریبوزومی جدید msL1 جبران می شود.در این مطالعه، ما دریافتیم که ریبوزوم E. cuniculi همچنین یک پروتئین مقلد RNA ریبوزومی اضافی را به عنوان جبرانی آشکار برای از دست دادن ES19L ایجاد کرد.با این حال، msL2 (در حال حاضر به عنوان پروتئین فرضی ECU06_1135 توضیح داده شده است) و msL1 منشأ ساختاری و تکاملی متفاوتی دارند.این کشف از تولید پروتئین‌های ریبوزومی msL1 و msL2 که از نظر تکاملی نامرتبط هستند، نشان می‌دهد که اگر ریبوزوم‌ها جهش‌های مضر را در rRNA خود جمع کنند، می‌توانند به سطوح بی‌سابقه‌ای از تنوع ترکیبی حتی در زیرمجموعه کوچکی از گونه‌های نزدیک به هم دست یابند.این کشف می تواند به روشن شدن منشاء و تکامل ریبوزوم میتوکندری کمک کند، ریبوزوم میتوکندری که به دلیل rRNA بسیار کاهش یافته و تنوع غیر طبیعی در ترکیب پروتئین در بین گونه ها شناخته شده است.
سپس پروتئین msL2 را با پروتئین msL1 که قبلاً توضیح داده شد، مقایسه کردیم، تنها پروتئین ریبوزومی خاص میکروسپوریدیایی که در ریبوزوم V. necatrix یافت می‌شود.ما می خواستیم آزمایش کنیم که آیا msL1 و msL2 از نظر تکاملی مرتبط هستند یا خیر.تجزیه و تحلیل ما نشان داد که msL1 و msL2 یک حفره را در ساختار ریبوزومی اشغال می کنند، اما ساختارهای اولیه و سوم متفاوتی دارند که نشان دهنده منشاء تکاملی مستقل آنها است (شکل 6).بنابراین، کشف msL2 ما شواهدی را ارائه می‌کند که گروه‌هایی از گونه‌های یوکاریوتی فشرده می‌توانند به طور مستقل پروتئین‌های ریبوزومی متمایز ساختاری را برای جبران از دست دادن قطعات rRNA تکامل دهند.این یافته از این جهت قابل توجه است که اکثر ریبوزوم های یوکاریوتی سیتوپلاسمی حاوی یک پروتئین ثابت، از جمله همان خانواده از 81 پروتئین ریبوزومی هستند.ظهور msL1 و msL2 در کلادهای مختلف میکروسپوریدی‌ها در پاسخ به از دست دادن بخش‌های rRNA گسترده نشان می‌دهد که تخریب ساختار مولکولی انگل باعث می‌شود انگل‌ها به دنبال جهش‌های جبرانی باشند که در نهایت ممکن است منجر به کسب آنها در جمعیت‌های مختلف انگل شود.سازه های.
در نهایت، زمانی که مدل ما تکمیل شد، ترکیب ریبوزوم E. cuniculi را با آن چیزی که از توالی ژنوم پیش‌بینی شده بود، مقایسه کردیم.چندین پروتئین ریبوزومی، از جمله eL14، eL38، eL41، و eS30، قبلاً تصور می‌شد که در ژنوم E. cuniculi به دلیل عدم وجود همولوگ آنها در ژنوم E. cuniculi وجود ندارند.از دست دادن بسیاری از پروتئین‌های ریبوزومی نیز در بسیاری از انگل‌های درون سلولی بسیار کاهش‌یافته و درون همزیستی‌ها پیش‌بینی می‌شود.برای مثال، اگرچه اکثر باکتری‌های آزاد حاوی همان خانواده 54 پروتئینی ریبوزومی هستند، تنها 11 خانواده از این خانواده‌های پروتئینی همولوگ‌های قابل تشخیص در هر ژنوم آنالیز شده باکتری‌های محدود شده میزبان دارند.در حمایت از این مفهوم، از دست دادن پروتئین های ریبوزومی به طور تجربی در V. necatrix و P. locustae microsporidia، که فاقد پروتئین های eL38 و eL4131،32 هستند، مشاهده شده است.
با این حال، ساختارهای ما نشان می دهد که تنها eL38، eL41، و eS30 در واقع در ریبوزوم E. cuniculi گم می شوند.پروتئین eL14 حفظ شد و ساختار ما نشان داد که چرا این پروتئین در جستجوی همسانی یافت نشد (شکل 7).در ریبوزوم های E. cuniculi، بیشتر محل اتصال eL14 به دلیل تخریب ES39L تقویت شده با rRNA از بین می رود.در غیاب ES39L، eL14 بیشتر ساختار ثانویه خود را از دست داد و تنها 18 درصد از توالی eL14 در E. cuniculi و S. cerevisiae یکسان بود.این حفظ توالی ضعیف قابل توجه است زیرا حتی Saccharomyces cerevisiae و Homo sapiens - ارگانیسم هایی که با فاصله 1.5 میلیارد سال از هم تکامل یافته اند - بیش از 51٪ از باقی مانده های مشابه در eL14 را به اشتراک می گذارند.این از دست دادن غیرعادی حفاظت توضیح می دهد که چرا E. cuniculi eL14 در حال حاضر به عنوان پروتئین فرضی M970_061160 و نه به عنوان پروتئین ریبوزومی eL1427 حاشیه نویسی می شود.
و ریبوزوم Microsporidia پسوند ES39L rRNA را از دست داد، که تا حدی محل اتصال پروتئین ریبوزومی eL14 را حذف کرد.در غیاب ES39L، پروتئین میکروسپور eL14 دچار از دست دادن ساختار ثانویه می شود، که در آن آلفا-مارپیچ متصل به rRNA سابق به یک حلقه با طول حداقل تبدیل می شود.b هم ترازی توالی چندگانه نشان می دهد که پروتئین eL14 در گونه های یوکاریوتی به شدت حفظ شده است (57٪ هویت توالی بین مخمر و همولوگ انسان)، اما در میکروسپوریدیا (که در آن بیش از 24٪ باقیمانده ها مشابه همولوگ eL14 نیستند) ضعیف و واگرا است.از S. cerevisiae یا H. sapiens).این حفظ توالی ضعیف و تنوع ساختار ثانویه توضیح می دهد که چرا همولوگ eL14 هرگز در E. cuniculi یافت نشده است و چرا تصور می شود که این پروتئین در E. cuniculi گم شده است.در مقابل، E. cuniculi eL14 قبلاً به عنوان یک پروتئین M970_061160 مطرح شده بود.این مشاهدات نشان می‌دهد که تنوع ژنوم میکروسپوریدیا در حال حاضر بیش از حد برآورد شده است: برخی از ژن‌هایی که در حال حاضر تصور می‌شود در میکروسپوریدیا گم شده‌اند، در واقع حفظ شده‌اند، البته به شکل‌های بسیار متمایز.در عوض، تصور می‌شود که برخی از ژن‌های میکروسپوریدیا برای پروتئین‌های مخصوص کرم (مثلاً پروتئین فرضی M970_061160) در واقع پروتئین‌های بسیار متنوع موجود در یوکاریوت‌های دیگر را کد می‌کنند.
این یافته نشان می‌دهد که دناتوره‌سازی rRNA می‌تواند منجر به از دست دادن چشمگیر حفظ توالی در پروتئین‌های ریبوزومی مجاور شود و این پروتئین‌ها را برای جستجوی همسانی غیرقابل شناسایی کند.بنابراین، ممکن است درجه واقعی تخریب مولکولی در ارگانیسم‌های ژنومی کوچک را بیش از حد تخمین بزنیم، زیرا برخی از پروتئین‌هایی که گمان می‌رود از بین رفته‌اند، در واقع باقی می‌مانند، البته در اشکال بسیار تغییر یافته.
چگونه انگل ها می توانند عملکرد ماشین های مولکولی خود را تحت شرایط کاهش شدید ژنوم حفظ کنند؟مطالعه ما با توصیف ساختار مولکولی پیچیده (ریبوزوم) E. cuniculi، موجودی با یکی از کوچک‌ترین ژنوم‌های یوکاریوتی، به این سوال پاسخ می‌دهد.
تقریباً دو دهه است که مشخص شده است که مولکول‌های پروتئین و RNA در انگل‌های میکروبی اغلب با مولکول‌های همولوگ خود در گونه‌های آزاد متفاوت هستند، زیرا فاقد مراکز کنترل کیفیت هستند، در میکروب‌های آزاد به ۵۰ درصد اندازه خود کاهش می‌یابند و غیره.بسیاری از جهش های ناتوان کننده که چین خوردگی و عملکرد را مختل می کنند.برای مثال، انتظار می‌رود که ریبوزوم‌های ارگانیسم‌های ژنومی کوچک، از جمله بسیاری از انگل‌های درون سلولی و همزیست‌های درون سلولی، در مقایسه با گونه‌های زنده آزاد 27، 29، 30، 49، فاقد چندین پروتئین ریبوزومی و تا یک سوم نوکلئوتیدهای rRNA باشند.
مطالعه ما نشان می‌دهد که ساختار ماکرومولکول‌ها می‌تواند بسیاری از جنبه‌های تکامل را آشکار کند که استخراج آن‌ها از مطالعات ژنومی مقایسه‌ای سنتی انگل‌های درون سلولی و سایر ارگانیسم‌های محدود شده توسط میزبان دشوار است (شکل تکمیلی 7).برای مثال، مثال پروتئین eL14 نشان می‌دهد که می‌توانیم درجه واقعی تخریب دستگاه مولکولی در گونه‌های انگلی را بیش از حد تخمین بزنیم.اکنون اعتقاد بر این است که انگل های انسفالیتیک دارای صدها ژن خاص میکروسپوریدیا هستند.با این حال، نتایج ما نشان می‌دهد که برخی از این ژن‌های به ظاهر خاص، در واقع انواع بسیار متفاوتی از ژن‌ها هستند که در یوکاریوت‌های دیگر رایج هستند.علاوه بر این، مثال پروتئین msL2 نشان می دهد که چگونه پروتئین های ریبوزومی جدید را نادیده می گیریم و محتوای ماشین های مولکولی انگلی را دست کم می گیریم.مثال مولکول‌های کوچک نشان می‌دهد که چگونه می‌توانیم خلاقانه‌ترین نوآوری‌ها را در ساختارهای مولکولی انگلی نادیده بگیریم که می‌تواند به آنها فعالیت بیولوژیکی جدیدی بدهد.
روی هم رفته، این نتایج درک ما را از تفاوت‌های بین ساختارهای مولکولی موجودات محدود میزبان و همتایان آن‌ها در موجودات زنده آزاد بهبود می‌بخشد.ما نشان می‌دهیم که ماشین‌های مولکولی، که مدت‌ها تصور می‌شد کاهش می‌یابند، منحط می‌شوند و در معرض جهش‌های تضعیف‌کننده مختلف هستند، در عوض دارای مجموعه‌ای از ویژگی‌های ساختاری غیرمعمول نادیده گرفته شده‌اند.
از سوی دیگر، قطعات غیر حجیم rRNA و قطعات ذوب‌شده‌ای که در ریبوزوم‌های E. cuniculi یافتیم، نشان می‌دهد که کاهش ژنوم می‌تواند حتی آن بخش‌هایی از ماشین‌های مولکولی اساسی را که در سه حوزه حیات حفظ شده‌اند، پس از تقریباً 3.5 میلیارد سال تغییر دهد.تکامل مستقل گونه ها
قطعات rRNA بدون برآمدگی و ذوب شده در ریبوزوم‌های E. cuniculi در پرتو مطالعات قبلی مولکول‌های RNA در باکتری‌های درون همزیستی مورد توجه خاص هستند.به عنوان مثال، در شته endosymbiont Buchnera aphidicola، مولکول‌های rRNA و tRNA به دلیل سوگیری ترکیب A+T و نسبت بالایی از جفت‌های باز غیر متعارف، ساختارهای حساس به دما دارند.تصور می‌شود که این تغییرات در RNA و همچنین تغییرات در مولکول‌های پروتئین، مسئول وابستگی بیش از حد همزیست‌های درونی به شرکا و ناتوانی درون همزیستی‌ها در انتقال گرما هستند.اگرچه rRNA میکروسپوریدی انگلی دارای تغییرات ساختاری مشخصی است، ماهیت این تغییرات نشان می‌دهد که کاهش پایداری حرارتی و وابستگی بیشتر به پروتئین‌های چاپرون ممکن است ویژگی‌های مشترک مولکول‌های RNA در ارگانیسم‌هایی با ژنوم کاهش یافته باشد.
از سوی دیگر، ساختارهای ما نشان می‌دهند که میکروسپوریدی‌های انگل توانایی منحصربه‌فردی را برای مقاومت در برابر قطعات پروتئین و rRNA به طور گسترده حفظ کرده‌اند، و توانایی استفاده از متابولیت‌های کوچک فراوان و در دسترس را به‌عنوان تقلید ساختاری قطعات پروتئین و rRNA منحط ایجاد کرده‌اند.تخریب ساختار مولکولی.این نظر با این واقعیت پشتیبانی می‌شود که مولکول‌های کوچکی که از دست دادن قطعات پروتئین در rRNA و ریبوزوم‌های E. cuniculi را جبران می‌کنند به باقی مانده‌های اختصاصی میکروسپوریدیا در پروتئین‌های uL15 و eL30 متصل می‌شوند.این نشان می‌دهد که اتصال مولکول‌های کوچک به ریبوزوم‌ها ممکن است محصول انتخاب مثبت باشد، که در آن جهش‌های اختصاصی Microsporidia در پروتئین‌های ریبوزومی به دلیل توانایی آنها در افزایش میل ترکیبی ریبوزوم‌ها برای مولکول‌های کوچک انتخاب شده‌اند، که ممکن است منجر به ارگانیسم‌های ریبوزومی کارآمدتر شود.این کشف یک نوآوری هوشمند را در ساختار مولکولی انگل‌های میکروبی نشان می‌دهد و به ما درک بهتری از نحوه حفظ عملکرد ساختارهای مولکولی انگل با وجود تکامل تقلیل‌دهنده به ما می‌دهد.
در حال حاضر، شناسایی این مولکول های کوچک نامشخص است.مشخص نیست که چرا ظاهر این مولکول های کوچک در ساختار ریبوزومی بین گونه های میکروسپوریدیا متفاوت است.به طور خاص، مشخص نیست که چرا اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم های E. cuniculi و P. locustae، و نه در ریبوزوم های V. necatrix، با وجود وجود باقی مانده F170 در پروتئین های eL20 و K172 V. necatrix مشاهده می شود.این حذف ممکن است توسط باقیمانده 43 uL6 (واقع در مجاورت پاکت اتصال نوکلئوتیدی) ایجاد شود که تیروزین در V. necatrix است و نه ترئونین در E. cuniculi و P. locustae.زنجیره جانبی معطر حجیم Tyr43 می تواند به دلیل همپوشانی فضایی با اتصال نوکلئوتیدی تداخل ایجاد کند.روش دیگر، حذف نوکلئوتید آشکار ممکن است به دلیل وضوح پایین تصویربرداری cryo-EM باشد، که مانع از مدل‌سازی قطعات ریبوزومی V. necatrix می‌شود.
از سوی دیگر، کار ما نشان می‌دهد که فرآیند فروپاشی ژنوم ممکن است یک نیروی اختراعی باشد.به طور خاص، ساختار ریبوزوم E. cuniculi نشان می دهد که از دست دادن قطعات rRNA و پروتئین در ریبوزوم میکروسپوریدیا باعث ایجاد فشار تکاملی می شود که باعث تغییرات در ساختار ریبوزوم می شود.این گونه ها دور از محل فعال ریبوزوم رخ می دهند و به نظر می رسد به حفظ (یا بازیابی) مجموعه ریبوزوم بهینه کمک می کنند که در غیر این صورت با کاهش rRNA مختل می شود.این نشان می‌دهد که به نظر می‌رسد یک نوآوری بزرگ در ریبوزوم میکروسپوریدیا به نیاز به بافر کردن رانش ژن تبدیل شده است.
شاید این به بهترین وجه با اتصال نوکلئوتیدی که تا کنون در موجودات دیگر مشاهده نشده است، نشان داده شود.این واقعیت که بقایای اتصال به نوکلئوتید در میکروسپوریدی‌های معمولی وجود دارد، اما در یوکاریوت‌های دیگر وجود ندارد، نشان می‌دهد که مکان‌های اتصال به نوکلئوتید فقط آثاری نیستند که منتظر ناپدید شدن هستند، یا مکان نهایی rRNA برای بازیابی به شکل نوکلئوتیدهای منفرد نیستند.در عوض، به نظر می‌رسد این سایت یک ویژگی مفید است که می‌توانست طی چندین دور انتخاب مثبت تکامل یافته باشد.محل‌های اتصال نوکلئوتیدی ممکن است محصول جانبی انتخاب طبیعی باشند: هنگامی که ES39L تجزیه می‌شود، میکروسپوریدی‌ها مجبور می‌شوند در غیاب ES39L به دنبال جبران برای بازگرداندن بیوژنز بهینه ریبوزوم باشند.از آنجایی که این نوکلئوتید می‌تواند تماس‌های مولکولی نوکلئوتید A3186 در ES39L را تقلید کند، مولکول نوکلئوتید به بلوک ساختمانی ریبوزوم تبدیل می‌شود که اتصال آن با جهش توالی eL30 بیشتر بهبود می‌یابد.
با توجه به تکامل مولکولی انگل های درون سلولی، مطالعه ما نشان می دهد که نیروهای انتخاب طبیعی داروینی و رانش ژنتیکی فروپاشی ژنوم به صورت موازی عمل نمی کنند، بلکه در نوسان هستند.اول، رانش ژنتیکی ویژگی‌های مهم زیست مولکول‌ها را از بین می‌برد و جبران آن را به شدت مورد نیاز می‌سازد.تنها زمانی که انگل‌ها این نیاز را از طریق انتخاب طبیعی داروینی برآورده کنند، درشت مولکول‌های آنها فرصتی برای توسعه چشمگیرترین و خلاقانه‌ترین ویژگی‌های خود خواهند داشت.نکته مهم این است که تکامل مکان‌های اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم E. cuniculi نشان می‌دهد که این الگوی از دست دادن به سود تکامل مولکولی نه تنها جهش‌های مضر را از بین می‌برد، بلکه گاهی اوقات عملکردهای کاملاً جدیدی را به ماکرومولکول‌های انگلی می‌دهد.
این ایده با تئوری تعادل متحرک سول رایت مطابقت دارد، که بیان می کند که یک سیستم دقیق انتخاب طبیعی توانایی موجودات را برای نوآوری محدود می کند.با این حال، اگر رانش ژنتیکی انتخاب طبیعی را مختل کند، این رانش‌ها می‌توانند تغییراتی ایجاد کنند که به خودی خود تطبیقی ​​(یا حتی مضر) نیستند، اما منجر به تغییرات بیشتر می‌شوند که تناسب بالاتر یا فعالیت بیولوژیکی جدید را فراهم می‌کنند.چارچوب ما این ایده را با نشان دادن اینکه همان نوع جهش که چین خوردگی و عملکرد یک مولکول زیستی را کاهش می‌دهد، محرک اصلی برای بهبود آن است، پشتیبانی می‌کند.در راستای مدل تکاملی برد-برد، مطالعه ما نشان می‌دهد که فروپاشی ژنوم، که به طور سنتی به عنوان یک فرآیند تخریبی در نظر گرفته می‌شود، همچنین محرک اصلی نوآوری است، که گاهی اوقات و شاید حتی اغلب به ماکرومولکول‌ها اجازه می‌دهد تا فعالیت‌های انگلی جدیدی به دست آورند.می تواند از آنها استفاده کند.