برخی از موضوعات عیب‌یابی LC هرگز قدیمی نیستند، زیرا در عمل LC مشکلاتی وجود دارد، حتی با بهبود فناوری ابزار در طول زمان. راه‌های زیادی وجود دارد که از طریق آن‌ها می‌توانند مشکلات در یک سیستم LC ایجاد شوند و در نهایت به شکل اوج ضعیفی ختم شوند. وقتی مشکلات مربوط به شکل اوج به وجود می‌آیند، فهرست کوتاهی از دلایل احتمالی برای این نتایج به ساده‌تر شدن تجربه عیب‌یابی ما کمک می‌کند.
نوشتن این ستون «عیب‌یابی LC» و فکر کردن در مورد موضوعات هر ماه بسیار سرگرم‌کننده است، زیرا برخی از موضوعات هرگز از مد نمی‌افتند. در حالی که در زمینه تحقیقات کروماتوگرافی، برخی از موضوعات یا ایده‌ها منسوخ می‌شوند زیرا با ایده‌های جدیدتر و بهتر، در زمینه عیب‌یابی جایگزین می‌شوند، از زمانی که اولین مقاله عیب‌یابی در این مجله منتشر شد. در چند سال گذشته، من چندین بخش عیب‌یابی LC را روی روندهای معاصر مؤثر بر کروماتوگرافی مایع (LC) متمرکز کرده‌ام (برای مثال، مقایسه نسبی درک ما از تأثیر فشار بر حفظ [2] پیشرفت‌های جدید) تفسیر ما از نتایج LC و نحوه عیب‌یابی با ابزارهای مدرن LC. و مرگ» موضوعات عیب‌یابی LC — عناصری که برای هر عیب‌یابی عالی هستند، مهم نیست، مهم نیست از سن سیستمی که استفاده می‌کنیم. موضوع اصلی این مجموعه به نمودار دیواری معروف «راهنمای عیب‌یابی LC» LCGC (4) که در بسیاری از آزمایشگاه‌ها آویزان شده است، بسیار مرتبط است. یا اوج شکل!
به‌طور فزاینده‌ای به سؤال‌های عیب‌یابی با «هر چیزی ممکن است» پاسخ می‌دهم. این پاسخ ممکن است هنگام بررسی مشاهداتی که تفسیر آنها دشوار است، آسان به نظر برسد، اما من اغلب آن را مناسب می‌دانم. با بسیاری از علل احتمالی شکل ضعیف اوج، مهم است که هنگام در نظر گرفتن اینکه مشکل ممکن است ذهنی باز داشته باشیم، و بتوانیم دلایل بالقوه را اولویت‌بندی کنیم تا بتوانیم تلاش‌های عیب‌یابی را آغاز کنیم.
یک گام کلیدی در هر تمرین عیب‌یابی - اما به نظر من دست کم گرفته شده است - تشخیص این موضوع است که مشکلی وجود دارد که باید حل شود. تشخیص اینکه مشکلی وجود دارد اغلب به معنای درک این است که آنچه برای ابزار اتفاق می‌افتد متفاوت از انتظارات ما است که توسط نظریه، دانش تجربی و تجربه شکل می‌گیرد (5). ، کرکی، لبه جلو، باطله، و غیره)، اما همچنین به عرض. انتظارات ما برای شکل واقعی قله ساده است. نظریه (6) به خوبی از این انتظار کتاب درسی پشتیبانی می کند که در بیشتر موارد، قله های کروماتوگرافی باید متقارن و مطابق با شکل توزیع گاوسی باشند، همانطور که در شکل 1a نشان داده شده است. شکل‌های اوج در شکل 1 برخی از احتمالات دیگر را نشان می‌دهند که می‌توان مشاهده کرد - به عبارت دیگر، برخی از راه‌هایی که ممکن است اشتباه پیش برود. در ادامه این قسمت، ما زمانی را صرف بحث در مورد چند نمونه خاص از موقعیت‌هایی می‌کنیم که می‌توانند به این نوع شکل‌ها منجر شوند.
گاهی اوقات پیک ها در کروماتوگرام جایی که انتظار می رود شسته شوند اصلاً مشاهده نمی شوند. نمودار دیواره بالا نشان می دهد که عدم وجود پیک (با فرض اینکه نمونه واقعا حاوی آنالیت هدف در غلظتی است که باید پاسخ آشکارساز را برای دیدن آن بالاتر از نویز کافی کند) معمولاً به برخی از مشکلات دستگاه یا شرایط نادرست فاز متحرک (اگر اصلاً مشاهده شود) مربوط می شود.قله ها، معمولاً خیلی «ضعیف»). فهرست کوتاهی از مشکلات و راه حل های بالقوه در این دسته را می توان در جدول I یافت.
همانطور که در بالا ذکر شد، این سوال که قبل از توجه و تلاش برای رفع آن چقدر باید گشاد شدن قله را تحمل کرد، موضوع پیچیده ای است که در مقاله آینده درباره آن بحث خواهم کرد. تجربه من این است که گشاد شدن قابل توجه قله اغلب با تغییر قابل توجهی در شکل قله همراه است و باطله شدن قله بیشتر از قبل از پیک یا شکافتن است.
هر یک از این مسائل در شماره های قبلی عیب یابی LC به تفصیل مورد بحث قرار گرفته است و خوانندگان علاقه مند به این موضوعات می توانند برای اطلاع از علل ریشه ای و راه حل های بالقوه این مسائل به این مقالات قبلی مراجعه کنند.جزئیات بیشتر.
باطله شدن قله، پیشروی قله و شکافتن همگی می توانند ناشی از پدیده های شیمیایی یا فیزیکی باشند، و فهرست راه حل های بالقوه برای این مشکلات بسته به اینکه با یک مشکل شیمیایی یا فیزیکی سر و کار داریم، بسیار متفاوت است. .اگر فقط یک یا چند قله تحت تاثیر قرار گرفته باشد، اما بقیه خوب به نظر برسند، علت آن به احتمال زیاد شیمیایی است.
علل شیمیایی پیک باطله خیلی پیچیده است که نمی توان در اینجا به طور خلاصه در مورد آن صحبت کرد. خواننده علاقه مند برای بحث عمیق تر به شماره اخیر "عیب یابی LC" ارجاع داده می شود (10). با این حال، یک چیز آسان برای امتحان این است که جرم آنالیت تزریقی را کاهش دهیم و ببینیم آیا شکل اوج بهبود می یابد یا خیر. توده‌ها یا شرایط کروماتوگرافی باید تغییر کند تا حتی با تزریق توده‌های بزرگ‌تر، شکل‌های اوج خوبی به دست آید.
همچنین دلایل فیزیکی بالقوه زیادی برای پیک باطله وجود دارد. خوانندگان علاقه مند به بحث مفصل در مورد احتمالات به شماره اخیر دیگری از "عیب یابی LC" (11) ارجاع داده می شوند. یکی از شایع ترین علل فیزیکی باطله پیک، اتصال ضعیف در نقطه ای بین انژکتور و آشکارساز (12) است. یک مثال شدید در شکل 1 جدید نشان داده شده است. شیری که قبلاً از آن استفاده نکرده بودیم، و یک حلقه تزریق حجم کوچک با فرول نصب کردیم که روی یک لوله مویین فولادی ضد زنگ قالب‌گیری شده بود. پس از آزمایش‌های اولیه عیب‌یابی، متوجه شدیم که عمق پورت در استاتور شیر تزریق بسیار عمیق‌تر از آن چیزی است که قبلاً به آن عادت کرده بودیم، در نتیجه یک حجم مرده بزرگ دیگر در پایین پورت تنظیم می‌شود. فرول را در موقعیت مناسب قرار دهید تا حجم مرده در پایین درگاه از بین برود.
قله‌های قله‌ای مانند آنچه در شکل 1e نشان داده شده است نیز می‌تواند ناشی از مشکلات فیزیکی یا شیمیایی باشد. یکی از دلایل فیزیکی معمول لبه جلویی این است که بستر ذرات ستون به خوبی بسته نشده است، یا اینکه ذرات در طول زمان سازماندهی مجدد شده‌اند. همانطور که با دنباله پیک ناشی از این پدیده فیزیکی، بهترین راه برای رفع این مشکل این است که ستون را جایگزین کرده و به حرکت ادامه دهید. در شرایط ماندگاری ایده آل (خطی)، مقدار آنالیت حفظ شده توسط فاز ثابت (بنابراین، ضریب احتباس) به طور خطی با غلظت آنالیت در ستون مرتبط است. از نظر کروماتوگرافی، این بدان معنی است که با افزایش جرم آنالیت تزریق شده به ستون، قله بلندتر می شود، اما رفتار ماندگاری گسترده تر نمی شود. همانطور که جرم بیشتری تزریق می شود. علاوه بر این، اشکال غیرخطی شکل پیک های کروماتوگرافی را تعیین می کند و منجر به لبه های پیشرو یا انتهایی می شود. همانطور که در مورد اضافه بار جرمی که باعث باطله شدن پیک می شود (10)، پیک منجر به احتباس غیرخطی را نیز می توان با کاهش جرم آنالیت تزریقی تشخیص داد. شرایط گرافیکی باید تغییر کند تا این رفتار به حداقل برسد.
گاهی اوقات، همانطور که در شکل 1f نشان داده شده است، آنچه را که به نظر می‌رسد یک پیک «شکاف» است مشاهده می‌کنیم. اولین گام در حل این مشکل این است که تعیین کنیم آیا شکل پیک به دلیل هم‌شستگی جزئی است (یعنی وجود دو ترکیب متمایز اما کاملاً در حال شستشو). قله‌های تقسیم شده به فیزیکی مربوط می‌شوند. عملکرد ربطی به خود ستون ندارد. اغلب، مهم‌ترین سرنخ برای این تصمیم این است که آیا همه پیک‌های کروماتوگرام شکل‌های تقسیم‌شده دارند یا فقط یک یا دو.اگر همه قله ها تقسیم شوند، احتمالاً یک مشکل فیزیکی است که به احتمال زیاد مربوط به خود ستون است.
پیک‌های شکاف مربوط به خصوصیات فیزیکی خود ستون معمولاً به دلیل مسدود شدن جزئی فریت‌های ورودی یا خروجی یا سازمان‌دهی مجدد ذرات در ستون است که به فاز متحرک اجازه می‌دهد در نواحی خاصی از شکل‌گیری کانال ستون سریع‌تر از فاز متحرک جریان یابد. در مناطق دیگر.با این حال، در تجربه من، این معمولاً یک راه حل کوتاه مدت است نه طولانی مدت. اگر ذرات در ستون دوباره ترکیب شوند، این اغلب برای ستون های مدرن کشنده است. در این مرحله، بهتر است ستون را جایگزین کنید و ادامه دهید.
پیک در شکل 1g، همچنین از نمونه‌ای اخیر در آزمایشگاه خودم، معمولاً نشان می‌دهد که سیگنال به قدری بالا است که به انتهای بالای محدوده پاسخ رسیده است. برای آشکارسازهای جذب نوری (در این مورد، UV-vis)، زمانی که غلظت آنالیت بسیار بالا است، آنالیت بیشتر نور عبوری از آشکارساز را جذب می‌کند، و نور الکتریکی آشکارساز را از سلول آشکارساز بسیار کمی رها می‌کند. تحت تاثیر منابع مختلف نویز، مانند نور سرگردان و "جریان تاریک"، سیگنال را در ظاهر بسیار "فازی" و مستقل از غلظت آنالیت می کند.هنگامی که این اتفاق می افتد، مشکل اغلب می تواند به راحتی با کاهش حجم تزریق آنالیت حل شود - کاهش حجم تزریق، رقیق کردن نمونه، یا هر دو.
در دانشکده کروماتوگرافی، ما از سیگنال آشکارساز (یعنی محور y در کروماتوگرام) به عنوان نشانگر غلظت آنالیت در نمونه استفاده می کنیم. بنابراین دیدن کروماتوگرام با سیگنال زیر صفر عجیب به نظر می رسد، زیرا تفسیر ساده این است که این نشان دهنده غلظت منفی آنالیت است – که البته اغلب با استفاده از آشکارسازهای نوری منفی، از نظر فیزیکی مشاهده نمی شود. در مقابل).
در این مورد، پیک منفی صرفاً به این معنی است که مولکول‌هایی که از ستون خارج می‌شوند، نور کمتری را نسبت به خود فاز متحرک بلافاصله قبل و بعد از پیک جذب می‌کنند. این می‌تواند رخ دهد، برای مثال، هنگام استفاده از طول‌موج‌های تشخیص نسبتاً کم (کمتر از 230 نانومتر) و افزودنی‌های فاز متحرک که بیشتر نور را در این طول‌موج‌ها جذب می‌کند. می تواند در واقع از پیک های منفی برای تهیه منحنی کالیبراسیون و به دست آوردن اطلاعات کمی دقیق استفاده کند، بنابراین هیچ دلیل اساسی برای اجتناب از آنها به خودی خود وجود ندارد (این روش گاهی اوقات به عنوان "تشخیص غیرمستقیم اشعه ماوراء بنفش" نامیده می شود) (13). با این حال، اگر واقعاً بخواهیم از پیک های منفی به طور کلی جلوگیری کنیم، در مورد تشخیص جذب، بهترین راه حل این است که از فاز متحرک استفاده کنیم تا فاز متحرک را به گونه ای متفاوت جذب کنیم که موج آنال را تغییر دهد. آنها نور کمتری نسبت به آنالیت ها جذب می کنند.
هنگامی که ضریب شکست اجزای غیر از آنالیت موجود در نمونه، مانند ماتریس حلال، با ضریب شکست فاز متحرک متفاوت است، هنگام استفاده از تشخیص ضریب شکست (RI) نیز می‌توان پیک‌های منفی را نشان داد. این امر با تشخیص UV-vis نیز اتفاق می‌افتد، اما این اثر تمایل دارد که با به حداقل رساندن ترکیب منفی نسبت به RI نسبت به RI کمتر شود. تریکس به فاز متحرک.
در بخش سوم درباره موضوع اصلی عیب‌یابی LC، موقعیت‌هایی را مورد بحث قرار دادم که در آنها شکل قله مشاهده‌شده با شکل اوج مورد انتظار یا معمولی متفاوت است. عیب‌یابی مؤثر چنین مشکلاتی با آگاهی از اشکال پیک مورد انتظار (بر اساس تئوری یا تجربه قبلی با روش‌های موجود) شروع می‌شود، بنابراین انحراف از این انتظارات واضح است. برخی از مشکلات شکل قله‌ها دلایل بالقوه زیادی دارند، در این موارد، دلایل بالقوه متفاوتی دارند. دلایلی که من اغلب می بینم. دانستن این جزئیات مکان خوبی برای شروع عیب یابی است، اما همه احتمالات را در بر نمی گیرد. خوانندگانی که علاقه مند به فهرست عمیق تری از علل و راه حل ها هستند، می توانند به نمودار دیواری «راهنمای عیب یابی LC» LCGC مراجعه کنند.
(4) نمودار دیواری «راهنمای عیب‌یابی LC» LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger، تجزیه و تحلیل داده ها و پردازش سیگنال در کروماتوگرافی (الزویر، نیویورک، نیویورک، 1998)، صفحات 43-96.
(8) Wahab MF، Dasgupta PK، Kadjo AF و Armstrong DW، Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.