از بازدید شما از Nature.com متشکریم. شما از نسخه مرورگری با پشتیبانی محدود از CSS استفاده می‌کنید. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
یک چرخ و فلک از سه اسلاید را به طور همزمان نمایش می‌دهد. از دکمه‌های قبلی و بعدی برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید، یا از دکمه‌های کشویی در انتها برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید.
اندامک‌های عصبی خودآرا، بستری نویدبخش در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) برای مدل‌سازی رشد و بیماری‌های انسان هستند. با این حال، ارگانوئیدها فاقد اتصالی هستند که در شرایط درون‌تنی (in vivo) وجود دارد، که بلوغ را محدود می‌کند و از ادغام با سایر مدارهایی که رفتار را کنترل می‌کنند، جلوگیری می‌کند. در اینجا ما نشان می‌دهیم که ارگانوئیدهای قشری مشتق از سلول‌های بنیادی انسان که به قشر حسی-تنی موش‌های صحرایی برهنه نوزاد پیوند زده شده‌اند، انواع سلول‌های بالغی را ایجاد می‌کنند که در مدارهای حسی و انگیزشی ادغام می‌شوند. MRI رشد ارگانوئید پس از پیوند را در چندین رده سلول بنیادی و حیوان نشان داد، در حالی که تجزیه و تحلیل تک هسته‌ای پیشرفت کورتیکوجنسیس و ظهور یک برنامه رونویسی وابسته به فعالیت را نشان داد. در واقع، نورون‌های قشری پیوند شده، خواص مورفولوژیکی، سیناپسی و غشایی داخلی پیچیده‌تری نسبت به همتایان آزمایشگاهی خود نشان می‌دهند و امکان تشخیص نقص‌های عصبی در بیماران مبتلا به سندرم تیموتی را فراهم می‌کنند. ردیابی آناتومیکی و عملکردی نشان داده است که اندامک‌های پیوند شده ورودی‌های تالاموکورتیکال و کورتیکوکورتیکال را دریافت می‌کنند و ثبت‌های درون‌تنی فعالیت عصبی نشان می‌دهد که این ورودی‌ها می‌توانند پاسخ‌های حسی را در سلول‌های انسانی ایجاد کنند. در نهایت، ارگانوئیدهای قشری، آکسون‌ها را در سراسر مغز موش گسترش می‌دهند و فعال‌سازی اپتوژنتیکی آنها منجر به رفتار پاداش‌جویانه می‌شود. بنابراین، نورون‌های قشر مغز انسان پیوند شده بالغ می‌شوند و در مدارهای میزبان که رفتار را کنترل می‌کنند، شرکت می‌کنند. ما انتظار داریم این رویکرد، تشخیص فنوتیپ‌های سطح رشته‌ای را در سلول‌های مشتق شده از بیمار که با روش‌های دیگر قابل تشخیص نیستند، تسهیل کند.
مغز انسان در حال رشد، یک فرآیند خودسازمانده قابل توجه است که در آن سلول‌ها تکثیر، تمایز، مهاجرت و اتصال می‌یابند تا مدارهای عصبی عملکردی را تشکیل دهند که از طریق تجربه حسی، بیشتر اصلاح می‌شوند. یک مشکل کلیدی در درک رشد مغز انسان، به ویژه در زمینه بیماری، عدم دسترسی به بافت مغز است. اندامک‌های خودسازمانده، از جمله ارگانوئیدهای قشر مغز انسان (hCO؛ که به عنوان کره قشر مغز انسان نیز شناخته می‌شود)، می‌توانند 2،3،4،5،6 تولید کنند. با این حال، چندین محدودیت، کاربرد گسترده‌تر آنها را در درک توسعه و عملکرد مدارهای عصبی محدود می‌کند. به طور خاص، مشخص نیست که آیا بلوغ hCO به دلیل عدم وجود ورودی‌های ریزمحیطی و حسی خاص موجود در داخل بدن محدود می‌شود یا خیر. علاوه بر این، از آنجا که hCOها در مدارهایی که می‌توانند پیامدهای رفتاری ایجاد کنند، ادغام نمی‌شوند، کاربرد آنها در مدل‌سازی اختلالات عصبی-روانی پیچیده ژنتیکی و رفتاری در حال حاضر محدود است.
پیوند hCO به یک مغز زنده‌ی سالم می‌تواند بر این محدودیت‌ها غلبه کند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که نورون‌های انسانی پیوند شده به قشر مغز جوندگان قادر به زنده ماندن، انتشار و ارتباط با سلول‌های جوندگان هستند7،8،9،10،11،12. با این حال، این آزمایش‌ها معمولاً روی حیوانات بالغ انجام می‌شوند که ممکن است ادغام سیناپسی و آکسونی را محدود کند. در اینجا، ما یک الگوی پیوند را شرح می‌دهیم که در آن hCO سه‌بعدی مشتق شده از سلول‌های hiPS را در مرحله اولیه رشد پلاستیک به قشر حسی-پیکری اولیه موش‌های دارای نقص ایمنی پیوند زدیم. نورون‌های hCO (t-hCO) پیوند شده بلوغ قابل توجهی را تجربه می‌کنند، ورودی‌های تالاموکورتیکال و کورتیکال-کورتیکال را دریافت می‌کنند که پاسخ‌های حسی را ایجاد می‌کنند و انتشار آکسونی را به مغز موش گسترش می‌دهند تا رفتار پاداش‌جویی را تحریک کنند. بلوغ طولانی مدت t-hCO نقص‌های عصبی را در بیماران مبتلا به سندرم تیموتی (TS) نشان داده است، یک اختلال ژنتیکی شدید که در اثر جهش در کانال کلسیم CaV1.2 نوع L حساس به ولتاژ (که توسط CACNA1C کدگذاری می‌شود) ایجاد می‌شود.
برای مطالعه نورون‌های قشر مغز انسان در مدارهای in vivo، ما hCO3 سه‌بعدی دست‌نخورده را به صورت استریوتاکتیک به S1 موش‌های فاقد تیموس در اوایل پس از تولد (روزهای 3 تا 7 پس از تولد) پیوند زدیم (شکل 1a و داده‌های گسترده شکل 1a-c). در این مرحله، برآمدگی‌های آکسونی تالاموکورتیکال و کورتیکوکورتیکال هنوز عصب‌دهی S1 خود را تکمیل نکرده‌اند (مرجع 13). بنابراین، این رویکرد برای به حداکثر رساندن ادغام t-hCO و در عین حال به حداقل رساندن تأثیر بر مدارهای درون‌زا طراحی شده است. برای تجسم محل t-hCO3 در حیوانات زنده، ما بازسازی‌های مغزی MRI با وزن T2 از موش‌ها را 2 تا 3 ماه پس از پیوند انجام دادیم (شکل 1b و داده‌های گسترده، شکل 1d). t-hCO3 به راحتی مشاهده شد و اندازه‌گیری‌های حجم t-hCO3 مشابه مقادیر محاسبه‌شده از برش‌های ثابت بود (داده‌های گسترده شکل 1d، e؛ P > 0.05). t-hCO3 به راحتی مشاهده شد و اندازه‌گیری‌های حجم t-hCO3 مشابه مقادیر محاسبه‌شده از برش‌های ثابت بود (داده‌های گسترده شکل 1d، e؛ P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 به راحتی مشاهده شد و اندازه‌گیری‌های حجمی t-hCO3 مشابه مقادیر محاسبه‌شده برای مقاطع ثابت بود (داده‌های بسط‌یافته، شکل 1d، e؛ P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 به راحتی مشاهده شد و اندازه‌گیری‌های حجمی t-hCO3 مشابه مقادیر محاسبه‌شده برای مقاطع ثابت بود (داده‌های بسط‌یافته، شکل 1d، e؛ P > 0.05).ما t-hCO را در 81٪ از حیوانات پیوند شده تقریباً 2 ماه پس از پیوند تعیین کردیم (n = 72 حیوان؛ hCO از 10 رده سلولی hiPS؛ رده‌های سلولی hiPS در جدول تکمیلی 1). از این تعداد، 87٪ در قشر مغز قرار داشتند (شکل 1c). با انجام اسکن‌های MRI سریالی در چندین نقطه زمانی در همان موش پیوند شده، افزایش نه برابری حجم t-hCO را در عرض 3 ماه مشاهده کردیم (شکل 1d و داده‌های گسترده‌تر، شکل 1f). حیوانات پیوند شده در 12 ماه پس از پیوند، میزان بقای بالایی (74٪) داشتند (داده‌های گسترده‌تر، شکل 1g و جدول تکمیلی 2) و هیچ اختلال حرکتی یا حافظه آشکار، گلیوز یا الکتروانسفالوگرام (EEG) مشاهده نشد. داده‌های شکل 1g و جدول تکمیلی 2). 1h-m و 3e).
الف، طرح کلی طراحی آزمایش. hCO مشتق شده از سلول‌های hiPS در روزهای 30 تا 60 تمایز به S1 موش‌های صحرایی برهنه تازه متولد شده پیوند زده شد. ب، تصاویر MRI کرونال و افقی با وزن T2 که t-hCO را در S1، 2 ماه پس از پیوند نشان می‌دهند. نمودار مقیاس، 2 میلی‌متر. ج، کمی‌سازی میزان موفقیت پیوند برای هر رده سلولی hiPS (n = 108، اعداد داخل نمودارها نشان‌دهنده مقدار t-hCO در هر رده سلولی hIPS هستند) و محل قشری یا زیرقشری (n = 88). د، تصویر MRI از یک شریان کرونری (چپ؛ نمودار مقیاس، 3 میلی‌متر) و بازسازی حجمی سه‌بعدی مربوطه (نمودار مقیاس، 3 میلی‌متر) که افزایش t-hCO را در طول 3 ماه نشان می‌دهد. ه، بررسی الگوهای t-hCO در قشر مغز موش صحرایی. نمودار مقیاس، 1 میلی‌متر. و، تصاویر ایمونوسیتوشیمی نمونه‌ای از t-hCO که از بالا سمت چپ به راست (در طول تمایز) نشان داده شده‌اند: PPP1R17 (4 ماهه)، NeuN (8 ماهه)، SOX9 و GFAP (8 ماهه)، PDGFRα؛ (8 ماهه)، MAP2 (8 ماهه) و IBA1 (8 ماهه). نوار مقیاس، 20 میکرومتر. بیان همزمان HNA سلول‌هایی با منشأ انسانی را نشان می‌دهد. ز، snRNA-seq: تصویربرداری کاهش ابعاد منیفولد و طرح‌ریزی یکپارچه (UMAP) از تمام هسته‌های t-hCO با کیفیت بالا پس از ادغام Seurat (n=3 نمونه t-hCO، n=2 رده سلولی hiPS). آستروسیت‌ها، سلول‌های رده آستروسیت؛ cyc prog، پیش‌سازهای در گردش؛ GluN DL، نورون‌های گلوتاماترژیک عمیق؛ GluN DL/SP، نورون‌های گلوتاماترژیک عمیق و زیر لایه‌ای؛ GluN UL، نورون‌های گلوتاماترژیک لایه بالایی؛ الیگودندروسیت‌ها، الیگودندروسیت‌ها؛ OPC، سلول‌های پیش‌ساز الیگودندروسیت؛ RELN، نورون‌های ریلین. h، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی اصطلاح هستی‌شناسی ژن (GO) از ژن‌هایی که به طور قابل توجهی افزایش بیان داشته‌اند (P تعدیل‌شده < 0.05، تغییر برابر > 2، بیان شده در حداقل 10٪ از هسته‌ها) در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO. h، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی اصطلاح هستی‌شناسی ژن (GO) از ژن‌هایی که به طور قابل توجهی افزایش بیان داشته‌اند (P تعدیل‌شده < 0.05، تغییر برابر > 2، بیان شده در حداقل 10٪ از هسته‌ها) در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO. h, Анализ обогащения терминов ژن هستی شناسی (GO) для генов со значительной فعال (скоректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по کراینی مره در 10% yader) در گلوتاماترژیکهای غیرهرونی t-hCO در سراونه با گلوتامترژیکهای غیرهرونامی hCO. h، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی عبارت هستی‌شناسی ژن (GO) برای ژن‌هایی با فعال‌سازی قابل توجه (P تعدیل‌شده <0.05، تغییر فولد >2، بیان در حداقل 10٪ هسته‌ها) در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调P 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上萃 （5 （ p变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно فعال (скоректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере در 10% ядер) در glutamatergicheskih neyronah t-hCO در sravneniyu با glutamatergicheskimi neyronami hCO Ontologiческий (GO) آنالیز Terma обогащения. h، ژن‌ها در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO به طور قابل توجهی افزایش بیان داشتند (P < 0.05 تنظیم شده، تغییر برابر > 2، بیان شده در حداقل 10٪ از هسته‌ها). تجزیه و تحلیل هستی‌شناسی (GO) از عبارت غنی‌سازی.خط چین مقدار aq برابر با 0.05 را نشان می‌دهد. i، تصویربرداری UMAP از انواع سلول‌های GluN در t-hCO با استفاده از انتقال برچسب از مجموعه داده‌های قشر حرکتی بزرگسالان 22 snRNA-seq مرجع. CT - سلول‌های قشری-تالاموسی، ET - سلول‌های خارج مغزی، IT - سلول‌های تلانسفالیک داخلی، NP - تصویر نزدیک.
سپس ما ساختار سلولی و ترکیب کلی سلولی t-hCO را ارزیابی کردیم. رنگ‌آمیزی آنتی‌بادی سلول‌های اندوتلیال موش، رگ‌زایی با t-hCO را نشان داد، در حالی که رنگ‌آمیزی IBA1 وجود میکروگلیای موش را در سراسر پیوند نشان داد (شکل 1f و داده‌های گسترده، شکل 3c، d). رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی سلول‌های مثبت آنتی‌ژن هسته‌ای انسان (HNA) را که همزمان PPP1R17 (پیش‌سازهای قشری)، NeuN (نورون‌ها)، SOX9 و GFAP (سلول‌های مشتق از گلیال) یا PDGFRα (پیش‌سازهای الیگودندروسیت) را بیان می‌کردند، نشان داد (شکل 1f). برای مطالعه ترکیب سلولی t-hCO در وضوح تک سلولی، ما توالی‌یابی RNA تک هسته‌ای (snRNA-seq) را پس از تقریباً 8 ماه تمایز انجام دادیم. فیلتراسیون انبوه و حذف هسته‌های موش، 21500 نقشه تک هسته‌ای انسانی با کیفیت بالا را به دست داد (شکل 1g و داده‌های گسترده، شکل 4a، b). الگوهای بیان نشانگرهای معمول نوع سلول، خوشه‌هایی از رده‌های سلولی اصلی قشر مغز، از جمله نورون‌های گلوتاماترژیک عمیق و سطحی، پیش‌سازهای در گردش، الیگودندروسیت‌ها و دودمان آستروسیت را شناسایی کردند (شکل 1g، داده‌های گسترده، شکل 4c، و جدول تکمیلی 3). رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای SATB2 و CTIP2 نشان داد که علیرغم وجود زیرگروه‌های قشر مغز، t-hCO طبقه‌بندی آناتومیکی واضحی را نشان نمی‌دهد (داده‌های گسترده، شکل 3a). hCO با snRNA-seq منطبق با مرحله، رده‌های سلولی کاملاً مشابهی را تولید کرد، با چند استثنا، از جمله عدم وجود الیگودندروسیت‌ها و وجود نورون‌های GABAergic، که ممکن است منعکس کننده شرایط مطلوب آزمایشگاهی گزارش شده قبلی برای سلول‌های پیش‌ساز جانبی باشد15 (داده‌های گسترده، شکل 4f-i و جدول تکمیلی 4). تجزیه و تحلیل بیان ژن افتراقی، تفاوت‌های قابل توجهی را در نورون‌های گلوتاماترژیک بین t-hCO و hCO نشان داد (جدول تکمیلی 5)، از جمله فعال شدن مجموعه‌ای از ژن‌های مرتبط با بلوغ عصبی مانند سیگنالینگ سیناپسی، محلی‌سازی دندریتیک و فعالیت کانال‌های وابسته به ولتاژ (شکل 1h و جدول تکمیلی 5). بر این اساس، نورون‌های t-hCO گلوتاماترژیک قشر مغز، بلوغ رونویسی تسریع‌شده‌ای را نشان دادند.
برای روشن شدن اینکه آیا این تغییرات رونویسی در t-hCO مربوط به تفاوت‌های مورفولوژیکی بین hCO در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و t-hCO در داخل بدن (in vivo) است یا خیر، ما hCO پر شده با بیوسیتین و hCO را در مقاطع حاد پس از 7-8 ماه تمایز بازسازی کردیم. نورون‌های hCO (شکل 2a). نورون‌های t-hCO در مقایسه با hCO در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) به طور قابل توجهی بزرگتر بودند، 1.5 برابر قطر سوما، دو برابر دندریت و به طور کلی شش برابر افزایش طول کل دندریتیک داشتند (شکل 2b). علاوه بر این، ما تراکم قابل توجهی بالاتر از خارهای دندریتیک را در نورون‌های t-hCO نسبت به نورون‌های hCO مشاهده کردیم (شکل 2c). این نشان می‌دهد که نورون‌های t-hCO متحمل طویل شدن و شاخه‌دار شدن گسترده دندریتیک می‌شوند، که در ترکیب با تکثیر مداوم سلولی، ممکن است به رشد شدید t-hCO پس از پیوند کمک کند (شکل 1d و داده‌های گسترده شکل 1f). این امر ما را بر آن داشت تا خواص الکتروفیزیولوژیکی را بررسی کنیم. ظرفیت خازنی غشا هشت برابر بیشتر بود (داده‌های بسط‌یافته، شکل 8d)، پتانسیل غشا در حالت استراحت بیش‌قطبی‌تر بود (تقریباً 20 میلی‌ولت)، و تزریق جریان، حداکثر نرخ تحریک بالاتری را در نورون‌های t-hCO نسبت به نورون‌های hCO القا کرد. در شرایط آزمایشگاهی (شکل 2d)، e)، که با ویژگی‌های مورفولوژیکی بزرگ‌تر و پیچیده‌تر t-hCO سازگار است. علاوه بر این، فراوانی رویدادهای جریان پس‌سیناپسی تحریکی خودبه‌خودی (EPSC) در نورون‌های t-hCO به طور قابل توجهی بالاتر بود (شکل 2f)، که نشان می‌دهد افزایش تراکم خارهای دندریتیک مشاهده شده در نورون‌های t-hCO با تحریک‌پذیری عملکردی سیناپس جنسی مرتبط است. ما با ثبت نورون‌های گلوتاماترژیک نشاندار شده (داده‌های بسط‌یافته، شکل 6a-c)، ویژگی نابالغ نورون‌های hCO را در شرایط آزمایشگاهی تأیید کردیم.
الف) بازسازی سه‌بعدی نورون‌های hCO و t-hCO پر از بیوسیتین پس از ۸ ماه تمایز. ب، کمی‌سازی ویژگی‌های مورفولوژیکی (n = 8 نورون hCO، n = 6 نورون t-hCO؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 و ***P < 0.0001). ب، کمی‌سازی ویژگی‌های مورفولوژیکی (n = 8 نورون hCO، n = 6 نورون t-hCO؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 و ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 nyronov hCO، n = 6 neyronov t-hCO؛ ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). ب، کمی‌سازی ویژگی‌های مورفولوژیکی (n=8 نورون hCO، n=6 نورون t-hCO؛ **P=0.0084، *P=0.0179 و ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0.0001 ）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0.0001 ）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 nyronov hCO، n = 6 neyronov t-hCO؛ ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). ب، کمی‌سازی ویژگی‌های مورفولوژیکی (n=8 نورون hCO، n=6 نورون t-hCO؛ **P=0.0084، *P=0.0179 و ***P<0.0001).ج، بازسازی سه‌بعدی شاخه‌های دندریتیک hCO و t-hCO پس از 8 ماه تمایز. ستاره‌های قرمز نشان‌دهنده خارهای دندریتیک احتمالی هستند. اندازه‌گیری تراکم خارهای دندریتیک (n = 8 نورون hCO، n = 6 نورون t-hCO؛ **P = 0.0092). د، کمی‌سازی پتانسیل استراحت غشاء (n = 25 نورون hCO، n = 16 نورون t-hCO؛ ***P < 0.0001). د، کمی‌سازی پتانسیل استراحت غشاء (n = 25 نورون hCO، n = 16 نورون t-hCO؛ ***P < 0.0001). d، colyчественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 hCO، n = 16 نیرون t-hCO؛ *** P <0,0001). د، کمی‌سازی پتانسیل استراحت غشاء (n = 25 نورون hCO2، n = 16 نورون t-hCO2؛ ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d، colyчественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 hCO، n = 16 نیرون t-hCO؛ *** P <0,0001). د، کمی‌سازی پتانسیل استراحت غشاء (n = 25 نورون hCO2، n = 16 نورون t-hCO2؛ ***P < 0.0001). ه، شلیک پتانسیل عمل تکراری در hCO و t-hCO القا شده توسط تزریق جریان فزاینده، و تعیین کمیت حداکثر نرخ شلیک (n = 25 نورون hCO، n = 16 نورون t-hCO؛ ***P < 0.0001). ه، شلیک پتانسیل عمل تکراری در hCO و t-hCO القا شده توسط تزریق جریان فزاینده، و تعیین کمیت حداکثر نرخ شلیک (n = 25 نورون hCO، n = 16 نورون t-hCO؛ ***P < 0.0001). e، مجددا возбуждение потенциала действия در hCO و t-hCO، вызванное увеличением тока، и количественная оценка максимальной скорости возбудения (n = 25 نیرون hCO، n = 16 نیرون t-hCO؛ *** P <00001). e، پتانسیل عمل مجدد در hCO و t-hCO القا شده توسط افزایش جریان و تعیین کمیت حداکثر نرخ شلیک (n = 25 نورون hCO، n = 16 نورون t-hCO؛ *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大攚电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）. e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO و t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 neuronov hCO، n = 16 neyronov t-hCO؛ *** P <0,0001). ه، شلیک مکرر پتانسیل‌های عمل hCO و t-hCO القا شده توسط افزایش جریان ورودی و تعیین کمیت حداکثر سرعت شلیک (n = 25 نورون hCO، n = 16 نورون t-hCO؛ *** P < 0.0001). f، EPSC های خودبخودی (sEPSCs) در نورون‌های hCO و t-hCO در 8 ماهگی تمایز، و تعیین کمیت فراوانی وقایع سیناپسی (n = 25 نورون hCO، n = 17 نورون t-hCO؛ ***P < 0.0001). f، EPSC های خودبخودی (sEPSCs) در نورون‌های hCO و t-hCO در 8 ماهگی تمایز، و تعیین کمیت فراوانی وقایع سیناپسی (n = 25 نورون hCO، n = 17 نورون t-hCO؛ ***P < 0.0001). f، EPSC (sEPSC) در ناهنجار hCO و t-hCO به دلیل 8 عدد دیفرانسیروکی و اطلاعات عمومی (n = 25 نفر) hCO، n = 17 t-hCO; *** P <0,0001) . f، EPSC های خودبخودی (sEPSCs) در نورون‌های hCO و t-hCO در 8 ماهگی تمایز و کمی‌سازی نرخ رویدادهای سیناپسی (n=25 نورون hCO، n=17 نورون t-hCO؛ ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs)，以及突触事件频率猏元中的自发性EPSCs.神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率缄颇5 CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001）. f، EPSC (sEPSC) در ناهنجار hCO و t-hCO به دلیل 8 عدد دیفرانسیروکی و اطلاعات عمومی (n = 25 نفر) hCO، n = 17 t-hCO; *** P <00001). f، EPSC های خودبخودی (sEPSCs) در نورون‌های hCO و t-hCO در 8 ماه تمایز و کمی‌سازی نرخ رویدادهای سیناپسی (n = 25 نورون hCO، n = 17 نورون t-hCO؛ *** P<0.0001).برای bf، hCO و t-hCO در خط 1208-2 از همان دسته تمایزی که به صورت موازی نگهداری می‌شدند، گرفته شدند. g، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن (آزمون دقیق فیشر یک‌طرفه) از ژن‌هایی که به طور قابل توجهی افزایش بیان داشته‌اند (P تعدیل‌شده < 0.05، تغییر برابر > 2، بیان شده در حداقل 10٪ از هسته‌ها) در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO با مجموعه ژن‌های وابسته به فعالیت پاسخ اولیه (ERG) و پاسخ دیرهنگام (LRG) که از یک مطالعه موشی درون‌تنی 16 و LRGهای اختصاصی انسان از نورون‌های آزمایشگاهی 17 شناسایی شده‌اند. g، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن (آزمون دقیق فیشر یک‌طرفه) از ژن‌هایی که به طور قابل توجهی افزایش بیان داشته‌اند (P تعدیل‌شده < 0.05، تغییر برابر > 2، بیان شده در حداقل 10٪ از هسته‌ها) در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO با مجموعه ژن‌های وابسته به فعالیت پاسخ اولیه (ERG) و پاسخ دیرهنگام (LRG) که از یک مطالعه موشی درون‌تنی 16 و LRGهای اختصاصی انسان از نورون‌های آزمایشگاهی 17 شناسایی شده‌اند. g، آنالیز обогащения набора ژن (одосторонний точный критерий Фишера) ژن با значительной فعال (скоректированный P <0,05، кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере در 10% yader) در glutamatergicheskih neyronah t-hCO در sravneniyu با glutamatergicheskimi нейронами hCO بر روی ژنوهای مختلف (ERG)، تاک و مثبت (LRG) ژنو، فعالیت های مربوط به فعالیت ها، والدین فیزیولوژیکی در ویوو16، и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن (آزمون دقیق فیشر یک‌طرفه) ژن‌هایی با فعال‌سازی قابل توجه (P تعدیل‌شده <0.05، تغییر برابر >2، بیان در حداقل 10٪ از هسته‌ها) در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با مجموعه‌های نورون‌های گلوتاماترژیک hCO از ژن‌های وابسته به فعالیت اولیه (ERG) و دیررس (LRG) شناسایی‌شده در موش‌های درون‌تنی16 و LRGهای اختصاصی انسان از نورون‌ها در شرایط آزمایشگاهی17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特R g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （胞 核中 表达） 的体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基反应和神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g، glutamatergiceskye neyronы t-hCO به طور قابل توجهی فعال است با sravneniyu با گلوتامترژیک های غیرهرونامی hCO P<0,05، кратность изменения> 2، نه من 10% Genы، зависящие от активности ответа (LRG)، идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 و нейронах in vitro17. LRG، specifiчnые для человека. g، نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO در مقایسه با نورون‌های گلوتاماترژیک hCO به طور قابل توجهی افزایش بیان داشتند (P<0.05 تعدیل‌شده، تغییر برابر >2، حداقل 10٪). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ژن پاسخ زودهنگام (ERG) و پاسخ دیرهنگام (آزمون دقیق فیشر یک‌طرفه) ژن‌های وابسته به فعالیت پاسخ (LRG) را که در موش‌های درون‌تنی (in vivo)16 و نورون‌های درون‌تنی (in vitro) شناسایی شده بودند، نشان داد.17 LRGهای خاص انسان.خط چین نشان دهنده مقدار P اصلاح شده با Bonferroni برابر با 0.05 است. h، بیان ژن GluN (شبه بسته و مقیاس هر ژن) به طور قابل توجهی در کپی‌های snRNA-seq ژن‌های LRG در نورون‌های گلوتاماترژیک t-hCO افزایش یافته است. i، رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی بیان SCG2 را در نورون‌های t-hCO (بالا) و hCO (پایین) نشان می‌دهد. فلش‌های سفید به سلول‌های SCG2+ اشاره دارند. نوار مقیاس، 25 میکرومتر. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده‌اند.
بر اساس افزایش فعالیت t-hCO مشاهده شده در برش‌های ex vivo، snRNA-seq افزایش وابسته به فعالیت رونوشت‌های ژن را در t-hCO در مقایسه با hCO در شرایط آزمایشگاهی نشان داد. نورون‌های t-hCO گلوتاماترژیک سطوح بالاتری از ژن‌های تنظیم‌کننده فعالیت پاسخ تأخیری را بیان کردند (شکل 2g، h)، که در مطالعات قبلی در نورون‌های موش و انسان یافت شده بود16،17. به عنوان مثال، BDNF18، SCG2 و OSTN، یک ژن تنظیم‌کننده فعالیت اختصاصی نخستی‌سانان، بیان افزایش‌یافته‌ای را در نورون‌های t-hCO در مقایسه با نورون‌های hCO نشان دادند (شکل 2g-i). بنابراین، نورون‌های t-hCO با تجزیه و تحلیل‌های رونویسی، مورفولوژیکی و عملکردی، ویژگی‌های بلوغ پیشرفته‌تری را در مقایسه با نورون‌های hCO نشان دادند.
برای ارزیابی بیشتر ارتباط بلوغ t-hCO با رشد مغز انسان، ما مقایسه‌های ترانسکریپتومی از انواع سلول‌های قشری جنین و بالغ19،20 و بالغ21،22 و همچنین داده‌های گسترده‌ای در مورد بیان ژن قشری23 در طول رشد انجام دادیم (داده‌های بسط‌یافته، شکل 5). با کار قبلی 24، وضعیت بلوغ ترانسکریپتوم کلی hCO و t-hCO در 7-8 ماهگی تمایز به طور گسترده با زمان رشد درون‌تنی سازگار است و بیشتر معادل اواخر زندگی جنینی است (داده‌های بسط‌یافته، شکل 5a). نکته قابل توجه این است که ما افزایش بلوغ ترانسکریپتوم را در t-hCO در مقایسه با hCO همسن، و همچنین فعال‌سازی ترانسکریپتوم مرتبط با سیناپتوژنز، آستروژنز و میلین‌سازی مشاهده کردیم (داده‌های بسط‌یافته، شکل 5b-d). در سطح سلولی، ما شواهدی از زیرگروه قشر نازک‌تر در t-hCO یافتیم، به طوری که خوشه‌هایی از نورون‌های گلوتاماترژیک با زیرگروه‌های نورونی L2/3، L5 و L6 بزرگسالان همپوشانی داشتند (شکل 1i). در مقابل، همپوشانی خوشه‌ها بین نورون‌های t-hCO گلوتاماترژیک و نورون‌های قشری جنین در اواسط بارداری محدودتر بود (داده‌های گسترش‌یافته، شکل 5e-j). برای تعیین اینکه آیا نورون‌های t-hCO از نظر عملکردی مشابه نورون‌های نئوکورتیکال پس از تولد انسان هستند، ما ثبت‌های الکتروفیزیولوژیکی و بازسازی‌های آناتومیکی نورون‌های هرمی L2/3 انسان را در بخش‌های تیز از قشر پس از تولد انسان انجام دادیم (داده‌های گسترش‌یافته، شکل 7a). خواص الکتروفیزیولوژیکی نورون‌های هرمی L2/3 مشابه نورون‌های هرمی t-hCO بود (داده‌های گسترش‌یافته، شکل 7e). از نظر مورفولوژیکی، نورون‌های L2/3 از نمونه‌های انسانی پس از تولد بیشتر به t-hCO شبیه بودند تا به hCO، اگرچه سلول‌های L2/3 بلندتر بودند، در کل شاخه‌های بیشتری داشتند و تراکم خار بیشتری داشتند (شکل 3g و داده‌های بسط‌یافته، شکل 7b-). G).
الف) پیوند hCO تولید شده توسط رده‌های سلولی hiPS کنترل و TS به موش‌های نوزاد. ب) بازسازی سه‌بعدی نورون‌های t-hCO پر از بیوسیتین پس از 8 ماه تمایز. ج) کمی‌سازی میانگین طول دندریتیک (n = 19 نورون کنترل، n = 21 نورون TS؛ **P = 0.0041). د، شاخه‌های دندریتیک بازسازی‌شده سه‌بعدی از t-hCO کنترل و TS در 8 ماه تمایز، و تعیین کمیت تراکم خار دندریتیک (n = 16 نورون کنترل، n = 21 نورون TS، ***P < 0.0001). د، شاخه‌های دندریتیک بازسازی‌شده سه‌بعدی از t-hCO کنترل و TS در 8 ماه تمایز، و تعیین کمیت تراکم خار دندریتیک (n = 16 نورون کنترل، n = 21 نورون TS، ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 کنترلьных нейронов، n = 21 TS нейронов، *** P <0,0001). د، بازسازی سه‌بعدی شاخه‌های دندریتیک از سلول‌های بنیادی مزانشیمی کنترل و t-hCO3 در 8 ماهگی تمایز و تعیین تراکم خارهای دندریتیک (n=16 نورون کنترل، n=21 نورون TS، ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 کنترلьных нейронов، n = 21 TS нейронов، *** P <0,0001). د، بازسازی سه‌بعدی شاخه‌های دندریتیک کنترل و t-hCO TS در 8 ماهگی تمایز و تعیین تراکم خار دندریتیک (n=16 نورون کنترل، n=21 نورون TS، ***P<0.0001).ستاره‌های قرمز نشان‌دهنده خارهای دندریتیک فرضی هستند. ه، EPSCهای خودبه‌خودی در نورون‌های t-hCO کنترل و TS پس از 8 ماه تمایز. و، نمودار فراوانی تجمعی و کمی‌سازی فراوانی و دامنه رویدادهای سیناپسی (n=32 نورون کنترل، n=26 نورون TS؛ **P=0.0076 و P=0.8102). ز، آنالیز شول از نورون‌های TS و کنترل در hCO و t-hCO. خطوط نقطه‌چین، نورون‌های هرمی L2/3 پس از تولد انسان را برای مقایسه نشان می‌دهند (n = 24 نورون t-hCO کنترل، n = 21 نورون t-hCO TS، n = 8 نورون hCO کنترل و n = 7 نورون hCO TS). داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده‌اند.
توانایی t-hCO در تکثیر ویژگی‌های مورفولوژیکی و عملکردی نورون‌های قشر مغز انسان در سطح بالا، ما را بر آن داشت تا بررسی کنیم که آیا می‌توان از t-hCO برای تشخیص فنوتیپ‌های بیماری استفاده کرد یا خیر. ما بر روی TS، یک اختلال عصبی-رشدی شدید ناشی از جهش‌های افزایش عملکرد در ژن کدکننده CaV1.2، که رونویسی ژن وابسته به فعالیت را در نورون‌ها آغاز می‌کند، تمرکز کردیم. ما hCO را از سه بیمار TS که حامل شایع‌ترین جایگزینی (p.G406R) بودند و سه گروه کنترل (شکل 3a) به دست آوردیم. پس از پیوند، متوجه شدیم که مورفولوژی دندریتیک در نورون‌های TS در مقایسه با گروه کنترل تغییر کرده است (شکل 3b و داده‌های گسترده، شکل 8a،b)، با افزایش دو برابری در تعداد دندریت‌های اولیه و افزایش کلی در میانگین و کاهش کلی در طول دندریتیک (شکل 3c و داده‌های گسترده، شکل 8c). این امر با افزایش تراکم خارها و افزایش فراوانی EPSCهای خودبه‌خودی در TS در مقایسه با نورون‌های کنترل همراه بود (شکل 3d-f و داده‌های گسترده، شکل 8g). تجزیه و تحلیل بیشتر، الگوهای انشعاب دندریتیک غیرطبیعی را در TS t-hCO در مقایسه با گروه کنترل نشان داد، اما در TS hCO در شرایط آزمایشگاهی در مرحله مشابهی از تمایز مشاهده نشد (شکل 3g). این با گزارش‌های قبلی ما در مورد انقباض دندریتیک وابسته به فعالیت در TS مطابقت دارد و توانایی این پلتفرم پیوند را در تشخیص فنوتیپ‌های بیماری در داخل بدن برجسته می‌کند.
سپس پرسیدیم که سلول‌های t-hCO تا چه حد از نظر عملکردی در S1 موش ادغام می‌شوند. S1 در جوندگان، ورودی‌های سیناپسی قوی را از هسته‌های قاعده‌ای شکمی و خلفی تالاموس همان طرف، و همچنین قشرهای حرکتی و حسی-پیکری ثانویه همان طرف، و S1 طرف مقابل دریافت می‌کند (شکل 4a). برای بازیابی الگوی عصب‌دهی، hCO را با ویروس هاری-dG-GFP/AAV-G آلوده کردیم و 3 روز بعد hCO را به موش S1 پیوند زدیم. 7 تا 14 روز پس از پیوند، بیان متراکم GFP را در نورون‌های S1 همان طرف و گانگلیون‌های قاعده‌ای شکمی مشاهده کردیم (شکل 4b، c). علاوه بر این، رنگ‌آمیزی آنتی‌بادی نشانگر تالاموس netrin G1، وجود انتهای تالاموس را در t-hCO نشان داد (شکل 4d، e). برای ارزیابی اینکه آیا این انشعابات آوران می‌توانند پاسخ‌های سیناپسی را در سلول‌های t-hCO ایجاد کنند، ما ثبت‌های سلولی کامل از سلول‌های انسانی را در بخش‌های تیز لایه تالاموکورتیکال انجام دادیم. تحریک الکتریکی S1 موش، کپسول داخلی، ماده سفید، فیبرهای نزدیک t-hCO یا فعال‌سازی اپتوژنتیکی انتهای تالاموس بیان‌کننده اپسین در t-hCO، EPSCهای با تأخیر کوتاه را در نورون‌های t-hCO که در معرض آنتاگونیست گیرنده AMPA، NBQX، قرار گرفته بودند، القا کرد. (شکل 4f، g و داده‌های گسترده، شکل 9a-g). این داده‌ها نشان می‌دهند که t-hCO از نظر آناتومیکی در مغز موش ادغام شده است و می‌تواند توسط بافت میزبان موش فعال شود.
الف، نمودار شماتیک یک آزمایش ردیابی هاری. ب، بیان GFP و STEM121 اختصاصی انسان بین t-hCO و قشر مغز موش صحرایی (پانل بالایی). همچنین بیان GFP در هسته قاعده‌ای شکمی (VB) همان طرف موش صحرایی (پایین سمت چپ) و S1 همان طرف (پایین سمت راست) نشان داده شده است. نوار مقیاس، 50 میکرومتر. مربع‌های قرمز نشان دهنده مناطقی از مغز هستند که تصاویر در آنها گرفته شده است. ج، کمی‌سازی سلول‌های بیان کننده GFP (n = 4 موش). د، ه - پایانه‌های تالاموس Netrin G1+ در t-hCO. د یک برش تاجی حاوی هسته‌های t-hCO و VB را نشان می‌دهد. نوار مقیاس، 2 میلی‌متر. ه بیان Netrin G1 و STEM121 را در نورون‌های t-hCO (چپ) و VB (راست) نشان می‌دهد. نوار مقیاس، 50 میکرومتر. خط نقطه‌چین نارنجی مرز t-hCO را نشان می‌دهد. f، g، ردپای فعلی نورون‌های t-hCO پس از تحریک الکتریکی در موش S1 (f) یا کپسول داخلی (g)، با (بنفش) یا بدون (سیاه) NBQX (چپ). دامنه‌های EPSC با و بدون NBQX (n = 6 نورون S1، *P = 0.0119؛ و n = 6 نورون کپسول داخلی، **P = 0.0022) (مرکز). درصد نورون‌های t-hCO که EPSC را در پاسخ به تحریک الکتریکی موش S1 (f) یا کپسول داخلی (g) نشان می‌دهند (راست). aCSF، مایع مغزی نخاعی مصنوعی. h، نمودار شماتیک آزمایش تصویربرداری 2P (چپ). بیان GCaMP6s در t-hCO (وسط). نوار مقیاس، 100 میکرومتر. مرور زمان فلورسانس GCaMP6s (راست). i، امتیاز Z فلورسانس فعالیت خودبخودی. j، تصویر شماتیک تحریک سبیل. k، مسیرهای فلورسانس 2P با امتیاز z در یک آزمایش، همسو با انحراف ویسکر در زمان صفر (خط چین) در سلول‌های نمونه. l، پاسخ‌های میانگین جمعیت با امتیاز z از تمام سلول‌های همسو با انحراف ویسکر در زمان صفر (خط چین) (قرمز) یا مهرهای زمانی تصادفی تولید شده (خاکستری). m. نمودار شماتیک آزمایش بر روی علامت‌گذاری نوری. n، منحنی‌های ولتاژ خام از یک سلول t-hCO نمونه در طول تحریک لیزر آبی یا انحراف ویسکر. فلش‌های قرمز اولین جهش‌های ناشی از نور (بالا) یا ناشی از انحراف ویسکر (پایین) را نشان می‌دهند. سایه خاکستری دوره‌های انحراف ویسکر را نشان می‌دهد. o، شکل موج‌های اوج نور و پاسخ‌های انحراف ویسکر. p، جهش‌های یک تلاش واحد، همسو با انحراف ویسکر در سلول‌های نمونه. 0 انحراف ویسکر (خط چین) را نشان می‌دهد. q، نرخ شلیک میانگین جمعیت z-score برای همه سلول‌های حساس به نور، هم‌تراز با انحراف سبیل در زمان صفر (خط چین) (قرمز) یا مهرهای زمانی تصادفی تولید شده (خاکستری). r، نسبت واحدهای حساس به نور که به طور قابل توجهی توسط انحراف سبیل تعدیل می‌شوند (n = 3 موش) (چپ). حداکثر تأخیر z-score (n = 3 موش؛ n = 5 (سبز روشن)، n = 4 (سبز تیره) و n = 4 (فیروزه‌ای) واحد مدولاسیون انحراف سبیل در هر موش) (راست). داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده‌اند.
سپس پرسیدیم که آیا t-hCO می‌تواند توسط محرک‌های حسی در داخل بدن فعال شود یا خیر. ما hCO را که نشانگرهای کلسیم کدگذاری شده ژنتیکی GCaMP6 را بیان می‌کرد، به موش‌های S1 پیوند زدیم. پس از 150 روز، ما فتومتری فیبر یا تصویربرداری کلسیم دو فوتونی را انجام دادیم (شکل 4h و داده‌های گسترش‌یافته، شکل 10a). ما دریافتیم که سلول‌های t-hCO فعالیت ریتمیک هماهنگ‌شده‌ای را نشان می‌دهند (شکل 4i، داده‌های گسترش‌یافته، شکل 10b و ویدیوی تکمیلی 1). برای مشخص کردن اوج فعالیت t-hCO، ما ثبت‌های الکتروفیزیولوژیکی خارج سلولی را در موش‌های پیوندی بی‌هوش انجام دادیم (داده‌های گسترش‌یافته، شکل 10c-f). ما مختصات استریوتاکسی را از تصاویر MRI ایجاد کرده‌ایم. بنابراین، این واحدهای ثبت‌شده نشان‌دهنده نورون‌های فرضی انسان هستند، اگرچه الکتروفیزیولوژی به تنهایی اجازه تعیین گونه مبدا را نمی‌دهد. ما انفجارهای هماهنگ فعالیت را مشاهده کردیم (داده‌های گسترش‌یافته، شکل 10d). این انفجارها حدود ۴۶۰ میلی‌ثانیه طول کشیدند و با دوره‌های سکوت حدود ۲ ثانیه از هم جدا شدند (داده‌های بسط‌یافته، شکل ۱۰d، e). واحدهای منفرد به طور متوسط ​​حدود سه دور در هر انفجار شلیک کردند که تقریباً ۷۳٪ از واحدهای ثبت‌شده در هر انفجار است. فعالیت‌های واحدهای منفرد بسیار هم‌بسته بودند و این همبستگی‌ها بیشتر از واحدهای شناسایی‌شده در حیوانات واکسینه نشده ثبت‌شده تحت شرایط مشابه بود (داده‌های بسط‌یافته، شکل ۱۰f). برای توصیف بیشتر پاسخ‌های اسپایک نورون‌های مشتق‌شده از انسان شناسایی‌شده، ما آزمایش‌های برچسب‌گذاری نوری را روی موش‌های بی‌هوش‌شده که با hCO بیان‌کننده کانال کاتیونی حساس به نور رودوپسین ۲ (hChR2) پیوند شده بودند، انجام دادیم که از طریق آن نورون‌های t-hCO در پاسخ به محرک‌های نور آبی، تشخیص با تأخیر کوتاه (کمتر از ۱۰ میلی‌ثانیه) را انجام می‌دهند (شکل ۴m-o). نورون‌های t-hCO انفجارهایی از فعالیت خودبه‌خودی را در فرکانس‌هایی مشابه با فرکانس‌های مشاهده‌شده در تصویربرداری کلسیم و همچنین ثبت‌های الکتروفیزیولوژیکی انجام‌شده در t-hCO در غیاب علامت‌گذاری نوری نشان دادند (داده‌های بسط‌یافته، شکل 10c-g). هیچ فعالیت خودبه‌خودی در مراحل مربوطه hCO ثبت‌شده در شرایط آزمایشگاهی مشاهده نشد. برای ارزیابی اینکه آیا t-hCO می‌تواند توسط محرک‌های حسی فعال شود، ما به‌طور خلاصه سبیل‌های موش را از t-hCO منحرف کردیم (شکل 4j,m و داده‌های بسط‌یافته، شکل 10h,k). طبق مطالعات قبلی8،10، زیرمجموعه‌ای از سلول‌های t-hCO فعالیت افزایش‌یافته‌ای را در پاسخ به انحراف سبیل نشان دادند، که هنگام مقایسه داده‌ها با مهرهای زمانی تصادفی مشاهده نشد (شکل 4k-q و داده‌های بسط‌یافته، شکل 10h-q). در واقع، حدود 54٪ از واحدهای منفرد برچسب‌گذاری‌شده با اپتو، پس از تحریک سبیل، افزایش قابل‌توجهی در میزان برانگیختگی نشان دادند که در حدود 650 میلی‌ثانیه به اوج خود رسید (شکل 4r). روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که t-hCO ورودی‌های عملکردی مناسبی دریافت می‌کند و می‌تواند توسط محرک‌های محیطی فعال شود.
سپس بررسی کردیم که آیا t-hCO می‌تواند مدارهایی را در موش‌ها برای کنترل رفتار فعال کند یا خیر. ابتدا بررسی کردیم که آیا آکسون‌های نورون‌های t-hCO به بافت‌های اطراف موش پرتاب می‌شوند یا خیر. ما hCO را با یک لنتی‌ویروس کدکننده hChR2 متصل به EYFP (hChR2-EYFP) آلوده کردیم. پس از 110 روز، بیان EYFP را در نواحی قشری همان طرف، از جمله قشرهای شنوایی، حرکتی و حسی-تنی، و همچنین در نواحی زیرقشری، از جمله جسم مخطط، هیپوکامپ و تالاموس مشاهده کردیم (شکل 5a). برای ارزیابی اینکه آیا این برآمدگی‌های وابران می‌توانند پاسخ‌های سیناپسی را در سلول‌های موش ایجاد کنند، سلول‌های t-hCO بیان‌کننده hChR2-EYFP را با ثبت سلول‌های قشر مغز موش در مقاطع تیز مغز، به صورت نوری فعال کردیم. فعال‌سازی آکسون‌های t-hCO با نور آبی، EPSCهای با تأخیر کوتاه را در نورون‌های قشر هرمی موش القا کرد که توسط NBQX مسدود شده بودند (شکل‌های 5b-g). علاوه بر این، این پاسخ‌ها می‌توانند توسط تترودوتوکسین (TTX) مسدود شده و توسط 4-آمینوپیریدین (4-AP) بازیابی شوند، که نشان می‌دهد آنها توسط اتصالات تک سیناپسی ایجاد شده‌اند (شکل 5e).
الف، نمودار شماتیک ردیابی آکسون (چپ). بیان t-hCO EYFP (راست). نوار مقیاس، ۱۰۰ میکرومتر. A1، قشر شنوایی، ACC، قشر کمربندی قدامی، d. جسم مخطط، جسم مخطط پشتی، HPC، هیپوکامپ؛ دیافراگم، سپتوم جانبی، mPFC، قشر جلوی پیشانی داخلی، پیری، قشر پیریفورم، v. جسم مخطط، جسم مخطط شکمی، VPM، هسته شکمی-پوستومی میانی تالاموس، VTA، ناحیه تگمنتوم شکمی. مربع‌های قرمز نشان دهنده نواحی مغز هستند که تصاویر در آنها گرفته شده است. ب، نمودار شماتیک آزمایش تحریک. ج، د، نمونه‌هایی از پاسخ جریان نوری ناشی از نور آبی (بالا) و ولتاژ (پایین) در انسان (ج) سلول‌های EYFP+ t-hCO یا موش (د) سلول‌های EYFP-. e، f، ردپای فعلی نورون‌های موش صحرایی پس از تحریک آکسون‌های t-hCO با نور آبی با TTX و 4-AR (سبز)، TTX (خاکستری) یا aCSF (سیاه) (e)، با (بنفش) یا بدون (سیاه) NBQX (e). g، تأخیر پاسخ‌های القا شده توسط نور آبی در سلول‌های موش صحرایی (n = 16 سلول)؛ میله‌های افقی میانگین تأخیر (7.13 میلی‌ثانیه) را نشان می‌دهند (چپ). دامنه EPSC های برانگیخته شده با نور ثبت شده با یا بدون NBQX (n = 7 سلول؛ ***P < 0.0001) (وسط). دامنه EPSC های برانگیخته شده با نور ثبت شده با یا بدون NBQX (n = 7 سلول؛ ***P < 0.0001) (وسط). Amplituda vыzvannыh World EPSC، ثبت شده با یا بدون NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (در مرکز). دامنه EPSC های القا شده توسط نور با یا بدون NBQX ثبت شده است (n = 7 سلول؛ ***P < 0.0001) (مرکز).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中） Amplituda vыzvannыh World EPSC، ثبت شده با یا بدون NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (در مرکز). دامنه EPSC های القا شده توسط نور با یا بدون NBQX ثبت شده است (n = 7 سلول؛ ***P < 0.0001) (مرکز).درصد سلول‌های موش صحرایی که EPSCهایی را نشان می‌دهند که به نور آبی پاسخ می‌دهند (راست). ح، نمودار شماتیک یک وظیفه رفتاری. د0، روز 0. ط. عملکرد حیوانات نمونه در روز 1 (چپ) یا روز 15 (راست) آموزش. میانگین تعداد لیس زدن‌های انجام شده در روز ۱ (چپ) یا روز ۱۵ (سمت راست وسط) (n = ۱۵۰ آزمایش نور آبی، n = ۱۵۰ آزمایش نور قرمز؛ ***P < ۰.۰۰۰۱). میانگین تعداد لیس زدن‌های انجام شده در روز ۱ (چپ) یا روز ۱۵ (سمت راست وسط) (n = ۱۵۰ آزمایش نور آبی، n = ۱۵۰ آزمایش نور قرمز؛ ***P < ۰.۰۰۰۱). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) یا 15 (در центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <00001). میانگین تعداد لیس زدن‌های انجام شده در روز ۱ (چپ) یا روز ۱۵ (وسط سمت راست) (n = ۱۵۰ آزمایش نور آبی، n = ۱۵۰ آزمایش نور قرمز؛ ***P < ۰.۰۰۰۱).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150n =次红光试验；***P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150n =次红光试验；***P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) یا 15 (در центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <00001). میانگین تعداد لیس زدن‌های انجام شده در روز ۱ (چپ) یا روز ۱۵ (وسط سمت راست) (n = ۱۵۰ آزمایش نور آبی، n = ۱۵۰ آزمایش نور قرمز؛ ***P < ۰.۰۰۰۱).لیسیدن‌های تجمعی برای آزمایش‌های نور قرمز و آبی در روز 1 (وسط سمت چپ) یا روز 15 (راست). NS، معنی‌دار نیست. j,k، ویژگی‌های رفتاری تمام حیواناتی که در روز 1 یا 15 با t-hCO بیان‌کننده hChR2-EYFP (j) یا فلوروفور کنترل (k) پیوند زده شده‌اند (hChR2-EYFP: n = 9 موش، ** P = 0.0049؛ کنترل: n = 9، P = 0.1497). l، تکامل امتیاز ترجیح (n = 9 hChR2، n = 9 کنترل؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l، تکامل امتیاز ترجیح (n = 9 hChR2، n = 9 کنترل؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l، Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 کنترلьных؛ **P <0،001، ***P <0،0001). l، تکامل امتیاز ترجیح (n = 9 hChR2، n = 9 گروه کنترل؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9hChR2，n = 9对照；**P <0.001،***P <0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9hChR2，n = 9对照；**P <0.001،***P <0.0001）. l، Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 کنترل؛ **P <0،001، ***P <0،0001). l، تکامل نمرات ترجیحی (n = 9 hChR2، n = 9 گروه کنترل؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001).m، بیان FOS در پاسخ به فعال‌سازی اپتوژنتیکی t-hCO در S1. تصاویر بیان FOS (چپ) و اندازه‌گیری (n = 3 در هر گروه؛ *P < 0.05، **P < 0.01 و ***P < 0.001) (راست) نشان داده شده است. تصاویر بیان FOS (چپ) و اندازه‌گیری (n = 3 در هر گروه؛ *P < 0.05، **P < 0.01 و ***P < 0.001) (راست) نشان داده شده است. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) و مشخصه های عمومی (n = 3 در گروه؛ * P <0,05, ** P <0,01 و *** P <0,001) (справа). تصاویر بیان FOS (چپ) و تعیین مقدار آن (n = 3 در هر گروه؛ *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001) (راست) نشان داده شده است.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) و مشخصه های عمومی (n = 3 در گروه؛ * P <0,05, ** P <0,01 و *** P <0,001) (справа). تصاویر بیان FOS (چپ) و تعیین مقدار آن (n = 3 در هر گروه؛ *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001) (راست) نشان داده شده است.نوار مقیاس، ۱۰۰ میکرومتر. داده‌ها به صورت میانگین ± خطای معیار BLA، لوزه قاعده‌ای-جانبی، MDT، هسته تالاموس پشتی-میانی، PAG، خاکستری اطراف مجرا بیان شده‌اند.
در نهایت، ما پرسیدیم که آیا t-hCO می‌تواند رفتار موش را تعدیل کند. برای آزمایش این موضوع، hCO بیان‌کننده hChR2-EYFP را به S1 پیوند زدیم و 90 روز بعد، فیبرهای نوری را برای انتقال نور به t-hCO کاشتیم. سپس موش‌ها را با یک الگوی شرطی‌سازی عامل اصلاح‌شده آموزش دادیم (شکل 5h). ما حیوانات را در یک محفظه آزمایش رفتاری قرار دادیم و به طور تصادفی محرک‌های لیزری 5 ثانیه‌ای آبی (473 نانومتر) و قرمز (635 نانومتر) را اعمال کردیم. اگر حیوانات در طول تحریک نور آبی لیس می‌زدند اما در طول تحریک نور قرمز لیس نمی‌زدند، پاداش آب دریافت می‌کردند. در روز اول آموزش، حیوانات هیچ تفاوتی در لیس زدن هنگام تحریک با نور آبی یا قرمز نشان ندادند. با این حال، در روز 15، حیواناتی که hCO بیان‌کننده hChR2-EYFP پیوند زده شده بودند، هنگام تحریک با نور آبی در مقایسه با تحریک با نور قرمز، لیس زدن فعال‌تری نشان دادند. این تغییرات در رفتار لیسیدن در حیوانات کنترل که با hCO بیان کننده فلوروفور کنترل پیوند شده بودند، مشاهده نشد (میزان موفقیت یادگیری: hChR2 89٪، EYFP 0٪، شکل 5i-1 و ویدیوی تکمیلی 2). این داده‌ها نشان می‌دهند که سلول‌های t-hCO می‌توانند نورون‌های موش را برای تحریک رفتار پاداش‌جویی فعال کنند. برای فهمیدن اینکه کدام مدارهای عصبی t-hCO موش ممکن است در این تغییرات رفتاری دخیل باشند، ما t-hCO را به صورت اپتوژنتیکی در حیوانات آموزش دیده فعال کردیم و 90 دقیقه بعد بافت‌ها را برداشتیم. ایمونوهیستوشیمی بیان پروتئین FOS وابسته به فعالیت را در چندین ناحیه مغز که در رفتار انگیزشی دخیل هستند، از جمله قشر جلوی مغز میانی، تالاموس میانی و ماده خاکستری اطراف مجرا، که یا در حیوانات کنترل تحریک نشده یا در حیوانات بیان شده بود، نشان داد. برنج. 5m). روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که t-hCO می‌تواند فعالیت عصبی موش را برای هدایت رفتار تعدیل کند.
ارگانوئیدهای عصبی، سیستمی امیدوارکننده برای مطالعه‌ی رشد و بیماری‌های انسانی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) هستند، اما به دلیل فقدان ارتباط بین مدارهای موجود در داخل بدن (in vivo)، محدود شده‌اند. ما یک پلتفرم جدید ایجاد کرده‌ایم که در آن hCO را به S1 موش‌های صحرایی مبتلا به نقص ایمنی در مراحل اولیه‌ی پس از تولد پیوند زدیم تا رشد و عملکرد سلول‌های انسانی را در داخل بدن (in vivo) مطالعه کنیم. ما نشان داده‌ایم که t-hCO انواع سلول‌های بالغی را ایجاد می‌کند که در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) مشاهده نمی‌شوند28 و اینکه t-hCO از نظر آناتومیکی و عملکردی در مغز جوندگان ادغام شده است. ادغام t-hCO در مدارهای عصبی جوندگان به ما این امکان را داد تا ارتباطی بین فعالیت سلولی انسان و رفتار حیوانات مورد مطالعه برقرار کنیم و نشان دهیم که نورون‌های t-hCO می‌توانند فعالیت عصبی موش را برای هدایت پاسخ‌های رفتاری تعدیل کنند.
پلتفرمی که ما توصیف می‌کنیم، مزایای متعددی نسبت به تحقیقات قبلی در مورد پیوند سلول‌های انسانی به مغز جوندگان دارد. اول، ما hCO را به قشر در حال رشد موش‌های صحرایی در مراحل اولیه پس از تولد پیوند زدیم که ممکن است ادغام آناتومیکی و عملکردی را تسهیل کند. دوم، نظارت MRI با t-hCO به ما این امکان را داد که موقعیت پیوند و رشد را در حیوانات زنده مطالعه کنیم و به ما این امکان را داد که مطالعات طولانی مدت چند حیوانی را انجام دهیم و قابلیت اطمینان چندین رده سلولی hiPS را ایجاد کنیم. در نهایت، ما به جای سوسپانسیون‌های تک سلولی جدا شده، ارگانوئیدهای دست نخورده را پیوند زدیم که برای سلول‌های انسانی کمتر مخرب هستند و می‌توانند ادغام و تولید نورون‌های قشر مغز انسان را در مغز موش‌ها تقویت کنند.
ما اذعان داریم که علیرغم پیشرفت‌ها در این پلتفرم، محدودیت‌های زمانی، مکانی و بین گونه‌ای مانع از تشکیل مدارهای عصبی انسان با دقت بالا، حتی پس از پیوند در مراحل اولیه رشد، می‌شود. به عنوان مثال، مشخص نیست که آیا فعالیت خودبه‌خودی مشاهده شده در t-hCO نشان دهنده یک فنوتیپ رشدی مشابه فعالیت ریتمیک مشاهده شده در طول رشد قشر مغز است یا اینکه به دلیل عدم وجود انواع سلول‌های سرکوبگر موجود در t-hCO است. به طور مشابه، مشخص نیست که عدم وجود لایه‌بندی در t-hCO تا چه حد بر اتصال زنجیره تأثیر می‌گذارد30. کارهای آینده بر ادغام انواع دیگر سلول‌ها مانند میکروگلیاهای انسانی، سلول‌های اندوتلیال انسانی و نسبت‌های مختلف نورون‌های رابط گاباارژیک همانطور که با استفاده از assembly 6 در شرایط آزمایشگاهی نشان داده شده است، و همچنین درک چگونگی وقوع ادغام و پردازش عصبی در سطوح رونویسی، سیناپسی و رفتاری تغییر یافته t-hCO تمرکز خواهد کرد.
به طور کلی، این پلتفرم درون‌تنی (in vivo) منبع قدرتمندی را ارائه می‌دهد که می‌تواند تحقیقات در مورد رشد مغز انسان و بیماری‌ها را در شرایط آزمایشگاهی تکمیل کند. ما پیش‌بینی می‌کنیم که این پلتفرم به ما امکان می‌دهد فنوتیپ‌های جدید در سطح رشته را در سلول‌های مشتق شده از بیمار که در غیر این صورت دست نیافتنی بودند، کشف کنیم و استراتژی‌های درمانی جدیدی را آزمایش کنیم.
ما hCO2.5 را از سلول‌های HiPS همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تولید کردیم. برای شروع تولید hCO از سلول‌های hiPS کشت شده روی لایه‌های تغذیه‌کننده، کلونی‌های سالم سلول‌های hiPS با استفاده از دیسپاز (0.35 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) از ظروف کشت خارج شده و به کشت‌های پلاستیکی با چسبندگی بسیار کم حاوی ظروف حاوی محیط کشت سلول hiPS (Corning) که با دو مهارکننده SMAD، دورسومورفین (5 میکرومولار؛ P5499، Sigma-Aldrich) و SB-431542 (10 میکرومولار؛ 1614، Tocris) و مهارکننده ROCK Y-27632 (10 میکرومولار؛ S1049، Selleckchem) تکمیل شده بودند، منتقل شدند. در طول 5 روز اول، محیط کشت سلول‌های hiPS روزانه تعویض می‌شد و دورسومورفین و SB-431542 اضافه می‌شدند. در روز ششم در حالت تعلیق، اسفروئیدهای عصبی به محیط عصبی حاوی نوروبازال-A (10888، Life Technologies)، مکمل B-27 بدون ویتامین A (12587، Life Technologies)، گلوتاماکس (1:100، Life Technologies)، پنی‌سیلین و استرپتومایسین (1:100، Life Technologies) منتقل شدند و تا روز 24 با فاکتور رشد اپیدرمی (EGF؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) و فاکتور رشد فیبروبلاست 2 (FGF2؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) تکمیل شدند. از روز 25 تا روز 42، محیط کشت با فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ Peprotech) و نوروتروفین 3 (NT3؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ Peprotech) تکمیل شد و محیط کشت یک روز در میان تعویض شد. در روز ششم در حالت تعلیق، اسفروئیدهای عصبی به محیط عصبی حاوی نوروبازال-A (10888، Life Technologies)، مکمل B-27 بدون ویتامین A (12587، Life Technologies)، گلوتاماکس (1:100، Life Technologies)، پنی‌سیلین و استرپتومایسین (1:100، Life Technologies) منتقل شدند و تا روز 24 با فاکتور رشد اپیدرمی (EGF؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) و فاکتور رشد فیبروبلاست 2 (FGF2؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) تکمیل شدند. از روز 25 تا روز 42، محیط کشت با فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ Peprotech) و نوروتروفین 3 (NT3؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ Peprotech) تکمیل شد و محیط کشت یک روز در میان تعویض شد.در روز ششم در حالت تعلیق، اسفروئیدهای عصبی به محیط عصبی حاوی Neurobasal-A (10888، Life Technologies)، مکمل B-27 بدون ویتامین A (12587، Life Technologies)، GlutaMax (1:100، Life Technologies) و پنی‌سیلین منتقل شدند.و streptomicin (1:100، Life Technologies) و تکمیل کننده эпидермальным фактором розта (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) و фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20ng/ml; R&D Systems) تا 24-. و استرپتومایسین (۱:۱۰۰، Life Technologies) و تا روز ۲۴ با فاکتور رشد اپیدرمی (EGF؛ ۲۰ نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) و فاکتور رشد فیبروبلاست ۲ (FGF2؛ ۲۰ نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) تکمیل شد.از روزهای ۲۵ تا ۴۲، فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF؛ ۲۰ نانوگرم در میلی‌لیتر، Peprotech) و نوروتروفین ۳ (NT3؛ ۲۰ نانوگرم در میلی‌لیتر، Peprotech) به محیط کشت اضافه شدند و محیط کشت یک روز در میان تعویض گردید.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A7补充剂 (12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和10Life فناوری‌ها (تکنولوژی‌ها) سیستم ها）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a (10888) 神经b-27 补充剂 （12587， Life Technologies） Glutamax （1: 100， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 培养 基 中10 ， فناوری های زندگی ） 表皮 生长 因子 (((20 نانوگرم میلی لیتر-1) سیستم های تحقیق و توسعه) سیستم ها）直至第24天. در 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), Dobavku В-27 بدون ویتامین А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100، Life Technologies) со добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; در روز ششم، سوسپانسیون‌های نوروسفر به مکملی حاوی نوروبازال-A (10888، Life Technologies)، مکمل B-27 بدون ویتامین A (12587، Life Technologies)، گلوتامکس (1:100، Life Technologies)، استرپتومایسین خنثی‌شده با پنی‌سیلین (1:100، Life Technologies) غنی‌شده با فاکتور رشد اپیدرمی (EGF؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ R&D Systems) و فاکتور رشد فیبروبلاست 2 (FGF2؛ 20 نانوگرم در میلی‌لیتر) 1 تغییر داده شدند. سیستم های تحقیق و توسعه) تا 24 روز. سیستم‌های تحقیق و توسعه) تا روز ۲۴.از روزهای ۲۵ تا ۴۲، فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF؛ ۲۰ نانوگرم در میلی‌لیتر، Peprotech) و فاکتور نوروتروفیک ۳ (NT3؛ ۲۰ نانوگرم در میلی‌لیتر، Peprotech) یک روز در میان به محیط کشت اضافه شدند. محیط کشت یک بار تعویض شد.از روز ۴۳، hCO در محیط کشت neurobasal-A بدون مکمل (NM; 1088022, Thermo Fisher) نگهداری شد و محیط کشت هر ۴ تا ۶ روز تعویض گردید. برای به دست آوردن hCO از سلول‌های hiPS کشت شده در شرایط بدون تغذیه، سلول‌های hiPS به مدت ۷ دقیقه با Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند، به سلول‌های تکی تفکیک شدند و در صفحات AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) با تراکم ۳ × ۱۰۶ سلول تکی در هر چاهک در محیط کشت Essential 8 حاوی مهارکننده ROCK Y-27632 (10 میکرومولار; S1049, Selleckchem) کشت داده شدند. پس از 24 ساعت، محیط‌های کشت داخل چاهک‌ها با پیپت به محیط‌های کشت حاوی محیط کشت Essential 6 (A1516401، Life Technologies) غنی‌شده با دورسومورفین (2.5 میکرومولار؛ P5499، سیگما-آلدریچ) و SB-431542 (10 میکرومولار؛ 1614)، توکریدا، منتقل شدند. از روزهای 2 تا 6، محیط کشت Essential 6 روزانه با دورسومورفین و مکمل SB-431542 جایگزین شد. از روز ششم، سوسپانسیون‌های نوروسفر به محیط کشت نوروبازال منتقل و مطابق آنچه در بالا توضیح داده شد، نگهداری شدند.
تمام مراحل مراقبت از حیوانات مطابق با دستورالعمل‌های مراقبت از حیوانات که توسط کمیته اداری مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه استنفورد (APLAC) تأیید شده است، انجام شد. موش‌های باردار RNU (rnu/+) با وضعیت طبیعی (euthymic) از (آزمایشگاه‌های چارلز ریور) خریداری یا در محل نگهداری شدند. حیوانات در یک چرخه روشنایی-تاریکی ۱۲ ساعته با غذا و آب به طور آزاد نگهداری شدند. توله‌های موش صحرایی برهنه (FOXN1-/-) در سنین سه تا هفت روز، قبل از کشتار، با رشد سبیل‌های نابالغ شناسایی شدند. توله سگ‌ها (نر و ماده) با ایزوفلوران ۲-۳٪ بیهوش شده و روی قاب استریوتاکسی قرار داده شدند. سوراخ کردن جمجمه با قطر تقریبی ۲-۳ میلی‌متر بالای S1 با حفظ یکپارچگی سخت‌شامه انجام شد. سپس از یک سوزن ۳۰-G (تقریباً ۰.۳ میلی‌متر) درست در خارج از کرانیوتومی برای سوراخ کردن سخت‌شامه استفاده کنید. سپس HCO3 را روی یک پارافیلم نازک ۳×۳ سانتی‌متر بمالید و محیط اضافی را بردارید. با استفاده از یک سرنگ همیلتون متصل به یک سوزن ۲۳ G با زاویه ۴۵ درجه، به آرامی hCO را به انتهای انتهایی سوزن بکشید. سپس سرنگ را روی پمپ سرنگی متصل به دستگاه استریوتاکسیک نصب کنید. سپس نوک سوزن را روی یک سوراخ سوراخ شده قبلی به عرض ۰.۳ میلی‌متر در سخت‌شامه (z = ۰ میلی‌متر) قرار دهید و سرنگ را ۱ تا ۲ میلی‌متر (z = تقریباً -۱.۵ میلی‌متر) باریک کنید تا سوزن بین سخت‌شامه A قرار گیرد. یک آب‌بندی متراکم ایجاد می‌شود. سپس سرنگ را تا مرکز سطح قشری در z = -۰.۵ میلی‌متر بالا ببرید و hCO را با سرعت ۱ تا ۲ میکرولیتر در دقیقه تزریق کنید. پس از اتمام تزریق hCO، سوزن با سرعت ۰.۲ تا ۰.۵ میلی‌متر در دقیقه عقب کشیده می‌شود، پوست بخیه زده می‌شود و توله سگ بلافاصله تا زمان بهبودی کامل روی یک پد گرم قرار می‌گیرد. برخی از حیوانات به صورت دو طرفه پیوند زده شدند.
تمام مراحل مراقبت از حیوانات مطابق با دستورالعمل‌های مراقبت از حیوانات مورد تأیید APLAC دانشگاه استنفورد انجام شد. موش‌ها (بیش از 60 روز پس از پیوند) با 5٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند و در طول تصویربرداری با 1-3٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند. برای تصویربرداری، از یک اسکنر گمانه افقی 7 تسلایی Bruker (شرکت Bruker) با درایو گرادیان شرکت بین‌المللی برق (IECO)، یک درج گرادیانی محافظ با قطر داخلی 120 میلی‌متر (600 میلی‌تسلا بر متر، 1000 T/m/s) با استفاده از AVANCE. III، RF چند سیم‌پیچ هشت کاناله و قابلیت‌های چند هسته‌ای و پلتفرم Paravision 6.0.1 همراه استفاده شد. ضبط با استفاده از یک سیم‌پیچ RF حجمی جدا شده فعال با قطر داخلی 86 میلی‌متر و یک سیم‌پیچ RF چهار کاناله با خنک‌کننده کرایو فقط برای دریافت انجام شد. محوری دوبعدی توربو-RARE (زمان تکرار = ۲۵۰۰ میلی‌ثانیه، زمان اکو = ۳۳ میلی‌ثانیه، ۲ میانگین) با ۱۶ برش، ضخامت برش ۰.۶-۰.۸ میلی‌متر، حاوی ۲۵۶ × ۲۵۶ نمونه. سیگنال‌ها با استفاده از یک کویل RF حجمی فرستنده-گیرنده چهارگوش با قطر داخلی ۲ سانتی‌متر (Rapid MR International, LLC) دریافت شدند. در نهایت، از توابع تخمین سطح داخلی Imaris (BitPlane) برای رندر سه‌بعدی و تجزیه و تحلیل حجم استفاده کنید. پیوند موفق به عنوان پیوندی تعریف شد که در آن مناطقی از سیگنال MRI با وزن T2 پیوسته در نیمکره پیوند شده تشکیل شود. رد پیوند به عنوان پیوندی تعریف شد که مناطقی از سیگنال MRI با وزن T2 پیوسته در نیمکره پیوند شده ایجاد نکرد. t-hCO زیرقشری از تجزیه و تحلیل بعدی حذف شد.
برای بیان پایدار GCaMP6ها در hCO2 برای تصویربرداری کلسیم دو فوتونی، سلول‌های hiPS با pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro آلوده شدند و به دنبال آن آنتی‌بیوتیک‌های انتخابی تجویز گردید. به طور خلاصه، سلول‌ها با EDTA تفکیک شده و در 1 میلی‌لیتر از محیط کشت Essential 8 با تراکم تقریبی 300000 سلول در حضور پلی‌برن (5 میکروگرم در میلی‌لیتر) و 15 میکرولیتر ویروس به حالت تعلیق درآمدند. سپس سلول‌ها به مدت 60 دقیقه در حالت تعلیق انکوبه شدند و با تراکم 50000 سلول در هر چاهک کشت داده شدند. پس از تلاقی، سلول‌ها به مدت 5 تا 10 روز یا تا زمانی که کلنی‌های پایدار ظاهر شوند، با 5 تا 10 میکروگرم در میلی‌لیتر پورومایسین تیمار شدند. عفونت حاد hCO2 همانطور که قبلاً توضیح داده شد5 با برخی اصلاحات انجام شد. به طور خلاصه، روز ۳۰ تا ۴۵، hCO2 را به لوله‌های میکروسانتریفیوژ ۱.۵ میلی‌لیتری اپندورف حاوی ۱۰۰ میکرولیتر محیط کشت عصبی منتقل کنید. سپس تقریباً ۹۰ میکرولیتر از محیط کشت برداشته می‌شود، ۳ تا ۶ میکرولیتر لنتی ویروس با تیتر بالا (از ۰.۵ × ۱۰۸ تا ۱.۲ × ۱۰۹) به لوله اضافه می‌شود و hCO2 به مدت ۳۰ دقیقه به انکوباتور منتقل می‌شود. سپس ۹۰ تا ۱۰۰ میکرولیتر محیط کشت به هر لوله اضافه می‌شود و لوله‌ها یک شب به انکوباتور برگردانده می‌شوند. روز بعد، hCO2 را به محیط کشت عصبی تازه در پلیت‌های با چسبندگی کم منتقل کنید. پس از ۷ روز، hCO2 برای مشاهده و ارزیابی کیفیت عفونت به پلیت‌های کف شیشه‌ای ۲۴ خانه‌ای منتقل شد. pLV[Exp]-SYN1::eyfp-WPRE و pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE توسط VectorBuilder تولید شدند. لنتی ویروس در بیشتر آزمایش‌ها استفاده می‌شود زیرا در ژنوم میزبان ادغام می‌شود و امکان بیان ژن گزارشگر را در رده‌های سلولی آلوده فراهم می‌کند. برای پیگیری هاری، hCO3 در روزهای 30 تا 45 به طور همزمان با rabies-ΔG-eGFP و AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (پلاسمید شماره 67528، Addgene) آلوده شد، به مدت 3 روز کاملاً شسته شد و به موش‌های S1 پیوند زده شد و به مدت 7 تا 14 روز در داخل بدن نگهداری شد.
برای ایمونوسیتوشیمی، حیوانات بیهوش شده و از طریق ترانس کاردی با PBS و به دنبال آن 4٪ پارافرمالدهید (PFA در PBS؛ علوم میکروسکوپ الکترونی) پرفیوژن شدند. مغزها به مدت 2 ساعت یا یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد در 4٪ PFA تثبیت شدند، به مدت 48-72 ساعت در 30٪ ساکارز در PBS نگهداری شدند و در 1:1، 30٪ ساکارز: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583، Sakura Finetek) جاسازی شدند و برش‌های کرونالی با ضخامت 30 میکرومتر با استفاده از کرایوستات (Leica) تهیه شدند. برای ایمونوهیستوشیمی مقاطع ضخیم، حیوانات با PBS پرفیوژن شدند و مغز با استفاده از ویبراتوم (Leica) تشریح و به صورت کرونالی با ضخامت 300-400 میکرومتر برش داده شد و برش‌ها به مدت 30 دقیقه با 4٪ PFA تثبیت شدند. سپس کرایوسکشن‌ها یا برش‌های ضخیم با PBS شسته شدند، به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق (۱۰٪ سرم معمولی الاغ (NDS) و ۰.۳٪ تریتون X-100 رقیق شده در PBS) بلوکه شدند و با محلول بلوک‌کننده در دمای ۴ درجه سانتیگراد بلوکه شدند. – انکوباسیون کرایوسکشن‌ها یک شب انکوبه شدند و برش‌های ضخیم به مدت ۵ روز انکوبه شدند. آنتی‌بادی‌های اولیه مورد استفاده عبارت بودند از: ضد NeuN (موش، 1:500؛ ab104224، abcam)، ضد CTIP2 (موش صحرایی، 1:300؛ ab18465، abcam)، ضد GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، Dako)، ضد GFP (مرغ، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، ضد HNA (موش، 1:200؛ ab191181، abcam)، ضد NeuN (خرگوش، 1:500؛ ABN78، Millipore)، ضد PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، Santa Cruz)، ضد PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، Atlas Antibodies)، ضد RECA-1 (موش، 1:50؛ ab9774، abcam)، ضد SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، ضد SOX9 (بز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، Netrin G1a (بز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ضد STEM121 (موش، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، ضد SATB2 (موش، 1:50؛ ab51502، abcam)، ضد GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، Millipore) و ضد IBA1 (بز، 1:100؛ ab5076، abcam). آنتی‌بادی‌های اولیه مورد استفاده عبارت بودند از: ضد NeuN (موش، 1:500؛ ab104224، abcam)، ضد CTIP2 (موش صحرایی، 1:300؛ ab18465، abcam)، ضد GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، Dako)، ضد -GFP (مرغ، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، ضد HNA (موش، 1:200؛ ab191181، abcam)، ضد NeuN (خرگوش، 1:500؛ ABN78، Millipore)، ضد PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، Santa Cruz)، ضد PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، Atlas Antibodies)، ضد RECA-1 (موش، 1:50؛ ab9774، abcam)، ضد SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، ضد SOX9 (بز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، Netrin G1a (بز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ضد STEM121 (موش، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، ضد SATB2 (موش، 1:50؛ ab51502، abcam)، ضد GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، Millipore) و ضد IBA1 (بز، 1:100؛ ab5076، abcam). Anti-NeuN (мышиные, 1:500؛ ab104224, abcam)، anti-CTIP2 (крысиные, 1:300؛ ab18465, abcam), anti-GFAP (1:010), anti-GFAP (1:010) -GFP (курица، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، anti-HNA (мышь، 1:200؛ ab191181، abcam)، anti-NeuN (кролик، 1:500؛ ABN78، Millipore)، анти-PDGFRA (кролик، 1:200، sc-38; anti-PPP1R17 (crolik، 1:200؛ HPA047819، Atlas Antibodies)، anti-RECA-1 (мышь، 1:50؛ ab9774، abcam)، anti-SCG2 (кролик، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، anti-SOX9 (козий، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، нетрин G1a (козий، 110، 6، AF) anti-STEM121 (мышиный , 1:200؛ Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502، abcam)، anti-GAD65/67 (crolik، 1:400؛ ABN904، Millipore) و anti-IBA1 (کزا، 1:100؛ ab5076، абкам). آنتی‌بادی‌های اولیه مورد استفاده عبارت بودند از: ضد NeuN (موش، 1:500؛ ab104224، abcam)، ضد CTIP2 (موش صحرایی، 1:300؛ ab18465، abcam)، ضد GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، Dako)، ضد GFP (مرغ، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، ضد HNA (موش، 1:200؛ ab191181، abcam)، ضد NeuN (خرگوش، 1:500؛ ABN78، Millipore)، ضد PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، ضد PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، آنتی‌بادی‌های اطلس)، ضد RECA-1 (موش، 1:50؛ ab9774، abcam)، ضد SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، ضد SOX9 (بز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، نترین G1a (بز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ضد STEM121 (موش، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، ضد SATB2 (موش، 1:50؛ ab51502، abcam)، ضد GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، Millipore) و ضد IBA1 (بز، 1:100؛ ab5076، abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970،GeneTex）،抗HNA（小鼠،1:200；ab1911 81,abcam,,抗NeuN,兔,1:500,ABN78,Milipore,抗PDGFRA,兔, 1:200；sc-338，سانتا کروز），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，اطلس抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）، 1:100, 20357-1-AP, Proteintech, SOX9, 山羊, 1:500, AF3075, R&D Systems, Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300,ab18465,abcam,,GFAP,兔,1:1,000,Z0334,Dako,,抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠،1:200；ab 191181, abcam,, 抗NeuN, 兔, 1:500, ABN78, Millipore, 弔, 抗1: 200；sc-338，سانتا کروز），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，اطلس抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）,Netrin G1a（山羊（山羊（（（， 羊，1:100 AFR&6 سیستم‌ها） فصل ۱:۲۰،Y40410، Takara Bio)، anti-SATB2 (موش، 1:50؛ ab51502، abcam)، anti-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، Millipore) و anti-IBA1 (بز، 1:100؛ ab5076، abcam).آنتی‌بادی‌های اولیه مورد استفاده عبارت بودند از: ضد NeuN (موش، 1:500؛ ab104224، abcam)، ضد CTIP2 (موش صحرایی، 1:300؛ ab18465، abcam)، ضد GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، Dako). ، ضد GFP (مرغ، ۱:۱۰۰۰؛ GTX13970، GeneTex)، ضد HNA (موش، ۱:۲۰۰؛ ab191181، abcam)، ضد NeuN (خرگوش، ۱:۵۰۰؛ ABN78، Millipore)، ضد PDGFRA (خرگوش، ۱:۲۰۰؛ sc-338، سانتا کروز)، ضد PPP1R17 (خرگوش، ۱:۲۰۰؛ HPA047819، آنتی‌بادی اطلس)، ضد RECA-1 (موش، ۱:۵۰؛ ab9774، abcam)، ضد SCG2 (خرگوش)، ۱:۱۰۰؛20357-1-AP، Proteintech)، anti-SOX9 (коза، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، نترین G1a (کزا، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ضد -STEM121 (мышь، 1:200B، 1:200،YARA) (мышь، 1:50؛ ab51502، abcam)، anti-GAD65/67 (кролик، 1:400؛ ABN904، Millipore) و anti-IBA1 (کزا، 1:100؛ ab5076، abkam). 20357-1-AP، Proteintech)، آنتی-SOX9 (بز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، Netrin G1a (بز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، آنتی-STEM121 (موش، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، آنتی-SATB2 (موش، 1:50؛ ab51502، abcam)، آنتی-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، Millipore) و آنتی-IBA1 (بز، 1:100؛ ab5076، abkam).سپس برش‌ها با PBS شسته شده و به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق (برش‌های منجمد) یا یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد (برش‌های ضخیم) با آنتی‌بادی ثانویه انکوبه شدند. از آنتی‌بادی ثانویه Alexa Fluor (Life Technologies) رقیق شده با نسبت ۱:۱۰۰۰ در محلول مسدودکننده استفاده شد. پس از شستشو با PBS، هسته‌ها با Hoechst 33258 (Life Technologies) مشاهده شدند. در نهایت، اسلایدها با استفاده از Aquamount (Polysciences) روی میکروسکوپ با لامل (Fisher Scientific) قرار داده شدند و با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت Keyence (آنالیزور BZ-X) یا میکروسکوپ کانفوکال Leica TCS SP8 (Las-X) روی تصویر تجزیه و تحلیل شدند. تصاویر با استفاده از برنامه ImageJ (Fiji) پردازش شدند. برای تعیین کمیت نسبت نورون‌های انسان در t-hCO و قشر مغز موش، تصاویر مستطیلی به عرض ۳۸۷.۵ میکرومتر در مرکز t-hCO، در لبه یا نزدیک به لبه قشر مغز موش گرفته شد. حاشیه‌های پیوند با ارزیابی تغییرات در شفافیت بافت، هسته‌های HNA+ و/یا وجود خودفلورسانس بافت تعیین شدند. در هر تصویر، تعداد کل سلول‌های NeuN+ و HNA+ بر تعداد کل سلول‌های NeuN+ در همان ناحیه تقسیم شد. برای اطمینان از اینکه فقط سلول‌های دارای هسته در صفحه تصویر شمارش می‌شوند، فقط سلول‌هایی که Hoechst+ نیز هستند در محاسبه لحاظ می‌شوند. برای کاهش خطای آماری، از دو تصویر با فاصله حداقل ۱ میلی‌متر میانگین گرفته شد.
یک هفته قبل از جمع‌آوری نمونه، حیوانات پیوند شده با hCO (تقریباً ۸ ماه تمایز) را در یک اتاق تاریک با ریش‌های کوتاه شده برای به حداقل رساندن تحریک حسی قرار دهید. جداسازی هسته‌ها همانطور که قبلاً توضیح داده شد، با برخی اصلاحات انجام شد. به طور خلاصه، t-hCO و hCO با استفاده از لیز سلولی مکانیکی-شوینده و یک آسیاب بافت شیشه‌ای ۲ میلی‌لیتری (D8938، Sigma-Aldrich/KIMBLE) از بین رفتند. سپس هسته‌های خام با استفاده از یک فیلتر ۴۰ میکرومتری فیلتر شده و قبل از انجام گرادیان چگالی ساکارز، به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دور ۳۲۰ گرم سانتریفیوژ شدند. پس از مرحله سانتریفیوژ (۳۲۰ گرم به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد)، نمونه‌ها در ۰.۰۴٪ BSA/PBS با افزودن ۰.۲ واحد مهارکننده RNase µl-1 (۴۰ میکرولیتر، AM2682، Ambion) دوباره به حالت تعلیق درآمدند و از یک فیلتر جریان ۴۰ میکرومتری عبور داده شدند. سپس هسته‌های جدا شده در PBS حاوی ۰.۰۲٪ BSA دوباره به حالت تعلیق درآمدند و روی یک تراشه Chromium Single Cell 3′ بارگذاری شدند (بازیابی تخمینی ۸۰۰۰ سلول در هر لاین). کتابخانه‌های snRNA-seq با استفاده از Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) تهیه شدند. کتابخانه‌های snRNA-seq با استفاده از Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) تهیه شدند. Biblioтеки snRNA-seq با کمک Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). کتابخانه‌های snRNA-seq با استفاده از Chromium Single cell 3′ GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) تهیه شدند. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteku snRNA-seq آماده با استفاده از Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). کتابخانه snRNA-seq با استفاده از Chromium Single Cell 3′ GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) تهیه شد.کتابخانه‌های نمونه‌های مختلف جمع‌آوری و توسط Admera Health با استفاده از NovaSeq S4 (Illumina) توالی‌یابی شدند.
سطوح بیان ژن برای هر بارکد هسته‌ای فرضی با استفاده از بسته نرم‌افزاری تجزیه و تحلیل 10x Genomics CellRanger (نسخه 6.1.2) تعیین کمیت شدند. به طور خاص، خوانش‌ها با ترکیبی از ژنوم‌های مرجع انسان (GRCh38، Ensemble، نسخه 98) و موش (Rnor_6.0، Ensemble، نسخه 100) که با دستور mkref ایجاد شده بودند و با استفاده از count با دستور –include-introns=TRUE برای تعیین کمیت خوانش‌های شامل نگاشت شده به نواحی اینترون، تطبیق داده شدند. برای نمونه‌های t-hCO، هسته‌های انسان بر اساس الزام محافظه‌کارانه‌ای که حداقل 95٪ از کل خوانش‌های نگاشت شده با ژنوم انسان مطابقت دارند، شناسایی شدند. تمام تجزیه و تحلیل‌های بعدی بر روی خروجی آرایه بارکد فیلتر شده از CellRanger با استفاده از بسته R (نسخه 4.1.2) Seurat (نسخه 4.1.1)32 انجام شد.
برای اطمینان از اینکه فقط هسته‌های با کیفیت بالا در تجزیه و تحلیل بعدی گنجانده می‌شوند، یک فرآیند فیلترینگ تکراری برای هر نمونه اجرا شد. ابتدا هسته‌های با کیفیت پایین که کمتر از ۱۰۰۰ ژن منحصر به فرد در آنها یافت شده و بیش از ۲۰٪ از کل میتوکندری‌ها را تشکیل می‌دهند، شناسایی و حذف شدند. متعاقباً، ماتریس خام تعداد ژن‌ها با استفاده از رگرسیون دوجمله‌ای منفی منظم با استفاده از تابع sctransform(vst.flavor=”v2”) نرمال‌سازی شد، که همچنین ۳۰۰۰ ژن با بیشترین متغیر را با استفاده از پارامترهای پیش‌فرض شناسایی کرد. کاهش ابعاد روی ژن‌های متغیر بالایی با استفاده از تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) با پارامترهای پیش‌فرض با استفاده از مجموعه داده با ابعاد ۳۰ انجام شد (dims = ۳۰ بر اساس بازرسی بصری از محل‌های زانو انتخاب و برای همه نمونه‌ها و تجزیه و تحلیل‌های گروهی استفاده شد). سپس چندین دور خوشه‌بندی تکراری (رزولوشن = ۱) را برای طبقه‌بندی ژن‌ها بر اساس تعداد ژن‌های به‌طور غیرطبیعی کم (میانگین زیر صدک دهم)، تعداد ژن‌های میتوکندری به‌طور غیرطبیعی بالا (میانگین بالای صدک ۹۵) انجام دادیم تا سلول‌های فرضی با کیفیت پایین را شناسایی و حذف کنیم. خوشه‌ها و/یا نسبت بالایی از دوقلوهای مشکوک که با استفاده از بسته DoubletFinder33 شناسایی شدند (میانگین امتیاز DoubletFinder بالای صدک ۹۵). نمونه‌های t-hCO (n=3) و نمونه‌های hCO (n=3) با استفاده از تابع IntegrateData با پارامترهای فوق، به طور جداگانه ادغام شدند. سپس دور دیگری از فیلتر کیفی مجموعه داده‌های ادغام شده، همانطور که در بالا توضیح داده شد، انجام شد.
پس از حذف هسته‌های کم‌کیفیت، مجموعه داده‌های یکپارچه گروه‌بندی شدند (وضوح = 0.5) و برای اهداف تجسم UMAP34 جاسازی شدند. ژن‌های نشانگر برای هر خوشه با استفاده از تابع FindMarkers با پارامترهای پیش‌فرض محاسبه‌شده از داده‌های بیان ژن نرمال‌شده تعیین شدند. ما با ترکیب مجموعه داده‌های مرجع قشر جنین و بزرگسال با بیان ژن نشانگر 19،20،21،35 و حاشیه‌نویسی، کلاس‌های اصلی سلول را شناسایی و طبقه‌بندی می‌کنیم. به‌طور خاص، پیش‌سازهای در گردش با بیان MKI67 و TOP2A شناسایی شدند. خوشه‌های پیش‌ساز با عدم وجود رونوشت‌های میتوزی، همپوشانی زیاد با خوشه‌های پیش‌ساز گلیال چندتوان که در قشر جنینی متافاز انتهایی شرح داده شده‌اند، و بیان EGFR و OLIG1 تعریف شدند. ما از اصطلاح آستروسیت برای در بر گرفتن چندین حالت تمایز آستروسیت، از گلیاهای شعاعی انتهایی تا بلوغ آستروسیت‌ها استفاده می‌کنیم. خوشه‌های آستروسیت سطوح بالایی از SLC1A3 و AQP4 را بیان می‌کنند و نشان داده شده است که با زیرگروه‌های گلیا شعاعی جنینی و/یا آستروسیت‌های بالغ نقشه‌برداری می‌شوند. OPCها PDGFRA و SOX10 را بیان می‌کنند در حالی که الیگودندروسیت‌ها نشانگرهای میلین‌سازی (MOG و MYRF) را بیان می‌کنند. نورون‌های گلوتاماترژیک با حضور رونوشت‌های نورونی (SYT1 و SNAP25)، عدم وجود نشانگرهای گاباارژیک (GAD2) و بیان NEUROD6، SLC17A7، BCL11B یا SATB2 شناسایی شدند. نورون‌های GluN بیشتر به زیرکلاس‌های بالایی (بیان SATB2 و فقدان BCL11B) و عمیق (بیان BCL11B) تقسیم شدند. نورون‌های زیرصفحه فرضی (SP) علاوه بر نشانگرهای GluN عمیق، نشانگرهای شناخته شده SP18 مانند ST18 و SORCS1 را بیان می‌کنند. سلول‌های شبه شبکه کوروئید با بیان TTR شناسایی شدند و سلول‌های شبه مننژی، ژن‌های مرتبط با فیبروبلاست را بیان کرده و سلول‌های پیال/عروقی مجموعه داده‌های مرجع را نقشه‌برداری کردند.
تجزیه و تحلیل افتراقی بیان ژن بین زیرکلاس‌های t-hCO و hCO با استفاده از یک روش شبه‌دسته‌ای تازه توسعه‌یافته که در نمونه‌های پیاده‌سازی شده با استفاده از بسته Libra R (نسخه 1.0.0) بازتولید شده بود، انجام شد. به طور خاص، آزمون‌های لگاریتمی درستنمایی edgeR (نسخه 3.36.0، بسته R) برای گروه‌ها با جمع کردن تعداد ژن‌های موجود در سلول‌ها برای یک کلاس سلولی معین برای هر تکرار نمونه انجام شد. برای تجسم نقشه حرارتی، مقادیر نرمال شده در هر میلیون (CPM) با استفاده از تابع edgeR (cpm()) محاسبه و مقیاس‌بندی می‌شوند (برای دستیابی به میانگین = 0، انحراف معیار = 1). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی هستی‌شناسی ژن (GO) از ژن‌های t-hCO GluN با تنظیم افزایشی قابل توجه انجام شد (مقدار P اصلاح‌شده Benjamini-Hochberg کمتر از 0.05 بیان شده در حداقل 10٪ از سلول‌های t-hCO GluN و افزایش برابر در تغییر حداقل 2 برابر). با استفاده از ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 انجام شد. ما از برنامه ToppFun با پارامترهای پیش‌فرض استفاده می‌کنیم و مقادیر P اصلاح‌شده با Benjamini-Hochberg را که از آزمون‌های فوق‌هندسی حاشیه‌نویسی‌شده با GO محاسبه شده‌اند، گزارش می‌دهیم.
برای تطبیق خوشه‌های snRNA-seq ما با خوشه‌های سلولی حاشیه‌نویسی‌شده از مطالعات مرجع RNA-seq تک‌سلولی اولیه یا snRNA-seq بالغ19،20،21،22، از یک رویکرد ادغام مجموعه داده‌های جفت‌شده استفاده کردیم. ما از گردش کار نرمال‌سازی SCTransform (v2) در Seurat برای ادغام و مقایسه همپوشانی‌های خوشه بین مجموعه داده‌ها (با استفاده از همان پارامترهای فوق) استفاده کردیم. مجموعه داده‌های منفرد به طور تصادفی تا 500 سلول یا هسته در هر خوشه اصلی برای کارایی محاسباتی زیرمجموعه‌بندی شدند. با استفاده از رویکردی مشابه همانطور که قبلاً توضیح داده شد، همپوشانی خوشه به عنوان نسبت سلول‌ها یا هسته‌ها در هر خوشه جمع‌آوری‌شده که با برچسب خوشه مرجع همپوشانی داشتند، تعریف شد. برای طبقه‌بندی بیشتر GluNها، از گردش کار TransferData Seurat برای داده‌های زیرمجموعه GluN استفاده کردیم تا برچسب‌های مجموعه داده‌های مرجع را به سلول‌های GluN خود اختصاص دهیم.
برای ارزیابی وضعیت بلوغ ترانسکریپتوم جهانی نمونه‌های t-hCO و hCO، نمونه‌های شبه‌بالی خود را با BrainSpan/psychENCODE23 مقایسه کردیم که شامل یک توالی RNA بزرگ در برگیرنده رشد مغز انسان است. ما PCA را روی یک ماتریس بیان ژن نرمال شده با الگوی ترکیبی از نمونه‌های قشری، 10 هفته پس از لقاح و بعد از آن، در 5567 ژن (همراه با داده‌های خود) که قبلاً در نمونه‌های قشری BrainSpan فعال شناسایی شده بودند (به عنوان بیش از 50٪ در واریانس رشدی توضیح داده شده توسط سن با استفاده از یک مدل مکعبی تعریف شده است)38 انجام دادیم. علاوه بر این، ما ژن‌های مرتبط با امضاهای اصلی ترانسکریپتوم رشد عصبی را با استفاده از فاکتورگیری ماتریس غیرمنفی همانطور که قبلاً توضیح داده شد، استخراج کردیم. وزن‌های نمونه محاسبه شده با استفاده از روش فاکتورگیری ماتریس غیرمنفی در شکل 5b با داده‌های گسترده برای هر یک از پنج امضا که توسط Zhu و همکاران شرح داده شده است، رسم شده‌اند. باز هم، نشانگرهای رونویسی وابسته به فعالیت از مطالعات منتشر شده قبلی استخراج شدند. به طور خاص، ERG و LRG به طور قابل توجهی در نورون‌های گلوتاماترژیک شناسایی شده توسط مجموعه snRNA-seq قشر بینایی موش پس از تحریک بصری از جدول تکمیلی 3 Hrvatin و همکاران.16 افزایش بیان داشتند. LRG های غنی شده با انسان از کشت مغز جنین انسان فعال شده با KCl به دست آمدند و 6 ساعت پس از تحریک برداشت شدند و ژن‌های فیلتر شده به طور قابل توجهی در انسان افزایش بیان داشتند اما در جوندگان اینطور نبود (جدول تکمیلی 4). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن با استفاده از این مجموعه‌های ژن با استفاده از آزمون دقیق فیشر یک طرفه انجام شد.
موش‌ها را با ایزوفلوران بیهوش کنید، مغزها را خارج کرده و در محلول ساکارز سرد (تقریباً 4 درجه سانتیگراد) اکسیژن‌دار (95٪ O2 و 5٪ CO2) برای برش‌های حاوی: 234 میلی‌مولار ساکارز، 11 میلی‌مولار گلوکز، 26 میلی‌مولار NaHCO3، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار NaH2PO4، 10 میلی‌مولار MgSO4 و 0.5 میلی‌مولار CaCl2 (حدود 310 میلی‌اسمول) قرار دهید. برش‌های کرونال مغز موش (300-400 میکرومتر) حاوی t-hCO3 با استفاده از ویبراتوم Leica VT1200 همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تهیه شدند.39 سپس برش‌ها به یک محفظه برش با اکسیژن‌رسانی مداوم در دمای اتاق حاوی aCSF تهیه‌شده از: 10 میلی‌مولار گلوکز، 26 میلی‌مولار NaHCO3، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار NaHPO4، 1 میلی‌مولار MgSO4، 2 میلی‌مولار CaCl2 و 126 میلی‌مولار NaCl (298 میلی‌اسمول) حداقل 45 دقیقه قبل از ثبت منتقل شدند. برش‌ها در یک محفظه غوطه‌ور ثبت شدند که در آن به طور مداوم با aCSF (ویال 95% O2 و 5% CO2) پرفیوژن می‌شدند. تمام داده‌ها در دمای اتاق ثبت شدند. نورون‌های t-hCO با یک پیپت شیشه‌ای بوروسیلیکات پر شده با محلولی حاوی 127 میلی‌مولار گلوکونات پتاسیم، 8 میلی‌مولار NaCl، 4 میلی‌مولار منیزیم ATP، 0.3 میلی‌مولار سدیم GTP، 10 میلی‌مولار HEPES و 0.6 میلی‌مولار EGTA، pH 7.2، محلول داخلی تنظیم‌شده با KOH (290 میلی‌اسمول) خاتمه داده شدند. به منظور بازیابی، بیوسیتین (0.2٪) به محلول ضبط اضافه شد.
داده‌ها با استفاده از یک تقویت‌کننده MultiClamp 700B (Molecular Devices) و یک دیجیتایزر Digidata 1550B (Molecular Devices) به دست آمدند، با فیلتر پایین‌گذر در فرکانس ۲ کیلوهرتز، در فرکانس ۲۰ کیلوهرتز دیجیتال شدند و با استفاده از Clampfit (Molecular Devices)، Origin (OriginPro. 2021b, OriginLab) و توابع سفارشی MATLAB (Mathworks) تجزیه و تحلیل شدند. پتانسیل اتصال با استفاده از JPCalc محاسبه شد و ورودی‌ها بر روی مقدار محاسبه‌شده -۱۴ میلی‌ولت تنظیم شدند. عملیات IV شامل یک سری مراحل جریان در گام‌های ۱۰ تا ۲۵ پیکوآمپر، از -۲۵۰ تا ۷۵۰ پیکوآمپر است.
همانطور که قبلاً توضیح داده شد، در طول ثبت نورون‌های hCO با روش patch-clamp، آوران‌های تالاموس، ماده سفید و S1 در برش‌های تالاموکورتیکال به صورت الکتریکی تحریک شدند. به طور خلاصه، مغز روی یک میز چاپ سه‌بعدی با زاویه 10 درجه قرار داده شد و قسمت جلویی مغز با زاویه 35 درجه برش داده شد. سپس مغز به سطح برش داده شده چسبانده و برش داده شد و آکسون‌های بیرون زده تالاموکورتیکال حفظ شدند. الکترودهای تنگستن دوقطبی (0.5 MΩ) بر روی یک میکرومانیپولاتور دوم نصب شدند و به صورت استراتژیک برای تحریک چهار ناحیه در هر سلول (کپسول داخلی، ماده سفید، S1 و hCO) قرار داده شدند. پاسخ‌های سیناپسی را پس از تحریک فازی 300 میکروآمپر در 0.03-0.1 هرتز ثبت کنید.
نورون‌های hCO بیان‌کننده hChR2 در طول موج 480 نانومتر فعال شدند و پالس‌های نوری تولید شده توسط یک LED (Prizmatix) از طریق یک عدسی شیئی ×40 (0.9 NA؛ Olympus) برای ثبت بیان hChR2 در نزدیکی سلول‌ها اعمال شدند. قطر میدان روشن تقریباً 0.5 میلی‌متر و توان کل 10-20 میلی‌وات است. پهنای پالس روی 10 میلی‌ثانیه تنظیم شد که مربوط به پالس داده شده در طول آزمایش یادگیری رفتاری است. فرکانس‌های تحریک مختلفی از 1 تا 20 هرتز استفاده شد، اما فقط اولین پالس از این سری برای کمی‌سازی استفاده شد. فواصل بین قطارها معمولاً طولانی‌تر از 30 ثانیه است تا تأثیر بر مسیرهای مهاری یا تسهیل‌کننده سیناپسی به حداقل برسد. برای آزمایش اینکه آیا پاسخ hChR2 تک سیناپسی است، TTX (1 میکرومولار) را به حمام اضافه کردیم تا واکنش EPSC ناپدید شود و سپس 4-آمینوپیریدین (4-AP؛ 100 میکرومولار) را اعمال کردیم. معمولاً، پاسخ در عرض چند دقیقه بازگردانده می‌شود، و تأخیر کمی طولانی‌تر بین روشن شدن LED و تولید EPSC وجود دارد. از NBQX (10 میکرومولار) برای آزمایش اینکه آیا پاسخ توسط گیرنده‌های AMPA هدایت می‌شود یا خیر، استفاده شد.
بخش‌های تیز hCO همانطور که قبلاً توضیح داده شد، ایجاد شدند. به طور خلاصه، بخش‌های hCO در آگارز 4٪ جاسازی شدند و به سلول‌های حاوی 126 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار NaH2PO4، 1 میلی‌مولار MgSO4، 2 میلی‌مولار CaCl2، 26 میلی‌مولار NaHCO3 و 10 میلی‌مولار d-(+)-گلوکز منتقل شدند. بخش‌ها با استفاده از ویبراتور Leica VT1200 در دمای اتاق با ضخامت 200 تا 300 میکرومتر برش داده شدند و در ASF در دمای اتاق نگهداری شدند. سپس، ثبت patch-camp از سلول‌های کامل بر روی بخش‌های hCO تحت میکروسکوپ مستقیم SliceScope (Scientifica) انجام شد. بخش‌ها با aCSF (95٪ O2 و 5٪ CO2) پرفیوژن شدند و سیگنال‌های سلولی در دمای اتاق ثبت شدند. نورون‌های hCO3 با استفاده از یک پیپت شیشه‌ای بوروسیلیکات پر شده با محلولی حاوی 127 میلی‌مولار گلوکونات پتاسیم، 8 میلی‌مولار NaCl، 4 میلی‌مولار منیزیم ATP، 0.3 میلی‌مولار سدیم GTP، 10 میلی‌مولار HEPES و 0.6 میلی‌مولار EGTA، pH داخلی 7.2، تنظیم شده با KOH (اسمولاریته 290) اعمال شدند. برای اهداف بازیابی، 0.2٪ بیوسیتین را به محلول داخلی اضافه کنید.
داده‌ها توسط Clampex (Clampex 11.1، Molecular Devices) با استفاده از یک تقویت‌کننده MultiClamp 700B (Molecular Devices) و یک دیجیتایزر Digidata 1550B (Molecular Devices) جمع‌آوری شدند، با فیلتر پایین‌گذر در فرکانس ۲ کیلوهرتز، با دیجیتال‌سازی در فرکانس ۲۰ کیلوهرتز، و با استفاده از Clampfit (نسخه ۱۰.۶) برای تجزیه و تحلیل، دستگاه‌های مولکولی) و توابع سفارشی MATLAB (MATLAB 2019b، Mathworks) تجزیه و تحلیل شدند. پتانسیل اتصال با استفاده از JPCalc محاسبه شد و ورودی‌ها با پتانسیل اتصال محاسبه‌شده -۱۴ میلی‌ولت تنظیم شدند. عملیات IV شامل یک سری مراحل جریان در گام‌های ۵ تا ۱۰ پیکوآمپر از -۵۰ تا ۲۵۰ پیکوآمپر است.
برای بازسازی مورفولوژیکی نورون‌های فشرده شده، 0.2٪ بیوسیتین (سیگما-آلدریچ) به محلول داخلی اضافه شد. سلول‌ها حداقل 15 دقیقه پس از برش، آماده‌سازی شدند. سپس پیپت به آرامی به مدت 1 تا 2 دقیقه کشیده می‌شود تا غشای ثبت شده کاملاً آب‌بندی شود. پس از انجام مراحل فیزیولوژی برش، برش‌ها به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد در 4٪ PFA تثبیت شدند، با PBS X3 شسته شدند و با DyLight 549 یا DyLight 405 (Vector Labs) به نسبت 1:1000 با استرپتاویدین کونژوگه رقیق شدند. سلول‌های پر شده با بیوسیتین (2٪؛ سیگما-آلدریچ) در طول ضبط گیره پچ در دمای اتاق به مدت 2 ساعت برچسب‌گذاری شدند. سپس برش‌ها با استفاده از Aquamount (Thermo Scientific) روی اسلایدهای میکروسکوپی نصب شدند و روز بعد با استفاده از یک عدسی شیئی غوطه‌وری روغنی با دیافراگم عددی ×40 1.3، بزرگنمایی ×0.9-1.0، xy، روی یک میکروسکوپ کانفوکال Leica TCS SP8 مشاهده شدند. نرخ نمونه‌برداری تقریباً 7 پیکسل در هر میکرون است. Z-stackها با فواصل 1 میکرومتر به صورت سریالی تهیه شدند و موزاییک‌های z-stack و دوخت خودکار مبتنی بر Leica برای پوشش کل درخت دندریتیک هر نورون انجام شد. سپس نورون‌ها به صورت نیمه دستی با استفاده از رابط neuTube 40 ردیابی شدند و فایل‌های SWC تولید شدند. سپس فایل‌ها در افزونه SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ، نسخه 2.1.0؛ NIH) آپلود شدند.
بافت قشر مغز انسان با رضایت آگاهانه و طبق پروتکلی که توسط هیئت بررسی نهادی دانشگاه استنفورد تأیید شده است، تهیه شد. دو نمونه از بافت پس از زایمان انسان (۳ و ۱۸ ساله) با برداشتن قشر پیشانی (شکنج پیشانی میانی) به عنوان بخشی از جراحی صرع مقاوم به درمان، تهیه شد. پس از برداشتن، بافت در محلول NMDG-aCSF سرد حاوی: ۹۲ میلی‌مولار NMDG، ۲.۵ میلی‌مولار KCl، ۱.۲۵ میلی‌مولار NaH2PO4، ۳۰ میلی‌مولار NaHCO3، ۲۰ میلی‌مولار HEPES، ۲۵ میلی‌مولار گلوکز، ۲ میلی‌مولار تیوره، ۵ میلی‌مولار آسکوربات سدیم، ۳ میلی‌مولار پیروات سدیم، ۰.۵ میلی‌مولار CaCl2·4H2O و ۱۰ میلی‌مولار MgSO4·7H2O برداشته شد. با اسید هیدروکلریک غلیظ تا pH 7.3-7.4 تیتراسیون انجام شد. بافت‌ها ظرف 30 دقیقه به آزمایشگاه تحویل داده شدند و برش‌های کرونالی طبق روشی که در بالا توضیح داده شد، گرفته شدند.
تمام مراحل مراقبت از حیوانات مطابق با دستورالعمل‌های مراقبت از حیوانات مورد تأیید APLAC دانشگاه استنفورد انجام شد. موش‌ها (بیش از ۱۴۰ روز پس از پیوند) با ۵٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند و در حین عمل با ۱-۳٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند. حیوانات در یک قاب استریوتاکسی (Kopf) قرار داده شدند و بوپرنورفین با رهایش پایدار (SR) به صورت زیر جلدی تزریق شد. جمجمه نمایان، تمیز و ۳-۵ پیچ استخوانی وارد می‌شود. برای هدف قرار دادن t-hCO3، مختصات استریوتاکسی را از تصاویر MRI ایجاد کردیم. یک سوراخ با مته در محل مورد نظر ایجاد شد و الیاف (با قطر ۴۰۰ میکرومتر، NA 0.48، Doric) ۱۰۰ میکرومتر زیر سطح hCO3 پایین آورده شدند و با سیمان دندانی قابل پخت با اشعه ماوراء بنفش (Relyx) به جمجمه محکم شدند.
ضبط‌های فتومتریک فیبر نوری همانطور که قبلاً توضیح داده شد42 انجام شد. برای ثبت فعالیت خودبه‌خودی، موش‌ها در یک قفس تمیز قرار داده شدند و یک کابل پچ فیبر نوری با قطر 400 میکرومتر (Doric) متصل به یک سیستم جمع‌آوری داده‌های فتومتریک فیبر نوری به کابل فیبر نوری کاشته شده متصل شد. در طول ثبت 10 دقیقه‌ای فعالیت حرکتی، حیوانات آزاد بودند که قفس را کاوش کنند. برای ثبت فعالیت برانگیخته شده، موش‌ها (بیش از 140 روز پس از پیوند) با 5٪ ایزوفلوران برای القا و 1-3٪ ایزوفلوران برای نگهداری بی‌هوش شدند. حیوان را در یک قاب استریوتاکتیک (Kopf) قرار دهید و سبیل‌های طرف مقابل t-hCO2 تا حدود 2 سانتی‌متر کوتاه شده و از طریق توری متصل به یک محرک پیزوالکتریک (PI) عبور داده می‌شوند. یک کابل پچ فیبر نوری 400 میکرومتری (Doric) به فیبر کاشته شده متصل و به سیستم جمع‌آوری داده‌ها متصل شد. سپس سبیل‌های سمت مقابل t-hCO به صورت تصادفی و در زمان‌های تصادفی ۵۰ بار (۲ میلی‌متر با فرکانس ۲۰ هرتز، ۲ ثانیه در هر ارائه) توسط یک درایو پیزوالکتریک در طول یک دوره ضبط ۲۰ دقیقه‌ای منحرف شدند. از بسته پشتیبانی Arduino MATLAB برای کنترل زمان انحراف با کد سفارشی MATLAB استفاده کنید. رویدادها با استفاده از پالس‌های منطق ترانزیستور-ترانزیستور (TTL) با نرم‌افزار جمع‌آوری داده‌ها هماهنگ می‌شوند.
موش‌ها (بیش از ۱۴۰ روز پس از پیوند) با ۵٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند و در حین عمل با ۱-۳٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند. حیوانات در یک قاب استریوتاکسی (Kopf) قرار داده شدند و بوپرنورفین SR و دگزامتازون به صورت زیر جلدی تزریق شدند. جمجمه نمایان، تمیز و ۳-۵ پیچ استخوانی وارد شد. برای هدف قرار دادن t-hCO، مختصات استریوتاکسی را از تصاویر MRI ایجاد کردیم. یک کرانیوتومی دایره‌ای (تقریباً ۱ سانتی‌متر قطر) با یک مته پرسرعت مستقیماً روی hCO پیوند شده انجام شد. هنگامی که استخوان تا حد امکان نازک شد، اما قبل از سوراخ کردن کل استخوان، از فورسپس برای برداشتن دیسک لگن سالم باقی مانده استفاده کنید تا t-hCO زیرین آشکار شود. کرانیوتومی با محلول نمکی استریل پر شد و یک لامل و یک سنجاق سر مخصوص با سیمان دندانپزشکی UV-cured (Relyx) به جمجمه متصل شد.
تصویربرداری دو فوتونی با استفاده از میکروسکوپ چند فوتونی Bruker با عدسی شیئی Nikon LWD (16×، 0.8 NA) انجام شد. تصویربرداری GCaMP6 در طول موج 920 نانومتر با بزرگنمایی تک صفحه z 1.4x و میانگین 8x 7.5 فریم بر ثانیه انجام شد. موش‌ها با 5% ایزوفلوران بی‌هوش شدند و با 1-3% ایزوفلوران بی‌هوش شدند. موش‌ها در یک فیکسچر سر سفارشی قرار داده شدند و زیر لنز قرار گرفتند. یک ضبط پس‌زمینه 3 دقیقه‌ای از فعالیت حرکتی به دست آمد. در طول 20 دقیقه ضبط، 50 پاف (هر ارائه 100 میلی‌ثانیه) به طور تصادفی با استفاده از یک پیکوپریسر به پد ویسکر مقابل t-hCO3 تحویل داده شد. از بسته پشتیبانی Arduino MATLAB برای کنترل زمان انفجار با کد سفارشی MATLAB استفاده کنید. رویدادها را با نرم‌افزار جمع‌آوری داده (PrairieView 5.5) با استفاده از پالس‌های TTL همگام‌سازی کنید. برای تجزیه و تحلیل، تصاویر با استفاده از تصحیح آفین در برنامه MoCo که در فیجی راه‌اندازی شده است، از نظر حرکت xy اصلاح شدند. استخراج ردپای فلورسنت از سلول‌های منفرد با استفاده از CNMF-E43. فلورسانس برای هر ناحیه مورد نظر استخراج، به منحنی‌های dF/F تبدیل و سپس به نمرات z تبدیل شد.
موش‌ها (بیش از ۱۴۰ روز پس از پیوند) با ۵٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند و در حین عمل با ۱-۳٪ ایزوفلوران بی‌هوش شدند. حیوانات در یک قاب استریوتاکسی (Kopf) قرار داده شدند و بوپرنورفین SR و دگزامتازون به صورت زیر جلدی تزریق شدند. سبیل‌های طرف مقابل t-hCO به طول حدود ۲ سانتی‌متر بریده شده و از طریق یک توری متصل به یک محرک پیزوالکتریک عبور داده شدند. جمجمه نمایان و تمیز می‌شود. یک پیچ زمینی از جنس استیل ضد زنگ به جمجمه متصل می‌شود. برای هدف قرار دادن t-hCO، مختصات استریوتاکسی را از تصاویر MRI ایجاد کردیم. یک کرانیوتومی دایره‌ای (تقریباً ۱ سانتی‌متر قطر) با یک مته پرسرعت درست بالای t-hCO انجام دهید. هنگامی که استخوان تا حد امکان نازک شد، اما قبل از سوراخ کردن کل استخوان، از فورسپس برای برداشتن دیسک لگن سالم باقی مانده استفاده کنید تا t-hCO زیرین آشکار شود. سلول‌های منفرد با استفاده از پروب‌های سیلیکونی با چگالی بالا ۳۲ کاناله یا ۶۴ کاناله (Cambridge Neurotech) که به پیچ‌های زمین متصل شده و با تقویت‌کننده‌های RHD (Intan) پیش‌تقویت شده بودند، ثبت شدند. از این دستکاری‌کننده برای پایین آوردن الکترودها به محل هدف از طریق کرانیوتومی، که با محلول نمکی استریل پر شده است، استفاده کنید. جمع‌آوری داده‌ها با فرکانس ۳۰ کیلوهرتز با استفاده از سیستم جمع‌آوری داده Open Ephys انجام شد. ضبط فقط زمانی ادامه یافت که فعالیت خودبه‌خودی ریتمیک بسیار هم‌بسته را در بیش از ۱۰ کانال تشخیص دادیم، که نشان می‌دهد الکترودها در پیوند قرار دارند (بر اساس داده‌های تصویربرداری کلسیم دو فوتونی). یک ضبط پس‌زمینه ۱۰ دقیقه‌ای از فعالیت حرکتی به دست آمد. سپس سبیل‌های طرف مقابل t-hCO 50 بار (۲ میلی‌متر در ۲۰ هرتز، ۲ ثانیه در هر ارائه) در زمان‌های تصادفی توسط یک درایو پیزوالکتریک در یک دوره ضبط ۲۰ دقیقه‌ای منحرف شدند. با استفاده از بسته پشتیبانی MATLAB برای آردوینو (MATLAB 2019b)، زمان انحراف را با کد MATLAB سفارشی کنترل کنید. از پالس‌های TTL برای همگام‌سازی رویدادها با نرم‌افزار جمع‌آوری داده استفاده کنید.
برای آزمایش‌های علامت‌گذاری نوری، یک کابل نوری ۲۰۰ میکرومتری (Doric) متصل به لیزر ۴۷۳ نانومتری (Omicron) به یک فیبر نوری ۲۰۰ میکرومتری که روی کرانیوتومی قرار داده شده بود، متصل شد. بلافاصله قبل از این، قدرت جامپر را روی ۲۰ میلی‌وات تنظیم کنید. از دستگیره برای پایین آوردن الکترودها به محل هدف از طریق کرانیوتومی، که با محلول نمکی استریل پر شده است، استفاده کنید. در ابتدای ضبط، ده پالس نوری ۴۷۳ نانومتر (فرکانس ۲ هرتز، مدت زمان پالس ۱۰ میلی‌ثانیه) ساطع شد. سلول‌های حساس به نور به عنوان سلول‌هایی تعریف شدند که در ۷۰٪ یا بیشتر از آزمایش‌ها، پاسخ اسپایک را در فاصله ۱۰ میلی‌ثانیه از نور نشان دادند.