از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
بیوپسی مایع (LB) مفهومی است که به سرعت در حال محبوبیت در زمینه زیست پزشکی است.این مفهوم عمدتاً مبتنی بر تشخیص قطعات DNA خارج سلولی در گردش (ccfDNA) است که عمدتاً به صورت قطعات کوچک پس از مرگ سلولی در بافت‌های مختلف آزاد می‌شوند.بخش کوچکی از این قطعات از بافت ها یا موجودات خارجی (خارجی) منشاء می گیرند.در کار فعلی، ما این مفهوم را برای صدف‌ها، گونه‌ای نگهبان که به دلیل ظرفیت بالای تصفیه آب دریا شناخته شده‌اند، اعمال کرده‌ایم.ما از توانایی صدف ها برای عمل به عنوان فیلترهای طبیعی برای گرفتن قطعات DNA محیطی از منابع مختلف برای ارائه اطلاعات در مورد تنوع زیستی اکوسیستم های ساحلی دریایی استفاده می کنیم.نتایج ما نشان می دهد که همولنف صدف حاوی قطعات DNA است که اندازه آنها بسیار متفاوت است، از 1 تا 5 کیلوبایت.توالی یابی تفنگ ساچمه ای نشان داد که تعداد زیادی از قطعات DNA منشا میکروبی خارجی دارند.در میان آنها، ما قطعات DNA را از باکتری‌ها، باستان‌ها و ویروس‌ها، از جمله ویروس‌هایی که میزبان‌های مختلفی را که معمولاً در اکوسیستم‌های دریایی ساحلی یافت می‌شوند، آلوده می‌کنند، پیدا کردیم.در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مفهوم LB که برای صدف‌ها اعمال می‌شود، منبعی غنی اما هنوز ناشناخته از دانش در مورد تنوع میکروبی در اکوسیستم‌های ساحلی دریایی است.
تأثیر تغییر اقلیم (CC) بر تنوع زیستی اکوسیستم‌های دریایی یک حوزه تحقیقاتی به سرعت در حال رشد است.گرم شدن کره زمین نه تنها باعث ایجاد تنش های فیزیولوژیکی مهم می شود، بلکه محدودیت های تکاملی پایداری حرارتی موجودات دریایی را تحت تأثیر قرار می دهد و روی زیستگاه تعدادی از گونه ها تأثیر می گذارد و آنها را به جستجوی شرایط مطلوب تر ترغیب می کند [1، 2].CC علاوه بر تاثیر بر تنوع زیستی متازوئرها، تعادل ظریف تعاملات میزبان و میکروبی را مختل می کند.این دیس‌باکتریوز میکروبی تهدیدی جدی برای اکوسیستم‌های دریایی است، زیرا موجودات دریایی را نسبت به پاتوژن‌های عفونی حساس‌تر می‌کند [3، 4].اعتقاد بر این است که SS نقش مهمی در مرگ و میرهای جمعی ایفا می کند، که یک مشکل جدی برای مدیریت اکوسیستم های دریایی جهانی است [5، 6].با توجه به اثرات اقتصادی، زیست محیطی و تغذیه ای بسیاری از گونه های دریایی، این موضوع مهمی است.این امر به ویژه برای دوکفه ای هایی که در نواحی قطبی زندگی می کنند، جایی که اثرات CK فوری و شدیدتر است، صادق است [6، 7].در واقع دوکفه ای مانند Mytilus spp.به طور گسترده ای برای نظارت بر اثرات CC بر اکوسیستم های دریایی استفاده می شود.جای تعجب نیست که تعداد نسبتاً زیادی از نشانگرهای زیستی برای نظارت بر سلامت آنها ایجاد شده است که اغلب از یک رویکرد دو لایه شامل نشانگرهای زیستی عملکردی مبتنی بر فعالیت آنزیمی یا عملکردهای سلولی مانند زنده ماندن سلول و فعالیت فاگوسیتی استفاده می‌کنند [8].این روش ها همچنین شامل اندازه گیری غلظت شاخص های فشار خاصی است که پس از جذب مقادیر زیادی آب دریا در بافت های نرم تجمع می یابند.با این حال، ظرفیت فیلتراسیون بالا و سیستم گردش خون نیمه باز دوکفه ای ها فرصتی را برای توسعه بیومارکرهای جدید همولنف با استفاده از مفهوم بیوپسی مایع (LB)، یک رویکرد ساده و کم تهاجمی برای مدیریت بیمار فراهم می کند.نمونه های خون [9، 10].اگرچه چندین نوع مولکول در گردش را می توان در LB انسان یافت، این مفهوم اساساً بر اساس تجزیه و تحلیل توالی DNA قطعات در گردش DNA خارج سلولی (ccfDNA) در پلاسما است.در واقع، وجود DNA در گردش در پلاسمای انسان از اواسط قرن بیستم شناخته شده است [11]، اما تنها در سال های اخیر است که ظهور روش های توالی یابی با توان بالا منجر به تشخیص بالینی بر اساس ccfDNA شده است.وجود این قطعات DNA در گردش تا حدی به دلیل انتشار غیر فعال DNA ژنومی (هسته ای و میتوکندری) پس از مرگ سلول است. در افراد سالم، غلظت ccfDNA به طور معمول کم است (<10 نانوگرم در میلی لیتر) اما در بیمارانی که از آسیب شناسی های مختلف رنج می برند یا تحت استرس قرار می گیرند، می تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد و منجر به آسیب بافتی شود. در افراد سالم، غلظت ccfDNA به طور معمول کم است (<10 نانوگرم در میلی لیتر) اما در بیمارانی که از آسیب شناسی های مختلف رنج می برند یا تحت استرس قرار می گیرند، می تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد و منجر به آسیب بافتی شود. در здоровых людей концентрация вккДНК در норме ниская (<10 ng/ml)، اما ممکن است در 5-10 در больных با различной патологией или подвергающихся стрессу, приводяврщенйню. در افراد سالم، غلظت cccDNA به طور معمول کم است (<10 نانوگرم در میلی لیتر)، اما در بیماران مبتلا به آسیب شناسی های مختلف یا تحت استرس که منجر به آسیب بافتی می شود، می تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10ng/mL），但在患有各种病理或承各种病理或承在健康个体中，ccfDNA加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍，从而 组织。。。 损伤تمرکز ccfDNA بسیار پایین است (<10 ng/ml) در یک بیماری نادرست، اما می تواند در 5-10 بار در بیماران مبتلا به بیماری های ناخوشایند یا استرس، که منجر به آسیب دیدن شود. غلظت ccfDNA معمولاً در افراد سالم کم است (کمتر از ng/ml 10)، اما در بیماران مبتلا به آسیب شناسی های مختلف یا استرس می تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد و منجر به آسیب بافتی شود.اندازه قطعات ccfDNA بسیار متفاوت است، اما معمولاً بین 150 تا 200 جفت باز است.[12].تجزیه و تحلیل ccfDNA خود مشتق شده، به عنوان مثال، ccfDNA از سلول های میزبان طبیعی یا تبدیل شده، می تواند برای تشخیص تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی موجود در ژنوم هسته ای و/یا میتوکندری استفاده شود، در نتیجه به پزشکان کمک می کند تا درمان های هدفمند مولکولی خاص را انتخاب کنند [13].با این حال، ccfDNA را می توان از منابع خارجی مانند ccfDNA از سلول های جنین در دوران بارداری یا از اندام های پیوندی به دست آورد [14،15،16،17].ccfDNA همچنین منبع مهمی از اطلاعات برای تشخیص حضور اسیدهای نوکلئیک یک عامل عفونی (خارجی) است که امکان تشخیص غیر تهاجمی عفونت‌های گسترده‌ای را که توسط کشت‌های خون شناسایی نشده‌اند را فراهم می‌کند و از بیوپسی تهاجمی بافت عفونی اجتناب می‌کند [18].مطالعات اخیر در واقع نشان داده است که خون انسان حاوی منبع غنی از اطلاعات است که می تواند برای شناسایی پاتوژن های ویروسی و باکتریایی مورد استفاده قرار گیرد و حدود 1% از ccfDNA موجود در پلاسمای انسان منشأ خارجی دارد [19].این مطالعات نشان می دهد که تنوع زیستی میکروبیوم در گردش یک موجود زنده را می توان با استفاده از تجزیه و تحلیل ccfDNA ارزیابی کرد.با این حال، تا همین اواخر، این مفهوم به طور انحصاری در انسان و تا حدی در سایر مهره داران استفاده می شد [20، 21].
در مقاله حاضر، ما از پتانسیل LB برای تجزیه و تحلیل ccfDNA Aulacomya atra، یک گونه جنوبی که معمولاً در جزایر Kerguelen زیر قطبی یافت می‌شود، استفاده می‌کنیم، گروهی از جزایر در بالای فلات بزرگی که 35 میلیون سال پیش تشکیل شده است.فوران آتشفشانی.با استفاده از یک سیستم آزمایشگاهی آزمایشگاهی، متوجه شدیم که قطعات DNA در آب دریا به سرعت توسط صدف‌ها گرفته شده و وارد محفظه همولنف می‌شوند.توالی یابی تفنگ ساچمه ای نشان داده است که ccfDNA همولنف صدف حاوی قطعات DNA با منشأ خود و غیر خود است، از جمله باکتری های همزیست و قطعات DNA از بیوم های معمولی اکوسیستم های ساحلی دریایی آتشفشانی سرد.ccfDNA همولنف همچنین حاوی توالی‌های ویروسی است که از ویروس‌هایی با دامنه میزبان متفاوت مشتق شده‌اند.ما همچنین قطعات DNA را از حیوانات چند سلولی مانند ماهی های استخوانی، شقایق های دریایی، جلبک ها و حشرات پیدا کردیم.در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مفهوم LB می‌تواند با موفقیت برای بی‌مهرگان دریایی برای تولید یک مجموعه ژنومی غنی در اکوسیستم‌های دریایی به کار رود.
بزرگسالان (55-70 میلی متر طول) Mytilus platensis (M. platensis) و Aulacomya atra (A. atra) از سواحل سنگی جزر و مدی پورت-او-فرانس (049°21.235 S، 070°13.490 E . .) جمع آوری شدند.جزایر کرگولن در دسامبر 2018. سایر صدف های آبی بالغ (Mytilus spp.) از یک تامین کننده تجاری (PEI Mussel King Inc.، جزیره پرنس ادوارد، کانادا) به دست آمد و در مخزن هوادهی با دمای کنترل شده (4 درجه سانتی گراد) حاوی 10-20 لیتر آب نمک مصنوعی 32 ‰ قرار داده شد.(کریستال ریف نمک دریایی مصنوعی، اقیانوس فوری، ویرجینیا، ایالات متحده آمریکا).برای هر آزمایش، طول و وزن پوسته های جداگانه اندازه گیری شد.
یک پروتکل دسترسی آزاد رایگان برای این برنامه به صورت آنلاین در دسترس است (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).به طور خلاصه، همولنف LB از عضلات ابدکتور همانطور که توضیح داده شد جمع آوری شد [22].همولنف با سانتریفیوژ در 1200×g به مدت 3 دقیقه شفاف شد، مایع رویی تا زمان استفاده منجمد شد (20- درجه سانتیگراد).برای جداسازی و خالص‌سازی cfDNA، نمونه‌های (1.5-2.0 میلی‌لیتر) ذوب شده و با استفاده از کیت NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel، Bethlehen، PA) طبق دستورالعمل سازنده پردازش شدند.ccfDNA تا آنالیز بیشتر در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.در برخی آزمایش‌ها، ccfDNA با استفاده از کیت محقق DNA QIAamp (QIAGEN، تورنتو، انتاریو، کانادا) جدا و خالص شد.DNA خالص شده با استفاده از روش استاندارد PicoGreen اندازه گیری شد.توزیع قطعه ccfDNA جدا شده با الکتروفورز مویرگی با استفاده از یک آنالایزر زیستی Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) با استفاده از کیت DNA با حساسیت بالا مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.سنجش با استفاده از 1 میکرولیتر از نمونه ccfDNA طبق دستورالعمل سازنده انجام شد.
برای توالی یابی قطعات ccfDNA همولنف، ژنوم کبک (مونترال، کبک، کانادا) کتابخانه های تفنگ ساچمه ای را با استفاده از کیت Illumina DNA Mix کیت Illumina MiSeq PE75 تهیه کرد.یک آداپتور استاندارد (BioO) استفاده شد.فایل های داده خام از بایگانی خواندن دنباله NCBI (SRR8924808 و SRR8924809) در دسترس هستند.کیفیت خواندن پایه با استفاده از FastQC [23] ارزیابی شد.Trimmomatic [24] برای برش آداپتورها و خواندن با کیفیت پایین استفاده شده است.خوانش های تفنگ ساچمه ای با انتهای جفت شده با FLASH به قرائت های منفرد طولانی تر با حداقل همپوشانی 20 جفت باز ادغام شدند تا از عدم تطابق جلوگیری شود [25]. قرائت های ادغام شده با BLASTN با استفاده از یک پایگاه داده تاکسونومی NCBI دوکفه ای حاشیه نویسی شدند (مقدار e < 1e-3 و همسانی 90٪)، و پوشش توالی های کم پیچیدگی با استفاده از DUST [26] انجام شد. قرائت های ادغام شده با BLASTN با استفاده از یک پایگاه داده تاکسونومی NCBI دوکفه ای حاشیه نویسی شدند (مقدار e < 1e-3 و همسانی 90٪)، و پوشش توالی های کم پیچیدگی با استفاده از DUST [26] انجام شد. BLASTN با کمک BLASTN با استفاده از تاکسونومی двустворчатых моллюсков NCBI (معنای e < 1e-3 و 90% تمام کم‌تربیت) со использованием DUST [26]. قرائت‌های تلفیقی با BLASTN با استفاده از پایگاه‌داده طبقه‌بندی دوکفه‌ای NCBI (ارزش e < 1e-3 و همسانی 90 درصد) حاشیه‌نویسی شدند، و پوشش‌دهی دنباله‌ای با پیچیدگی کم با استفاده از DUST [26] انجام شد.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 [6]复杂度 序列 的.蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN با کمک BLASTN با استفاده از تاکسونومیcheskoy базы данных двустворчатых моллюсков NCBI کاملن со использование DUST [26]. قرائت های تلفیقی با BLASTN با استفاده از پایگاه داده طبقه بندی دوکفه ای NCBI (مقدار e <1e-3 و همسانی 90 درصد) حاشیه نویسی شدند، و پوشش توالی با پیچیدگی کم با استفاده از DUST [26] انجام شد.خوانده‌ها به دو گروه تقسیم شدند: مربوط به توالی‌های دوکفه‌ای (که در اینجا خودخوانده‌ها نامیده می‌شوند) و غیر مرتبط (غیر خودخوان).دو گروه به طور جداگانه با استفاده از MEGAHIT برای تولید contigs جمع شدند [27].در همین حال، توزیع طبقه بندی خوانش های میکروبیوم بیگانه با استفاده از Kraken2 [28] طبقه بندی شد و به صورت گرافیکی با نمودار دایره ای کرون در کهکشان [29، 30] نشان داده شد.کیلومترهای بهینه از آزمایش‌های اولیه ما کیلومتر-59 تعیین شد. سپس خود contigs با تراز با BLASTN (پایگاه داده NCBI دوکفه ای، مقدار e < 1e-10 و 60٪ همسانی) برای حاشیه نویسی نهایی شناسایی شدند. سپس خود contigs با تراز با BLASTN (پایگاه داده NCBI دوکفه ای، مقدار e < 1e-10 و 60٪ همسانی) برای حاشیه نویسی نهایی شناسایی شدند. مخاطرات ناشناخته با BLASTN (بر اساس داده های ایجاد شده توسط NCBI، اهمیت <1e-10 و علم شناسی 60٪) برای تشخیص درست است. سپس با تطبیق با BLASTN (پایگاه داده دوکفه ای NCBI، مقدار e <1e-10 و همسانی 60 درصد) برای حاشیه نویسی نهایی، خود ایجادها شناسایی شدند.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来語菆别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% با توجه به ویژگی‌های ناخوشایند BLASTN (با توجه به اطلاعات NCBI برای دوساختن موللوسکوو، اهمیت e <1e-10% و 6%). سپس با تطبیق با BLASTN (پایگاه داده دوکفه ای NCBI، مقدار e <1e-10 و همسانی 60 درصد) خود، برای حاشیه نویسی نهایی شناسایی شدند. به طور موازی، contigs غیر خود گروه با BLASTN (پایگاه داده nt NCBI، مقدار e < 1e-10 و 60٪ همسانی) حاشیه نویسی شد. به طور موازی، contigs غیر خود گروه با BLASTN (پایگاه داده nt NCBI، مقدار e < 1e-10 و 60٪ همسانی) حاشیه نویسی شد. همسانی گروه‌های قارچی ناشناخته با کمک BLASTN (بر اساس داده‌های nt NCBI، معنی e <1e-10 و ژومولوژی 60%). به طور موازی، contigs گروه خارجی با BLASTN (پایگاه داده NT NCBI، مقدار e <1e-10 و همسانی 60٪) حاشیه نویسی شدند.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 تا 60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 تا 60% 同源性）注释非自身组重叠 همسانی در گروه اجتماعی، غیر قابل تشخیص با کمک BLASTN (بر اساس داده های nt NCBI، معنی e <1e-10 و گومولوژی 60%). به طور موازی، contigs غیر خود گروه با BLASTN (پایگاه داده nt NCBI، مقدار e <1e-10 و همسانی 60٪) حاشیه نویسی شد. BLASTX همچنین با استفاده از پایگاه‌های داده NCBI پروتئین nr و RefSeq (مقدار e < 1e-10 و همسانی 60٪) بر روی contigs غیر خودی انجام شد. BLASTX همچنین با استفاده از پایگاه‌های داده NCBI پروتئین nr و RefSeq (مقدار e < 1e-10 و همسانی 60٪) بر روی contigs غیر خودی انجام شد. BLASTX также был проведен на несамостоятельных contigah با استفاده از belka nr و RefSeq NCBI (مقدار e <1e-10 و گومولوژی 60%). BLASTX همچنین با استفاده از پایگاه‌های داده پروتئین nr و RefSeq NCBI (مقدار e < 1e-10 و همسانی 60 درصد) بر روی کانتیگ‌های غیر خود انجام شد.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также کاملاً ناامیدکننده با استفاده از BLASTX با BLASTX NCBI و RefSeq NCBI (معنای e <1e-10 و گومولوژی 60%). BLASTX همچنین با استفاده از پایگاه‌داده‌های پروتئین nr و RefSeq NCBI (مقدار e <1e-10 و همسانی 60 درصد) روی پیوندهای غیر خودی نیز انجام شد.استخرهای BLASTN و BLASTX غیر خود-contig ها نشان دهنده contig های نهایی هستند (به فایل تکمیلی مراجعه کنید).
پرایمرهای مورد استفاده برای PCR در جدول S1 آمده است.Taq DNA پلیمراز (Bio Basic Canada، Markham، ON) برای تقویت ژن های هدف ccfDNA استفاده شد.شرایط واکنش زیر مورد استفاده قرار گرفت: دناتوراسیون در 95 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه، 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، تنظیم دمای بازپخت برای 1 دقیقه، افزایش طول در 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، 35 چرخه، و در نهایت 72 درجه سانتیگراد در مدت 10 دقیقه..محصولات PCR با الکتروفورز در ژل آگارز (1.5%) حاوی رنگ آمیزی ژل DNA ایمن SYBRTM (Invitrogen، Burlington، ON، کانادا) در ولتاژ 95 V جدا شدند.
صدف ها (Mytilus spp.) در 500 میلی لیتر آب اکسیژنه دریا (32 PSU) به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد سازگار شدند.DNA پلاسمید حاوی یک درج کد کننده توالی cDNA گالکتین-7 انسانی (شماره دسترسی NCBI L07769) در غلظت نهایی 190 میکروگرم بر میکرولیتر به ویال اضافه شد.صدف های انکوبه شده تحت شرایط مشابه بدون افزودن DNA، کنترل بودند.سومین تانک کنترل حاوی DNA بدون صدف بود.برای نظارت بر کیفیت DNA در آب دریا، نمونه‌های آب دریا (20 میکرولیتر، سه تکرار) از هر مخزن در زمان مشخص شده گرفته شد.برای ردیابی DNA پلاسمید، صدف های LB در زمان های مشخص شده برداشت شدند و با qPCR و ddPCR آنالیز شدند.با توجه به محتوای نمک بالای آب دریا، مقدار کمی در آب با کیفیت PCR (1:10) قبل از همه آزمایش‌های PCR رقیق شد.
PCR قطره ای دیجیتال (ddPCR) با استفاده از پروتکل BioRad QX200 (Mississauga، انتاریو، کانادا) انجام شد.از مشخصات دما برای تعیین دمای بهینه استفاده کنید (جدول S1).قطرات با استفاده از یک مولد قطره QX200 (BioRad) تولید شد.ddPCR به شرح زیر انجام شد: 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه، 50 چرخه 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و دمای بازپخت داده شده برای 1 دقیقه و 72 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه، 4 درجه سانتی گراد برای 5 دقیقه و 90 درجه سانتی گراد در عرض 5 دقیقه.تعداد قطره ها و واکنش های مثبت (تعداد کپی در میکرولیتر) با استفاده از قطره خوان QX200 (BioRad) اندازه گیری شد.نمونه هایی با کمتر از 10000 قطره رد شدند.هر بار که ddPCR اجرا شد، کنترل الگو انجام نشد.
qPCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research، سیدنی، استرالیا) و LGALS7 انجام شد.تمام PCRهای کمی در 20 میکرولیتر با استفاده از کیت سبز PCR QuantiFast SYBR (QIAGEN) انجام شد.qPCR با 15 دقیقه انکوباسیون در دمای 95 درجه سانتی گراد و سپس 40 چرخه در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 10 ثانیه و در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه با یک جمع آوری داده آغاز شد.منحنی های ذوب با استفاده از اندازه گیری های متوالی در دمای 95 درجه سانتی گراد برای 5 ثانیه، 65 درجه سانتی گراد برای 60 ثانیه و 97 درجه سانتی گراد در پایان qPCR ایجاد شدند.هر qPCR به جز نمونه های شاهد در سه تکرار انجام شد.
از آنجایی که صدف ها به دلیل نرخ بالای فیلتراسیون شناخته شده اند، ما ابتدا بررسی کردیم که آیا آنها می توانند قطعات DNA موجود در آب دریا را فیلتر و حفظ کنند.ما همچنین علاقه مند بودیم که آیا این قطعات در سیستم لنفاوی نیمه باز خود تجمع می کنند یا خیر.ما این مشکل را به صورت تجربی با ردیابی سرنوشت قطعات DNA محلول اضافه شده به مخازن صدف آبی حل کردیم.برای تسهیل ردیابی قطعات DNA، از DNA پلاسمید خارجی (نه خود) حاوی ژن گالکتین-7 انسانی استفاده کردیم.ddPCR قطعات DNA پلاسمید را در آب دریا و صدف ها ردیابی می کند.نتایج ما نشان می‌دهد که اگر مقدار قطعات DNA در آب دریا در طول زمان (تا 7 روز) در غیاب صدف‌ها نسبتاً ثابت بماند، سپس در حضور صدف‌ها این سطح تقریباً در عرض 8 ساعت به طور کامل ناپدید شد (شکل 1a,b).قطعات DNA اگزوژن به راحتی در ظرف 15 دقیقه در مایع داخل دریچه ای و همولنف شناسایی شدند (شکل 1c).این قطعات هنوز تا 4 ساعت پس از قرار گرفتن در معرض قابل تشخیص هستند.این فعالیت فیلتر کردن با توجه به قطعات DNA با فعالیت فیلتر کردن باکتری ها و جلبک ها قابل مقایسه است [31].این نتایج نشان می دهد که صدف ها می توانند DNA خارجی را در محفظه مایع خود فیلتر کرده و جمع کنند.
غلظت نسبی DNA پلاسمید در آب دریا در حضور (A) یا عدم حضور (B) صدف، اندازه‌گیری شده توسط ddPCR.در A، نتایج به صورت درصد بیان می شود، با مرزهای جعبه ها نشان دهنده صدک های 75 و 25 است.منحنی لگاریتمی متناسب با رنگ قرمز نشان داده شده است و ناحیه ای که به رنگ خاکستری سایه زده شده است نشان دهنده فاصله اطمینان 95٪ است.در B، خط قرمز نشان دهنده میانگین و خط آبی نشان دهنده فاصله اطمینان 95٪ برای غلظت است.C تجمع DNA پلاسمید در همولنف و مایع دریچه ای صدف ها در زمان های مختلف پس از افزودن DNA پلاسمید.نتایج به‌عنوان نسخه‌های مطلق شناسایی‌شده در میلی‌لیتر (± SE) ارائه می‌شوند.
در مرحله بعد، منشأ ccfDNA را در صدف‌های جمع‌آوری‌شده از تخت‌های صدف در جزایر کرگولن، گروهی دورافتاده از جزایر با نفوذ انسانی محدود، بررسی کردیم.برای این منظور، cccDNA از همولنف صدف جدا شد و با روش‌هایی که معمولاً برای خالص‌سازی cccDNA انسان استفاده می‌شود، خالص‌سازی شد [32، 33].ما دریافتیم که میانگین غلظت ccfDNA همولنف در صدف ها در محدوده میکروگرم در هر میلی لیتر همولنف کم است (جدول S2، اطلاعات تکمیلی را ببینید).این محدوده غلظت بسیار بیشتر از افراد سالم است (نانوگرم در میلی لیتر کم)، اما در موارد نادر، در بیماران سرطانی، سطح ccfDNA می تواند به چندین میکروگرم در میلی لیتر برسد [34، 35].تجزیه و تحلیل توزیع اندازه همولنف ccfDNA نشان داد که این قطعات از نظر اندازه بسیار متفاوت هستند، از 1000 جفت باز تا 1000 جفت باز.تا 5000 جفت باز (شکل 2).نتایج مشابهی با استفاده از کیت پژوهشگر QIAamp مبتنی بر سیلیس به دست آمد، روشی که معمولاً در علم پزشکی قانونی برای جداسازی و خالص‌سازی سریع DNA ژنومی از نمونه‌های DNA با غلظت کم، از جمله ccfDNA استفاده می‌شود [36].
الکتروفورگرام ccfDNA نماینده همولنف صدف.استخراج شده با کیت پلاسما NucleoSnap (بالا) و کیت بررسی کننده DNA QIAamp.B نمودار ویولن که توزیع غلظت ccfDNA همولنف (±SE) را در صدف نشان می دهد.خطوط سیاه و قرمز به ترتیب نشان دهنده میانه و چارک اول و سوم هستند.
تقریباً 1٪ از ccfDNA در انسان و پستانداران دارای منبع خارجی است [21، 37].با توجه به سیستم گردش خون نیمه باز دوکفه ای، آب دریای غنی از میکروبی، و توزیع اندازه ccfDNA صدف، ما فرض کردیم که ccfDNA همولنف صدف ممکن است حاوی یک مخزن غنی و متنوع از DNA میکروبی باشد.برای آزمایش این فرضیه، ما ccfDNA همولنف را از نمونه‌های Aulacomya atra جمع‌آوری‌شده از جزایر کرگولن، توالی‌یابی کردیم، که بیش از 10 میلیون مطالعه به دست آورد، که 97.6 درصد آن‌ها از کنترل کیفیت عبور کردند.سپس قرائت ها بر اساس منابع خود و غیر خود با استفاده از پایگاه های داده دوکفه ای BLASTN و NCBI طبقه بندی شدند (شکل S1، اطلاعات تکمیلی).
در انسان، DNA هسته ای و میتوکندریایی هر دو می توانند در جریان خون آزاد شوند [38].با این حال، در مطالعه حاضر، با توجه به اینکه ژنوم A. atra توالی یابی یا توصیف نشده است، امکان توصیف جزئیات DNA ژنومی هسته صدف وجود نداشت.با این حال، ما توانستیم تعدادی از قطعات ccfDNA را با استفاده از کتابخانه دوکفه ای شناسایی کنیم (شکل S2، اطلاعات تکمیلی).ما همچنین وجود قطعات DNA از منشأ خودمان را با تقویت PCR هدایت شده آن دسته از ژن‌های A. atra که توالی‌یابی شدند تأیید کردیم (شکل 3).به طور مشابه، با توجه به اینکه ژنوم میتوکندری A. atra در پایگاه های داده عمومی موجود است، می توان شواهدی مبنی بر وجود قطعات ccfDNA میتوکندری در همولنف A. atra پیدا کرد.وجود قطعات DNA میتوکندری با تقویت PCR تایید شد (شکل 3).
ژن های مختلف میتوکندری در همولنف A. atra (نقاط قرمز – شماره موجودی: SRX5705969) و M. platensis (نقاط آبی – شماره موجودی: SRX5705968) وجود داشت که با PCR تکثیر شدند.شکل اقتباس شده از برتون و همکاران، 2011 B تقویت مایع رویی همولنف از A. atra ذخیره شده بر روی کاغذ FTA.از پانچ 3 میلی متری برای افزودن مستقیم به لوله PCR حاوی مخلوط PCR استفاده کنید.
با توجه به محتوای میکروبی فراوان در آب دریا، ما در ابتدا بر روی توصیف توالی‌های DNA میکروبی در همولنف تمرکز کردیم.برای این کار از دو استراتژی مختلف استفاده می کنیم.اولین استراتژی از Kraken2 استفاده کرد، یک برنامه طبقه بندی توالی مبتنی بر الگوریتم که می تواند توالی های میکروبی را با دقتی قابل مقایسه با BLAST و سایر ابزارها شناسایی کند [28].بیش از 6719 مورد مطالعه مشخص شد که منشا باکتریایی دارند، در حالی که 124 و 64 مورد به ترتیب مربوط به باستان شناسی و ویروس ها بودند (شکل 4).فراوان ترین قطعات DNA باکتری Firmicutes (46%)، Proteobacteria (27%) و Bacteroidetes (17%) بودند (شکل 4a).این توزیع با مطالعات قبلی میکروبیوم صدف آبی دریایی مطابقت دارد [39، 40].گاماپروتئوباکتری ها کلاس اصلی پروتئوباکتری ها بودند (44%)، از جمله بسیاری از ویبریونال ها (شکل 4b).روش ddPCR وجود قطعات DNA ویبریو را در ccfDNA همولنف A. atra تایید کرد (شکل 4c) [41].برای به دست آوردن اطلاعات بیشتر در مورد منشا باکتریایی ccfDNA، یک رویکرد اضافی اتخاذ شد (شکل S2، اطلاعات تکمیلی). در این مورد، قرائت هایی که همپوشانی داشتند به عنوان خوانده های انتهایی جفتی مونتاژ شدند و با استفاده از BLASTN و مقدار e 1e-3 و یک برش با همسانی بیش از 90% به عنوان منشا خود (دوکفه ای) یا غیر خود طبقه بندی شدند. در این مورد، قرائت هایی که همپوشانی داشتند به عنوان خوانده های انتهایی جفتی مونتاژ شدند و با استفاده از BLASTN و مقدار e 1e-3 و یک برش با همسانی بیش از 90% به عنوان منشا خود (دوکفه ای) یا غیر خود طبقه بندی شدند. در این مورد با استفاده از نرم افزارهای مختلف و با استفاده از ابزارهای تبلیغاتی (دولت ایجاد شده) و یا با استفاده از BLUE 3. отсечения с гомологией> 90%. در این مورد، قرائت‌های همپوشانی به‌عنوان قرائت‌های زوجی جمع‌آوری شدند و با استفاده از BLASTN و ارزش e 1e-3 و برش با همولوژی 90% به‌عنوان بومی (دوکفه‌ای) یا غیر اصلی طبقه‌بندی شدند.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和歄怺怺怐皒e >90%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 1-3 bla和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身..… در این مورد با استفاده از مواد مغذی با استفاده از ابزارهای خاص نرخ رشد> 90%. در این مورد، قرائت‌های همپوشانی به‌عنوان قرائت‌های زوجی جمع‌آوری شدند و با استفاده از مقادیر e BLASTN و 1e-3 و آستانه همسانی >90% به عنوان خود (دوکفه‌ای) یا غیر اصلی طبقه‌بندی شدند.از آنجایی که ژنوم A. atra هنوز توالی یابی نشده است، ما از استراتژی مونتاژ de novo مونتاژ کننده توالی نسل بعدی MEGAHIT (NGS) استفاده کردیم.در مجموع 147188 کانتیگ به عنوان منشاء وابسته (دوکفه ای) شناسایی شده اند.سپس با استفاده از BLASTN و BLASTX، این کانتیگ‌ها با مقادیر e-1e-10 منفجر شدند.این استراتژی به ما امکان می دهد 482 قطعه غیر دوکفه ای موجود در A. atra ccfDNA را شناسایی کنیم.بیش از نیمی (57٪) از این قطعات DNA از باکتری ها، عمدتاً از همزیست های آبشش، از جمله همزیست های سولفوتروفیک، و از همزیست های آبششی Solemya velum به دست آمد (شکل 5).
فراوانی نسبی در سطح نوع.B تنوع میکروبی دو فیلا اصلی (فرمیکوت ها و پروتئوباکتری ها).تقویت نماینده ddPCR C Vibrio spp.الف. قطعاتی از ژن 16S rRNA (آبی) در سه همولنف آترا.
در مجموع 482 contigs جمع آوری شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.نمایه عمومی توزیع طبقه بندی حاشیه نویسی های متاژنومیک (پروکاریوت ها و یوکاریوت ها).B توزیع دقیق قطعات DNA باکتری شناسایی شده توسط BLASTN و BLASTX.
تجزیه و تحلیل Kraken2 همچنین نشان داد که ccfDNA صدف حاوی قطعات DNA باستانی، از جمله قطعات DNA از Euryarchaeota (65٪)، Crenarchaeota (24٪)، و Thaurmarcheota (11٪) است (شکل 6a).وجود قطعات DNA مشتق شده از Euryarchaeota و Crenarchaeota که قبلا در جامعه میکروبی صدف های کالیفرنیایی یافت شده بود، نباید تعجب آور باشد [42].اگرچه Euryarchaeota اغلب با شرایط شدید همراه است، اکنون مشخص شده است که Euryarchaeota و Crenarcheota هر دو از رایج ترین پروکاریوت ها در محیط برودتی دریایی هستند [43، 44].وجود میکروارگانیسم های متانوژن در صدف ها با توجه به گزارش های اخیر از نشت متان گسترده از نشت های پایین در فلات کرگولن [45] و تولید متان میکروبی احتمالی مشاهده شده در سواحل جزایر کرگولن [46] تعجب آور نیست.
سپس توجه ما به خواندن ویروس های DNA معطوف شد.تا آنجا که ما می دانیم، این اولین مطالعه خارج از هدف در مورد محتوای ویروس صدف ها است.همانطور که انتظار می رفت، ما قطعات DNA باکتریوفاژها (Caudovirales) را پیدا کردیم (شکل 6b).با این حال، رایج‌ترین DNA ویروسی از دسته‌ای از نوکلئوسیتوویروس‌ها می‌آید که به عنوان ویروس DNA بزرگ سیتوپلاسمی هسته‌ای (NCLDV) نیز شناخته می‌شود، که بزرگترین ژنوم را در بین هر ویروسی دارد.در این شاخه، بیشتر توالی‌های DNA به خانواده‌های Mimimidoviridae (58%) و Poxviridae (21%) تعلق دارند که میزبان طبیعی آن شامل مهره‌داران و بندپایان است، در حالی که بخش کمی از این توالی‌های DNA متعلق به جلبک‌های ویروسی شناخته شده است.جلبک های یوکاریوتی دریایی را آلوده می کند.توالی ها همچنین از ویروس پاندورا، ویروس غول پیکر با بزرگترین اندازه ژنوم در بین هر جنس ویروسی شناخته شده به دست آمد.جالب توجه است که محدوده میزبان هایی که به ویروس آلوده می شوند، همانطور که توسط توالی یابی ccfDNA همولنف تعیین می شود، نسبتاً بزرگ بود (شکل S3، اطلاعات تکمیلی).این شامل ویروس هایی است که حشرات مانند Baculoviridae و Iridoviridae را آلوده می کند و همچنین ویروس هایی که آمیب، جلبک ها و مهره داران را آلوده می کنند.ما همچنین توالی‌هایی را یافتیم که با ژنوم پیتوویروس sibericum مطابقت داشتند.پیتوویروس ها (همچنین به عنوان "ویروس های زامبی" شناخته می شوند) برای اولین بار از یخبندان 30000 ساله در سیبری جدا شدند [47].بنابراین، نتایج ما با گزارش‌های قبلی مطابقت دارد که نشان می‌دهد همه گونه‌های مدرن این ویروس‌ها منقرض نشده‌اند [48] و ممکن است این ویروس‌ها در اکوسیستم‌های دریایی دورافتاده زیر قطبی وجود داشته باشند.
در نهایت، ما آزمایش کردیم تا ببینیم آیا می‌توانیم قطعات DNA را از سایر حیوانات چند سلولی پیدا کنیم.در مجموع 482 کانتیگ خارجی توسط BLASTN و BLASTX با کتابخانه های nt، nr و RefSeq (ژنومیک و پروتئین) شناسایی شدند.نتایج ما نشان می‌دهد که در میان قطعات خارجی ccfDNA حیوانات چند سلولی، DNA استخوان‌های استخوانی غالب است (شکل 5).قطعات DNA از حشرات و گونه های دیگر نیز یافت شده است.بخش نسبتاً بزرگی از قطعات DNA شناسایی نشده است، احتمالاً به دلیل کمتر بودن تعداد زیادی از گونه های دریایی در پایگاه داده های ژنومی در مقایسه با گونه های زمینی [49].
در مقاله حاضر، مفهوم LB را برای صدف‌ها به کار می‌بریم و استدلال می‌کنیم که توالی‌بندی شات ccfDNA همولنف می‌تواند بینشی در مورد ترکیب اکوسیستم‌های ساحلی دریایی ارائه دهد.به طور خاص، ما متوجه شدیم که 1) همولنف صدف حاوی غلظت نسبتاً بالایی (سطح میکروگرم) از قطعات DNA نسبتاً بزرگ (~ 1-5 کیلوبایت) در گردش است.2) این قطعات DNA هم مستقل و هم غیر مستقل هستند. 3) در میان منابع خارجی این قطعات DNA، DNA باکتریایی، باستانی و ویروسی و همچنین DNA سایر حیوانات چند سلولی را یافتیم.4) تجمع این قطعات خارجی ccfDNA در همولنف به سرعت اتفاق می افتد و به فعالیت فیلتر داخلی صدف کمک می کند.در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مفهوم LB، که تاکنون عمدتاً در زمینه زیست‌پزشکی به کار رفته است، منبع دانش غنی اما ناشناخته‌ای را رمزگذاری می‌کند که می‌تواند برای درک بهتر تعامل بین گونه‌های نگهبان و محیط آنها مورد استفاده قرار گیرد.
علاوه بر پستانداران، جداسازی ccfDNA در پستانداران از جمله موش، سگ، گربه و اسب گزارش شده است [50، 51، 52].با این حال، طبق دانش ما، مطالعه ما اولین مطالعه ای است که تشخیص و توالی یابی ccfDNA را در گونه های دریایی با سیستم گردش خون باز گزارش می دهد.این ویژگی تشریحی و توانایی فیلتر صدف ها ممکن است، حداقل تا حدی، ویژگی های اندازه متفاوت قطعات DNA در گردش را در مقایسه با گونه های دیگر توضیح دهد.در انسان، بیشتر قطعات DNA در گردش خون، قطعات کوچکی هستند که اندازه آنها بین 150 تا 200 جفت باز است.با حداکثر پیک 167 جفت باز [34، 53].اندازه بخش کوچک اما قابل توجهی از قطعات DNA بین 300 تا 500 جفت باز است و حدود 5 درصد آنها بلندتر از 900 جفت باز هستند.[54].دلیل این توزیع اندازه این است که منبع اصلی ccfDNA در پلاسما در نتیجه مرگ سلولی یا به دلیل مرگ سلولی یا به دلیل نکروز سلول های خونساز در گردش در افراد سالم یا به دلیل آپوپتوز سلول های تومور در بیماران سرطانی (معروف به DNA تومور در گردش) رخ می دهد.، ctDNA).توزیع اندازه همولنف ccfDNA که در صدف‌ها یافتیم از 1000 تا 5000 جفت باز بود که نشان می‌دهد ccfDNA صدف منشأ متفاوتی دارد.این یک فرضیه منطقی است، زیرا صدف ها دارای یک سیستم عروقی نیمه باز هستند و در محیط های آبی دریایی حاوی غلظت بالایی از DNA ژنومی میکروبی زندگی می کنند.در واقع، آزمایش‌های آزمایشگاهی ما با استفاده از DNA اگزوژن نشان داده‌اند که صدف‌ها قطعات DNA را در آب دریا جمع می‌کنند، حداقل پس از چند ساعت پس از جذب سلولی تجزیه می‌شوند و/یا آزاد می‌شوند و/یا در سازمان‌های مختلف ذخیره می‌شوند.با توجه به نادر بودن سلول ها (اعم از پروکاریوتی و یوکاریوتی)، استفاده از محفظه های داخل دریچه ای باعث کاهش مقدار ccfDNA از منابع خود و همچنین از منابع خارجی می شود.با توجه به اهمیت ایمنی ذاتی دوکفه ای و تعداد زیاد فاگوسیت های در گردش، ما بیشتر این فرضیه را مطرح کردیم که حتی ccfDNA خارجی نیز در فاگوسیت های در حال گردش غنی شده است که DNA خارجی را پس از بلع میکروارگانیسم ها و/یا بقایای سلولی جمع می کنند.روی هم رفته، نتایج ما نشان می دهد که ccfDNA همولنف دوکفه ای یک مخزن منحصر به فرد از اطلاعات مولکولی است و وضعیت آنها را به عنوان گونه نگهبان تقویت می کند.
داده های ما نشان می دهد که تعیین توالی و تجزیه و تحلیل قطعات ccfDNA همولنف مشتق از باکتری می تواند اطلاعات کلیدی در مورد فلور باکتریایی میزبان و باکتری های موجود در اکوسیستم دریایی اطراف ارائه دهد.تکنیک‌های توالی‌یابی شات، توالی‌هایی از باکتری مشترک A. atra gill را نشان داده‌اند که اگر از روش‌های متداول شناسایی 16S rRNA استفاده می‌شد، تا حدودی به دلیل سوگیری کتابخانه مرجع، از دست می‌رفتند.در واقع، استفاده ما از داده‌های LB جمع‌آوری‌شده از M. platensis در همان لایه صدف در Kerguelen نشان داد که ترکیب همزیستی‌های باکتریایی مرتبط با آبشش برای هر دو گونه صدف یکسان بود (شکل S4، اطلاعات تکمیلی).این شباهت دو صدف ژنتیکی متفاوت ممکن است منعکس کننده ترکیب جوامع باکتریایی در ذخایر سرد، گوگردی و آتشفشانی Kerguelen باشد [55، 56، 57، 58].سطوح بالاتری از میکروارگانیسم‌های کاهنده گوگرد به خوبی در هنگام برداشت صدف‌ها از مناطق ساحلی بیوتورباتی شده [59]، مانند سواحل پورتو فرانس، توصیف شده است.احتمال دیگر این است که فلور صدف مشترک ممکن است تحت تأثیر انتقال افقی قرار گیرد [60، 61].تحقیقات بیشتری برای تعیین ارتباط بین محیط دریایی، سطح بستر دریا و ترکیب باکتری‌های همزیست در صدف‌ها مورد نیاز است.این مطالعات در حال حاضر ادامه دارد.
طول و غلظت ccfDNA همولنف، سهولت خالص‌سازی و کیفیت بالا برای تعیین توالی سریع تفنگ ساچمه‌ای برخی از مزایای استفاده از ccfDNA صدف برای ارزیابی تنوع زیستی در اکوسیستم‌های ساحلی دریایی است.این رویکرد به ویژه برای توصیف جوامع ویروسی (ویروم ها) در یک اکوسیستم معین مؤثر است [62، 63].برخلاف باکتری‌ها، باستان‌ها و یوکاریوت‌ها، ژنوم‌های ویروسی حاوی ژن‌های حفظ‌شده فیلوژنتیکی مانند توالی‌های 16S نیستند.نتایج ما نشان می‌دهد که نمونه‌برداری مایع از گونه‌های شاخص مانند صدف‌ها می‌تواند برای شناسایی تعداد نسبتاً زیادی از قطعات ویروس ccfDNA شناخته شده برای آلوده کردن میزبان‌هایی که معمولاً در اکوسیستم‌های دریایی ساحلی ساکن هستند استفاده شود.این شامل ویروس های شناخته شده برای آلوده کردن تک یاخته ها، بندپایان، حشرات، گیاهان و ویروس های باکتریایی (به عنوان مثال، باکتریوفاژها) می شود.هنگامی که ما ویروس ccfDNA همولنف صدف آبی (M. platensis) جمع آوری شده در همان لایه صدف در Kerguelen را بررسی کردیم، توزیع مشابهی پیدا شد (جدول S2، اطلاعات تکمیلی).تعیین توالی تفنگ ساچمه ای ccfDNA در واقع یک رویکرد جدید است که در مطالعه ویروس انسان یا سایر گونه ها شتاب می گیرد [21، 37، 64].این رویکرد به ویژه برای مطالعه ویروس‌های DNA دو رشته‌ای مفید است، زیرا هیچ ژن واحدی در بین همه ویروس‌های DNA دو رشته‌ای حفظ نشده است، که متنوع‌ترین و گسترده‌ترین دسته ویروس‌ها را در بالتیمور نشان می‌دهد [65].اگرچه بیشتر این ویروس‌ها طبقه‌بندی نشده باقی می‌مانند و ممکن است شامل ویروس‌هایی از بخش کاملاً ناشناخته دنیای ویروسی باشند [66]، ما دریافتیم که ویروس‌ها و محدوده میزبان صدف‌های A. atra و M. platensis بین این دو گونه قرار می‌گیرند.به طور مشابه (شکل S3، اطلاعات اضافی را ببینید).این شباهت تعجب آور نیست، زیرا ممکن است منعکس کننده عدم انتخاب پذیری در جذب DNA موجود در محیط باشد.مطالعات آینده با استفاده از RNA خالص در حال حاضر برای مشخص کردن ویروس RNA مورد نیاز است.
در مطالعه خود، از خط لوله بسیار دقیقی استفاده کردیم که از کار کووارسکی و همکاران [37] اقتباس شده بود، که از حذف دو مرحله‌ای از خوانده‌ها و contigs ادغام شده قبل و بعد از مونتاژ ccfDNA بومی استفاده کردند، که منجر به نسبت بالایی از خواندن‌های بدون نقشه شد.بنابراین، نمی‌توانیم رد کنیم که برخی از این خوانش‌های بدون نقشه هنوز منشأ خاص خود را داشته باشند، در درجه اول به این دلیل که ژنوم مرجعی برای این گونه صدف نداریم.ما همچنین از این خط لوله استفاده کردیم زیرا نگران واهی‌های بین خودخوان‌ها و غیرخودخوانی‌ها و طول خواندن تولید شده توسط Illumina MiSeq PE75 بودیم.دلیل دیگر برای اکثر قرائت های ناشناخته این است که بسیاری از میکروب های دریایی، به ویژه در مناطق دورافتاده مانند Kerguelen، حاشیه نویسی نشده اند.ما از Illumina MiSeq PE75 استفاده کردیم، با فرض طول قطعه ccfDNA مشابه ccfDNA انسان.برای مطالعات آینده، با توجه به نتایج ما که نشان می‌دهد ccfDNA همولنف خوانش طولانی‌تری نسبت به انسان و/یا پستانداران دارد، توصیه می‌کنیم از یک پلت فرم توالی‌یابی مناسب‌تر برای قطعات ccfDNA طولانی‌تر استفاده کنید.این عمل شناسایی نشانه های بیشتر برای تجزیه و تحلیل عمیق تر را بسیار آسان تر می کند.به دست آوردن توالی ژنوم هسته ای A. atra که در حال حاضر در دسترس نیست، همچنین تشخیص ccfDNA از منابع خود و غیر خود را بسیار تسهیل می کند.با توجه به اینکه تحقیقات ما بر روی امکان به کارگیری مفهوم بیوپسی مایع در صدف متمرکز شده است، امیدواریم با استفاده از این مفهوم در تحقیقات آتی، ابزارها و خطوط لوله جدیدی برای افزایش پتانسیل این روش برای مطالعه تنوع میکروبی صدف ها ایجاد شود.اکوسیستم دریایی
به عنوان یک بیومارکر بالینی غیر تهاجمی، سطوح بالای ccfDNA پلاسمایی انسان با بیماری‌های مختلف، آسیب بافتی و شرایط استرس مرتبط است [67،68،69].این افزایش با آزاد شدن قطعات DNA با منشأ خود پس از آسیب بافت همراه است.ما با استفاده از استرس گرمایی حاد به این موضوع پرداختیم، که در آن صدف‌ها برای مدت کوتاهی در معرض دمای 30 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.ما این تجزیه و تحلیل را بر روی سه نوع مختلف صدف در سه آزمایش مستقل انجام دادیم.با این حال، ما هیچ تغییری در سطوح ccfDNA پس از استرس گرمایی حاد پیدا نکردیم (شکل S5، اطلاعات اضافی را ببینید).این کشف ممکن است حداقل تا حدی این واقعیت را توضیح دهد که صدف‌ها یک سیستم گردش خون نیمه باز دارند و به دلیل فعالیت بالای فیلتر کردنشان، مقادیر زیادی DNA خارجی در خود جمع می‌کنند.از سوی دیگر، صدف‌ها، مانند بسیاری از بی‌مهرگان، ممکن است در برابر آسیب بافتی ناشی از استرس مقاوم‌تر باشند و در نتیجه آزادسازی ccfDNA را در همولنف خود محدود کنند [70، 71].
تا به امروز، تجزیه و تحلیل DNA تنوع زیستی در اکوسیستم های آبی عمدتاً بر روی کدگذاری DNA محیطی (eDNA) متمرکز شده است.با این حال، این روش معمولا در تجزیه و تحلیل تنوع زیستی زمانی که پرایمر استفاده می شود محدود است.استفاده از توالی تفنگ ساچمه ای محدودیت های PCR و انتخاب سوگیرانه مجموعه های پرایمر را دور می زند.بنابراین، به یک معنا، روش ما به روش توالی‌یابی تفنگ ساچمه‌ای با توان بالای eDNA که اخیراً مورد استفاده قرار گرفته است، نزدیک‌تر است، که قادر است به طور مستقیم DNA تکه تکه شده را توالی‌بندی کند و تقریباً همه موجودات را تجزیه و تحلیل کند [72، 73].با این حال، تعدادی از مسائل اساسی وجود دارد که LB را از روش های استاندارد eDNA متمایز می کند.البته تفاوت اصلی بین eDNA و LB استفاده از هاست فیلتر طبیعی است.استفاده از گونه های دریایی مانند اسفنج ها و دوکفه ای ها (Dresseina spp.) به عنوان یک فیلتر طبیعی برای مطالعه eDNA گزارش شده است [74، 75].با این حال، مطالعه Dreissena از بیوپسی بافتی استفاده کرد که DNA از آن استخراج شد.تجزیه و تحلیل ccfDNA از LB نیازی به بیوپسی بافت، تجهیزات تخصصی و گاهی گران قیمت و تدارکات مرتبط با eDNA یا بیوپسی بافت ندارد.در واقع، اخیراً گزارش دادیم که ccfDNA از LB را می توان با پشتیبانی FTA بدون حفظ زنجیره سرد ذخیره و تجزیه و تحلیل کرد که این یک چالش بزرگ برای تحقیقات در مناطق دور افتاده است [76].استخراج ccfDNA از بیوپسی های مایع نیز ساده است و DNA با کیفیت بالایی را برای تعیین توالی تفنگ ساچمه ای و آنالیز PCR فراهم می کند.این یک مزیت بزرگ با توجه به برخی از محدودیت های فنی مرتبط با تجزیه و تحلیل eDNA است [77].سادگی و هزینه کم روش نمونه گیری نیز به ویژه برای برنامه های نظارت بلندمدت مناسب است.علاوه بر توانایی فیلتر کنندگی بالای آنها، یکی دیگر از ویژگی های شناخته شده دوکفه ای، ترکیب شیمیایی موکوپلی ساکارید مخاط آنها است که باعث جذب ویروس ها می شود [78، 79].این باعث می شود که دوکفه ای ها فیلتر طبیعی ایده آلی برای توصیف تنوع زیستی و تأثیر تغییرات آب و هوایی در یک اکوسیستم آبی خاص باشند.اگرچه وجود قطعات DNA مشتق شده از میزبان می تواند به عنوان یک محدودیت روش در مقایسه با eDNA دیده شود، هزینه مرتبط با داشتن چنین ccfDNA بومی در مقایسه با eDNA به طور همزمان برای حجم وسیع اطلاعات موجود برای مطالعات بهداشتی قابل درک است.میزبان افست.این شامل حضور توالی های ویروسی ادغام شده در ژنوم میزبان میزبان است.با توجه به وجود رتروویروس‌های لوسمی افقی در دوکفه‌ای، این امر به ویژه برای صدف‌ها مهم است [80، 81].مزیت دیگر LB نسبت به eDNA این است که از فعالیت فاگوسیتیک سلول های خونی در گردش در همولنف که میکروارگانیسم ها (و ژنوم آنها) را می بلعد، استفاده می کند.فاگوسیتوز عملکرد اصلی سلول های خونی در دوکفه ای ها است [82].در نهایت، این روش از ظرفیت فیلتر بالای صدف‌ها (به طور متوسط ​​1.5 لیتر در ساعت آب دریا) و گردش دو روزه بهره می‌برد که اختلاط لایه‌های مختلف آب دریا را افزایش می‌دهد و امکان جذب eDNA هترولوگ را فراهم می‌کند.[83، 84].بنابراین، تجزیه و تحلیل ccfDNA صدف یک راه جالب با توجه به اثرات تغذیه ای، اقتصادی و زیست محیطی صدف ها است.مشابه تجزیه و تحلیل LB جمع آوری شده از انسان، این روش همچنین امکان اندازه گیری تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در DNA میزبان را در پاسخ به مواد برون زا باز می کند.به عنوان مثال، فناوری‌های توالی‌یابی نسل سوم را می‌توان برای انجام تجزیه و تحلیل متیلاسیون ژنومی در ccfDNA بومی با استفاده از توالی‌یابی نانوحفره در نظر گرفت.این فرآیند باید با این واقعیت تسهیل شود که طول قطعات ccfDNA صدف به طور ایده آل با پلت فرم های توالی یابی طولانی مدت سازگار است که امکان تجزیه و تحلیل متیلاسیون DNA در سطح ژنوم را از یک اجرای توالی یابی واحد بدون نیاز به دگرگونی های شیمیایی فراهم می کند.بنابراین، می تواند بینش ارزشمندی در مورد مکانیسم های اساسی حاکم بر واکنش پس از قرار گرفتن در معرض تغییرات آب و هوایی یا آلاینده ها ارائه دهد [87].با این حال، استفاده از LB بدون محدودیت نیست.نیازی به گفتن نیست که این امر مستلزم حضور گونه های شاخص در اکوسیستم است.همانطور که در بالا ذکر شد، استفاده از LB برای ارزیابی تنوع زیستی یک اکوسیستم معین به یک خط لوله بیوانفورماتیک دقیق نیز نیاز دارد که حضور قطعات DNA از منبع را در نظر می گیرد.مشکل عمده دیگر در دسترس بودن ژنوم مرجع برای گونه های دریایی است.امید است که ابتکاراتی مانند پروژه ژنوم پستانداران دریایی و پروژه Fish10k اخیراً تأسیس شده [88] چنین تحلیلی را در آینده تسهیل کند.استفاده از مفهوم LB برای موجودات دریایی تغذیه‌کننده فیلتر نیز با آخرین پیشرفت‌ها در فناوری توالی‌یابی سازگار است و آن را برای توسعه نشانگرهای زیستی چند اهم برای ارائه اطلاعات مهم در مورد سلامت زیستگاه‌های دریایی در پاسخ به استرس‌های محیطی مناسب می‌سازد.
داده‌های توالی‌یابی ژنوم در آرشیو خواندن توالی NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 تحت Bioprojects SRR8924808 ذخیره شده است.
Brierley AS، Kingsford MJ تأثیر تغییر آب و هوا بر زندگی دریایی و اکوسیستم ها.زیست شناسی کول.2009;19: P602–P614.
Gissi E، Manea E، Mazaris AD، Fraschetti S، Almpanidou V، Bevilacqua S، و همکاران.اثرات ترکیبی تغییرات آب و هوا و سایر عوامل استرس زا محلی را بر محیط دریایی در نظر بگیرید.محیط علمی عمومی2021; 755:142564.
Carella F، Antuofermo E، Farina S، Salati F، Mandas D، Prado P، و همکاران.).علم اول اسفند.2020؛ 7:48.
Seront L، Nicastro CR، Zardi GI، Goberville E. کاهش تحمل گرما تحت شرایط تنش گرمایی تکراری، مرگ و میر بالای صدف‌های آبی در تابستان را توضیح می‌دهد.گزارش علمی 2019;9:17498.
Fey SB، Siepielski AM، Nussle S، Cervantes-Yoshida K، Hwan JL، Huber ER، و همکاران.تغییرات اخیر در فراوانی، علل و میزان مرگ و میر حیوانات.Proc Natl Acad Sci USA.2015؛ 112: 1083-8.
Scarpa F، Sanna D، Azzena I، Mughetti D، Cerruti F، Hosseini S، و همکاران.چندین پاتوژن غیر خاص ممکن است باعث مرگ و میر دسته جمعی Pinna nobilis شده باشد.زندگی2020؛ 10:238.
بردلی ام، کوتس اس ​​جی، جنکینز ای، اوهارا تی ام.تاثیر بالقوه تغییر آب و هوا بر بیماری های مشترک بین انسان و دام قطب شمالInt J Circumpolar Health.2005;64:468-77.
Beyer J.، Greene NW، Brooks S.، Allan IJ، Ruus A.، Gomez T. و همکاران.صدف های آبی (Mytilus edulis spp.) به عنوان موجودات سیگنال در پایش آلودگی ساحلی: یک بررسیMar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G، Marsoni S، Siena S، Bardelli A. ادغام بیوپسی مایع در درمان سرطان.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531-48.
وان جی سی ام، ماسی سی، گارسیا-کورباچو جی، مولیره اف، برنتون جی دی، کالداس سی، و همکاران.بلوغ بیوپسی مایع: به DNA تومور اجازه گردش می دهد.Nat Rev سرطان.2017؛ 17:223-38.
Mandel P., Metais P. اسیدهای نوکلئیک در پلاسمای انسان.صورتجلسه شرکت های تابعه Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ، Ungerer W، Holdenrieder S. نقش جدیدی برای DNA بدون سلول به عنوان یک نشانگر مولکولی برای درمان سرطان.کمی سازی آنالیز بیومولار.2019؛ 17:100087.
Ignatiadis M.، Sledge GW، Jeffrey SS بیوپسی مایع وارد کلینیک می شود - مسائل اجرایی و چالش های آینده.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM، Corbetta N.، Chamberlain PF، Rai W.، Sargent IL، Redman CW و دیگران.DNA جنین در پلاسما و سرم مادر وجود دارد.لانست.1997;350:485-7.
Mufarray MN، Wong RJ، Shaw GM، Stevenson DK، Quake SR مطالعه سیر بارداری و عوارض آن با استفاده از RNA خارج سلولی در گردش خون زنان در دوران بارداری.دوپدیکال.2020؛ 8:605219.
اولریچ ام، شروود کی، کیون پی، شوتز ای، بک جی، استگباوئر جی، و همکاران.بیوپسی مایع: DNA بدون سلول اهداکننده برای تشخیص ضایعات آلوژنیک در پیوند کلیه استفاده می شود.نات ریو نفرول.2021;17:591-603.
Juan FC، Lo YM نوآوری در تشخیص پیش از تولد: توالی یابی ژنوم پلاسمای مادر.آنا MD.2016؛ 67:419-32.
Gu W، Deng X، Lee M، Sucu YD، Arevalo S، Stryke D، و همکاران.تشخیص سریع پاتوژن با توالی متاژنومیک نسل بعدی مایعات بدن آلودهNat Medicine.2021؛ 27:115-24.