از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
بیوپسی مایع (LB) مفهومی است که به سرعت در حوزه زیست‌پزشکی محبوبیت پیدا می‌کند. این مفهوم عمدتاً مبتنی بر تشخیص قطعات DNA خارج سلولی در گردش (ccfDNA) است که عمدتاً پس از مرگ سلولی در بافت‌های مختلف به صورت قطعات کوچک آزاد می‌شوند. بخش کوچکی از این قطعات از بافت‌ها یا ارگانیسم‌های خارجی (بیگانه) منشأ می‌گیرند. در کار فعلی، ما این مفهوم را بر روی صدف‌ها، گونه‌ای نگهبان که به دلیل ظرفیت بالای فیلتراسیون آب دریا شناخته شده است، اعمال کرده‌ایم. ما از توانایی صدف‌ها در عمل به عنوان فیلترهای طبیعی برای گرفتن قطعات DNA محیطی از منابع مختلف استفاده می‌کنیم تا اطلاعاتی در مورد تنوع زیستی اکوسیستم‌های ساحلی دریایی ارائه دهیم. نتایج ما نشان می‌دهد که همولنف صدف حاوی قطعات DNA است که از نظر اندازه بسیار متفاوت هستند، از 1 تا 5 کیلوبایت. توالی‌یابی با تفنگ ساچمه‌ای نشان داد که تعداد زیادی از قطعات DNA منشأ میکروبی خارجی دارند. در میان آنها، قطعات DNA از باکتری‌ها، آرکی‌ها و ویروس‌ها، از جمله ویروس‌هایی که به آلوده کردن میزبان‌های مختلف که معمولاً در اکوسیستم‌های دریایی ساحلی یافت می‌شوند، شناخته شده‌اند، یافتیم. در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مفهوم LB که برای صدف‌ها به کار می‌رود، منبع غنی اما هنوز کشف نشده‌ای از دانش در مورد تنوع میکروبی در اکوسیستم‌های ساحلی دریایی است.
تأثیر تغییرات اقلیمی (CC) بر تنوع زیستی اکوسیستم‌های دریایی، حوزه‌ای تحقیقاتی است که به سرعت در حال رشد است. گرمایش جهانی نه تنها باعث ایجاد تنش‌های فیزیولوژیکی مهم می‌شود، بلکه محدودیت‌های تکاملی پایداری حرارتی موجودات دریایی را نیز تحت تأثیر قرار می‌دهد و زیستگاه تعدادی از گونه‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد و آنها را به جستجوی شرایط مطلوب‌تر سوق می‌دهد [1، 2]. علاوه بر تأثیر بر تنوع زیستی متازوئن‌ها، CC تعادل ظریف تعاملات میزبان-میکروبی را مختل می‌کند. این دیس‌باکتریوز میکروبی تهدیدی جدی برای اکوسیستم‌های دریایی محسوب می‌شود زیرا موجودات دریایی را در برابر عوامل بیماری‌زای عفونی حساس‌تر می‌کند [3، 4]. اعتقاد بر این است که SS نقش مهمی در مرگ و میر دسته جمعی دارد که یک مشکل جدی برای مدیریت اکوسیستم‌های دریایی جهانی است [5، 6]. این موضوع با توجه به تأثیرات اقتصادی، اکولوژیکی و تغذیه‌ای بسیاری از گونه‌های دریایی، مسئله مهمی است. این امر به ویژه در مورد دوکفه‌ای‌هایی که در مناطق قطبی زندگی می‌کنند، صادق است، جایی که اثرات CK فوری‌تر و شدیدتر است [6، 7]. در واقع، دوکفه‌ای‌هایی مانند Mytilus spp. به طور گسترده برای نظارت بر اثرات CC بر اکوسیستم‌های دریایی استفاده می‌شوند. جای تعجب نیست که تعداد نسبتاً زیادی از نشانگرهای زیستی برای نظارت بر سلامت آنها توسعه یافته‌اند، که اغلب با استفاده از یک رویکرد دو لایه شامل نشانگرهای زیستی عملکردی مبتنی بر فعالیت آنزیمی یا عملکردهای سلولی مانند زیست‌پذیری سلولی و فعالیت فاگوسیتیک [8] انجام می‌شوند. این روش‌ها همچنین شامل اندازه‌گیری غلظت شاخص‌های فشار خاص هستند که پس از جذب مقادیر زیادی از آب دریا در بافت‌های نرم تجمع می‌یابند. با این حال، ظرفیت بالای فیلتراسیون و سیستم گردش خون نیمه باز دوکفه‌ای‌ها فرصتی را برای توسعه نشانگرهای زیستی همولنف جدید با استفاده از مفهوم بیوپسی مایع (LB)، یک رویکرد ساده و کم تهاجمی برای مدیریت بیمار، فراهم می‌کند. نمونه‌های خون [9، 10]. اگرچه چندین نوع مولکول در گردش را می‌توان در LB انسان یافت، اما این مفهوم در درجه اول مبتنی بر تجزیه و تحلیل توالی DNA قطعات DNA خارج سلولی در گردش (ccfDNA) در پلاسما است. در واقع، وجود DNA در گردش خون در پلاسمای انسان از اواسط قرن بیستم شناخته شده است [11]، اما تنها در سال‌های اخیر است که ظهور روش‌های توالی‌یابی با توان عملیاتی بالا منجر به تشخیص بالینی بر اساس ccfDNA شده است. وجود این قطعات DNA در گردش خون تا حدی به دلیل آزادسازی غیرفعال DNA ژنومی (هسته‌ای و میتوکندریایی) پس از مرگ سلولی است. در افراد سالم، غلظت ccfDNA به طور معمول کم است (کمتر از 10 نانوگرم در میلی‌لیتر) اما در بیمارانی که از بیماری‌های مختلف رنج می‌برند یا در معرض استرس قرار دارند و منجر به آسیب بافتی می‌شوند، می‌تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد. در افراد سالم، غلظت ccfDNA به طور معمول کم است (کمتر از 10 نانوگرم در میلی‌لیتر) اما در بیمارانی که از بیماری‌های مختلف رنج می‌برند یا در معرض استرس قرار دارند و منجر به آسیب بافتی می‌شوند، می‌تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد. У здоровых людей концентрация вккДНК در норме низкая (<10 ng/ml)، اما ممکن است در 5-10 در больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. در افراد سالم، غلظت cccDNA به طور معمول کم است (کمتر از 10 نانوگرم در میلی‌لیتر)، اما در بیمارانی که دارای آسیب‌های مختلف هستند یا تحت استرسی هستند که منجر به آسیب بافتی می‌شود، می‌تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。损伤تمرکز ccfDNA بسیار کم است (<10 ng/ml) در بیماری های نادرست، اما ممکن است در 5-10 بار در بیماران مبتلا به بیماری های مختلف و یا استرسсом, что приводит к повреждению тканей. غلظت ccfDNA معمولاً در افراد سالم پایین است (کمتر از 10 نانوگرم در میلی‌لیتر)، اما در بیمارانی که دارای آسیب‌های مختلف یا استرس هستند، می‌تواند 5 تا 10 برابر افزایش یابد و منجر به آسیب بافتی شود.اندازه قطعات ccfDNA بسیار متفاوت است، اما معمولاً از 150 تا 200 جفت باز متغیر است. [12]. تجزیه و تحلیل ccfDNA مشتق شده از خود، یعنی ccfDNA از سلول‌های میزبان طبیعی یا تغییر شکل یافته، می‌تواند برای تشخیص تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی موجود در ژنوم هسته‌ای و/یا میتوکندری مورد استفاده قرار گیرد و در نتیجه به پزشکان در انتخاب درمان‌های هدفمند مولکولی خاص کمک کند [13]. با این حال، ccfDNA را می‌توان از منابع خارجی مانند ccfDNA از سلول‌های جنینی در دوران بارداری یا از اندام‌های پیوندی به دست آورد [14،15،16،17]. ccfDNA همچنین منبع مهمی از اطلاعات برای تشخیص وجود اسیدهای نوکلئیک یک عامل عفونی (خارجی) است که امکان تشخیص غیرتهاجمی عفونت‌های گسترده که توسط کشت خون شناسایی نمی‌شوند را فراهم می‌کند و از بیوپسی تهاجمی بافت آلوده جلوگیری می‌کند [18]. مطالعات اخیر در واقع نشان داده‌اند که خون انسان حاوی منبع غنی از اطلاعات است که می‌تواند برای شناسایی پاتوژن‌های ویروسی و باکتریایی استفاده شود و حدود 1٪ از ccfDNA موجود در پلاسمای انسان منشأ خارجی دارد [19]. این مطالعات نشان می‌دهند که تنوع زیستی میکروبیوم در گردش یک موجود زنده را می‌توان با استفاده از تجزیه و تحلیل ccfDNA ارزیابی کرد. با این حال، تا همین اواخر، این مفهوم منحصراً در انسان و به میزان کمتری در سایر مهره‌داران مورد استفاده قرار می‌گرفت [20، 21].
در مقاله حاضر، ما از پتانسیل LB برای تجزیه و تحلیل ccfDNA آئولاکومیا آترا، گونه‌ای جنوبی که معمولاً در جزایر کرگولن زیرجنوبگان، گروهی از جزایر در بالای یک فلات بزرگ که ۳۵ میلیون سال پیش تشکیل شده است، یافت می‌شود، استفاده می‌کنیم. فوران آتشفشانی. با استفاده از یک سیستم آزمایشگاهی آزمایشگاهی، دریافتیم که قطعات DNA در آب دریا به سرعت توسط صدف‌ها جذب شده و وارد محفظه همولنف می‌شوند. توالی‌یابی تفنگ ساچمه‌ای نشان داده است که ccfDNA همولنف صدف حاوی قطعات DNA با منشأ خود و غیر خود، از جمله باکتری‌های همزیست و قطعات DNA از بیوم‌های معمول اکوسیستم‌های ساحلی دریایی آتشفشانی سرد است. ccfDNA همولنف همچنین حاوی توالی‌های ویروسی مشتق شده از ویروس‌هایی با دامنه میزبان‌های مختلف است. ما همچنین قطعات DNA از حیوانات چند سلولی مانند ماهی‌های استخوانی، شقایق‌های دریایی، جلبک‌ها و حشرات را یافتیم. در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مفهوم LB را می‌توان با موفقیت در مورد بی‌مهرگان دریایی به کار برد تا یک مجموعه ژنومی غنی در اکوسیستم‌های دریایی ایجاد کند.
صدف‌های بالغ (با طول ۵۵ تا ۷۰ میلی‌متر) Mytilus platensis (M. platensis) و Aulacomya atra (A. atra) از سواحل صخره‌ای بین جزر و مدی پورتو-فرانس (۰۴۹°۲۱.۲۳۵ جنوبی، ۰۷۰°۱۳.۴۹۰ شرقی) در دسامبر ۲۰۱۸ جمع‌آوری شدند. سایر صدف‌های آبی بالغ (Mytilus spp.) از یک تأمین‌کننده تجاری (PEI Mussel King Inc.، جزیره پرنس ادوارد، کانادا) تهیه و در یک مخزن هوادهی شده با دمای کنترل‌شده (۴ درجه سانتیگراد) حاوی ۱۰ تا ۲۰ لیتر آب نمک مصنوعی ۳۲ درصد (نمک دریایی مصنوعی Reef Crystal، Instant Ocean، ویرجینیا، ایالات متحده آمریکا) قرار داده شدند. برای هر آزمایش، طول و وزن صدف‌های جداگانه اندازه‌گیری شد.
یک پروتکل دسترسی آزاد رایگان برای این برنامه به صورت آنلاین در دسترس است (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). به طور خلاصه، همولنف LB از عضلات دورکننده همانطور که شرح داده شد [22] جمع‌آوری شد. همولنف با سانتریفیوژ در سرعت 1200×g به مدت 3 دقیقه شفاف‌سازی شد، مایع رویی تا زمان استفاده (-20 درجه سانتیگراد) منجمد شد. برای جداسازی و خالص‌سازی cfDNA، نمونه‌ها (1.5-2.0 میلی‌لیتر) با استفاده از کیت cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel، Bethlehen، PA) طبق دستورالعمل سازنده، ذوب و پردازش شدند. ccfDNA تا زمان تجزیه و تحلیل بیشتر در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. در برخی آزمایش‌ها، ccfDNA با استفاده از کیت QIAamp DNA Investigator (QIAGEN، تورنتو، انتاریو، کانادا) جداسازی و خالص‌سازی شد. DNA خالص‌سازی شده با استفاده از روش استاندارد PicoGreen تعیین مقدار شد. توزیع قطعات ccfDNA جدا شده با استفاده از الکتروفورز مویین با استفاده از یک آنالیزور زیستی Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc.، سانتا کلارا، کالیفرنیا) و با استفاده از کیت DNA با حساسیت بالا مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. این سنجش با استفاده از 1 میکرولیتر از نمونه ccfDNA طبق دستورالعمل سازنده انجام شد.
برای توالی‌یابی قطعات ccfDNA همولنف، Génome Québec (مونترال، کبک، کانادا) کتابخانه‌های shotgun را با استفاده از کیت Illumina DNA Mix کیت Illumina MiSeq PE75 تهیه کرد. از یک آداپتور استاندارد (BioO) استفاده شد. فایل‌های داده خام از بایگانی توالی‌های خوانده شده NCBI (SRR8924808 و SRR8924809) در دسترس هستند. کیفیت خواندن اولیه با استفاده از FastQC [23] ارزیابی شد. از Trimmomatic [24] برای آداپتورهای برش و خواندن‌های با کیفیت پایین استفاده شده است. خواندن‌های shotgun با انتهای جفت شده به صورت FLASH در خواندن‌های تکی طولانی‌تر با حداقل همپوشانی 20 جفت باز ادغام شدند تا از عدم تطابق جلوگیری شود [25]. خوانش‌های ادغام‌شده با استفاده از پایگاه داده طبقه‌بندی NCBI دوکفه‌ای (مقدار e < 1e−3 و 90٪ همولوژی) با BLASTN حاشیه‌نویسی شدند و پوشش توالی‌های با پیچیدگی کم با استفاده از DUST [26] انجام شد. خوانش‌های ادغام‌شده با استفاده از پایگاه داده طبقه‌بندی NCBI دوکفه‌ای (مقدار e < 1e−3 و 90٪ همولوژی) با BLASTN حاشیه‌نویسی شدند و پوشش توالی‌های با پیچیدگی کم با استفاده از DUST [26] انجام شد. BLASTN با کمک BLASTN با استفاده از تاکسونومی двустворчатых моллюсков NCBI (معنای e < 1e-3 و 90% گوмологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено со использованием DUST [26]. داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از پایگاه داده طبقه‌بندی دوکفه‌ای NCBI با BLASTN حاشیه‌نویسی شدند (مقدار e < 1e-3 و 90٪ همولوژی) و پوشش توالی با پیچیدگی کم با استفاده از DUST [26] انجام شد.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数ST进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 并 读数 [6]进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы со помош BLASTN با استفاده از تاکسونومیcheskoy базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (منظور e <1e-3 و 90% GOMOLOGIE)، یک ماскирование последовательностей низкой сложности было выполнено со использованием DUST [26]. داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از پایگاه داده طبقه‌بندی دوکفه‌ای NCBI (مقدار e <1e-3 و 90٪ همولوژی) با BLASTN حاشیه‌نویسی شدند و پوشش توالی با پیچیدگی کم با استفاده از DUST [26] انجام شد.خوانش‌ها به دو گروه تقسیم شدند: مرتبط با توالی‌های دوکفه‌ای (که در اینجا خودخوان نامیده می‌شوند) و نامرتبط (غیر خودخوان). دو گروه به طور جداگانه با استفاده از MEGAHIT برای تولید کانتیگ‌ها [27] گردآوری شدند. در همین حال، توزیع طبقه‌بندی خوانش‌های میکروبیوم بیگانه با استفاده از Kraken2 [28] طبقه‌بندی و به صورت گرافیکی توسط نمودار دایره‌ای Krona در Galaxy [29، 30] نمایش داده شد. کیلومترهای بهینه از آزمایش‌های اولیه ما، کیلومترهای-59 تعیین شدند. سپس توالی‌های خودی با هم‌ترازی با BLASTN (پایگاه داده NCBI دوکفه‌ای، مقدار e < 1e−10 و 60٪ همولوژی) برای حاشیه‌نویسی نهایی شناسایی شدند. سپس توالی‌های خودی با هم‌ترازی با BLASTN (پایگاه داده NCBI دوکفه‌ای، مقدار e < 1e−10 و 60٪ همولوژی) برای حاشیه‌نویسی نهایی شناسایی شدند. Затем собственные contigi были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (بر اساس داده های ایجاد شده توسط NCBI، معنی e <1e-10 و گومولوژی 60٪ برای ناهنجاری های ناخوشایند. سپس با تطبیق با BLASTN (پایگاه داده دوکفه‌ای NCBI، مقدار e <1e-10 و 60٪ همولوژی) برای حاشیه‌نویسی نهایی، خود-هم‌سانی‌ها شناسایی شدند.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% با توجه به علائم ناخوشایند BLASTN (بر اساس داده های NCBI dlya) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 و gromologiя 60%). سپس توالی‌های خودهمسان برای حاشیه‌نویسی نهایی با تطبیق با BLASTN (پایگاه داده دوکفه‌ای NCBI، مقدار e <1e-10 و 60٪ همولوژی) شناسایی شدند. به طور موازی، کانتیگ‌های گروه‌های غیرخودی با BLASTN (پایگاه داده NCBI، مقدار e < 1e−10 و 60٪ همولوژی) حاشیه‌نویسی شدند. به طور موازی، کانتیگ‌های گروه‌های غیرخودی با BLASTN (پایگاه داده NCBI، مقدار e < 1e−10 و 60٪ همولوژی) حاشیه‌نویسی شدند. همسانی گروه‌های قارچی ناشناخته با کمک BLASTN (بر اساس داده‌های nt NCBI، معنی e <1e-10 و ژومولوژی 60%). به طور موازی، کانتیگ‌های گروه‌های خارجی با BLASTN (پایگاه داده NT NCBI، مقدار e <1e-10 و 60٪ همولوژی) حاشیه‌نویسی شدند.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 تا 60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 تا 60% 同源性）注释非自身组重叠 همسانی در گروه اجتماعی، غیر قابل تشخیص با کمک BLASTN (بر اساس داده های nt NCBI، معنی e <1e-10 و عضلانی 60%). به طور موازی، کانتیگ‌های غیر خودی با BLASTN (پایگاه داده nt NCBI، مقدار e <1e-10 و 60٪ همولوژی) حاشیه‌نویسی شدند. BLASTX همچنین با استفاده از پایگاه‌های داده پروتئین nr و RefSeq در NCBI (مقدار e < 1e−10 و 60٪ همولوژی) روی کانتیگ‌های غیرخودی انجام شد. BLASTX همچنین با استفاده از پایگاه‌های داده پروتئین nr و RefSeq در NCBI (مقدار e < 1e−10 و 60٪ همولوژی) روی کانتیگ‌های غیرخودی انجام شد. BLASTX также был проведен на несамостоятельных contigah با استفاده از belka nr و RefSeq NCBI (مقدار e <1e-10 و گومولوژی 60%). BLASTX همچنین روی کانتیگ‌های غیرخودی با استفاده از پایگاه‌های داده پروتئین nr و RefSeq NCBI انجام شد (مقدار e < 1e-10 و 60٪ همولوژی).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также کاملاً ناامیدکننده با استفاده از BLASTX با BLASTX NCBI و RefSeq NCBI (مقدار e <1e-10 و گومولوژی 60%). BLASTX همچنین روی کانتیگ‌های غیرخودی با استفاده از پایگاه‌های داده پروتئین nr و RefSeq NCBI انجام شد (مقدار e <1e-10 و 60٪ همولوژی).مجموعه‌های BLASTN و BLASTX از کانتیگ‌های غیرخودی، کانتیگ‌های نهایی را نشان می‌دهند (به فایل تکمیلی مراجعه کنید).
پرایمرهای مورد استفاده برای PCR در جدول S1 فهرست شده‌اند. از آنزیم Taq DNA پلیمراز (Bio Basic Canada, Markham, ON) برای تکثیر ژن‌های هدف ccfDNA استفاده شد. شرایط واکنش زیر مورد استفاده قرار گرفت: دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه، 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، تنظیم دمای اتصال به مدت 1 دقیقه، طویل‌سازی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، 35 سیکل و در نهایت 72 درجه سانتیگراد ظرف 10 دقیقه. محصولات PCR با الکتروفورز در ژل‌های آگارز (1.5٪) حاوی SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) در ولتاژ 95 ولت جدا شدند.
صدف‌ها (Mytilus spp.) به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد در 500 میلی‌لیتر آب دریای اکسیژن‌دار (32 PSU) سازگار شدند. DNA پلاسمید حاوی قطعه‌ای که توالی cDNA گالکتین-7 انسانی (شماره دسترسی NCBI L07769) را کدگذاری می‌کند، با غلظت نهایی 190 میکروگرم در میکرولیتر به ویال اضافه شد. صدف‌هایی که تحت شرایط مشابه و بدون افزودن DNA انکوبه شده بودند، به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. مخزن سوم کنترل حاوی DNA بدون صدف بود. برای نظارت بر کیفیت DNA در آب دریا، نمونه‌های آب دریا (20 میکرولیتر؛ سه تکرار) از هر مخزن در زمان مشخص شده گرفته شد. برای ردیابی DNA پلاسمید، صدف‌های LB در زمان‌های مشخص شده برداشت و توسط qPCR و ddPCR تجزیه و تحلیل شدند. با توجه به محتوای بالای نمک آب دریا، قبل از تمام سنجش‌های PCR، نمونه‌هایی از نمونه‌ها در آب با کیفیت PCR (1:10) رقیق شدند.
PCR قطره‌ای دیجیتال (ddPCR) با استفاده از پروتکل BioRad QX200 (میسی‌ساگا، انتاریو، کانادا) انجام شد. از پروفایل دما برای تعیین دمای بهینه استفاده کنید (جدول S1). قطرات با استفاده از یک مولد قطره QX200 (BioRad) تولید شدند. ddPCR به شرح زیر انجام شد: 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 50 چرخه 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و دمای اتصال مشخص به مدت 1 دقیقه و 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 4 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 90 درجه سانتیگراد در عرض 5 دقیقه. تعداد قطرات و واکنش‌های مثبت (تعداد کپی در میکرولیتر) با استفاده از یک دستگاه خوانش قطره QX200 (BioRad) اندازه‌گیری شد. نمونه‌هایی با کمتر از 10000 قطره رد شدند. هر بار که ddPCR اجرا می‌شد، کنترل الگو انجام نمی‌شد.
qPCR با استفاده از Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research، سیدنی، استرالیا) و آغازگرهای اختصاصی LGALS7 انجام شد. همه PCRهای کمی در 20 میکرولیتر با استفاده از کیت PCR QuantiFast SYBR Green (QIAGEN) انجام شد. qPCR با انکوباسیون 15 دقیقه‌ای در دمای 95 درجه سانتیگراد و به دنبال آن 40 سیکل در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 ثانیه و در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه با یک بار جمع‌آوری داده‌ها آغاز شد. منحنی‌های ذوب با استفاده از اندازه‌گیری‌های متوالی در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 ثانیه، 65 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه و 97 درجه سانتیگراد در پایان qPCR ایجاد شدند. هر qPCR به جز نمونه‌های کنترل، در سه تکرار انجام شد.
از آنجایی که صدف‌ها به دلیل سرعت بالای فیلتراسیون خود شناخته شده‌اند، ابتدا بررسی کردیم که آیا می‌توانند قطعات DNA موجود در آب دریا را فیلتر و حفظ کنند یا خیر. ما همچنین علاقه‌مند بودیم که آیا این قطعات در سیستم لنفاوی نیمه باز آنها تجمع می‌یابند یا خیر. ما این مسئله را به صورت تجربی با ردیابی سرنوشت قطعات DNA محلول اضافه شده به مخازن صدف آبی حل کردیم. برای تسهیل ردیابی قطعات DNA، از DNA پلاسمید خارجی (نه خودی) حاوی ژن گالکتین-7 انسانی استفاده کردیم. ddPCR قطعات DNA پلاسمید را در آب دریا و صدف ردیابی می‌کند. نتایج ما نشان می‌دهد که اگر مقدار قطعات DNA در آب دریا در غیاب صدف‌ها در طول زمان (تا 7 روز) نسبتاً ثابت بماند، در حضور صدف‌ها این سطح تقریباً به طور کامل ظرف 8 ساعت ناپدید می‌شود (شکل 1a، b). قطعات DNA اگزوژن به راحتی در عرض 15 دقیقه در مایع داخل دریچه‌ای و همولنف تشخیص داده شدند (شکل 1c). این قطعات هنوز هم تا 4 ساعت پس از قرار گرفتن در معرض قابل تشخیص بودند. این فعالیت فیلترینگ در رابطه با قطعات DNA با فعالیت فیلترینگ باکتری‌ها و جلبک‌ها قابل مقایسه است [31]. این نتایج نشان می‌دهد که صدف‌ها می‌توانند DNA خارجی را در محفظه‌های مایع خود فیلتر و جمع کنند.
غلظت‌های نسبی DNA پلاسمید در آب دریا در حضور (A) یا عدم حضور (B) صدف، که توسط ddPCR اندازه‌گیری شده است. در A، نتایج به صورت درصد بیان شده‌اند و حاشیه‌های کادرها نشان‌دهنده صدک‌های 75 و 25 هستند. منحنی لگاریتمی برازش شده با رنگ قرمز نشان داده شده است و ناحیه سایه‌دار خاکستری نشان‌دهنده فاصله اطمینان 95٪ است. در B، خط قرمز نشان‌دهنده میانگین و خط آبی نشان‌دهنده فاصله اطمینان 95٪ برای غلظت است. C تجمع DNA پلاسمید در همولنف و مایع دریچه‌ای صدف‌ها در زمان‌های مختلف پس از افزودن DNA پلاسمید. نتایج به صورت کپی‌های مطلق شناسایی شده در هر میلی‌لیتر (±SE) ارائه شده‌اند.
در مرحله بعد، ما منشأ ccfDNA را در صدف‌های جمع‌آوری‌شده از بسترهای صدف در جزایر کرگولن، گروهی دورافتاده از جزایر با نفوذ انسانی محدود، بررسی کردیم. برای این منظور، cccDNA از همولنف‌های صدف با روش‌هایی که معمولاً برای خالص‌سازی cccDNA انسانی استفاده می‌شود، جداسازی و خالص‌سازی شد [32، 33]. ما دریافتیم که غلظت متوسط ​​ccfDNA همولنف در صدف‌ها در محدوده کم میکروگرم در میلی‌لیتر همولنف است (به جدول S2، اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید). این محدوده غلظت بسیار بیشتر از افراد سالم است (نانوگرم کم در میلی‌لیتر)، اما در موارد نادر، در بیماران سرطانی، سطح ccfDNA می‌تواند به چندین میکروگرم در میلی‌لیتر برسد [34، 35]. تجزیه و تحلیل توزیع اندازه ccfDNA همولنف نشان داد که این قطعات از نظر اندازه بسیار متفاوت هستند و از 1000 جفت باز تا 1000 جفت باز و تا 5000 جفت باز متغیر هستند (شکل 2). نتایج مشابهی با استفاده از کیت تحقیقاتی QIAamp مبتنی بر سیلیکا، روشی که معمولاً در علوم پزشکی قانونی برای جداسازی و خالص‌سازی سریع DNA ژنومی از نمونه‌های DNA با غلظت کم، از جمله ccfDNA [36] استفاده می‌شود، به دست آمد.
الکتروفورگرام نماینده ccfDNA همولنف صدف. استخراج شده با کیت پلاسما NucleoSnap (بالا) و کیت محقق DNA QIAamp. نمودار ویولن B که توزیع غلظت ccfDNA همولنف (±SE) را در صدف‌ها نشان می‌دهد. خطوط سیاه و قرمز به ترتیب میانه و چارک‌های اول و سوم را نشان می‌دهند.
تقریباً 1٪ از ccfDNA در انسان و نخستی‌سانان منبع خارجی دارد [21، 37]. با توجه به سیستم گردش خون نیمه باز دوکفه‌ای‌ها، آب دریا غنی از میکروب و توزیع اندازه ccfDNA صدف، ما فرض کردیم که ccfDNA همولنف صدف ممکن است حاوی مجموعه‌ای غنی و متنوع از DNA میکروبی باشد. برای آزمایش این فرضیه، ما ccfDNA همولنف را از نمونه‌های Aulacomya atra جمع‌آوری‌شده از جزایر Kerguelen توالی‌یابی کردیم و بیش از 10 میلیون خوانش به دست آوردیم که 97.6٪ از آنها از کنترل کیفیت عبور کردند. سپس خوانش‌ها با استفاده از پایگاه‌های داده دوکفه‌ای BLASTN و NCBI بر اساس منابع خودی و غیر خودی طبقه‌بندی شدند (شکل S1، اطلاعات تکمیلی).
در انسان، هم DNA هسته‌ای و هم DNA میتوکندریایی می‌توانند به جریان خون آزاد شوند [38]. با این حال، در مطالعه حاضر، با توجه به اینکه ژنوم A. atra توالی‌یابی یا توصیف نشده است، توصیف دقیق DNA ژنومی هسته‌ای صدف‌ها امکان‌پذیر نبود. با این حال، ما توانستیم تعدادی از قطعات ccfDNA با منشأ خودمان را با استفاده از کتابخانه دوکفه‌ای‌ها شناسایی کنیم (شکل S2، اطلاعات تکمیلی). ما همچنین با تکثیر مستقیم PCR ژن‌های A. atra که توالی‌یابی شده بودند، وجود قطعات DNA با منشأ خودمان را تأیید کردیم (شکل 3). به طور مشابه، با توجه به اینکه ژنوم میتوکندری A. atra در پایگاه‌های داده عمومی موجود است، می‌توان شواهدی مبنی بر وجود قطعات ccfDNA میتوکندریایی در همولنف A. atra یافت. وجود قطعات DNA میتوکندریایی با تکثیر PCR تأیید شد (شکل 3).
ژن‌های مختلف میتوکندریایی در همولنف A. atra (نقاط قرمز - شماره استوک: SRX5705969) و M. platensis (نقاط آبی - شماره استوک: SRX5705968) که توسط PCR تکثیر شده بودند، وجود داشتند. شکل اقتباس شده از Breton و همکاران، 2011 B تکثیر مایع رویی همولنف از A. atra ذخیره شده روی کاغذ FTA. از یک پانچ 3 میلی‌متری برای اضافه کردن مستقیم به لوله PCR حاوی مخلوط PCR استفاده کنید.
با توجه به محتوای میکروبی فراوان در آب دریا، ما در ابتدا بر توصیف توالی‌های DNA میکروبی در همولنف تمرکز کردیم. برای انجام این کار، از دو استراتژی مختلف استفاده می‌کنیم. استراتژی اول از Kraken2، یک برنامه طبقه‌بندی توالی مبتنی بر الگوریتم که می‌تواند توالی‌های میکروبی را با دقتی قابل مقایسه با BLAST و سایر ابزارها شناسایی کند [28]، استفاده کرد. بیش از 6719 مورد خوانده شده منشأ باکتریایی داشتند، در حالی که 124 و 64 مورد به ترتیب از آرکی‌ها و ویروس‌ها بودند (شکل 4). فراوان‌ترین قطعات DNA باکتریایی Firmicutes (46٪)، Proteobacteria (27٪) و Bacteroidetes (17٪) بودند (شکل 4a). این توزیع با مطالعات قبلی میکروبیوم صدف آبی دریایی [39، 40] سازگار است. گاماپروتئوباکتریاها دسته اصلی پروتئوباکتریاها (44٪) بودند، از جمله بسیاری از Vibrionales (شکل 4b). روش ddPCR وجود قطعات DNA ویبریو را در ccfDNA همولنف A. atra تأیید کرد (شکل 4c) [41]. برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد منشأ باکتریایی ccfDNA، یک رویکرد اضافی اتخاذ شد (شکل S2، اطلاعات تکمیلی). در این مورد، خوانش‌هایی که همپوشانی داشتند به عنوان خوانش‌های جفت‌شده جمع‌آوری شدند و با استفاده از BLASTN و مقدار e برابر با 1e−3 و حد آستانه‌ای با بیش از 90٪ همولوژی، به عنوان خودی (دوکفه‌ای‌ها) یا غیرخودی طبقه‌بندی شدند. در این مورد، خوانش‌هایی که همپوشانی داشتند به عنوان خوانش‌های جفت‌شده جمع‌آوری شدند و با استفاده از BLASTN و مقدار e برابر با 1e−3 و حد آستانه‌ای با بیش از 90٪ همولوژی، به عنوان خودی (دوکفه‌ای‌ها) یا غیرخودی طبقه‌بندی شدند. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами و были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) یا чужие по происхождению со использованием BLASTN و значения e 1e-3 و отсечения со гомологией> 90%. در این مورد، خوانش‌های همپوشانی به عنوان خوانش‌های جفت‌شده جمع‌آوری شدند و با استفاده از BLASTN و مقدار e برابر با 1e-3 و حد آستانه با همولوژی >90% به عنوان بومی (دوکفه‌ای) یا غیراصلی طبقه‌بندی شدند.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒e >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使1-e3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。…… در этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами و классифицированы как собственные (двусчатые моллюски) یا несобственные по происхождению со использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. در این حالت، خوانش‌های همپوشانی به عنوان خوانش‌های جفت‌شده جمع‌آوری و با استفاده از مقادیر e BLASTN و 1e-3 و آستانه همولوژی >90% به عنوان خودی (دوکفه‌ای‌ها) یا غیر اصلی طبقه‌بندی شدند.از آنجایی که ژنوم A. atra هنوز توالی‌یابی نشده است، ما از استراتژی مونتاژ de novo در مونتاژکننده MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) استفاده کردیم. در مجموع 147188 کانتیگ به عنوان وابسته (دوکفه‌ای) با منشأ شناسایی شده‌اند. سپس این کانتیگ‌ها با استفاده از BLASTN و BLASTX با مقادیر e برابر با 1e-10 منفجر شدند. این استراتژی به ما امکان شناسایی 482 قطعه غیر دوکفه‌ای موجود در ccfDNA A. atra را داد. بیش از نیمی (57٪) از این قطعات DNA از باکتری‌ها، عمدتاً از همزیست‌های آبششی، از جمله همزیست‌های سولفوتروفیک، و از همزیست‌های آبششی Solemya velum به دست آمد (شکل 5).
فراوانی نسبی در سطح تیپ. ب. تنوع میکروبی دو شاخه اصلی (فیرمیکوت‌ها و پروتئوباکتریا). تکثیر نماینده ddPCR ج. گونه‌های ویبریو. الف. قطعاتی از ژن 16S rRNA (آبی) در سه همولنف آترا.
در مجموع ۴۸۲ کانتیگ جمع‌آوری‌شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نمای کلی توزیع طبقه‌بندی حاشیه‌نویسی‌های کانتیگ متاژنومیک (پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها). B توزیع دقیق قطعات DNA باکتریایی شناسایی‌شده توسط BLASTN و BLASTX.
تجزیه و تحلیل Kraken2 همچنین نشان داد که ccfDNA صدف حاوی قطعات DNA آرکی، از جمله قطعات DNA از Euryarchaeota (65٪)، Crenarchaeota (24٪) و Thaurmarcheota (11٪) است (شکل 6a). وجود قطعات DNA مشتق شده از Euryarchaeota و Crenarchaeota، که قبلاً در جامعه میکروبی صدف‌های کالیفرنیایی یافت شده بود، نباید تعجب‌آور باشد [42]. اگرچه Euryarchaeota اغلب با شرایط شدید مرتبط است، اکنون مشخص شده است که هم Euryarchaeota و هم Crenarcheota از رایج‌ترین پروکاریوت‌ها در محیط برودتی دریایی هستند [43، 44]. با توجه به گزارش‌های اخیر از نشت گسترده متان از نشت‌های کف در فلات کرگولن [45] و تولید احتمالی متان میکروبی مشاهده شده در سواحل جزایر کرگولن [46]، وجود میکروارگانیسم‌های متان‌ساز در صدف‌ها تعجب‌آور نیست.
سپس توجه ما به خوانش‌های ویروس‌های DNA معطوف شد. تا آنجا که ما می‌دانیم، این اولین مطالعه‌ی خارج از هدف در مورد محتوای ویروس صدف‌ها است. همانطور که انتظار می‌رفت، قطعات DNA باکتریوفاژها (Caudovirales) را پیدا کردیم (شکل 6b). با این حال، رایج‌ترین DNA ویروسی از شاخه‌ای از نوکلئوسیتوویروس‌ها، که به عنوان ویروس DNA بزرگ سیتوپلاسمی هسته‌ای (NCLDV) نیز شناخته می‌شود، می‌آید که بزرگترین ژنوم را در بین تمام ویروس‌ها دارد. در این شاخه، بیشتر توالی‌های DNA متعلق به خانواده‌های Mimimidoviridae (58٪) و Poxviridae (21٪) هستند که میزبان‌های طبیعی آنها شامل مهره‌داران و بندپایان هستند، در حالی که بخش کوچکی از این توالی‌های DNA متعلق به جلبک‌های ویروسی شناخته شده است. جلبک‌های یوکاریوتی دریایی را آلوده می‌کند. این توالی‌ها همچنین از ویروس پاندورا، ویروس غول‌پیکر با بزرگترین اندازه ژنوم در بین تمام جنس‌های ویروسی شناخته شده، به دست آمدند. جالب توجه است که طیف میزبان‌های آلوده به این ویروس، همانطور که توسط توالی‌یابی ccfDNA همولنف تعیین شده است، نسبتاً وسیع بود (شکل S3، اطلاعات تکمیلی). این طیف شامل ویروس‌هایی است که حشراتی مانند Baculoviridae و Iridoviridae را آلوده می‌کنند، و همچنین ویروس‌هایی که آمیب، جلبک و مهره‌داران را آلوده می‌کنند. ما همچنین توالی‌هایی را یافتیم که با ژنوم Pithovirus sibericum مطابقت دارند. Pitovirusها (که به عنوان "ویروس‌های زامبی" نیز شناخته می‌شوند) برای اولین بار از خاک منجمد 30000 ساله در سیبری جدا شدند [47]. بنابراین، نتایج ما با گزارش‌های قبلی سازگار است که نشان می‌دهد همه گونه‌های مدرن این ویروس‌ها منقرض نشده‌اند [48] و این ویروس‌ها ممکن است در اکوسیستم‌های دریایی دورافتاده زیر قطب شمال وجود داشته باشند.
در نهایت، ما آزمایش کردیم تا ببینیم آیا می‌توانیم قطعات DNA از سایر حیوانات چند سلولی را پیدا کنیم یا خیر. در مجموع 482 کانتیگ خارجی توسط BLASTN و BLASTX با کتابخانه‌های nt، nr و RefSeq (ژنومی و پروتئینی) شناسایی شدند. نتایج ما نشان می‌دهد که در میان قطعات خارجی ccfDNA حیوانات چند سلولی، DNA استخوان‌های استخوانی غالب است (شکل 5). قطعات DNA از حشرات و سایر گونه‌ها نیز یافت شده‌اند. بخش نسبتاً بزرگی از قطعات DNA شناسایی نشده‌اند، احتمالاً به دلیل کمبود تعداد زیادی از گونه‌های دریایی در پایگاه‌های داده ژنومی در مقایسه با گونه‌های زمینی [49].
در مقاله حاضر، ما مفهوم LB را برای صدف‌ها به کار می‌بریم و استدلال می‌کنیم که توالی‌یابی شات ccfDNA همولنف می‌تواند بینشی در مورد ترکیب اکوسیستم‌های ساحلی دریایی ارائه دهد. به طور خاص، ما دریافتیم که ۱) همولنف صدف حاوی غلظت‌های نسبتاً بالایی (سطح میکروگرم) از قطعات DNA در گردش نسبتاً بزرگ (حدود ۱-۵ کیلوبایت) است. ۲) این قطعات DNA هم مستقل و هم غیر مستقل هستند. ۳) در میان منابع خارجی این قطعات DNA، DNA باکتریایی، باستانی و ویروسی و همچنین DNA سایر حیوانات چند سلولی را یافتیم. ۴) تجمع این قطعات ccfDNA خارجی در همولنف به سرعت رخ می‌دهد و به فعالیت فیلتراسیون داخلی صدف‌ها کمک می‌کند. در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مفهوم LB، که تاکنون عمدتاً در زمینه زیست‌پزشکی به کار رفته است، منبع غنی اما ناشناخته‌ای از دانش را رمزگذاری می‌کند که می‌تواند برای درک بهتر تعامل بین گونه‌های نگهبان و محیط آنها مورد استفاده قرار گیرد.
علاوه بر نخستی‌سانان، جداسازی ccfDNA در پستانداران، از جمله موش‌ها، سگ‌ها، گربه‌ها و اسب‌ها گزارش شده است [50، 51، 52]. با این حال، تا آنجا که ما می‌دانیم، مطالعه ما اولین مطالعه‌ای است که تشخیص و تعیین توالی ccfDNA را در گونه‌های دریایی با سیستم گردش خون باز گزارش می‌دهد. این ویژگی آناتومیکی و توانایی فیلتر کردن صدف‌ها ممکن است حداقل تا حدی ویژگی‌های اندازه متفاوت قطعات DNA در گردش را در مقایسه با سایر گونه‌ها توضیح دهد. در انسان، بیشتر قطعات DNA در گردش خون، قطعات کوچکی با اندازه 150 تا 200 جفت باز هستند که حداکثر پیک آن 167 جفت باز است [34، 53]. بخش کوچک اما قابل توجهی از قطعات DNA اندازه‌ای بین 300 تا 500 جفت باز دارند و حدود 5٪ آنها از 900 جفت باز بلندتر هستند [54]. دلیل این توزیع اندازه این است که منبع اصلی ccfDNA در پلاسما در نتیجه مرگ سلولی، یا به دلیل مرگ سلولی یا به دلیل نکروز سلول‌های خون‌ساز در گردش در افراد سالم یا به دلیل آپوپتوز سلول‌های تومور در بیماران سرطانی (که به عنوان DNA تومور در گردش شناخته می‌شود) رخ می‌دهد. ctDNA). توزیع اندازه ccfDNA همولنف که در صدف‌ها یافتیم از 1000 تا 5000 جفت باز متغیر بود، که نشان می‌دهد ccfDNA صدف منشأ متفاوتی دارد. این یک فرضیه منطقی است، زیرا صدف‌ها دارای سیستم عروقی نیمه باز هستند و در محیط‌های آبی دریایی حاوی غلظت‌های بالای DNA ژنومی میکروبی زندگی می‌کنند. در واقع، آزمایش‌های آزمایشگاهی ما با استفاده از DNA برون‌زا نشان داده است که صدف‌ها قطعات DNA را در آب دریا جمع می‌کنند، حداقل پس از چند ساعت پس از جذب سلولی تجزیه می‌شوند و/یا آزاد می‌شوند و/یا در سازمان‌های مختلف ذخیره می‌شوند. با توجه به کمیابی سلول‌ها (اعم از پروکاریوتی و یوکاریوتی)، استفاده از محفظه‌های داخل دریچه‌ای، میزان ccfDNA را از منابع خودی و همچنین از منابع خارجی کاهش می‌دهد. با توجه به اهمیت ایمنی ذاتی دوکفه‌ای‌ها و تعداد زیاد فاگوسیت‌های در گردش، ما همچنین فرض کردیم که حتی ccfDNA خارجی در فاگوسیت‌های در گردش که DNA خارجی را پس از بلع میکروارگانیسم‌ها و/یا بقایای سلولی جمع می‌کنند، غنی شده است. در مجموع، نتایج ما نشان می‌دهد که ccfDNA همولنف دوکفه‌ای‌ها مخزن منحصر به فردی از اطلاعات مولکولی است و جایگاه آنها را به عنوان یک گونه نگهبان تقویت می‌کند.
داده‌های ما نشان می‌دهد که توالی‌یابی و تجزیه و تحلیل قطعات ccfDNA همولنف مشتق‌شده از باکتری می‌تواند اطلاعات کلیدی در مورد فلور باکتریایی میزبان و باکتری‌های موجود در اکوسیستم دریایی اطراف ارائه دهد. تکنیک‌های توالی‌یابی تصادفی، توالی‌هایی از باکتری‌های همزیست A. atra gill را نشان داده‌اند که در صورت استفاده از روش‌های مرسوم شناسایی 16S rRNA، تا حدی به دلیل سوگیری کتابخانه مرجع، از دست می‌رفتند. در واقع، استفاده ما از داده‌های LB جمع‌آوری‌شده از M. platensis در همان لایه صدف در کرگولن نشان داد که ترکیب همزیست‌های باکتریایی مرتبط با آبشش برای هر دو گونه صدف یکسان بود (شکل S4، اطلاعات تکمیلی). این شباهت دو صدف از نظر ژنتیکی متفاوت ممکن است منعکس‌کننده ترکیب جوامع باکتریایی در رسوبات سرد، گوگردی و آتشفشانی کرگولن باشد [55، 56، 57، 58]. سطوح بالاتر میکروارگانیسم‌های کاهنده گوگرد هنگام برداشت صدف از مناطق ساحلی دارای آشفتگی زیستی [59]، مانند سواحل پورتوفرانس، به خوبی توصیف شده‌اند. احتمال دیگر این است که فلور صدف همزیست ممکن است تحت تأثیر انتقال افقی قرار گیرد [60، 61]. تحقیقات بیشتری برای تعیین همبستگی بین محیط دریایی، سطح کف دریا و ترکیب باکتری‌های همزیست در صدف‌ها مورد نیاز است. این مطالعات در حال حاضر در حال انجام است.
طول و غلظت ccfDNA همولنف، سهولت خالص‌سازی آن و کیفیت بالا برای امکان توالی‌یابی سریع با تفنگ ساچمه‌ای، از جمله مزایای فراوان استفاده از ccfDNA صدف برای ارزیابی تنوع زیستی در اکوسیستم‌های ساحلی دریایی است. این رویکرد به ویژه برای توصیف جوامع ویروسی (ویروم‌ها) در یک اکوسیستم مشخص مؤثر است [62، 63]. برخلاف باکتری‌ها، آرکی‌ها و یوکاریوت‌ها، ژنوم‌های ویروسی حاوی ژن‌های فیلوژنتیکی حفاظت‌شده مانند توالی‌های 16S نیستند. نتایج ما نشان می‌دهد که می‌توان از بیوپسی‌های مایع از گونه‌های شاخص مانند صدف‌ها برای شناسایی تعداد نسبتاً زیادی از قطعات ویروس ccfDNA که به عنوان آلوده‌کننده میزبان‌هایی که معمولاً در اکوسیستم‌های دریایی ساحلی زندگی می‌کنند، شناخته شده‌اند، استفاده کرد. این شامل ویروس‌هایی است که به عنوان آلوده‌کننده تک‌یاخته‌ها، بندپایان، حشرات، گیاهان و ویروس‌های باکتریایی (مانند باکتریوفاژها) شناخته می‌شوند. توزیع مشابهی هنگام بررسی ویروم ccfDNA همولنف صدف‌های آبی (M. platensis) که در همان لایه صدف در کرگولن جمع‌آوری شده بود، مشاهده شد (جدول S2، اطلاعات تکمیلی). توالی‌یابی ccfDNA با تفنگ ساچمه‌ای در واقع رویکرد جدیدی است که در مطالعه ویروم انسان یا سایر گونه‌ها در حال پیشرفت است [21، 37، 64]. این رویکرد به ویژه برای مطالعه ویروس‌های DNA دو رشته‌ای مفید است، زیرا هیچ ژن واحدی در بین همه ویروس‌های DNA دو رشته‌ای حفظ نشده است که متنوع‌ترین و گسترده‌ترین طبقه ویروس‌ها را در بالتیمور نشان می‌دهد [65]. اگرچه بیشتر این ویروس‌ها طبقه‌بندی نشده باقی مانده‌اند و ممکن است شامل ویروس‌هایی از یک بخش کاملاً ناشناخته از دنیای ویروسی باشند [66]، ما دریافتیم که ویروم‌ها و دامنه میزبان صدف‌های A. atra و M. platensis بین این دو گونه قرار می‌گیرند. به طور مشابه (به شکل S3، اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید). این شباهت تعجب‌آور نیست، زیرا ممکن است نشان‌دهنده عدم گزینش‌پذیری در جذب DNA موجود در محیط باشد. در حال حاضر، مطالعات آینده با استفاده از RNA خالص‌شده برای توصیف ویروس RNA مورد نیاز است.
در مطالعه ما، ما از یک خط لوله بسیار دقیق اقتباس شده از کار کووارسکی و همکارانش [37] استفاده کردیم که از حذف دو مرحله‌ای خوانش‌ها و کانتیگ‌های جمع‌آوری‌شده قبل و بعد از مونتاژ ccfDNA بومی استفاده کردند و منجر به نسبت بالایی از خوانش‌های نقشه‌برداری نشده شدند. بنابراین، نمی‌توانیم این احتمال را رد کنیم که برخی از این خوانش‌های نقشه‌برداری نشده ممکن است هنوز منشأ خود را داشته باشند، در درجه اول به این دلیل که ما ژنوم مرجعی برای این گونه صدف نداریم. ما همچنین از این خط لوله استفاده کردیم زیرا نگران کایمراهای بین خوانش‌های خودی و غیر خودی و طول خوانش‌های تولید شده توسط Illumina MiSeq PE75 بودیم. دلیل دیگر برای اکثر خوانش‌های نقشه‌برداری نشده این است که بسیاری از میکروب‌های دریایی، به ویژه در مناطق دورافتاده‌ای مانند کرگولن، حاشیه‌نویسی نشده‌اند. ما از Illumina MiSeq PE75 استفاده کردیم، با فرض اینکه طول قطعات ccfDNA مشابه ccfDNA انسانی است. برای مطالعات آینده، با توجه به نتایج ما که نشان می‌دهد ccfDNA همولنف خوانش‌های طولانی‌تری نسبت به انسان‌ها و/یا پستانداران دارد، توصیه می‌کنیم از یک پلتفرم توالی‌یابی مناسب‌تر برای قطعات ccfDNA طولانی‌تر استفاده کنید. این روش، شناسایی نشانه‌های بیشتر برای تجزیه و تحلیل عمیق‌تر را بسیار آسان‌تر می‌کند. به دست آوردن توالی کامل ژنوم هسته‌ای A. atra که در حال حاضر در دسترس نیست، همچنین تمایز ccfDNA از منابع خودی و غیر خودی را تا حد زیادی تسهیل می‌کند. با توجه به اینکه تحقیقات ما بر امکان اعمال مفهوم بیوپسی مایع بر روی صدف‌ها متمرکز شده است، امیدواریم که با استفاده از این مفهوم در تحقیقات آینده، ابزارها و خطوط لوله جدیدی برای افزایش پتانسیل این روش برای مطالعه تنوع میکروبی صدف‌ها توسعه داده شود. اکوسیستم دریایی.
به عنوان یک نشانگر زیستی بالینی غیرتهاجمی، افزایش سطح ccfDNA در پلاسمای انسان با بیماری‌های مختلف، آسیب بافتی و شرایط استرس مرتبط است [67،68،69]. این افزایش با آزادسازی قطعات DNA با منشاء خود پس از آسیب بافتی مرتبط است. ما این موضوع را با استفاده از استرس گرمایی حاد بررسی کردیم، که در آن صدف‌ها به طور خلاصه در معرض دمای 30 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. ما این تجزیه و تحلیل را بر روی سه نوع مختلف صدف در سه آزمایش مستقل انجام دادیم. با این حال، هیچ تغییری در سطح ccfDNA پس از استرس گرمایی حاد مشاهده نکردیم (به شکل S5، اطلاعات بیشتر مراجعه کنید). این کشف ممکن است حداقل تا حدی این واقعیت را توضیح دهد که صدف‌ها دارای سیستم گردش خون نیمه باز هستند و به دلیل فعالیت فیلترینگ بالای خود، مقادیر زیادی DNA خارجی را جمع می‌کنند. از سوی دیگر، صدف‌ها، مانند بسیاری از بی‌مهرگان، ممکن است در برابر آسیب بافتی ناشی از استرس مقاوم‌تر باشند و در نتیجه آزادسازی ccfDNA را در همولنف خود محدود کنند [70، 71].
تا به امروز، تجزیه و تحلیل DNA از تنوع زیستی در اکوسیستم‌های آبی عمدتاً بر متابارکدگذاری DNA محیطی (eDNA) متمرکز بوده است. با این حال، این روش معمولاً در تجزیه و تحلیل تنوع زیستی هنگام استفاده از آغازگرها محدود است. استفاده از توالی‌یابی تفنگ ساچمه‌ای، محدودیت‌های PCR و انتخاب مغرضانه مجموعه‌های آغازگر را دور می‌زند. بنابراین، به یک معنا، روش ما به روش توالی‌یابی تفنگ ساچمه‌ای eDNA با توان عملیاتی بالا که اخیراً استفاده می‌شود، نزدیک‌تر است که قادر به توالی‌یابی مستقیم DNA قطعه قطعه شده و تجزیه و تحلیل تقریباً همه موجودات زنده است [72، 73]. با این حال، تعدادی از مسائل اساسی وجود دارد که LB را از روش‌های استاندارد eDNA متمایز می‌کند. البته، تفاوت اصلی بین eDNA و LB استفاده از میزبان‌های فیلتر طبیعی است. استفاده از گونه‌های دریایی مانند اسفنج‌ها و دوکفه‌ای‌ها (Dresseina spp.) به عنوان یک فیلتر طبیعی برای مطالعه eDNA گزارش شده است [74، 75]. با این حال، مطالعه دریسنا از بیوپسی‌های بافتی که DNA از آنها استخراج شده بود، استفاده کرد. تجزیه و تحلیل ccfDNA از LB نیازی به بیوپسی بافت، تجهیزات تخصصی و گاهی گران‌قیمت و لجستیک مرتبط با eDNA یا بیوپسی بافت ندارد. در واقع، ما اخیراً گزارش دادیم که ccfDNA از LB را می‌توان با پشتیبانی FTA و بدون حفظ زنجیره سرد ذخیره و تجزیه و تحلیل کرد، که این یک چالش بزرگ برای تحقیقات در مناطق دورافتاده است [76]. استخراج ccfDNA از بیوپسی‌های مایع نیز ساده است و DNA با کیفیت بالا را برای توالی‌یابی با تفنگ ساچمه‌ای و تجزیه و تحلیل PCR فراهم می‌کند. با توجه به برخی از محدودیت‌های فنی مرتبط با تجزیه و تحلیل eDNA [77]، این یک مزیت بزرگ است. سادگی و هزینه کم روش نمونه‌برداری نیز به ویژه برای برنامه‌های نظارت طولانی مدت مناسب است. علاوه بر توانایی بالای فیلتر کردن آنها، یکی دیگر از ویژگی‌های شناخته شده دوکفه‌ای‌ها، ترکیب شیمیایی موکوپلی‌ساکارید مخاط آنها است که جذب ویروس‌ها را افزایش می‌دهد [78، 79]. این امر دوکفه‌ای‌ها را به یک فیلتر طبیعی ایده‌آل برای توصیف تنوع زیستی و تأثیر تغییرات آب و هوایی در یک اکوسیستم آبی خاص تبدیل می‌کند. اگرچه وجود قطعات DNA مشتق شده از میزبان را می‌توان به عنوان محدودیتی برای این روش در مقایسه با eDNA در نظر گرفت، اما هزینه مرتبط با داشتن چنین ccfDNA بومی در مقایسه با eDNA به طور همزمان برای حجم عظیم اطلاعات موجود برای مطالعات سلامت قابل درک است. میزبان جایگزین. این شامل وجود توالی‌های ویروسی ادغام شده در ژنوم میزبان میزبان است. این امر به ویژه برای صدف‌ها، با توجه به وجود رتروویروس‌های لوسمی منتقل شده افقی در دوکفه‌ای‌ها، بسیار مهم است [80، 81]. یکی دیگر از مزایای LB نسبت به eDNA این است که از فعالیت فاگوسیتیک سلول‌های خونی در گردش در همولنف استفاده می‌کند، که میکروارگانیسم‌ها (و ژنوم‌های آنها) را در بر می‌گیرد. فاگوسیتوز عملکرد اصلی سلول‌های خونی در دوکفه‌ای‌ها است [82]. در نهایت، این روش از ظرفیت فیلتراسیون بالای صدف‌ها (به طور متوسط ​​1.5 لیتر در ساعت آب دریا) و گردش خون دو روزه بهره می‌برد که باعث افزایش اختلاط لایه‌های مختلف آب دریا می‌شود و امکان جذب eDNA هترولوگ را فراهم می‌کند. [83، 84]. بنابراین، تجزیه و تحلیل ccfDNA صدف با توجه به تأثیرات تغذیه‌ای، اقتصادی و زیست‌محیطی صدف‌ها، مسیری جالب است. مشابه تجزیه و تحلیل LB جمع‌آوری‌شده از انسان، این روش همچنین امکان اندازه‌گیری تغییرات ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی در DNA میزبان را در پاسخ به مواد خارجی فراهم می‌کند. به عنوان مثال، می‌توان پیش‌بینی کرد که فناوری‌های توالی‌یابی نسل سوم، تجزیه و تحلیل متیلاسیون در سطح ژنوم را در ccfDNA بومی با استفاده از توالی‌یابی نانوحفره انجام دهند. این فرآیند باید با این واقعیت تسهیل شود که طول قطعات ccfDNA صدف به طور ایده‌آل با پلتفرم‌های توالی‌یابی با خوانش طولانی سازگار است که امکان تجزیه و تحلیل متیلاسیون DNA در سطح ژنوم را از یک توالی‌یابی واحد بدون نیاز به تبدیل‌های شیمیایی فراهم می‌کند.85،86] این یک احتمال جالب است، زیرا نشان داده شده است که الگوهای متیلاسیون DNA منعکس‌کننده پاسخ به استرس محیطی هستند و در طول نسل‌های زیادی ادامه می‌یابند. بنابراین، می‌تواند بینش ارزشمندی در مورد مکانیسم‌های اساسی حاکم بر پاسخ پس از قرار گرفتن در معرض تغییرات آب و هوایی یا آلاینده‌ها ارائه دهد [87]. با این حال، استفاده از LB بدون محدودیت نیست. ناگفته نماند که این امر مستلزم وجود گونه‌های شاخص در اکوسیستم است. همانطور که در بالا ذکر شد، استفاده از LB برای ارزیابی تنوع زیستی یک اکوسیستم مشخص، به یک خط لوله بیوانفورماتیک دقیق نیز نیاز دارد که وجود قطعات DNA از منبع را در نظر بگیرد. مشکل عمده دیگر، دسترسی به ژنوم‌های مرجع برای گونه‌های دریایی است. امید است ابتکاراتی مانند پروژه ژنوم پستانداران دریایی و پروژه Fish10k که اخیراً تأسیس شده است [88]، چنین تحلیلی را در آینده تسهیل کند. کاربرد مفهوم LB برای موجودات فیلترکننده دریایی نیز با آخرین پیشرفت‌ها در فناوری توالی‌یابی سازگار است و آن را برای توسعه نشانگرهای زیستی چند اهمی جهت ارائه اطلاعات مهم در مورد سلامت زیستگاه‌های دریایی در پاسخ به استرس‌های محیطی، بسیار مناسب می‌سازد.
داده‌های توالی‌یابی ژنوم در بایگانی توالی‌های خوانده‌شده NCBI به آدرس https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 تحت عنوان Bioprojects SRR8924808 ذخیره شده است.
بریرلی ای. اس.، کینگزفورد ام. جی. تأثیر تغییرات اقلیمی بر حیات دریایی و اکوسیستم‌ها. کول بیولوژی. ۲۰۰۹؛ ۱۹: P۶۰۲–P۶۱۴.
گیسی ای، مانیا ای، مازاریس ای دی، فراشتی اس، آلمپانیدو وی، بویلاکوا اس و همکاران. اثرات ترکیبی تغییرات اقلیمی و سایر عوامل استرس‌زای محلی بر محیط زیست دریایی را در نظر بگیرید. محیط علمی عمومی. 2021؛ 755:142564.
Carella F، Antuofermo E، Farina S، Salati F، Mandas D، Prado P، و همکاران. ). علم اول اسفند. 2020؛ 7:48.
Seront L، Nicastro CR، Zardi GI، Goberville E. کاهش تحمل گرما در شرایط استرس گرمایی مکرر، مرگ و میر بالای تابستانی صدف‌های آبی را توضیح می‌دهد. گزارش علمی ۲۰۱۹؛ ۹:۱۷۴۹۸.
فی اس بی، سیپیلسکی ای ام، نوسله اس، سروانتس-یوشیدا کی، هوان جی ال، هوبر ای آر و همکاران. تغییرات اخیر در فراوانی، علل و میزان مرگ و میر حیوانات. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F، Sanna D، Azzena I، Mughetti D، Cerruti F، Hosseini S، و همکاران. چندین پاتوژن غیر خاص ممکن است باعث مرگ و میر دسته جمعی Pinna nobilis شده باشد. زندگی 2020؛ 10:238.
بردلی ام، کوتس اس‌جی، جنکینز ای، اوهارا تی‌ام. تأثیر بالقوه تغییرات اقلیمی بر بیماری‌های مشترک انسان و دام در قطب شمال. مجله بین‌المللی سلامت قطب شمال. ۲۰۰۵؛ ۶۴: ۴۶۸–۷۷.
Beyer J.، Greene NW، Brooks S.، Allan IJ، Ruus A.، Gomez T. و همکاران. صدف‌های آبی (Mytilus edulis spp.) به عنوان موجودات سیگنال‌دهنده در پایش آلودگی ساحلی: یک بررسی. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
سیراوگنا جی، مارسونی اس، سینا اس، باردلی ای. ادغام بیوپسی مایع در درمان سرطان. مجله نات رو کلینر انکول. 2017؛ 14:531–48.
وان جی سی ام، ماسی سی، گارسیا-کورباچو جی، مولیر اف، برنتون جی دی، کالداس سی و همکاران. بلوغ بیوپسی مایع: به DNA تومور اجازه گردش می‌دهد. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
مندل پی.، متیس پی. اسیدهای نوکلئیک در پلاسمای انسان. صورتجلسات شرکت‌های تابعه Soc Biol. 1948؛ 142:241-3.
Bronkhorst AJ، Ungerer W، Holdenrieder S. نقش جدید DNA بدون سلول به عنوان یک نشانگر مولکولی برای درمان سرطان. کمی سازی آنالیز بیومولار. 2019؛ 17:100087.
ایگناتیادیس ام.، اسلج جی. دبلیو.، جفری اس. اس. بیوپسی مایع وارد کلینیک می‌شود - مسائل مربوط به اجرا و چالش‌های آینده. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
لو وای.ام، کوربتا ان.، چمبرلین پی.اف، رای دبلیو.، سارجنت آی.ال.، ردمن سی.دبلیو و دیگران. دی.ان.ای جنین در پلاسما و سرم مادر وجود دارد. لنست. ۱۹۹۷؛ ۳۵۰:۴۸۵-۷.
موفاری ام‌ان، وانگ آرجی، شاو جی‌ام، استیونسون دی‌کی، کوئیک اس‌آر. مطالعه سیر بارداری و عوارض آن با استفاده از RNA خارج سلولی در گردش خون زنان در دوران بارداری. دوپدیاتریک. 2020؛ 8:605219.
اولریش ام، شروود کی، کیون پی، شوتز ای، بک جی، استگباوئر جی و همکاران. بیوپسی مایع: از DNA بدون سلول اهداکننده برای تشخیص ضایعات آلوژنیک در پیوند کلیه استفاده می‌شود. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
خوان اف سی، لو وای ام، نوآوری‌ها در تشخیص پیش از تولد: تعیین توالی ژنوم پلاسمای مادر. دکتر آنا. 2016؛ 67: 419-32.
گو دبلیو، دنگ ایکس، لی ام، سوکو وای دی، آروالو اس، استریک دی و همکاران. تشخیص سریع پاتوژن با توالی‌یابی متاژنومیک نسل بعدی مایعات بدن آلوده. نات مدیسین. 2021؛ 27: 115-24.