از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده میکنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه میکنیم از یک مرورگر بهروز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایلها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
باروری پرندگان به توانایی آنها در ذخیره اسپرم کافی و زنده برای مدت طولانی در لولههای ذخیره اسپرم (SST) بستگی دارد. مکانیسم دقیقی که اسپرمها از طریق آن وارد لولههای ذخیره اسپرم (SST) میشوند، در آن قرار میگیرند و از آن خارج میشوند، همچنان بحثبرانگیز است. اسپرم مرغهای شارکاسی تمایل زیادی به آگلوتیناسیون نشان داد و دستههای رشتهای متحرک حاوی سلولهای زیادی را تشکیل داد. به دلیل دشواری مشاهده تحرک و رفتار اسپرم در یک لوله فالوپ مات، ما از یک دستگاه میکروفلوئیدیک با سطح مقطع میکروکانال مشابه با اسپرم برای مطالعه آگلوتیناسیون و تحرک اسپرم استفاده کردیم. این مطالعه به بررسی چگونگی تشکیل دستههای اسپرم، نحوه حرکت آنها و نقش احتمالی آنها در افزایش مدت اقامت اسپرم در SST میپردازد. ما سرعت اسپرم و رفتار رئولوژیکی آن را هنگامی که جریان سیال در یک کانال میکروفلوئیدیک با فشار هیدرواستاتیک (سرعت جریان = 33 میکرومتر بر ثانیه) ایجاد میشود، بررسی کردیم. اسپرمها تمایل دارند در خلاف جهت جریان شنا کنند (رئولوژی مثبت) و سرعت دسته اسپرمها در مقایسه با اسپرمهای منفرد به طور قابل توجهی کاهش مییابد. مشاهده شده است که دستههای اسپرم به صورت مارپیچی حرکت میکنند و با جذب اسپرمهای منفرد بیشتر، طول و ضخامت آنها افزایش مییابد. مشاهده شد که دستههای اسپرم به دیوارههای جانبی کانالهای میکروفلوئیدیک نزدیک شده و به آنها میچسبند تا از جابجایی آنها با سرعت جریان سیال > 33 میکرومتر بر ثانیه جلوگیری شود. مشاهده شد که دستههای اسپرم به دیوارههای جانبی کانالهای میکروفلوئیدیک نزدیک شده و به آنها میچسبند تا از جابجایی آنها با سرعت جریان سیال > 33 میکرومتر بر ثانیه جلوگیری شود. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 mkm / с. مشاهده شده است که دستههای اسپرم در سرعتهای جریان سیال > 33 میکرومتر بر ثانیه به دیوارههای جانبی کانالهای میکروفلوئیدیک نزدیک شده و به آنها میچسبند تا از جدا شدن جلوگیری کنند.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33μm/s33 میکرومتر بر ثانیه 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 mkm/s. مشاهده شده است که دستههای اسپرم برای جلوگیری از جابجایی توسط جریان سیال با سرعت بیش از ۳۳ میکرومتر بر ثانیه، به دیوارههای جانبی کانال میکروفلوئیدیک نزدیک شده و به آنها میچسبند.میکروسکوپ الکترونی روبشی و عبوری نشان داد که دستههای اسپرم توسط مواد متراکم فراوان پشتیبانی میشوند. دادههای بهدستآمده، تحرک منحصربهفرد اسپرم مرغ شارکزی و همچنین توانایی اسپرم در تجمع و تشکیل دستههای متحرک را نشان میدهد که به درک بهتر ذخیرهسازی طولانیمدت اسپرم در SMT کمک میکند.
برای انجام لقاح در انسان و بیشتر حیوانات، اسپرم و تخمک باید در زمان مناسب به محل لقاح برسند. بنابراین، جفتگیری باید قبل یا در زمان تخمکگذاری انجام شود. از سوی دیگر، برخی از پستانداران، مانند سگها، و همچنین گونههای غیرپستاندار، مانند حشرات، ماهیها، خزندگان و پرندگان، اسپرم را برای مدت طولانی در اندامهای تولید مثلی خود ذخیره میکنند تا زمانی که تخمکهایشان برای لقاح آماده شوند (لقاح غیرهمزمان 1). پرندگان قادرند زنده ماندن اسپرمهایی را که قادر به بارور کردن تخمکها هستند، به مدت 2 تا 10 هفته حفظ کنند.
این یک ویژگی منحصر به فرد است که پرندگان را از سایر حیوانات متمایز میکند، زیرا احتمال بالایی از لقاح را پس از یک تلقیح منفرد برای چند هفته بدون جفتگیری و تخمکگذاری همزمان فراهم میکند. اندام اصلی ذخیره اسپرم، به نام لوله ذخیره اسپرم (SST)، در چینهای مخاطی داخلی در محل اتصال رحم و واژن قرار دارد. تا به امروز، مکانیسمهایی که اسپرم از طریق آنها وارد، ساکن و از بانک اسپرم خارج میشود، به طور کامل شناخته نشده است. بر اساس مطالعات قبلی، فرضیههای زیادی مطرح شده است، اما هیچ یک از آنها تأیید نشده است.
فورمن۴ این فرضیه را مطرح کرد که اسپرمها از طریق حرکت نوسانی مداوم در خلاف جهت جریان سیال از طریق کانالهای پروتئینی واقع در سلولهای اپیتلیال SST (رئولوژی) محل سکونت خود را در حفره SST حفظ میکنند. ATP به دلیل فعالیت مداوم تاژک مورد نیاز برای نگه داشتن اسپرم در مجرای SST کاهش مییابد و تحرک در نهایت کاهش مییابد تا زمانی که اسپرم توسط جریان سیال از بانک اسپرم خارج شود و سفر جدیدی را در لوله فالوپ صعودی برای لقاح اسپرم آغاز کند. تخم مرغ (فورمن۴). این مدل از ذخیرهسازی اسپرم با تشخیص ایمونوسیتوشیمی آکواپورینهای ۲، ۳ و ۹ موجود در سلولهای اپیتلیال SST توسط ایمونوسیتوشیمی پشتیبانی میشود. تا به امروز، مطالعاتی در مورد رئولوژی مایع منی مرغ و نقش آن در ذخیرهسازی SST، انتخاب اسپرم واژن و رقابت اسپرم وجود ندارد. در مرغها، اسپرم پس از جفتگیری طبیعی وارد واژن میشود، اما بیش از ۸۰٪ اسپرمها اندکی پس از جفتگیری از واژن خارج میشوند. این نشان میدهد که واژن محل اصلی انتخاب اسپرم در پرندگان است. علاوه بر این، گزارش شده است که کمتر از 1٪ از اسپرمهای لقاحیافته در واژن به SST2 تبدیل میشوند. در تلقیح مصنوعی جوجهها در واژن، تعداد اسپرمهایی که به SST میرسند، 24 ساعت پس از تلقیح افزایش مییابد. تاکنون، مکانیسم انتخاب اسپرم در طول این فرآیند مشخص نیست و تحرک اسپرم ممکن است نقش مهمی در جذب اسپرم SST داشته باشد. به دلیل دیوارههای ضخیم و مات لولههای فالوپ، نظارت مستقیم بر تحرک اسپرم در لولههای فالوپ پرندگان دشوار است. بنابراین، ما فاقد دانش اولیه در مورد چگونگی گذار اسپرم به SST پس از لقاح هستیم.
رئولوژی اخیراً به عنوان یک عامل مهم کنترل کننده انتقال اسپرم در دستگاه تناسلی پستانداران شناخته شده است. بر اساس توانایی اسپرمهای متحرک در مهاجرت خلاف جهت، زعفرانی و همکارانش از یک سیستم میکروفلوئیدیک corra برای جداسازی غیرفعال اسپرمهای متحرک از نمونههای منی نگهداری شده استفاده کردند. این نوع جداسازی منی برای درمان ناباروری پزشکی و تحقیقات بالینی ضروری است و نسبت به روشهای سنتی که زمان و نیروی کار زیادی دارند و میتوانند مورفولوژی و یکپارچگی ساختاری اسپرم را به خطر بیندازند، ترجیح داده میشود. با این حال، تا به امروز، هیچ مطالعهای در مورد تأثیر ترشحات اندامهای تناسلی مرغ بر تحرک اسپرم انجام نشده است.
صرف نظر از مکانیسمی که اسپرم ذخیره شده در SST را حفظ میکند، بسیاری از محققان مشاهده کردهاند که اسپرمهای ساکن در SST مرغهای ۹، ۱۰، بلدرچینهای ۲ و بوقلمونهای ۱۱ به صورت سر به سر به هم چسبیده و دستههای اسپرم آگلوتینه شده را تشکیل میدهند. نویسندگان معتقدند که بین این آگلوتیناسیون و ذخیره طولانی مدت اسپرم در SST ارتباطی وجود دارد.
تینگاری و لیک12 ارتباط قوی بین اسپرمها در غده گیرنده اسپرم مرغ را گزارش کردند و این سوال را مطرح کردند که آیا اسپرمهای پرندگان به همان روشی که اسپرمهای پستانداران آگلوتینه میشوند، آگلوتینه میشوند یا خیر. آنها معتقدند که اتصالات عمیق بین اسپرمها در مجرای دفران ممکن است به دلیل استرس ناشی از وجود تعداد زیادی اسپرم در یک فضای کوچک باشد.
هنگام ارزیابی رفتار اسپرمها روی اسلایدهای شیشهای تازه آویزان، نشانههای گذرای آگلوتیناسیون، به ویژه در لبههای قطرات منی، قابل مشاهده است. با این حال، آگلوتیناسیون اغلب به دلیل عمل چرخشی مرتبط با حرکت مداوم مختل میشد، که ماهیت گذرای این پدیده را توضیح میدهد. محققان همچنین متوجه شدند که وقتی رقیقکننده به منی اضافه شد، تجمعات سلولی "نخ مانند" کشیدهای ظاهر شدند.
تلاشهای اولیه برای تقلید از اسپرماتوزون با حذف یک سیم نازک از یک قطره آویزان انجام شد که منجر به یک وزیکول کشیده اسپرم مانند شد که از قطره منی بیرون زده بود. اسپرمها بلافاصله به صورت موازی در داخل وزیکول قرار گرفتند، اما کل واحد به دلیل محدودیت سهبعدی به سرعت ناپدید شد. بنابراین، برای مطالعه آگلوتیناسیون اسپرم، لازم است تحرک و رفتار اسپرمها مستقیماً در لولههای ذخیره اسپرم جدا شده مشاهده شود، که دستیابی به آن دشوار است. بنابراین، لازم است ابزاری ساخته شود که اسپرمها را تقلید کند تا از مطالعات تحرک و رفتار آگلوتیناسیون اسپرم پشتیبانی کند. بریلارد و همکارانش13 گزارش دادند که طول متوسط لولههای ذخیره اسپرم در جوجههای بالغ 400 تا 600 میکرومتر است، اما برخی از SSTها میتوانند تا 2000 میکرومتر نیز برسند. مرو و اوگاساوارا14 غدد اسپرمساز را به لولههای ذخیره اسپرم بزرگشده و بزرگنشده تقسیم کردند که هر دو از نظر طول (حدود 500 میکرومتر) و عرض گردن (حدود 38 میکرومتر) یکسان بودند، اما میانگین قطر لومن لولهها 56.6 و 56.6 میکرومتر بود که به ترتیب 11.2 میکرومتر است. در مطالعه حاضر، ما از یک دستگاه میکروفلوئیدیک با اندازه کانال 200 میکرومتر × 20 میکرومتر (عرض × ارتفاع) استفاده کردیم که سطح مقطع آن تا حدودی نزدیک به سطح مقطع SST تقویتشده است. علاوه بر این، ما تحرک اسپرم و رفتار آگلوتیناسیون را در مایع در حال جریان بررسی کردیم که با فرضیه فورمن مبنی بر اینکه مایع تولید شده توسط سلولهای اپیتلیال SST، اسپرم را در لومن در جهت مخالف (رئولوژیکی) نگه میدارد، سازگار است.
هدف از این مطالعه، غلبه بر مشکلات مشاهده حرکت اسپرم در لوله فالوپ و اجتناب از دشواریهای مطالعه رئولوژی و رفتار اسپرم در یک محیط پویا بود. از یک دستگاه میکروفلوئیدیک استفاده شد که فشار هیدرواستاتیک ایجاد میکند تا حرکت اسپرم را در اندام تناسلی مرغ شبیهسازی کند.
وقتی قطرهای از نمونه اسپرم رقیقشده (۱:۴۰) در دستگاه میکروکانال قرار داده شد، دو نوع حرکت اسپرم قابل شناسایی بود (اسپرم ایزوله و اسپرم متصل). علاوه بر این، اسپرمها تمایل داشتند در خلاف جهت جریان شنا کنند (رئولوژی مثبت؛ ویدئو ۱، ۲). اگرچه دستههای اسپرم سرعت کمتری نسبت به اسپرمهای تنها داشتند (p < 0.001)، اما درصد اسپرمهایی که رئوتاکسی مثبت نشان میدادند را افزایش دادند (p < 0.001؛ جدول 2). اگرچه دستههای اسپرم سرعت کمتری نسبت به اسپرمهای تنها داشتند (p < 0.001)، اما درصد اسپرمهایی که رئوتاکسی مثبت نشان میدادند را افزایش دادند (p < 0.001؛ جدول 2). Хотя пучки اسپرماتوزوئیدهای نامیده شده اند، به زودی، در صورتی که اسپرماتوزوئیدها از بین بروند (p < 0,001)، демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; tabлица 2). اگرچه دستههای اسپرم سرعت کمتری نسبت به اسپرمهای منفرد داشتند (0.001>p)، اما درصد اسپرمهایی که رئوتاکسی مثبت نشان میدادند را افزایش دادند (0.001>p؛ جدول 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p <0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示百分比 (p <0.001 ； 2 .. . . . . . ) Сперматозоидов положительной реологией (p < 0,001؛ tab. 2). اگرچه سرعت دستههای اسپرم کمتر از اسپرمهای تکی بود (0.001>p)، اما درصد اسپرمهای با رئولوژی مثبت را افزایش دادند (0.001>p؛ جدول 2).رئولوژی مثبت برای اسپرمهای تکی و تافتها به ترتیب تقریباً ۵۳٪ و ۸۵٪ تخمین زده میشود.
مشاهده شده است که اسپرم مرغهای شارکاسی بلافاصله پس از انزال، دستههای خطی تشکیل میدهند که شامل دهها عدد اسپرم است. این دستهها با گذشت زمان از نظر طول و ضخامت افزایش مییابند و ممکن است قبل از پراکنده شدن، چندین ساعت در شرایط آزمایشگاهی باقی بمانند (فیلم 3). این دستههای رشتهای شبیه اسپرمهای اکیدنا هستند که در انتهای اپیدیدیم تشکیل میشوند. مشخص شده است که منی مرغ شارکاسی تمایل زیادی به تجمع و تشکیل یک دسته مشبک در کمتر از یک دقیقه پس از جمعآوری دارد. این پرتوها پویا هستند و قادر به چسبیدن به هر دیواره یا اشیاء ساکن مجاور هستند. اگرچه دستههای اسپرم سرعت سلولهای اسپرم را کاهش میدهند، اما واضح است که از نظر ماکروسکوپی، خطی بودن آنها را افزایش میدهند. طول دستهها بسته به تعداد اسپرمهای جمعآوری شده در دستهها متفاوت است. دو قسمت از دسته جدا شد: قسمت اولیه، شامل سر آزاد اسپرم تجمع یافته، و قسمت انتهایی، شامل دم و کل انتهای دیستال اسپرم. با استفاده از یک دوربین پرسرعت (950 فریم در ثانیه)، سرهای آزاد اسپرمهای آگلوتینه شده در قسمت ابتدایی دسته مشاهده شدند که به دلیل حرکت نوسانی خود مسئول حرکت دسته هستند و بقیه اسپرمها را با حرکتی مارپیچی به داخل دسته میکشند (ویدئو 4). با این حال، در دستههای بلند، مشاهده شده است که برخی از سرهای آزاد اسپرم به بدنه چسبیدهاند و قسمت انتهایی دسته به عنوان پرههایی برای کمک به حرکت دسته عمل میکنند.
در حالی که در جریان آهسته سیال، دستههای اسپرم به موازات یکدیگر حرکت میکنند، با این حال، آنها شروع به همپوشانی میکنند و به هر چیزی که ساکن است میچسبند تا با افزایش سرعت جریان توسط جریان جاری شسته نشوند. دستهها زمانی تشکیل میشوند که تعداد انگشتشماری از سلولهای اسپرم به یکدیگر نزدیک میشوند، آنها شروع به حرکت همزمان میکنند و به دور یکدیگر میپیچند و سپس به یک ماده چسبنده میچسبند. شکلهای ۱ و ۲ نشان میدهند که چگونه اسپرمها به یکدیگر نزدیک میشوند و با پیچیدن دمها به دور یکدیگر، یک اتصال تشکیل میدهند.
محققان برای مطالعه رئولوژی اسپرم، از فشار هیدرواستاتیک برای ایجاد جریان سیال در یک میکروکانال استفاده کردند. یک میکروکانال با اندازه 200 میکرومتر × 20 میکرومتر (عرض × ارتفاع) و طول 3.6 میکرومتر استفاده شد. از میکروکانالهایی بین ظروف استفاده شد که سرنگهایی در انتهای آنها تعبیه شده بود. برای قابل مشاهدهتر شدن کانالها از رنگ خوراکی استفاده شد.
کابلهای اتصال و لوازم جانبی را به دیوار ببندید. این ویدئو با میکروسکوپ فاز کنتراست گرفته شده است. با هر تصویر، تصاویر میکروسکوپ فاز کنتراست و نقشهبرداری ارائه میشوند. (الف) اتصال بین دو جریان به دلیل حرکت مارپیچی در برابر جریان مقاومت میکند (فلش قرمز). (ب) اتصال بین دسته لوله و دیواره کانال (فلشهای قرمز)، همزمان آنها به دو دسته دیگر متصل هستند (فلشهای زرد). (ج) دستههای اسپرم در کانال میکروفلوئیدیک شروع به اتصال به یکدیگر میکنند (فلشهای قرمز) و شبکهای از دستههای اسپرم را تشکیل میدهند. (د) تشکیل شبکهای از دستههای اسپرم.
وقتی قطرهای از اسپرم رقیقشده در دستگاه میکروفلوئیدیک قرار داده شد و جریانی ایجاد شد، مشاهده شد که پرتو اسپرم در خلاف جهت جریان حرکت میکند. دستهها به دیوارههای میکروکانالها محکم چسبیدهاند و سرهای آزاد در قسمت اولیه دستهها به آنها محکم چسبیدهاند (فیلم ۵). آنها همچنین به هر ذره ثابتی در مسیر خود، مانند زبالهها، میچسبند تا در برابر جریان مقاومت کنند. با گذشت زمان، این دستهها به رشتههای بلندی تبدیل میشوند که اسپرمهای منفرد دیگر و دستههای کوتاهتر را به دام میاندازند (فیلم ۶). با شروع کند شدن جریان، صفهای طولانی اسپرم شروع به تشکیل شبکهای از خطوط اسپرم میکنند (فیلم ۷؛ شکل ۲).
در سرعت جریان بالا (ولتاژ > 33 میکرومتر بر ثانیه)، حرکات مارپیچی رشتهها افزایش مییابد تا تعداد زیادی از دستههای اسپرم تشکیلدهنده، بهتر بتوانند در برابر نیروی رانش جریان مقاومت کنند. در سرعت جریان بالا (ولتاژ > 33 میکرومتر بر ثانیه)، حرکات مارپیچی رشتهها افزایش مییابد تا تعداد زیادی از دستههای اسپرم تشکیلدهنده، بهتر بتوانند در برابر نیروی رانش جریان مقاومت کنند. При высокой скорости потока (V > 33 mkm/s) спиралевидные движения нитей усиливаются spermatozoidov, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. در نرخهای جریان بالا (ولتاژ > 33 میکرومتر بر ثانیه)، حرکات مارپیچی رشتهها افزایش مییابد زیرا آنها سعی میکنند بسیاری از اسپرمهای منفرد را به دام بیندازند و دستههایی تشکیل دهند که قادر به مقاومت بهتر در برابر نیروی رانش جریان هستند.在高流速(V > 33 میکرومتر بر ثانیه)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 میکرومتر بر ثانیه)从而 更 地 抵抗 的 漂移力 .. . . . . . При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных spermatozoidov, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. در نرخهای جریان بالا (ولتاژ > 33 میکرومتر بر ثانیه)، حرکت مارپیچی رشتهها افزایش مییابد تا اسپرمهای منفرد زیادی را به دام بیندازد و دستههایی تشکیل دهد که مقاومت بهتری در برابر نیروهای رانش جریان داشته باشند.آنها همچنین سعی کردند میکروکانالها را به دیوارههای جانبی متصل کنند.
دستههای اسپرم با استفاده از میکروسکوپ نوری (LM) به صورت خوشههایی از سر اسپرم و دمهای پیچخورده شناسایی شدند. دستههای اسپرم با تجمعات مختلف نیز به صورت سرهای پیچخورده و تجمعات تاژکدار، دمهای اسپرم متصل به هم، سرهای اسپرم متصل به یک دم و سرهای اسپرم با هستههای خمیده به صورت هستههای متصل به هم شناسایی شدهاند. میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM). میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) نشان داد که دستههای اسپرم، تجمعات غلافدار سر اسپرم هستند و تجمعات اسپرم، شبکهای متصل از دمهای پیچیده شده را نشان میدهند.
مورفولوژی و فراساختار اسپرمها، تشکیل دستههای اسپرم با استفاده از میکروسکوپ نوری (نیم برش)، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) مورد مطالعه قرار گرفت، اسمیر اسپرم با آکریدین اورنج رنگآمیزی و با استفاده از میکروسکوپ اپیفلورسانس بررسی شد.
رنگآمیزی اسمیر اسپرم با آکریدین اورنج (شکل 3B) نشان داد که سر اسپرمها به هم چسبیده و با مواد ترشحی پوشانده شدهاند که منجر به تشکیل دستههای بزرگ میشود (شکل 3D). دستههای اسپرم از تجمع اسپرم با شبکهای از دمهای متصل تشکیل شدهاند (شکل 4A-C). دستههای اسپرم از دمهای بسیاری از اسپرمهای به هم چسبیده تشکیل شدهاند (شکل 4D). رازها (شکل 4E، F) سر دستههای اسپرم را پوشاندهاند.
تشکیل دسته اسپرم با استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست و اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج، نشان داده شد که سرهای اسپرم به هم میچسبند. (الف) تشکیل اولیه دسته اسپرم با یک اسپرم (دایره سفید) و سه اسپرم (دایره زرد) آغاز میشود، که مارپیچ از دم شروع شده و به سر ختم میشود. (ب) عکس میکروسکوپی از اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج که سرهای اسپرم چسبیده را نشان میدهد (فلشها). ترشحات سر(ها) را میپوشاند. بزرگنمایی × 1000. (ج) ایجاد یک پرتو بزرگ که توسط جریان در یک کانال میکروفلوئیدیک منتقل میشود (با استفاده از دوربین پرسرعت با سرعت 950 فریم در ثانیه). (د) عکس میکروسکوپی از اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج که دستههای بزرگ را نشان میدهد (فلشها). بزرگنمایی: × 200.
تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از پرتو اسپرم و یک اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج. (A، B، D، E) تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی رنگی دیجیتال از اسپرمها هستند و C و F تصاویر میکروسکوپی از اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج هستند که اتصال چندین اسپرم را که به دور شبکه دمی پیچیده شدهاند، نشان میدهند. (AC) تجمعات اسپرم به صورت شبکهای از دمهای متصل (فلشها) نشان داده شدهاند. (D) چسبندگی چندین اسپرم (با ماده چسبنده، طرح صورتی، فلش) که به دور دم پیچیده شدهاند. (E و F) تجمعات سر اسپرم (اشارهگرها) که با ماده چسبنده (اشارهگرها) پوشیده شدهاند. اسپرمها دستههایی با چندین ساختار گرداب مانند تشکیل دادند (F). (C) بزرگنماییهای 400× و 200×.
با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری، دریافتیم که دستههای اسپرم دارای دمهای متصل (شکل 6A، C)، سرهای متصل به دمها (شکل 6B) یا سرهای متصل به دمها (شکل 6D) هستند. سرهای اسپرمها در دسته خمیده هستند و در ناحیه هستهای بخش دو (شکل 6D) نشان داده میشوند. در دسته برش، اسپرمها دارای یک سر پیچ خورده با دو ناحیه هستهای و چندین ناحیه تاژکدار بودند (شکل 5A).
تصویر میکروسکوپ الکترونی رنگی دیجیتال که دمهای متصلکننده در دسته اسپرم و ماده چسبنده متصلکننده سر اسپرمها را نشان میدهد. (الف) دم متصل تعداد زیادی اسپرم. به نحوه نمایش دم در هر دو تصویر عمودی (فلش) و افقی (فلش) توجه کنید. (ب) سر (فلش) اسپرم به دم (فلش) متصل است. (ج) چندین دم اسپرم (فلش) متصل هستند. (د) ماده چسبنده (AS، آبی) چهار سر اسپرم (بنفش) را به هم متصل میکند.
میکروسکوپ الکترونی روبشی برای تشخیص سر اسپرم در دستههای اسپرم پوشیده از ترشحات یا غشاها استفاده شد (شکل 6B)، که نشان میدهد دستههای اسپرم توسط مواد خارج سلولی لنگر انداختهاند. ماده آگلوتینه شده در سر اسپرم (مجموعهای شبیه سر عروس دریایی؛ شکل 5B) متمرکز شده و به سمت دیستال گسترش یافته بود و هنگام رنگآمیزی با آکریدین اورنج، ظاهری زرد درخشان در زیر میکروسکوپ فلورسانس ایجاد میکرد (شکل 6C). این ماده به وضوح در زیر میکروسکوپ اسکن قابل مشاهده است و به عنوان یک ماده چسبنده در نظر گرفته میشود. مقاطع نیمه نازک (شکل 5C) و اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج، دستههای اسپرم حاوی سرهای متراکم و دمهای فر خورده را نشان دادند (شکل 5D).
تصاویر میکروسکوپی مختلف که تجمع سر اسپرم و دمهای تا شده را با استفاده از روشهای مختلف نشان میدهند. (الف) تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری رنگی دیجیتال مقطعی از یک دسته اسپرم که یک سر اسپرم پیچ خورده با هسته دو قسمتی (آبی) و چندین قسمت تاژکدار (سبز) را نشان میدهد. (ب) تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی رنگی دیجیتال که خوشهای از سر اسپرمهای شبیه عروس دریایی (فلشها) را نشان میدهد که به نظر میرسد پوشیده شدهاند. (ج) برش نیمه نازک که سر اسپرمهای جمع شده (فلشها) و دمهای فر خورده (فلشها) را نشان میدهد. (د) تصویر میکروسکوپی از یک اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج که تجمع سر اسپرم (فلشها) و دمهای چسبنده فر خورده (فلشها) را نشان میدهد. توجه داشته باشید که یک ماده چسبنده (S) سر اسپرم را میپوشاند. (د) بزرگنمایی × 1000.
با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (شکل 7A)، همچنین مشاهده شد که سر اسپرمها پیچ خورده و هستهها شکل مارپیچی دارند، همانطور که توسط اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج و بررسی شده با میکروسکوپ فلورسانس (شکل 7B) تأیید شد.
(الف) میکروگراف الکترونی عبوری رنگی دیجیتال و (ب) اسمیر اسپرم رنگآمیزی شده با آکریدین اورنج که سرهای مارپیچی و اتصال سر و دم اسپرم (فلشها) را نشان میدهد. (ب) بزرگنمایی 1000 ×.
یک یافته جالب این است که اسپرم شارکزی برای تشکیل دستههای رشتهای متحرک تجمع مییابد. خواص این دستهها به ما این امکان را میدهد که نقش احتمالی آنها را در جذب و ذخیره اسپرم در SST درک کنیم.
پس از جفتگیری، اسپرم وارد واژن میشود و تحت یک فرآیند گزینش شدید قرار میگیرد که در نتیجه تنها تعداد محدودی اسپرم وارد SST15،16 میشوند. تا به امروز، مکانیسمهایی که اسپرم از طریق آنها وارد SST میشود و از آن خارج میشود، مشخص نیست. در طیور، اسپرمها بسته به گونه، برای مدت طولانی 2 تا 10 هفته در SST ذخیره میشوند6. در مورد وضعیت منی در طول ذخیرهسازی در SST اختلاف نظر وجود دارد. آیا آنها در حال حرکت هستند یا در حالت سکون؟ به عبارت دیگر، سلولهای اسپرم چگونه موقعیت خود را در SST برای مدت طولانی حفظ میکنند؟
فورمن۴ پیشنهاد کرد که اقامت و خروج اسپرم از SST را میتوان بر اساس تحرک اسپرم توضیح داد. نویسندگان این فرضیه را مطرح میکنند که اسپرم با شنا کردن در خلاف جهت جریان سیال ایجاد شده توسط اپیتلیوم SST موقعیت خود را حفظ میکند و اسپرمها هنگامی که سرعت آنها به زیر نقطهای که به دلیل کمبود انرژی شروع به حرکت به عقب میکنند، میرسد، از SST خارج میشوند. زنیبونی۵ وجود آکواپورینهای ۲، ۳ و ۹ را در قسمت رأسی سلولهای اپیتلیال SST تأیید کرد که ممکن است به طور غیرمستقیم از مدل ذخیرهسازی اسپرم فورمن پشتیبانی کند. در مطالعه حاضر، ما دریافتیم که تقریباً نیمی از اسپرمهای شارکاشی رئولوژی مثبت در سیال در حال جریان نشان میدهند و دستههای اسپرم آگلوتینه شده تعداد اسپرمهایی را که رئولوژی مثبت نشان میدهند افزایش میدهند، اگرچه آگلوتیناسیون آنها را کند میکند. چگونگی حرکت سلولهای اسپرم در لوله فالوپ پرندگان به محل لقاح به طور کامل مشخص نشده است. در پستانداران، مایع فولیکولی، اسپرمها را به صورت شیمیایی جذب میکند. با این حال، اعتقاد بر این است که مواد شیمیایی جاذب، اسپرمها را به فواصل طولانی هدایت میکنند7. بنابراین، مکانیسمهای دیگری مسئول انتقال اسپرم هستند. گزارش شده است که توانایی اسپرم در جهتگیری و جریان یافتن در خلاف جهت مایع لوله فالوپ که پس از جفتگیری آزاد میشود، عامل اصلی در هدف قرار دادن اسپرم در موشها است. پارکر 17 اظهار داشت که اسپرمها با شنا کردن در خلاف جهت جریان مژگانی در پرندگان و خزندگان از لولههای فالوپ عبور میکنند. اگرچه این موضوع به صورت تجربی در پرندگان نشان داده نشده است، آدولفی 18 اولین کسی بود که دریافت اسپرم پرندگان وقتی یک لایه نازک از مایع بین یک لامل و اسلاید با یک نوار کاغذ صافی ایجاد میشود، نتایج مثبتی میدهد. رئولوژی. هینو و یاناگیماچی [19] یک کمپلکس تخمدان-لوله-رحم موش را در یک حلقه پرفیوژن قرار دادند و 1 میکرولیتر جوهر را به داخل تنگه تزریق کردند تا جریان مایع در لولههای فالوپ را مشاهده کنند. آنها متوجه حرکت بسیار فعال انقباض و انبساط در لوله فالوپ شدند که در آن تمام گلولههای جوهر به طور پیوسته به سمت آمپول لوله فالوپ حرکت میکردند. نویسندگان بر اهمیت جریان مایع لوله فالوپ از لولههای فالوپ پایینی به بالایی برای بالا آمدن اسپرم و لقاح تأکید میکنند. بریلارد20 گزارش داد که در مرغها و بوقلمونها، اسپرمها با حرکت فعال از ورودی واژن، جایی که ذخیره میشوند، به محل اتصال رحم-واژن، جایی که ذخیره میشوند، مهاجرت میکنند. با این حال، این حرکت بین محل اتصال رحم-واژن و اینفاندیبولوم لازم نیست زیرا اسپرمها با جابجایی غیرفعال منتقل میشوند. با دانستن این توصیههای قبلی و نتایج به دست آمده در مطالعه حاضر، میتوان فرض کرد که توانایی اسپرمها برای حرکت به سمت بالا (رئولوژی) یکی از ویژگیهایی است که فرآیند انتخاب بر اساس آن انجام میشود. این امر عبور اسپرمها از واژن و ورود آنها به CCT برای ذخیره را تعیین میکند. همانطور که فورمن۴ پیشنهاد کرد، این امر همچنین ممکن است فرآیند ورود اسپرم به SST و زیستگاه آن را برای مدتی تسهیل کند و سپس با شروع کاهش سرعت آنها، از آن خارج شود.
از سوی دیگر، ماتسوزاکی و ساسانامی 21 اظهار داشتند که اسپرم پرندگان در دستگاه تولید مثلی نر و ماده دچار تغییرات حرکتی از حالت خواب به حالت تحرک میشود. مهار حرکت اسپرم ساکن در SST برای توضیح مدت زمان طولانی ذخیره اسپرم و سپس جوان شدن پس از ترک SST پیشنهاد شده است. در شرایط هیپوکسی، ماتسوزاکی و همکارانش 1 تولید و آزادسازی بالای لاکتات را در SST گزارش کردند که ممکن است منجر به مهار حرکت اسپرم ساکن شود. در این مورد، اهمیت رئولوژی اسپرم در انتخاب و جذب اسپرم منعکس میشود و نه در ذخیره آنها.
الگوی تجمع اسپرم، توضیحی قابل قبول برای مدت طولانی نگهداری اسپرم در لوله فالوپ (SST) در نظر گرفته میشود، زیرا این یک الگوی رایج برای حفظ اسپرم در طیور است2،22،23. باکست و همکاران 2 مشاهده کردند که بیشتر اسپرمها به یکدیگر چسبیده و تجمعهای فاسیکولی تشکیل میدهند و اسپرمهای منفرد به ندرت در CCM بلدرچین یافت میشوند. از سوی دیگر، ون و همکاران 24 اسپرمهای پراکندهتر و تعداد کمتری تافت اسپرم را در مجرای SST در مرغها مشاهده کردند. بر اساس این مشاهدات، میتوان فرض کرد که تمایل به تجمع اسپرم بین پرندگان و بین اسپرمها در یک انزال یکسان متفاوت است. علاوه بر این، ون کری و همکاران 9 پیشنهاد کردند که تفکیک تصادفی اسپرمهای تجمع یافته مسئول نفوذ تدریجی اسپرمها به مجرای لوله فالوپ است. طبق این فرضیه، اسپرمهایی با ظرفیت تجمع کمتر باید ابتدا از SST خارج شوند. در این زمینه، توانایی اسپرمها در تجمع ممکن است عاملی باشد که بر نتیجه رقابت اسپرم در پرندگان کثیف تأثیر میگذارد. علاوه بر این، هر چه اسپرم تجمع یافته مدت زمان بیشتری از هم جدا شود، باروری برای مدت طولانیتری حفظ میشود.
اگرچه تجمع و تبدیل اسپرمها به دستهها در چندین مطالعه مشاهده شده است2،22،24، اما به دلیل پیچیدگی مشاهده سینماتیک آنها در SST، به طور مفصل شرح داده نشدهاند. تلاشهای متعددی برای مطالعه آگلوتیناسیون اسپرم در شرایط آزمایشگاهی انجام شده است. هنگامی که سیم نازک از قطره دانه آویزان برداشته شد، تجمع گسترده اما گذرا مشاهده شد. این امر منجر به این واقعیت میشود که یک حباب کشیده از قطره بیرون میزند و غده منی را تقلید میکند. به دلیل محدودیتهای سهبعدی و زمانهای کوتاه خشک شدن قطره، کل بلوک به سرعت از بین میرود9. در مطالعه حاضر، با استفاده از مرغهای شارکاشی و تراشههای میکروفلوئیدیک، توانستیم نحوه تشکیل این دستهها و نحوه حرکت آنها را توصیف کنیم. دستههای اسپرم بلافاصله پس از جمعآوری اسپرم تشکیل شدند و مشخص شد که به صورت مارپیچی حرکت میکنند و در صورت وجود در جریان، رئولوژی مثبتی را نشان میدهند. علاوه بر این، هنگامی که از نظر ماکروسکوپی مشاهده میشود، مشاهده شده است که دستههای اسپرم در مقایسه با اسپرمهای جدا شده، خطی بودن حرکت را افزایش میدهند. این نشان میدهد که تجمع اسپرم ممکن است قبل از نفوذ SST رخ دهد و تولید اسپرم به دلیل استرس، همانطور که قبلاً پیشنهاد شده بود (تینگاری و لیک12)، به یک ناحیه کوچک محدود نمیشود. در طول تشکیل تافت، اسپرمها به طور همزمان شنا میکنند تا زمانی که یک محل اتصال تشکیل دهند، سپس دمهای آنها به دور یکدیگر میپیچد و سر اسپرم آزاد میماند، اما دم و قسمت انتهایی اسپرم با یک ماده چسبنده به هم میچسبد. بنابراین، سر آزاد رباط مسئول حرکت است و بقیه رباط را میکشد. میکروسکوپ الکترونی روبشی از دستههای اسپرم، سرهای اسپرم متصل شده را که با مقدار زیادی ماده چسبنده پوشیده شده بودند، نشان داد که سرهای اسپرم در دستههای استراحت متصل شدهاند، که ممکن است پس از رسیدن به محل ذخیره (SST) رخ داده باشد.
وقتی اسمیر اسپرم با آکریدین اورنج رنگآمیزی میشود، ماده چسبنده خارج سلولی اطراف سلولهای اسپرم را میتوان زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده کرد. این ماده به دستههای اسپرم اجازه میدهد تا به هر سطح یا ذرات اطراف بچسبند و به این ترتیب با جریان اطراف جابجا نشوند. بنابراین، مشاهدات ما نقش چسبندگی اسپرم را به شکل دستههای متحرک نشان میدهد. توانایی آنها در شنا کردن در خلاف جهت جریان و چسبیدن به سطوح مجاور، به اسپرم اجازه میدهد تا مدت بیشتری در SST باقی بماند.
روچیلد25 از یک دوربین هموسیتومتری برای مطالعه توزیع شناور اسپرم گاو در یک قطره سوسپانسیون استفاده کرد و از طریق دوربینی با محور نوری عمودی و افقی میکروسکوپ، تصاویر میکروسکوپ نوری تهیه کرد. نتایج نشان داد که اسپرمها به سطح محفظه جذب میشوند. نویسندگان پیشنهاد میکنند که ممکن است تعاملات هیدرودینامیکی بین اسپرم و سطح وجود داشته باشد. با در نظر گرفتن این موضوع، همراه با توانایی اسپرم جوجه شارکاشی در تشکیل تافتهای چسبنده، ممکن است احتمال چسبیدن اسپرم به دیواره SST و نگهداری آن برای مدت طولانی افزایش یابد.
Bccetti و Afzeliu26 گزارش دادند که گلیکوکالیکس اسپرم برای تشخیص گامت و آگلوتیناسیون مورد نیاز است. Forman10 مشاهده کرد که هیدرولیز پیوندهای α-گلیکوزیدی در پوششهای گلیکوپروتئین-گلیکولیپید با تیمار منی پرندگان با نورآمینیداز منجر به کاهش باروری بدون تأثیر بر تحرک اسپرم میشود. نویسندگان پیشنهاد میکنند که تأثیر نورآمینیداز بر گلیکوکالیکس، جداسازی اسپرم در محل اتصال رحم-واژن را مختل میکند و در نتیجه باروری را کاهش میدهد. مشاهدات آنها نمیتواند این احتمال را نادیده بگیرد که تیمار نورآمینیداز ممکن است تشخیص اسپرم و تخمک را کاهش دهد. Forman و Engel10 دریافتند که باروری هنگامی که مرغها به صورت داخل واژنی با منی تیمار شده با نورآمینیداز تلقیح شدند، کاهش یافت. با این حال، IVF با اسپرم تیمار شده با نورآمینیداز در مقایسه با مرغهای گروه کنترل، بر باروری تأثیری نداشت. نویسندگان نتیجه گرفتند که تغییرات در پوشش گلیکوپروتئین-گلیکولیپید اطراف غشای اسپرم، با اختلال در جداسازی اسپرم در محل اتصال رحم-واژن، توانایی اسپرم برای لقاح را کاهش میدهد، که به نوبه خود باعث افزایش از دست دادن اسپرم به دلیل سرعت اتصال رحم-واژن میشود، اما بر تشخیص اسپرم و تخمک تأثیری ندارد.
در بوقلمونها، باکست و باوچان ۱۱ وزیکولهای کوچک و قطعات غشایی را در لومن SST یافتند و مشاهده کردند که برخی از این گرانولها با غشای اسپرم ترکیب شدهاند. نویسندگان پیشنهاد میکنند که این روابط ممکن است در ذخیره طولانی مدت اسپرم در SST نقش داشته باشند. با این حال، محققان منبع این ذرات را مشخص نکردند، اینکه آیا توسط سلولهای اپیتلیال CCT ترشح میشوند، توسط سیستم تولید مثلی مرد تولید و ترشح میشوند یا توسط خود اسپرم تولید میشوند. همچنین، این ذرات مسئول آگلوتیناسیون هستند. گروتزنر و همکاران۲۷ گزارش دادند که سلولهای اپیتلیال اپیدیدیم پروتئین خاصی را تولید و ترشح میکنند که برای تشکیل مجاری منی تک منفذی مورد نیاز است. نویسندگان همچنین گزارش میدهند که پراکندگی این دستهها به تعامل پروتئینهای اپیدیدیم بستگی دارد. نیکسون و همکاران۲۸ دریافتند که ادنکسها پروتئینی به نام استئونکتین غنی از سیستئین اسیدی ترشح میکنند. SPARC در تشکیل دستههای اسپرم در اکیدنههای منقار کوتاه و پلاتیپوسها نقش دارد. پراکندگی این پرتوها با از دست دادن این پروتئین مرتبط است.
در مطالعه حاضر، تجزیه و تحلیل فراساختاری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نشان داد که اسپرمها به مقدار زیادی ماده متراکم چسبیدهاند. تصور میشود این مواد مسئول آگلوتیناسیونی هستند که بین و اطراف سرهای چسبنده متراکم میشود، اما در غلظتهای پایینتر در ناحیه دم. ما فرض میکنیم که این ماده آگلوتینهکننده از سیستم تولید مثلی مردان (اپیدیدیم یا لوله دفران) همراه با مایع منی دفع میشود، زیرا اغلب مشاهده میکنیم که مایع منی در طول انزال از لنف و پلاسمای منی جدا میشود. گزارش شده است که اسپرمهای پرندگان هنگام عبور از اپیدیدیم و لوله دفران، دچار تغییرات مرتبط با بلوغ میشوند که از توانایی آنها در اتصال به پروتئینها و کسب گلیکوپروتئینهای مرتبط با لم پلاسما پشتیبانی میکند. پایداری این پروتئینها بر روی غشای اسپرم ساکن در SST نشان میدهد که این پروتئینها ممکن است بر کسب پایداری غشای اسپرم تأثیر بگذارند30 و باروری آنها را تعیین کنند31. احمد و همکاران32 گزارش دادند که اسپرمهای بهدستآمده از بخشهای مختلف سیستم تولیدمثلی مردان (از بیضهها تا انتهای مجرای دفران) صرفنظر از دمای نگهداری، افزایش تدریجی در زندهمانی را در شرایط ذخیرهسازی مایع نشان میدهند و زندهمانی در مرغها نیز پس از تلقیح مصنوعی در لولههای فالوپ افزایش مییابد.
دستههای اسپرم مرغ شارکاشی ویژگیها و عملکردهای متفاوتی نسبت به سایر گونهها مانند اکیدنه، پلاتیپوس، موش جنگلی، موش آهو و خوکچه هندی دارند. در مرغهای شارکاشی، تشکیل دستههای اسپرم، سرعت شنای آنها را در مقایسه با اسپرمهای تکی کاهش میدهد. با این حال، این دستهها درصد اسپرمهای مثبت از نظر رئولوژیکی را افزایش داده و توانایی اسپرمها را برای تثبیت خود در یک محیط پویا افزایش میدهند. بنابراین، نتایج ما پیشنهاد قبلی مبنی بر اینکه آگلوتیناسیون اسپرم در SST با ذخیره طولانی مدت اسپرم مرتبط است را تأیید میکند. ما همچنین فرض میکنیم که تمایل اسپرم به تشکیل دستهها ممکن است میزان از دست دادن اسپرم در SST را کنترل کند، که ممکن است نتیجه رقابت اسپرم را تغییر دهد. طبق این فرض، اسپرمهایی با ظرفیت آگلوتیناسیون پایین ابتدا SST را آزاد میکنند، در حالی که اسپرمهایی با ظرفیت آگلوتیناسیون بالا بیشتر فرزندان را تولید میکنند. تشکیل دستههای اسپرم تک منفذی مفید است و بر نسبت والد-فرزند تأثیر میگذارد، اما از مکانیسم متفاوتی استفاده میکند. در اکیدنهها و پلاتیپوسها، اسپرمها به صورت موازی با یکدیگر قرار میگیرند تا سرعت پیشروی پرتو افزایش یابد. دستههای اکیدنهها حدود سه برابر سریعتر از اسپرمهای تکی حرکت میکنند. اعتقاد بر این است که تشکیل چنین دستههای اسپرمی در اکیدنهها یک سازگاری تکاملی برای حفظ سلطه است، زیرا مادهها بیبندوبار هستند و معمولاً با چندین نر جفتگیری میکنند. بنابراین، اسپرمهای حاصل از انزالهای مختلف برای لقاح تخمک به شدت رقابت میکنند.
اسپرمهای آگلوتینه شده مرغهای شارکاسی به راحتی با استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست قابل مشاهده هستند، که به دلیل امکان مطالعه آسان رفتار اسپرم در شرایط آزمایشگاهی، مفید تلقی میشود. مکانیسمی که تشکیل تافت اسپرم از طریق آن تولید مثل را در مرغهای شارکاسی تقویت میکند، با مکانیسمی که در برخی از پستانداران جفتدار دیده میشود، متفاوت است که نشاندهنده رفتار مشارکتی اسپرم مانند موشهای جنگلی است، جایی که برخی از اسپرمها به تخمکها میرسند و به سایر افراد مرتبط کمک میکنند تا به تخمکهای خود برسند و به آنها آسیب برسانند. برای اثبات خود. رفتار نوعدوستانه. خودلقاحی ۳۴. نمونه دیگری از رفتار مشارکتی در اسپرمها در موشهای گوزن یافت شد، جایی که اسپرمها قادر به شناسایی و ترکیب با اسپرمهایی با بیشترین ارتباط ژنتیکی بودند و گروههای مشارکتی تشکیل دادند تا سرعت خود را در مقایسه با اسپرمهای غیرمرتبط افزایش دهند۳۵.
نتایج به دست آمده در این مطالعه با نظریه فومن در مورد ذخیره طولانی مدت اسپرم در SWS مغایرت ندارد. محققان گزارش میدهند که سلولهای اسپرم برای مدت طولانی در جریان سلولهای اپیتلیال پوشاننده SST به حرکت خود ادامه میدهند و پس از مدت زمان مشخصی، ذخایر انرژی سلولهای اسپرم تخلیه میشود و در نتیجه سرعت کاهش مییابد که امکان خروج مواد با وزن مولکولی کوچک را فراهم میکند. انرژی اسپرم با جریان مایع از لومن SST حفره لوله فالوپ. در مطالعه حاضر، مشاهده کردیم که نیمی از اسپرمهای منفرد توانایی شنا در خلاف جهت مایعات جاری را نشان دادند و چسبندگی آنها در دسته، توانایی آنها را در نشان دادن رئولوژی مثبت افزایش داد. علاوه بر این، دادههای ما با دادههای ماتسوزاکی و همکارانش 1 که گزارش دادند افزایش ترشح لاکتات در SST ممکن است تحرک اسپرم ساکن را مهار کند، مطابقت دارد. با این حال، نتایج ما تشکیل رباطهای متحرک اسپرم و رفتار رئولوژیکی آنها را در حضور یک محیط پویا در یک میکروکانال در تلاش برای روشن کردن رفتار آنها در SST توصیف میکند. تحقیقات آینده ممکن است بر تعیین ترکیب شیمیایی و منشأ عامل چسبندگی تمرکز کند، که بدون شک به محققان کمک میکند تا راههای جدیدی برای ذخیره مایع منی و افزایش مدت زمان باروری ایجاد کنند.
پانزده عدد شارکاسی نر گردن لخت 30 هفتهای (هموزیگوت غالب؛ نا نا) به عنوان اهداکنندگان اسپرم در این مطالعه انتخاب شدند. این پرندگان در مزرعه تحقیقاتی طیور دانشکده کشاورزی، دانشگاه آشیت، استان آشیت، مصر پرورش داده شدند. پرندگان در قفسهای انفرادی (30 × 40 × 40 سانتیمتر) نگهداری شدند، تحت برنامه نوری (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) قرار گرفتند و با رژیم غذایی حاوی 160 گرم پروتئین خام، 2800 کیلوکالری انرژی قابل متابولیسم، 35 گرم کلسیم به ازای هر کیلوگرم و 5 گرم فسفر موجود در هر کیلوگرم جیره غذایی تغذیه شدند.
طبق دادههای ۳۶ و ۳۷، مایع منی از نرها با ماساژ شکمی جمعآوری شد. در مجموع ۴۵ نمونه مایع منی از ۱۵ مرد طی ۳ روز جمعآوری شد. مایع منی (n = ۱۵ در روز) بلافاصله با رقیقکننده مایع منی طیور Belsville به نسبت ۱:۱ (حجم:حجم) رقیق شد که حاوی دیفسفات پتاسیم (۱.۲۷ گرم)، مونوسدیم گلوتامات مونوهیدرات (۰.۸۶۷ گرم)، فروکتوز (۰.۵ روز) سدیم استات بیآب (۰.۴۳ گرم)، تریس (هیدروکسی متیل) آمینومتان (۰.۱۹۵ گرم)، سیترات پتاسیم مونوهیدرات (۰.۰۶۴ گرم)، مونوفسفات پتاسیم (۰.۰۶۵ گرم)، کلرید منیزیم (۰.۰۳۴ گرم) و H2O (۱۰۰ میلیلیتر)، pH = ۷.۵، اسمولاریته ۳۳۳ میلیاسمول بر کیلوگرم (۳۸) بود. نمونههای منی رقیقشده ابتدا زیر میکروسکوپ نوری بررسی شدند تا از کیفیت خوب منی (رطوبت) اطمینان حاصل شود و سپس در حمام آب با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد تا زمان استفاده ظرف نیم ساعت پس از جمعآوری نگهداری شدند.
سینماتیک و رئولوژی اسپرم با استفاده از سیستمی از دستگاههای میکروفلوئیدیک شرح داده شده است. نمونههای منی در رقیقکننده اسپرم پرندگان Beltsville Avian Semen Diluent تا نسبت ۱:۴۰ رقیق شدند، در یک دستگاه میکروفلوئیدیک (به زیر مراجعه کنید) بارگذاری شدند و پارامترهای سینتیکی با استفاده از یک سیستم آنالیز کامپیوتری منی (CASA) که قبلاً برای توصیف میکروفلوئیدیک توسعه داده شده بود، بر روی تحرک اسپرم در محیط مایع (گروه مهندسی مکانیک، دانشکده مهندسی، دانشگاه اسیوط، مصر) تعیین شدند. افزونه را میتوان از آدرس زیر دانلود کرد: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. سرعت منحنی (VCL، میکرومتر بر ثانیه)، سرعت خطی (VSL، میکرومتر بر ثانیه) و سرعت متوسط مسیر (VAP، میکرومتر بر ثانیه) اندازهگیری شدند. فیلمهای اسپرم با استفاده از یک میکروسکوپ فاز کنتراست معکوس Optika XDS-3 (با عدسی شیئی 40x) متصل به یک دوربین Tucson ISH1000 با سرعت 30 فریم در ثانیه به مدت 3 ثانیه گرفته شد. از نرمافزار CASA برای مطالعه حداقل سه ناحیه و 500 مسیر اسپرم در هر نمونه استفاده کنید. فیلم ضبط شده با استفاده از یک CASA خانگی پردازش شد. تعریف تحرک در افزونه CASA بر اساس سرعت شنا اسپرم در مقایسه با سرعت جریان است و پارامترهای دیگری مانند حرکت جانبی را شامل نمیشود، زیرا مشخص شده است که این امر در جریان سیال قابل اعتمادتر است. حرکت رئولوژیکی به عنوان حرکت سلولهای اسپرم در خلاف جهت جریان سیال توصیف میشود. اسپرمهایی با خواص رئولوژیکی بر تعداد اسپرمهای متحرک تقسیم شدند. اسپرمهایی که در حالت استراحت بودند و اسپرمهایی که به صورت همرفتی حرکت میکردند از شمارش حذف شدند.
تمام مواد شیمیایی مورد استفاده از شرکت داروسازی Elgomhoria (قاهره، مصر) تهیه شدند، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد. این دستگاه همانطور که توسط El-sherry و همکارانش 40 شرح داده شده است، با کمی اصلاحات ساخته شده است. مواد مورد استفاده برای ساخت میکروکانالها شامل صفحات شیشهای (Howard Glass, Worcester, MA)، مقاومت منفی SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA)، الکل دی استون (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) و پلی استون. -184, Dow Corning, Midland, Michigan) بودند. میکروکانالها با استفاده از لیتوگرافی نرم ساخته میشوند. ابتدا، یک ماسک محافظ صورت شفاف با طرح میکروکانال مورد نظر روی یک چاپگر با وضوح بالا (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) چاپ شد. نمونههای اصلی با استفاده از صفحات شیشهای به عنوان زیرلایه ساخته شدند. صفحات در استون، ایزوپروپانول و آب دیونیزه تمیز شدند و سپس با یک لایه 20 میکرومتری از SU8-25 با پوشش چرخشی (3000 دور در دقیقه، 1 دقیقه) پوشش داده شدند. سپس لایههای SU-8 به آرامی خشک شدند (65 درجه سانتیگراد، 2 دقیقه و 95 درجه سانتیگراد، 10 دقیقه) و به مدت 50 ثانیه در معرض تابش UV قرار گرفتند. پس از تابش، به مدت 1 دقیقه و 4 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد و 95 درجه سانتیگراد پخته شدند تا لایههای SU-8 در معرض تابش، پیوند عرضی پیدا کنند و به دنبال آن به مدت 6.5 دقیقه در الکل دی استون توسعه داده شدند. وافلها (200 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه) به صورت سخت پخته شدند تا لایه SU-8 بیشتر سفت شود.
PDMS با مخلوط کردن مونومر و سختکننده با نسبت وزنی 10:1 تهیه شد، سپس در یک دسیکاتور خلاء گاززدایی شده و روی قاب اصلی SU-8 ریخته شد. PDMS در یک فر (120 درجه سانتیگراد، 30 دقیقه) پخته شد، سپس کانالها بریده، از قسمت اصلی جدا و سوراخ شدند تا لولهها در ورودی و خروجی میکروکانال متصل شوند. در نهایت، میکروکانالهای PDMS با استفاده از یک پردازنده کرونای قابل حمل (Electro-Technic Products، شیکاگو، ایلینوی) همانطور که در جای دیگر توضیح داده شده است، به طور دائم به اسلایدهای میکروسکوپ متصل شدند. میکروکانال مورد استفاده در این مطالعه دارای ابعاد 200 میکرومتر × 20 میکرومتر (عرض × ارتفاع) و طول 3.6 سانتیمتر است.
جریان سیال ناشی از فشار هیدرواستاتیک درون میکروکانال با حفظ سطح سیال در مخزن ورودی بالاتر از اختلاف ارتفاع Δh39 در مخزن خروجی حاصل میشود (شکل 1).
که در آن f ضریب اصطکاک است که برای جریان آرام در یک کانال مستطیلی به صورت f = C/Re تعریف میشود، که در آن C یک ثابت وابسته به نسبت ابعاد کانال است، L طول میکروکانال است، Vav سرعت متوسط درون میکروکانال است، Dh قطر هیدرولیکی کانال است، g شتاب گرانش است. با استفاده از این معادله، سرعت متوسط کانال را میتوان با استفاده از معادله زیر محاسبه کرد:
زمان ارسال: ۱۷ آگوست ۲۰۲۲
