از بازدید شما از Nature.com متشکریم. شما از نسخه مرورگری با پشتیبانی محدود از CSS استفاده می‌کنید. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
یک چرخ و فلک از سه اسلاید را به طور همزمان نمایش می‌دهد. از دکمه‌های قبلی و بعدی برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید، یا از دکمه‌های کشویی در انتها برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید.
ذرات سیلیس متخلخل با روش سل-ژل و با اعمال برخی اصلاحات برای دستیابی به ذرات با منافذ پهن تهیه شدند. این ذرات با استفاده از پلیمریزاسیون N-فنیل مالیمید-متیل وینیل ایزوسیانات (PMI) و استایرن از طریق پلیمریزاسیون انتقال-قطعه‌سازی زنجیره معکوس (RAFT) مشتق شدند تا پلی‌آمیدهای میان‌لایه‌ای N-فنیل مالیمید تولید شوند. فاز ساکن استایرن (PMP). ستون‌های باریک فولاد ضد زنگ با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر با یک پرکننده دوغابی پر شدند. عملکرد کروماتوگرافی ستون PMP برای جداسازی مخلوطی از پپتیدهای مصنوعی متشکل از پنج پپتید (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، Leu آمینو اسید انکفالین) و هیدرولیزات تریپتیک آلبومین سرم انسانی (HAS) ارزیابی شد. تحت شرایط بهینه شویش، تعداد تئوری صفحات حاوی مخلوطی از پپتیدها به ۲۸۰۰۰۰ صفحه در هر متر مربع رسید. با مقایسه عملکرد جداسازی ستون توسعه‌یافته با ستون تجاری Ascentis Express RP-Amide، مشاهده شد که راندمان جداسازی ستون PMP از نظر راندمان جداسازی و وضوح، برتر از ستون تجاری است.
صنعت زیست‌داروسازی در سال‌های اخیر به یک بازار جهانی در حال گسترش تبدیل شده است و سهم بازار آن به طور قابل توجهی افزایش یافته است. با رشد انفجاری صنعت زیست‌داروسازی1،2،3 نیاز زیادی به تجزیه و تحلیل پپتید و پروتئین وجود دارد. علاوه بر پپتید هدف، ناخالصی‌های مختلفی در طول سنتز پپتید تشکیل می‌شوند، بنابراین برای به دست آوردن خلوص مطلوب پپتید، خالص‌سازی کروماتوگرافی مورد نیاز است. تجزیه و تحلیل و توصیف پروتئین‌ها در مایعات بدن، بافت‌ها و سلول‌ها به دلیل تعداد زیاد گونه‌های بالقوه قابل تشخیص موجود در یک نمونه واحد، یک کار بسیار چالش برانگیز است. اگرچه طیف‌سنجی جرمی ابزاری مؤثر برای تعیین توالی پپتیدها و پروتئین‌ها است، اما اگر چنین نمونه‌هایی مستقیماً وارد طیف‌سنج جرمی شوند، جداسازی رضایت‌بخش نخواهد بود. این مشکل را می‌توان با انجام کروماتوگرافی مایع (LC) قبل از تجزیه و تحلیل MS حل کرد، که باعث کاهش مقدار آنالیت‌های ورودی به طیف‌سنج جرمی در یک زمان معین می‌شود4،5،6. علاوه بر این، آنالیت‌ها می‌توانند در طول جداسازی فاز مایع در یک ناحیه باریک متمرکز شوند، در نتیجه این آنالیت‌ها را متمرکز کرده و حساسیت تشخیص MS را افزایش می‌دهند. کروماتوگرافی مایع (LC) در طول دهه گذشته پیشرفت قابل توجهی داشته و به روشی پرکاربرد برای تجزیه و تحلیل پروتئوم تبدیل شده است7،8،9،10.
کروماتوگرافی مایع فاز معکوس (RP-LC) به طور گسترده برای خالص‌سازی و جداسازی مخلوط‌های پپتیدها با استفاده از سیلیکای اصلاح‌شده با اکتادسیل (ODS) به عنوان فاز ساکن استفاده می‌شود11،12،13. با این حال، به دلیل ساختار پیچیده و ماهیت آمفوتریک آنها،14،15 فازهای ساکن RP نمی‌توانند جداسازی رضایت‌بخشی از پپتیدها و پروتئین‌ها ارائه دهند. بنابراین، تجزیه و تحلیل پپتیدها و پروتئین‌ها با قطعات قطبی و غیرقطبی نیاز به فازهای ساکن با طراحی ویژه برای تعامل و حفظ این آنالیت‌ها دارد16. کروماتوگرافی مختلط، که تعاملات چندوجهی را ارائه می‌دهد، می‌تواند جایگزینی برای RP-LC برای جداسازی پپتیدها، پروتئین‌ها و سایر مخلوط‌های پیچیده باشد. چندین فاز ساکن از نوع مختلط تهیه شد و ستون‌های پر شده با این فازهای ساکن برای جداسازی پپتیدها و پروتئین‌ها استفاده شدند17،18،19،20،21. به دلیل وجود گروه‌های قطبی و غیرقطبی، فازهای ثابت حالت مختلط (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، polar intercalation/RPLC) برای جداسازی پپتیدها و پروتئین‌ها مناسب هستند.22،23،24،25،26،27،28. فازهای ثابت قطبی intercalated با گروه‌های قطبی پیوند کووالانسی، قابلیت‌های جداسازی خوب و گزینش‌پذیری منحصر به فردی را برای آنالیت‌های قطبی و غیرقطبی نشان می‌دهند، زیرا جداسازی به برهمکنش بین آنالیت و فاز ثابت بستگی دارد. برهمکنش‌های چندوجهی 29،30،31،32. اخیراً، ژانگ و همکارانش 30 فازهای ثابت پلی‌آمین‌های با انتهای بهنیل را به دست آوردند و با موفقیت هیدروکربن‌ها، داروهای ضد افسردگی، فلاونوئیدها، نوکلئوزیدها، استروژن‌ها و برخی دیگر از آنالیت‌ها را جدا کردند. ماده ثابت قطبی تعبیه شده دارای گروه‌های قطبی و غیرقطبی است، بنابراین می‌توان از آن برای جداسازی پپتیدها و پروتئین‌ها به بخش‌های آبگریز و آبدوست استفاده کرد. ستون‌های قطبی درون خطی (مثلاً ستون‌های C18 با آمید درون خطی) با نام تجاری ستون‌های Ascentis Express RP-Amide موجود هستند، اما این ستون‌ها فقط برای آنالیز آمین ۳۳ استفاده شده‌اند.
در مطالعه حاضر، یک فاز ساکن قطبی (N-فنیل مالئیمید، پلی استایرن قطبی) تهیه و برای جداسازی پپتید و برش HSA تریپتیک ارزیابی شد. برای تهیه فاز ساکن از استراتژی زیر استفاده شد. ذرات سیلیس متخلخل طبق رویه‌های شرح داده شده در انتشارات قبلی ما، با تغییراتی در طرح‌های آماده‌سازی 31، 34، 35، 36، 37، 38، 39، تهیه شدند. نسبت‌های اوره، پلی‌اتیلن گلیکول (PEG)، TMOS و اسید استیک آبی تنظیم شدند تا ذرات سیلیس با اندازه منافذ بزرگ به دست آیند. در مرحله دوم، یک لیگاند جدید فنیل مالئیمید-متیل وینیل ایزوسیانات سنتز شد و ذرات سیلیس مشتق شده آن برای تهیه فازهای ساکن قطبی قطبی استفاده شد. فاز ساکن به دست آمده طبق یک طرح بسته‌بندی بهینه در یک ستون فولاد ضد زنگ (قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) بسته‌بندی شد. بسته‌بندی ستون با ارتعاش مکانیکی انجام می‌شود تا یک لایه یکنواخت در داخل ستون تضمین شود. ستون پر شده برای جداسازی مخلوطی از پپتیدها متشکل از پنج پپتید (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، پپتید لوسین-انکفالین) و هیدرولیزهای تریپتیک آلبومین سرم انسانی (HSA) ارزیابی شد. مشاهده شد که مخلوط پپتید و هضم تریپتیک HSA با وضوح و کارایی خوبی جداسازی می‌شوند. راندمان جداسازی ستون PMP با ستون Ascentis Express RP-Amide مقایسه شد. مشاهده شد که پپتیدها و پروتئین‌ها وضوح خوب و راندمان جداسازی بالایی روی ستون PMP دارند و راندمان جداسازی ستون PMP بالاتر از ستون Ascentis Express RP-Amide است.
PEG (پلی اتیلن گلیکول)، اوره، اسید استیک، تری متوکسی اورتوسیلیکات (TMOS)، تری متیل کلروسیلان (TMCS)، تریپسین، آلبومین سرم انسانی (HSA)، کلرید آمونیوم، اوره، هگزامتیل متاکریلوئیل دی سیلازان (HMDS)، متاکریلوئیل کلرید (MC)، استایرن، 4-هیدروکسی- TEMPO، بنزوئیل پراکسید (BPO)، استونیتریل (ACN) برای HPLC، متانول، 2-پروپانول و استون. شرکت سیگما-آلدریچ (سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده آمریکا).
مخلوطی از اوره (8 گرم)، پلی‌اتیلن گلیکول (8 گرم) و 8 میلی‌لیتر اسید استیک 0.01 نرمال به مدت 10 دقیقه هم زده شد و 24 میلی‌لیتر TMOS تحت خنک‌سازی با یخ به آن اضافه شد. مخلوط واکنش به مدت 6 ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد و سپس به مدت 8 ساعت در دمای 120 درجه سانتیگراد در اتوکلاو استیل ضد زنگ حرارت داده شد. آب تخلیه و باقیمانده به مدت 12 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد خشک شد. بلوک‌های نرم خشک شده به آرامی آسیاب شده و به مدت 12 ساعت در فر با دمای 550 درجه سانتیگراد کلسینه شدند. سه دسته تهیه و مشخصه‌یابی شدند تا تکرارپذیری اندازه ذرات، اندازه منافذ و مساحت سطح آزمایش شود.
گروه قطبی و فاز ساکن برای زنجیره‌های پلی‌استایرن. روش تهیه در زیر شرح داده شده است.
N-فنیل مالئیمید (200 میلی‌گرم) و متیل وینیل ایزوسیانات (100 میلی‌گرم) در تولوئن بی‌آب حل شدند و سپس 0.1 میلی‌لیتر 2،2′-آزوایزوبوتیرونیتریل (AIBN) به فلاسک واکنش اضافه شد تا کوپلیمر فنیل مالئیمید و متیل وینیل ایزوسیانات (PMCP) به دست آید. مخلوط به مدت 3 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد حرارت داده شد، فیلتر شد و به مدت 3 ساعت در فر با دمای 40 درجه سانتیگراد خشک شد.
ذرات سیلیس خشک (2 گرم) در تولوئن خشک (100 میلی‌لیتر) پراکنده شدند، هم زده شدند و به مدت 10 دقیقه در یک بالن ته گرد 500 میلی‌لیتری تحت امواج فراصوت قرار گرفتند. PMCP (10 میلی‌گرم) در تولوئن حل شد و از طریق قیف افزایشی به صورت قطره‌ای به بالن واکنش اضافه شد. مخلوط به مدت 8 ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد رفلاکس شد، فیلتر شد، با استون شسته شد و به مدت 3 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک شد. سپس، ذرات سیلیس مرتبط با PMCP (100 گرم) در تولوئن (200 میلی‌لیتر) حل شدند و 4-هیدروکسی-TEMPO (2 میلی‌لیتر) در حضور 100 میکرولیتر دی‌بوتیل‌تین دی‌لورات به عنوان کاتالیزور به آن اضافه شد. مخلوط به مدت 8 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد هم زده شد، فیلتر شد و به مدت 3 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد خشک شد.
استایرن (1 میلی‌لیتر)، بنزوئیل پراکسید BPO (0.5 میلی‌لیتر) و ذرات سیلیس متصل به TEMPO-PMCP (1.5 گرم) در تولوئن پراکنده و با نیتروژن تصفیه شدند. پلیمریزاسیون استایرن در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت انجام شد. محصول حاصل با متانول شسته و به مدت یک شب در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک شد. طرح کلی واکنش در شکل 1 نشان داده شده است.
نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۹۳ کلوین گاززدایی شدند تا فشار باقیمانده کمتر از ۱۰-۳ تور به دست آید. مقدار N2 جذب شده در فشار نسبی P/P0 = 0.99 برای تعیین حجم کل منافذ استفاده شد. مورفولوژی ذرات سیلیس خالص و متصل به لیگاند با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (Hitachi High Technologies، توکیو، ژاپن) بررسی شد. نمونه‌های خشک (سیلیس خالص و ذرات سیلیس متصل به لیگاند) با استفاده از نوار کربنی روی میله‌های آلومینیومی قرار داده شدند. طلا با استفاده از دستگاه کندوپاش Q150T روی نمونه رسوب داده شد و یک لایه طلا به ضخامت ۵ نانومتر روی نمونه رسوب داده شد. این کار راندمان فرآیند ولتاژ پایین را بهبود می‌بخشد و پاشش سرد دقیقی را فراهم می‌کند. تجزیه عنصری با استفاده از دستگاه تجزیه ترکیب عنصری Thermo Electron (Waltham، MA، USA) Flash EA1112 انجام شد. برای به دست آوردن توزیع اندازه ذرات از دستگاه تجزیه اندازه ذرات Malvern (Worcestershire، UK) Mastersizer 2000 استفاده شد. ذرات سیلیس بدون پوشش و ذرات سیلیس متصل به لیگاند (هر کدام 5 میلی‌گرم) در 5 میلی‌لیتر ایزوپروپانول پراکنده شدند، به مدت 10 دقیقه سونیکیت شدند، به مدت 5 دقیقه هم زده شدند و روی میز نوری Mastersizer قرار داده شدند. تجزیه و تحلیل وزن‌سنجی حرارتی با سرعت 5 درجه سانتیگراد در دقیقه در محدوده دمایی 30 تا 800 درجه سانتیگراد انجام می‌شود.
ستون‌های فولادی ضد زنگ با قطر داخلی باریک و روکش شده با الیاف شیشه و ابعاد (ID 100 × 1.8 میلی‌متر) با روش پر کردن دوغاب و طبق همان روشی که در مرجع 31 ذکر شده است، بسته‌بندی شدند. ستون فولاد ضد زنگ (با روکش شیشه، ID 100 × 1.8 میلی‌متر) و یک خروجی حاوی یک فریت 1 میکرومتری به یک دستگاه بسته‌بندی دوغاب (Alltech Deerfield، IL، USA) متصل شد. با معلق کردن 150 میلی‌گرم فاز ثابت در 1.2 میلی‌لیتر متانول و تغذیه آن به یک ستون مخزن، سوسپانسیونی از فاز ثابت تهیه کنید. متانول به عنوان حلال دوغاب و حلال کنترل استفاده شد. ستون را با اعمال توالی فشار 100 MP به مدت 10 دقیقه، 80 MP به مدت 15 دقیقه و 60 MP به مدت 30 دقیقه بسته‌بندی کنید. در فرآیند بسته‌بندی از دو ویبراتور ستون کروماتوگرافی گازی (Alltech، Deerfield، IL، USA) برای ارتعاش مکانیکی استفاده شد تا بسته‌بندی یکنواخت ستون تضمین شود. بسته‌بندی دوغاب را ببندید و فشار را به آرامی آزاد کنید تا از آسیب به رشته جلوگیری شود. ستون از نازل دوغاب جدا شد و یک اتصال دیگر به ورودی متصل شد و به سیستم LC متصل شد تا عملکرد آن آزمایش شود.
یک MLC سفارشی با استفاده از یک پمپ LC (10AD Shimadzu، ژاپن)، یک نمونه بردار با حلقه تزریق 50 نانولیتر (Valco (USA) C14 W.05)، یک گاززدای غشایی (Shimadzu DGU-14A) و یک پنجره مویرگی UV-VIS ساخته شد. دستگاه آشکارساز (UV-2075) و میکروستون لعابی. از لوله‌های اتصال بسیار باریک و کوتاه برای به حداقل رساندن اثر انبساط اضافی ستون استفاده کنید. پس از پر کردن ستون، یک لوله مویرگی (50 میکرومتر در 365) در خروجی اتصال کاهنده 1/16 اینچی نصب کنید و یک لوله مویرگی (50 میکرومتر) از اتصال کاهنده نصب کنید. جمع‌آوری داده‌ها و پردازش کروماتوگرام با استفاده از نرم‌افزار Multichro 2000 انجام می‌شود. در طول موج 254 نانومتر، جذب UV آنالیت‌های مورد بررسی در 0.05 اندازه‌گیری شد. داده‌های کروماتوگرافی با استفاده از OriginPro8 (Northampton، MA) تجزیه و تحلیل شدند.
آلبومین سرم انسانی، پودر لیوفیلیزه، ≥ ۹۶٪ (الکتروفورز ژل آگارز) ۳ میلی‌گرم مخلوط با تریپسین (۱.۵ میلی‌گرم)، اوره ۴.۰ مولار (۱ میلی‌لیتر) و بی‌کربنات آمونیوم ۰.۲ مولار (۱ میلی‌لیتر). محلول به مدت ۱۰ دقیقه هم زده شد و به مدت ۶ ساعت در حمام آب با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شد، سپس با ۱ میلی‌لیتر TFA ۰.۱٪ خاموش شد. محلول را فیلتر کرده و در دمای زیر ۴ درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
جداسازی مخلوطی از پپتیدها و HSA هضم شده توسط تریپتیک روی ستون PMP به طور جداگانه ارزیابی شد. هیدرولیز تریپتیک مخلوطی از پپتیدها و HSA جدا شده توسط ستون PMP را بررسی کنید و نتایج را با ستون Ascentis Express RP-Amide مقایسه کنید. تعداد صفحات نظری با استفاده از معادله زیر محاسبه می‌شود:
تصاویر SEM از ذرات سیلیس خالص و ذرات سیلیس متصل به لیگاند در شکل 2 نشان داده شده است. تصاویر SEM از ذرات سیلیس خالص (A، B) در مقایسه با مطالعات قبلی ما، شکلی کروی را نشان می‌دهند که در آن ذرات کشیده شده یا تقارن نامنظمی دارند. سطح ذرات سیلیس متصل به لیگاند (C، D) صاف‌تر از ذرات سیلیس خالص است که ممکن است به دلیل زنجیره‌های پلی‌استایرن باشد که سطح ذرات سیلیس را پوشانده‌اند.
تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از ذرات سیلیس خالص (A، B) و ذرات سیلیس متصل به لیگاند (C، D).
توزیع اندازه ذرات ذرات سیلیس خالص و ذرات سیلیس متصل به لیگاند در شکل 2.3(A) نشان داده شده است. منحنی‌های توزیع اندازه ذرات حجمی نشان دادند که اندازه ذرات سیلیس پس از اصلاح شیمیایی افزایش یافته است (شکل 3A). داده‌های توزیع اندازه ذرات سیلیس از مطالعه حاضر و مطالعه قبلی در جدول 1(A) مقایسه شده‌اند. اندازه ذرات حجمی d(0.5) PMP برابر با 3.36 میکرومتر بود، در حالی که در مطالعه قبلی ما (ذرات سیلیس متصل به پلی‌استایرن) مقدار ad(0.5) برابر با 3.05 میکرومتر بود34. به دلیل تغییر نسبت PEG، اوره، TMOS و اسید استیک در مخلوط واکنش، توزیع اندازه ذرات این دسته در مقایسه با مطالعه قبلی ما باریک‌تر بود. اندازه ذرات فاز PMP کمی بزرگتر از فاز ذرات سیلیس متصل به پلی‌استایرن است که قبلاً مطالعه کردیم. این بدان معناست که عامل‌دار کردن سطحی ذرات سیلیس با استایرن، تنها یک لایه پلی‌استایرن (0.97 میکرومتر) را روی سطح سیلیس رسوب می‌دهد، در حالی که در فاز PMP ضخامت لایه 1.38 میکرومتر است.
توزیع اندازه ذرات (A) و توزیع اندازه منافذ (B) ذرات سیلیس خالص و ذرات سیلیس متصل به لیگاند.
اندازه منافذ، حجم منافذ و مساحت سطح ذرات سیلیس مورد استفاده در این مطالعه در جدول 1 (B) نشان داده شده است. پروفیل‌های PSD ذرات سیلیس خالص و ذرات سیلیس متصل به لیگاند در شکل‌های 3 (B) نشان داده شده است. نتایج با مطالعه قبلی ما34 قابل مقایسه بود. اندازه منافذ ذرات سیلیس خالص و متصل به لیگاند به ترتیب 310 آنگستروم و 241 آنگستروم بود که نشان می‌دهد پس از اصلاح شیمیایی، اندازه منافذ 69 آنگستروم کاهش یافته است، همانطور که در جدول 1 (B) نشان داده شده است، و منحنی تغییر در شکل نشان داده شده است. مساحت سطح ویژه ذرات سیلیس در مطالعه حاضر 116 متر مربع بر گرم است که با مطالعه قبلی ما (124 متر مربع بر گرم) قابل مقایسه است. همانطور که در جدول 1 (B) نشان داده شده است، مساحت سطح (متر مربع بر گرم) ذرات سیلیس پس از اصلاح شیمیایی نیز از 116 متر مربع بر گرم به 105 متر مربع بر گرم کاهش یافته است.
نتایج آنالیز عنصری فاز ساکن در جدول 2 ارائه شده است. میزان کربن فاز ساکن فعلی 6.35٪ است که کمتر از مطالعه قبلی ما است (ذرات سیلیس مرتبط با پلی استایرن، به ترتیب 7.93٪35 و 10.21٪) 42. میزان کربن فاز ساکن فعلی در زیر آمده است، زیرا برخی از لیگاندهای قطبی مانند فنیل مالئیمید متیل وینیل ایزوسیانات (PCMP) و 4-هیدروکسی-TEMPO علاوه بر استایرن در تهیه SP استفاده شده‌اند. درصد وزنی نیتروژن در فاز ساکن فعلی 2.21٪ است در مقایسه با 0.1735 و 0.85٪ در مطالعات قبلی 42. این بدان معناست که فاز ساکن فعلی به دلیل فنیل مالئیمید درصد وزنی بالایی از نیتروژن دارد. به طور مشابه، محصولات (4) و (5) به ترتیب دارای محتوای کربن 2.7٪ و 2.9٪ هستند، در حالی که محصول نهایی (6) دارای محتوای کربن 6.35٪ است، همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است. آنالیز وزن سنجی حرارتی (TGA) در فاز ساکن PMP برای آزمایش کاهش وزن استفاده شد و منحنی TGA در شکل 4 نشان داده شده است. منحنی TGA کاهش وزن 8.6٪ را نشان می‌دهد که با محتوای کربن (6.35٪) مطابقت خوبی دارد، زیرا لیگاندها نه تنها حاوی C هستند، بلکه N، O و H را نیز شامل می‌شوند.
لیگاند فنیل مالئیمید-متیل وینیل ایزوسیانات به دلیل گروه‌های قطبی فنیل مالئیمید و وینیل ایزوسیانات، برای اصلاح سطح ذرات سیلیس انتخاب شد. گروه‌های وینیل ایزوسیانات می‌توانند از طریق پلیمریزاسیون رادیکالی زنده، با استایرن واکنش بیشتری نشان دهند. دلیل دوم، وارد کردن گروهی است که برهمکنش‌های متوسطی با آنالیت داشته باشد و هیچ برهمکنش الکترواستاتیکی قوی بین آنالیت و فاز ساکن وجود نداشته باشد، زیرا بخش فنیل مالئیمید در pH طبیعی هیچ بار مجازی ندارد. قطبیت فاز ساکن را می‌توان با مقدار بهینه استایرن و زمان واکنش پلیمریزاسیون رادیکال آزاد کنترل کرد. مرحله نهایی واکنش (پلیمریزاسیون رادیکال آزاد) بسیار مهم است زیرا قطبیت فاز ساکن را تغییر می‌دهد. تجزیه عنصری برای بررسی محتوای کربن در این فازهای ساکن انجام شد. مشاهده شده است که افزایش مقدار استایرن و زمان واکنش، محتوای کربن فاز ساکن را افزایش می‌دهد و برعکس. SP های تهیه شده با غلظت‌های مختلف استایرن، بار کربن متفاوتی دارند. به طور مشابه، این فازهای ساکن روی ستون‌های استیل ضد زنگ قرار داده شدند و ویژگی‌های کروماتوگرافی آنها (گزینش‌پذیری، تفکیک‌پذیری، مقدار N و غیره) بررسی شد. بر اساس این آزمایش‌ها، یک ترکیب بهینه برای تهیه فاز ساکن PMP انتخاب شد تا قطبیت کنترل‌شده و احتباس خوب آنالیت را فراهم کند.
ستون PMP همچنین برای تجزیه و تحلیل پنج مخلوط از پپتیدها (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، لوسین-انکفالین) با استفاده از ظرفیت فاز متحرک ارزیابی شد. 60/40 (v/v) ACN/آب (0.1% TFA) با سرعت جریان 80 میکرولیتر در دقیقه. در شرایط بهینه شستشو (200000 صفحه در متر مربع)، تعداد صفحات نظری (N) در هر ستون (100 × 1.8 میلی‌متر مربع) 20000 ± 100 است. مقادیر N برای سه ستون PMP در جدول 3 و کروماتوگرام‌ها در شکل 5A نشان داده شده است. آنالیز سریع با سرعت جریان بالا (700 میکرولیتر در دقیقه) روی ستون PMP، پنج پپتید در عرض یک دقیقه شسته شدند، مقدار عالی N برابر با 13500 ± 330 در هر ستون (قطر 100 × 1.8 میلی‌متر)، معادل 135000 پلیت در متر مربع (شکل 5B). سه ستون با اندازه یکسان (قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) با سه دسته مختلف از فاز ساکن PMP پر شدند تا تکرارپذیری آزمایش شود. آنالیت‌ها برای هر ستون با جدا کردن مخلوط آزمایشی یکسان روی هر ستون با استفاده از شرایط شستشوی بهینه، تعداد پلیت‌های نظری N و زمان بازداری ثبت شدند. داده‌های تکرارپذیری برای ستون‌های PMP در جدول 4 نشان داده شده است. تکرارپذیری ستون PMP با مقادیر بسیار پایین %RSD همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، همبستگی خوبی دارد.
جداسازی مخلوط‌های پپتیدی روی ستون PMP (B) و ستون Ascentis Express RP-Amide (A)، فاز متحرک 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)، ابعاد ستون PMP (100 x 1.8 mm id)، آنالیز. ترتیب شویش ترکیبات: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و 5 (لوسیک اسید انکفالین).
یک ستون PMP (با قطر داخلی 100 در 1.8 میلی‌متر) برای جداسازی هیدرولیز تریپتیک آلبومین سرم انسانی با استفاده از HPLC ارزیابی شد. کروماتوگرام شکل 6 نشان می‌دهد که نمونه‌ها به خوبی و با وضوح بسیار خوب جداسازی شده‌اند. محلول‌های HSA با استفاده از سرعت جریان 100 میکرولیتر در دقیقه، فاز متحرک 70/30 استونیتریل/آب و 0.1٪ TFA آنالیز شدند. تجزیه HSA به 17 پیک تقسیم شد، همانطور که در کروماتوگرام (شکل 6) نشان داده شده است، که مربوط به 17 پپتید است. راندمان جداسازی پیک‌های منفرد از هیدرولیز HSA محاسبه شد و مقادیر آن در جدول 5 نشان داده شده است.
هیدرولیزات‌های تریپتیک HSA روی ستون PMP (قطر داخلی ۱۰۰ در ۱.۸ میلی‌متر)، سرعت جریان (۱۰۰ میکرولیتر در دقیقه)، فاز متحرک ۶۰/۴۰ استونیتریل/آب و ۰.۱٪ TFA جدا شدند.
که در آن L طول ستون، η ویسکوزیته فاز متحرک، ΔP فشار برگشتی ستون و u سرعت خطی فاز متحرک است. نفوذپذیری ستون PMP برابر با 2.5 × 10-14 متر مربع، سرعت جریان 25 میکرولیتر در دقیقه و نسبت جریان به حجم 60/40 ولت بر ولت بود. ACN/آب. نفوذپذیری ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) مشابه مطالعه قبلی ما در مرجع 34 بود. نفوذپذیری ستونی که با ذرات متخلخل سطحی پر شده است، 1.7 × 10 .6 میکرومتر و برای ذرات 5 میکرومتری 2.5 × 10-14 متر مربع است43. بنابراین، نفوذپذیری فاز PMP مشابه نفوذپذیری ذرات هسته-پوسته با اندازه 5 میکرومتر است.
که در آن Wx جرم ستون پر شده با کلروفرم، Wy جرم ستون پر شده با متانول و ρ چگالی حلال است. چگالی متانول (ρ = 0.7866) و کلروفرم (ρ = 1.484). تخلخل کل ستون ذرات سیلیکا-C18 (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر)34 و ستون C18-urea31 که قبلاً مورد مطالعه قرار گرفته است، به ترتیب 0.63 و 0.55 بود. این بدان معناست که وجود لیگاندهای اوره، نفوذپذیری فاز ساکن را کاهش می‌دهد. از سوی دیگر، تخلخل کل ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) 0.60 است. ستون‌های PMP نسبت به ستون‌های پر شده با ذرات سیلیس متصل به C18 نفوذپذیری کمتری دارند، زیرا در فازهای ساکن از نوع C18، لیگاندهای C18 به صورت زنجیره‌های خطی به ذرات سیلیس متصل شده‌اند، در حالی که در فازهای ساکن از نوع پلی‌استایرن، یک پلیمر نسبتاً ضخیم در اطراف ذرات تشکیل می‌شود. لایه A. در یک آزمایش معمول، تخلخل ستون به صورت زیر محاسبه می‌شود:
در شکل‌های 7A و B نمودارهای ون دیمتر برای یک ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) و یک ستون Ascentis Express RP-Amide (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) تحت شرایط شستشوی یکسان، 60/40 ACN/H2O و 0.1% TFA 20 میکرولیتر در دقیقه تا 800 میکرولیتر در دقیقه در هر دو ستون نشان داده شده است. حداقل مقادیر HETP در سرعت جریان بهینه (80 میکرولیتر در دقیقه) به ترتیب برای ستون PMP و ستون Ascentis Express RP-Amide 2.6 میکرومتر و 3.9 میکرومتر بود. مقادیر HETP نشان می‌دهد که راندمان جداسازی ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) بسیار بیشتر از ستون Ascentis Express RP-Amide موجود در بازار (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) است. نمودار ون دیمتر در شکل 7 (A) نشان می‌دهد که کاهش مقدار N با افزایش جریان در مقایسه با مطالعه قبلی ما به طور قابل توجهی بیشتر نیست. راندمان جداسازی بالاتر ستون PMP (id 100 × 1.8 mm) در مقایسه با ستون Ascentis Express RP-Amide بر اساس شکل و اندازه ذرات بهبود یافته و روش بسته‌بندی ستون پیچیده مورد استفاده در کار فعلی است34.
(الف) نمودار ون دیمتر (HETP در مقابل سرعت خطی فاز متحرک) که روی ستون PMP (با قطر داخلی 100 در 1.8 میلی‌متر) در محلول 60/40 ACN/H2O با 0.1% TFA به دست آمده است. (ب) نمودار ون دیمتر (HETP در مقابل سرعت خطی فاز متحرک) که روی ستون Ascentis Express RP-Amide (با قطر داخلی 100 در 1.8 میلی‌متر) در محلول 60/40 ACN/H2O با 0.1% TFA به دست آمده است.
یک فاز ساکن قطبی از پلی‌استایرن بین لایه‌ای تهیه و برای جداسازی مخلوطی از پپتیدهای مصنوعی و هیدرولیزات تریپتیک آلبومین سرم انسانی (HSA) در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ارزیابی شد. عملکرد کروماتوگرافی ستون‌های PMP برای مخلوط‌های پپتیدی از نظر راندمان جداسازی و وضوح عالی است. راندمان جداسازی بهبود یافته ستون‌های PMP به دلایل مختلفی مانند اندازه ذرات سیلیس و اندازه منافذ، سنتز کنترل‌شده فازهای ساکن و مواد بسته‌بندی ستون پیچیده است. علاوه بر راندمان جداسازی بالا، مزیت دیگر این فاز ساکن، فشار برگشتی کم ستون در سرعت‌های جریان بالا است. ستون‌های PMP بسیار تکرارپذیر هستند و می‌توانند برای تجزیه و تحلیل مخلوط پپتیدها و هضم تریپتیک پروتئین‌های مختلف مورد استفاده قرار گیرند. ما قصد داریم از این ستون برای جداسازی ترکیبات زیست فعال از محصولات طبیعی، عصاره گیاهان دارویی و قارچ‌ها در کروماتوگرافی مایع استفاده کنیم. در آینده، ستون‌های PMP برای جداسازی پروتئین‌ها و آنتی‌بادی‌های مونوکلونال نیز ارزیابی خواهند شد.
فیلد، جی. کی.، یوئربی، ام. آر.، لاو، جی.، توگرسن، اچ. و پترسون، پی. بررسی سیستم‌های جداسازی پپتید کروماتوگرافی فاز معکوس بخش اول: توسعه پروتکلی برای توصیف ستون. فیلد، جی. کی.، یوئربی، ام. آر.، لاو، جی.، توگرسن، اچ. و پترسون، پی. بررسی سیستم‌های جداسازی پپتید کروماتوگرافی فاز معکوس بخش اول: توسعه پروتکلی برای توصیف ستون.فیلد، جی. کی.، اوربی، ام. آر.، لاو، جی.، توگرسن، اچ.، و پترسون، پی. بررسی سیستم‌های جداسازی پپتید با استفاده از کروماتوگرافی فاز معکوس، بخش اول: توسعه پروتکلی برای توصیف ستون. فیلد، جی کی، یوئربی، ام آر، لاو، جی.، توگرسن، اچ. و پترسون، پی. بررسی سیستم‌های جداسازی پپتید کروماتوگرافی فاز معکوس بخش اول: توسعه پروتکلی برای ویژگی‌های ستون. فیلد، جی کی، یوئربی، ام آر، لاو، جی.، توگرسن، اچ. و پترسون، پی. بررسی سیستم‌های جداسازی پپتید کروماتوگرافی فاز معکوس بخش اول: توسعه پروتکلی برای ویژگی‌های ستون.فیلد، جی. کی.، اوربی، ام. آر.، لاو، جی.، توگرسن، اچ.، و پترسون، پی. بررسی سیستم‌های جداسازی پپتید با استفاده از کروماتوگرافی فاز معکوس، بخش اول: توسعه پروتکلی برای توصیف ستون.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)".
گومز، ب. و همکاران. روش‌هایی برای ایجاد پپتیدهای فعال بهبود یافته برای درمان بیماری‌های عفونی. بیوتکنولوژی. دستاوردها 36(2)، 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
ولیگه، پ.، لیسوفسکی، و.، مارتینز، ج. و خرستچاتیسکی، م. پپتیدهای درمانی مصنوعی: علم و بازار. ولیگه، پ.، لیسوفسکی، و.، مارتینز، ج. و خرستچاتیسکی، م. پپتیدهای درمانی مصنوعی: علم و بازار.ویلیج پی، لیسوفسکی وی، مارتینز جی و کرشاتیسکی ام. پپتیدهای درمانی مصنوعی: علم و بازار.ویلیج پی، لیسوفسکی وی، مارتینز جی و خرشاتسکی ام. پپتیدهای درمانی مصنوعی: علم و بازار. کشف دارو. امروز 15 (1-2)، 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
شی، اف.، اسمیت، آر. دی. و شن، وای. کروماتوگرافی مایع پروتئومیک پیشرفته. شی، اف.، اسمیت، آر. دی. و شن، وای. کروماتوگرافی مایع پروتئومیک پیشرفته.به F.، Smith RD و Shen Yu مراجعه کنید. کروماتوگرافی مایع پروتئومیک پیشرفته. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. ترکیب پروتئین پیشرفته 液相色谱.به F.، Smith RD و Shen Yu مراجعه کنید. کروماتوگرافی مایع پروتئومیک پیشرفته.مجله کروماتوگرافی. A 1261، 78-90 (2012).
لیو، دبلیو. و همکاران. کروماتوگرافی مایع پیشرفته-طیف‌سنجی جرمی قادر به ترکیب متابولومیکس و پروتئومیکس با پایه گسترده است. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
چسنات، اس‌ام و سالیسبوری، جی‌جی. نقش UHPLC در توسعه دارویی. چسنات، اس‌ام و سالیسبوری، جی‌جی. نقش UHPLC در توسعه دارویی.چسنات، اس‌ام و سالیسبوری، جی‌جی. نقش UHPLC در توسعه دارویی.چسنات، اس. ام. و سالیسبوری، جی. جی. نقش UHPLC در توسعه دارو. مجله علوم سپتامبر. 30(8)، 1183–1190 (2007).
وو، ن. و کلاوزن، ای. ام. جنبه‌های اساسی و عملی کروماتوگرافی مایع با فشار فوق بالا برای جداسازی‌های سریع. وو، ن. و کلاوزن، ای. ام. جنبه‌های اساسی و عملی کروماتوگرافی مایع با فشار فوق بالا برای جداسازی‌های سریع.وو، ن. و کلاوزن، ای. ام. جنبه‌های اساسی و عملی کروماتوگرافی مایع با فشار بالا برای جداسازی سریع. وو، ن. و کلاوزن، AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 وو، ن. و کلاوزن، ای. ام. جنبه‌های اساسی و عملی کروماتوگرافی مایع با فشار بسیار بالا برای جداسازی سریع.وو، ن. و کلاوزن، ای. ام. جنبه‌های اساسی و عملی کروماتوگرافی مایع با فشار بالا برای جداسازی سریع.مجله علوم سپتامبر. 30(8)، 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
رن، اس. ای. و چلیچف، پی. استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در توسعه دارویی. رن، اس. ای. و چلیچف، پی. استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در توسعه دارویی.رن، اس. ای. و چلیشف، پی. استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالا در توسعه دارویی. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 رن، اس. ای. و چلیچف، پی.رن، اس. ای. و چلیشف، پی. کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در توسعه دارو.مجله کروماتوگرافی. 1119(1-2)، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
گو، اچ. و همکاران. یک هیدروژل ماکرومتخلخل یکپارچه مشتق شده از امولسیون روغن در آب با فاز داخلی بالا برای خالص‌سازی کارآمد انتروویروس ۷۱. پروژه شیمیایی. مجله ۴۰۱، ۱۲۶۰۵۱ (۲۰۲۰).
شی، ی.، شیانگ، ر.، هورواث، سی. و ویلکینز، جی. ای. نقش کروماتوگرافی مایع در پروتئومیکس. شی، ی.، شیانگ، ر.، هورواث، سی. و ویلکینز، جی. ای. نقش کروماتوگرافی مایع در پروتئومیکس.شی، ی.، شیانگ، ر.، هورواث، سی. و ویلکینز، جی. ای. نقش کروماتوگرافی مایع در پروتئومیکس. شی، ی.، شیانگ، آر.، هوروات، سی و ویلکینز، JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAشی، ی.، شیانگ، ر.، هورواث، سی. و ویلکینز، جی. ای. نقش کروماتوگرافی مایع در پروتئومیکس.مجله کروماتوگرافی. A 1053 (1-2)، 27-36 (2004).
فکت، س.، ووتی، ج.-ل. و گیلارم، دی. روندهای جدید در جداسازی‌های کروماتوگرافی مایع فاز معکوس پپتیدها و پروتئین‌های درمانی: نظریه و کاربردها. و گیلارم، دی. روندهای جدید در جداسازی‌های کروماتوگرافی مایع فاز معکوس پپتیدها و پروتئین‌های درمانی: نظریه و کاربردها. & Guillarme, D. Novыe tendences in distributed therapycheskih peptidos and belkov with pomoщью жидкостной хроматографии со обращенной фазой: теория и پریلوژونی و گیلارم، دی. روندهای جدید در جداسازی پپتیدها و پروتئین‌های درمانی با استفاده از کروماتوگرافی مایع فاز معکوس: نظریه و کاربردها. و گیلارمه، دی. و گیلارم، دی.و گیلارمه، دی. روندهای جدید در جداسازی پپتیدها و پروتئین‌های درمانی با استفاده از کروماتوگرافی مایع فاز معکوس: نظریه و کاربردها.مجله داروسازی. علوم زیست پزشکی. مقعد. 69، 9-27 (2012).
گیلار، م.، اولیووا، پ.، دالی، AE و گبلر، JC جداسازی دوبعدی پپتیدها با استفاده از سیستم RP-RP-HPLC با pH متفاوت در ابعاد جداسازی اول و دوم. گیلار، م.، اولیووا، پ.، دالی، AE و گبلر، JC جداسازی دوبعدی پپتیدها با استفاده از سیستم RP-RP-HPLC با pH متفاوت در ابعاد جداسازی اول و دوم.Gilar M.، Olivova P.، Dali AE و Gebler JK جداسازی دو بعدی پپتیدها با استفاده از سیستم RP-RP-HPLC با pH متفاوت در ابعاد جداسازی اول و دوم.Gilar M.، Olivova P.، Dali AE و Gebler JK جداسازی دو بعدی پپتیدها با استفاده از مقادیر pH مختلف در ابعاد جداسازی اول و دوم با استفاده از سیستم RP-RP-HPLC. مجله علوم سپتامبر. 28 (14)، 1694–1703 (2005).
فلیتی، س. و همکاران. بررسی انتقال جرم و ویژگی‌های سینتیکی ستون‌های کروماتوگرافی با کارایی بالا که با ذرات C18 کاملاً متخلخل و سطحی متخلخل کوچکتر از 2 میکرومتر پر شده‌اند. مجله علوم سپتامبر. 43 (9-10)، 1737-1745 (2020).
پیووِسانا، س. و همکاران. روندهای اخیر و چالش‌های تحلیلی در جداسازی، شناسایی و اعتبارسنجی پپتیدهای زیست‌فعال گیاهی. anus. Creature anal. Chemical. 410(15)، 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
مولر، جی.بی و همکاران. چشم‌انداز پروتئومیک قلمرو حیات. نیچر 582 (7813)، 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
د لوکا، ک. و همکاران. پس‌پردازش پپتیدهای درمانی با استفاده از کروماتوگرافی مایع مقدماتی. مولکول‌ها (بازل، سوئیس) 26(15)، 4688 (2021).
یانگ، وای. و گنگ، ایکس. کروماتوگرافی حالت ترکیبی و کاربردهای آن در بیوپلیمرها. یانگ، وای. و گنگ، ایکس. کروماتوگرافی حالت ترکیبی و کاربردهای آن در بیوپلیمرها.یانگ، یو. و گنگ، ایکس. کروماتوگرافی حالت ترکیبی و کاربرد آن در بیوپلیمرها. یانگ، ی و گنگ، ایکس. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 یانگ، وای. و گنگ، ایکس. کروماتوگرافی حالت ترکیبی و کاربرد آن در بیوپلیمرها.یانگ، یو. و جین، ایکس. کروماتوگرافی حالت ترکیبی و کاربرد آن در بیوپلیمرها.مجله کروماتوگرافی. A 1218(49)، 8813–8825 (2011).