از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
آنگوستیفولیوس لوپین (NLL، Lupinus angustifolius L.) یک گیاه حبوبات است که برای تولید غذا و اصلاح خاک استفاده می شود.گسترش جهانی NLL به عنوان یک محصول، بسیاری از قارچ‌های بیماری‌زا، از جمله لوپین آنتراکنوز را که باعث بیماری ویرانگر آنتراکنوز می‌شود، جذب کرده است.دو آلل Lanr1 و AnMan که باعث افزایش مقاومت می‌شوند، در اصلاح NLL استفاده شده‌اند، اما مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی ناشناخته باقی مانده‌اند.در این مطالعه، از نشانگرهای Lanr1 و AnMan برای غربالگری نمونه‌های NLL اروپایی استفاده شد.آزمایش واکسن در یک محیط کنترل شده اثربخشی هر دو اهداکننده مقاوم را تایید کرد.پروفایل بیان ژن افتراقی بر روی لاین‌های مقاوم و حساس انجام شد.مقاومت آنتراکنوز با بیان بیش از حد اصطلاحات هستی شناسی ژن "GO:0006952 Defense Response"، "GO:0055114 Redox Process" و "GO:0015979 Photosynthesis" همراه بود.علاوه بر این، خط Lanr1 (83A: 476) برنامه‌ریزی مجدد رونوشت قابل توجهی را به سرعت پس از تلقیح نشان داد، در حالی که خطوط دیگر تاخیر در این پاسخ را حدود 42 ساعت نشان دادند.پاسخ‌های دفاعی با ژن‌های TIR-NBS، CC-NBS-LRR و NBS-LRR، 10 پروتئین درگیر در پاتوژنز، پروتئین‌های انتقال لیپید، اندوگلوکان-1،3-β-گلوکوزیداز، پروتئین‌های دیواره سلولی غنی از گلیسین و ژن‌های موجود در مسیر واکنشی اکسیژن مرتبط است.پاسخ‌های اولیه به 83A:476، از جمله سرکوب دقیق ژن‌های مرتبط با فتوسنتز، همزمان با محافظت موفقیت‌آمیز در طول مرحله رشد رویشی زیست‌شناسی قارچی، نشان می‌دهد که یک عامل باعث ایجاد ایمنی می‌شود.سرعت واکنش ماندلوپ و همچنین کشش افقی کلی کاهش می یابد.
لوپین برگ باریک (NLL، Lupinus angustifolius L.) یک غلات با پروتئین بالا است که منشأ آن در منطقه غرب مدیترانه است.در حال حاضر به عنوان یک محصول غذایی برای حیوانات و انسان کشت می شود.همچنین به دلیل تثبیت نیتروژن توسط باکتری های تثبیت کننده نیتروژن همزیست و بهبود کلی ساختار خاک، کود سبز در سیستم های تناوب زراعی در نظر گرفته می شود.NLL در قرن گذشته یک فرآیند سریع اهلی شدن را پشت سر گذاشته است و هنوز تحت فشارهای پرورشی بالا قرار دارد 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.با کشت گسترده NLL، توالی قارچ‌های بیماری‌زا، سوله‌های کشاورزی جدیدی را ایجاد کردند و باعث بیماری‌های نابودکننده محصولات جدید شدند. قابل توجه ترین برای کشاورزان و پرورش دهندگان لوپین ظهور آنتراکنوز بود که توسط قارچ بیماری زا Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg، Feiler و Hagedorn13 ایجاد می شد. قابل توجه ترین برای کشاورزان و پرورش دهندگان لوپین ظهور آنتراکنوز بود که توسط قارچ بیماری زا Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg، Feiler و Hagedorn13 ایجاد می شد. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление antraknoza, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. قابل توجه ترین برای کشاورزان و پرورش دهندگان لوپین ظهور آنتراکنوز ناشی از قارچ بیماری زا Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 بود.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猎umleetorich) , Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猵Collei珗 lu مو دار. 1 . چشمگیرترین برای کشاورزان و پرورش دهندگان لوپین ظهور آنتراکنوز ناشی از قارچ بیماری زا Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 است.اولین گزارش‌های مربوط به این بیماری از برزیل و ایالات متحده بود که علائم معمول آن به ترتیب در سال‌های 1912 و 1929 ظاهر شد.با این حال، پس از حدود 30 سال، پاتوژن به عنوان Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz تعیین شد. & Sacc.، تئومورف Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، تئومورف Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، تئومورف Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc.، Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld در مورفولوژی هدفمند. & H. Schrenk،. & H. Schrenk،.و H. Schrenk. & H.施伦克،. & H.施伦克،.و H. Schlenk،.فنوتیپ اولیه بیماری که در اواسط قرن بیستم انجام شد، مقداری مقاومت در توده‌های NLL و لوپین زرد (L. luteus L.) نشان داد، اما تمام توده‌های لوپین سفید (L. albus L.) آزمایش‌شده بسیار حساس بودند15،16.مطالعات نشان داده است که رشد آنتراکنوز با افزایش بارندگی (رطوبت هوا) و دما (در محدوده 12 تا 28 درجه سانتیگراد) همراه است که منجر به نقض مقاومت در دماهای بالاتر می شود.بنابراین، گرم شدن مداوم زمین منجر به گسترش آنتراکنوز شده است.با این حال، این بیماری در فرانسه (1982) و اوکراین (1983) به عنوان منادی یک تهدید قریب الوقوع مشاهده شد، اما ظاهراً توسط صنعت لوپین در آن زمان نادیده گرفته شد.چند سال بعد، این بیماری ویرانگر در سراسر جهان گسترش یافت و کشورهای عمده تولید کننده لوپین مانند استرالیا، لهستان و آلمان را نیز تحت تاثیر قرار داد.پس از شیوع آنتراکنوز در اواسط دهه 1990، غربالگری گسترده منجر به شناسایی چندین اهداکننده مقاوم در نمونه NLL19 شد.مقاومت NLL به آنتراکنوز توسط دو آلل غالب جداگانه که در منابع ژرم پلاسم مختلف یافت می شود کنترل می شود: Lanr1 در رقم Tanjil و Wonga و AnMan در رقم.Mandalay 25, 26. این آلل ها مکمل نشانگرهای مولکولی هستند که از انتخاب ژرم پلاسم مقاوم در برنامه های اصلاحی حمایت می کنند25،26،27،28،29،30.خط اصلاح مقاوم 83A:476 حامل آلل Lanr1 با خط وحشی حساس P27255 تلاقی داده شد تا یک جمعیت RIL جداسازی شده برای مقاومت آنتراکنوز بدست آید، که این امکان را فراهم کرد تا جایگاه Lanr1 را به کروموزوم NLL-1131، 32 نشانگرهای نگاشت نگاشت، نشانگرهای نگاشتی از 32 نشان دهند. یک چارچوب ژنومی، NLL مکان هر سه آلل را در یک کروموزوم (NLL-11)، اما در موقعیت‌های مختلف نشان داد29،34،35.با این حال، به دلیل تعداد کم RIL ها و فاصله ژنتیکی زیاد بین نشانگرها و آلل های متناظر، هیچ نتیجه قابل اعتمادی در مورد ژن های زمینه ای آنها نمی توان گرفت.از سوی دیگر، استفاده از ژنتیک معکوس در لوپین ها به دلیل پتانسیل بسیار کم بازسازی آنها دشوار است که دستکاری ژنتیکی را دست و پا گیر می کند.
توسعه ژرم پلاسم اهلی شده حامل آلل مورد نظر در حالت هموزیگوت، مانند 83A:476 (Lanr1) و Mandelup (AnMan)، دری را برای مطالعه مقاومت آنتراکنوز در مواجهه با وجود ترکیبات متضاد از آلل ها در جمعیت های وحشی باز کرده است.امکان مکانیسم های مولکولیپاسخ های دفاعی تولید شده توسط ژنوتیپ های خاص را مقایسه کنید.این مطالعه پاسخ رونویسی اولیه NLL به واکسیناسیون C. lupini را ارزیابی کرد.ابتدا یک پانل ژرم پلاسم اروپایی NLL حاوی 215 خط با استفاده از نشانگرهای مولکولی که آلل‌های Lanr1 و AnMan را نشان می‌دهند، غربالگری شد.سپس فنوتیپ آنتراکنوز بر روی 50 خط NLL، که قبلا برای نشانگرهای مولکولی انتخاب شده بودند، تحت شرایط کنترل شده انجام شد.بر اساس این آزمایش‌ها، چهار خط متفاوت در مقاومت آنتراکنوز و ترکیب آللی Lanr1/AnMan برای پروفایل بیان ژن دفاعی افتراقی با استفاده از دو رویکرد مکمل انتخاب شدند: توالی‌یابی RNA با توان عملیاتی بالا و تعیین کمیت PCR در زمان واقعی.
غربالگری مجموعه ای از ژرم پلاسم NLL (N = 215) با نشانگرهای Lanr1 (Anseq3 و Anseq4) و AnMan (Anseq4) و AnMan (AnManM1) نشان داد که تنها یک خط (95726، نزدیک سالامانکا-b) "مقاومت" نشانگرها را تقویت می کند، در حالی که نشانگرهای "مقاومت" قابل مشاهده برای همه نشانگرها، غیر قابل قبول هستند. در 158 خط (~73.5%).سیزده خط دو آلل "مقاوم" از نشانگر Lanr1 و 8 خط آلل "مقاوم" Lanr1 تولید کردند.نشانگرآلل "مقاومت" نشانگر AnMan (جدول تکمیلی S1).دو خط برای نشانگر Anseq3 و یک خط برای نشانگر AnManM1 هتروزیگوت بودند.42 خط (19.5٪) دارای فازهای مخالف آلل Anseq3 و Anseq4 بودند که نشان دهنده فرکانس بالای نوترکیبی بین این دو مکان است.فنوتیپ های آنتراکنوز در شرایط کنترل شده (جدول تکمیلی S2) تنوع در مقاومت ژنوتیپ های آزمایش شده را نشان داد که در شدت آنتراکنوز منعکس شد.تفاوت در میانگین نمرات از 1.8 (مقاوم نسبتاً مقاوم) تا 6.9 (مقاوم) و اختلاف وزن بوته از 0.62 (مقاوم) تا 4.45 گرم (مقاوم) متغیر بود. بین مقادیر مشاهده شده در دو تکرار آزمایش (0.51 برای امتیاز شدت بیماری، 0.00017 = P و 0.61 برای وزن گیاه، P <0.0001) و همچنین بین این دو پارامتر (0.59- و 0.77-، P <0.000) همبستگی معنی داری وجود داشت. بین مقادیر مشاهده شده در دو تکرار آزمایش (0.51 برای امتیاز شدت بیماری، 0.00017 = P و 0.61 برای وزن گیاه، P <0.0001) و همچنین بین این دو پارامتر (0.59- و 0.77-، P <0.0) ارتباط معنی داری وجود داشت. Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями، ناблюдаемыми در دوش مجدداً اكسperimenta (0,51 برای بالlov тяжести болезни، P = 0,00017 و 0,61 dlya انبوه)، умя параметри (-0,59 و -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). بین مقادیر مشاهده شده در دو تکرار آزمایش (51/0 برای نمرات شدت بیماری، 00017/0 = P و 61/0 برای وزن بوته، 0001/0 P) و همچنین بین این دو پارامتر (59/0- و 77/0-، 0/0>11) همبستگی معنی‌داری مشاهده شد.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P.10，0P.10，0P.10.物重量为0.61，P <0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 严重 刦 5 1، p = 0.00017، 植物 为 为 0.61، p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（0.9-5. - 0.59 - 0.77، P <0.0001). 0,51، P = 0,00017 و 0,61، P <0,0001, P <0,0001, P <0,0001, P <0,0001, P <0,0001, P <0,0001, P<0,0001) 001) 0,77, P <0,0001. بین مقادیر مشاهده شده به صورت تکراری (نمره شدت بیماری 0.51، P = 0.00017 و وزن گیاه 0.61، P <0.0001) و بین این دو پارامتر (0.59- و 0.0001-) 0.77، 0.01 P<0.00 وجود داشت. ).علائم معمولی که در گیاهان حساس مشاهده می شود شامل پیچ خوردگی و پیچ خوردگی ساقه شبیه به ساختار "کمان چوپان" و به دنبال آن ضایعات بیضی شکل با اسپوروزویت های نارنجی/صورتی است (شکل تکمیلی 1).الحاقات استرالیایی حامل ژن های Lanr1 (83A:476 و Tanjil) و AnMan (Mandelup) نسبتاً مقاوم هستند، 0.0331 و 0.0036).برخی از خطوطی که همچنین حامل آلل های Lanr1 و/یا AnMan "مقاوم" هستند علائم بیماری را نشان می دهند.
جالب توجه است، چند خط NLL فاقد هر گونه آلل نشانگر «مقاوم» سطح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز (مقایسه یا بالاتر از ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) را نشان دادند، مانند Boregine (P value < 0.0001 برای هر دو پارامتر)، Bojar (P value < 0.0001 و B ارزش 01-9 برای Population و 0. 0001 برای امتیاز و غیر معنی دار برای وزن). جالب توجه است، چند خط NLL فاقد هر گونه آلل نشانگر «مقاوم» سطح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز (مقایسه یا بالاتر از ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) را نشان دادند، مانند Boregine (P value < 0.0001 برای هر دو پارامتر)، Bojar (P value < 0.0001 و B ارزش 01-9 برای Population و 0. 0001 برای امتیاز و غیر معنی دار برای وزن). Anteresno, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного آللя, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий, чем дль1м длякня) P <0,0001 для обоих параметров, Bojar (معنای P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) و محبوبیت B-549/79b (معنای P <0,0001 для оценки и незначително). جالب توجه است که چندین لاین NLL فاقد هر گونه آلل نشانگر «مقاوم» سطح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز (مقایسه با ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) مانند Boregine (P value < 0.0001 برای هر دو پارامتر)، Bojar (P value < 0.0001 <0.0001) و B ارزش 0.0001 < 0.001<0. 0001/0 برای ارزیابی و برای وزن معنی دار نیست).有趣的是，一些缺乏任何"抗性"标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭 抗性an 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P .001）和种群B-549/79b（得分P 值<0.0001，重量不显着）. جالب است که برخی از سیستم‌های NLL که هیچ نشانگر آنتی ژنی ندارند، مقاومت افقی بالایی (معادل ژن‌های Lanr1 یا AnMan یا بالاتر) نشان می‌دهند، مانند Boregine (هر دو پارامتر P <0.0001)، Bojar (P value < 0.0001، وزن گیاه 0.001) و سویه <7/7، B-549 معنی دار. Interesno, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности»، نشان می دهد высокие уровни устойчивости к antraknozu (сравнимые или выше، чем у генотипов Lanr1) ров <00001)، بوجار (مقدار P <00001، масса растения 0001) و محبوبیت B-549/79b (оценка P-значение <00001، масса незначительна). جالب توجه است، برخی از لاین‌های NLL فاقد هر گونه آلل نشانگر مقاومتی، سطوح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز را نشان دادند (مقایسه با ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan یا بالاتر)، مانند Boregine (مقدار P برای هر دو پارامتر <0.0001)، Bojar (P-value <0.0001-0.0001 <0.0001-0B، وزن گیاه 0.0001-0. 0001، وزن معنی دار نیست).این پدیده احتمال وجود یک منبع ژنتیکی جدید مقاومت را نشان می‌دهد و عدم همبستگی مشاهده‌شده بین ژنوتیپ‌های نشانگر و فنوتیپ‌های بیماری را توضیح می‌دهد (مقدار P از 0.42- تا 0.98-).بنابراین، آزمون کولموگروف-اسمیرنوف نشان داد که داده‌های مربوط به مقاومت آنتراکنوز تقریباً برای امتیازات (P-value 0.25 و 0.11) و توده گیاه (P-value 0.47 و 0.55) به طور معمول توزیع شده است، که نشان می‌دهد من فرض می‌کنم آلل‌های بیشتری نسبت به Lanr1 و AnMan درگیر هستند.
بر اساس نتایج غربالگری مقاومت آنتراکنوز، 4 خط برای آنالیز رونوشت انتخاب شد: 83A:476، Boregine، Mandelup و Population 22660. این خطوط مجدداً از نظر مقاومت سیاه زخم در آزمایشات تلقیح با توالی RNA مورد آزمایش قرار گرفتند، مشروط بر اینکه مانند آزمایش قبلی باشند.مقادیر امتیاز به شرح زیر بود: بورگین (1.39 ± 1.71)، 83A: 476 (1.38 ± 2.09)، Mandelup (1.42 ± 3.82) و جمعیت 22660 (6.11 ± 1.29).
پروتکل Illumina NovaSeq 6000 به طور متوسط ​​به 40.5 جفت Mread در هر نمونه (29.7 تا 54.4 Mreads) دست یافت (جدول S3 تکمیلی).نمرات تراز در توالی مرجع از 75.5٪ تا 88.6٪ متغیر بود.میانگین همبستگی داده های تعداد خوانده شده بین انواع تجربی بین تکرارهای بیولوژیکی از 0.812 تا 0.997 (میانگین 0.959) بود. از 35170 ژن مورد تجزیه و تحلیل، 2917 ژن هیچ بیانی را نشان ندادند و 4785 ژن دیگر در سطح ناچیز بیان شدند (میانگین پایه <5). از 35170 ژن مورد تجزیه و تحلیل، 2917 ژن هیچ بیانی را نشان ندادند و 4785 ژن دیگر در سطح ناچیز بیان شدند (میانگین پایه <5). از 35 170 proanalyzirovannыh Genov 2917 not proyavlyali эkspressii, a ostalьnыe 4785 genov экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). از 35170 ژن مورد تجزیه و تحلیل، 2917 ژن هیچ بیانی نشان ندادند و 4785 ژن باقی مانده در سطح ناچیز بیان شدند (میانگین پایه <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽值< 5）.35170 از 35 170 proanalyzirovannыh genov 2917 ne эkspresssirovalisь, а ostalьnыe 4785 genov nameli незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). از 35170 ژن مورد تجزیه و تحلیل، 2917 ژن بیان نشدند و 4785 ژن باقی مانده بیان ناچیزی داشتند (میانگین پایه <5).بنابراین، تعداد ژن های بیان شده در نظر گرفته شده (میانگین پایه ≥ 5) در طول آزمایش 27468 (78.1٪) بود (جدول تکمیلی S4).
از اولین نقطه زمانی، تمام خطوط NLL با برنامه ریزی مجدد رونوشت (جدول 1) به تلقیح C. lupini (سویه Col-08) پاسخ دادند، با این حال، تفاوت های قابل توجهی بین خطوط مشاهده شد.بنابراین، خط مقاومت 83A:476 (حامل ژن Lanr1) برنامه‌ریزی مجدد رونویسی قابل توجهی را در اولین نقطه زمانی (6 hpi) با افزایش 31-69 برابری تعداد ژن‌های بالا و پایین جدا شده در مقایسه با سایر نقاط زمانی در این زمان نشان داد.علاوه بر این، این اوج کوتاه مدت بود، زیرا بیان تنها چند ژن به طور قابل توجهی در نقطه زمانی دوم (12 اسب بخار) تغییر کرد.جالب اینجاست که بورجین که در آزمایش پیوند نیز مقاومت بالایی را نشان داد، در طول آزمایش تحت چنین برنامه‌ریزی مجدد رونویسی عظیمی قرار نگرفت.با این حال، تعداد ژن های متفاوت بیان شده (DEG) برای Boregine و 83A: 476 در 12 HPI یکسان بود.هم ماندلوپ و هم جمعیت 22660 پیک های DEG را در آخرین نقطه زمانی (48 لیتر در ثانیه) نشان دادند که نشان دهنده تاخیر نسبی در پاسخ های دفاعی است.
از آنجایی که 83A:476 در پاسخ به C. lupini در 6 HPI در مقایسه با سایر خطوط تحت برنامه‌ریزی مجدد رونوشت گسترده قرار گرفت، 91% از DEGهای مشاهده شده در این نقطه زمانی مختص دودمان بودند (شکل 1).با این حال، در پاسخ‌های اولیه بین خطوط مطالعه هم‌پوشانی وجود داشت، به‌طوری‌که به ترتیب 68.5، 50.9 و 52.6 درصد درجه در Boregine، Mandelup و جمعیت 22660 با پاسخ‌های یافت شده در 83A:476 در مقاطع زمانی خاص همپوشانی داشتند.با این حال، این DEG ها تنها بخش کوچکی (0.97-1.70٪) از همه DEG های شناسایی شده در حال حاضر با استفاده از 83A:476 را تشکیل می دهند.علاوه بر این، 11 DEG از همه لاین ها در این زمان منسجم بودند (جدول تکمیلی S4-S6)، از جمله اجزای رایج پاسخ های دفاعی گیاه: پروتئین انتقال چربی (TanjilG_32225)، آنزیم اندوگلوکان-1،3-β-گلوکزید (TanjilG_23384)، دو پروتئین مانند T13anjil8TanjilG2 و Stress-inducibleTanjilG_23384. 31531)، پروتئین لاتکس پایه (TanjilG_32352)، و دو پروتئین دیواره سلولی ساختاری غنی از گلیسین (TanjilG_19701 و TanjilG_19702).همچنین همپوشانی نسبتاً بالایی در پاسخ‌های رونوشت بین 83A:476 و Boregine در 24 HPI (کل 16-38٪ درجه) و بین Mandelup و جمعیت 22660 در 48 HPI (کل 14-20٪ DEG) وجود داشت.
نمودار ون تعداد ژن‌های بیان شده متفاوت (DEG) را در خطوط باریک برگ (NLL) تلقیح شده با Colletotrichum lupini (سویه Col-08 بدست‌آمده از مزارع لوپین در Wierzhenice، لهستان، 1999) نشان می‌دهد.خطوط NLL مورد تجزیه و تحلیل عبارت بودند از: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل Lanr1)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan) و جمعیت 22660 (بسیار حساس).مخفف hpi تا ساعت ها پس از واکسیناسیون می ماند.مقادیر صفر برای ساده کردن نمودار حذف شده است.
مجموعه ای از ژن های بیان بیش از حد در 6 hpi برای حضور دامنه های ژن R متعارف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (جدول تکمیلی S7).این مطالعه القای رونوشت ژن‌های مقاومت به بیماری کلاسیک با دامنه‌های NBS-LRR را تنها در 83A:476 نشان داد.این مجموعه متشکل از یک ژن TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042)، پنج ژن CC-NBS-LRR (tanjilg_06165، tanjilg_06162، tanjilg_22773، tanjilg_22640، و tanjilg_16ur162)، و tanjilg_16ur162، و NBS1، و NBS1، و NBS1_1. LRRE (tanjilg_16162) و همچنین Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) و Four NBS-LRR (TANJILG_16162).همه این ژن ها دارای حوزه های متعارفی هستند که در توالی های حفاظت شده مرتب شده اند.علاوه بر ژن های دامنه NBS-LRR، چندین کیناز RLL در 6 hpi فعال شدند، یعنی یکی در Boregine (TanjilG_19877)، دو مورد در Mandelup (TanjilG_07141 و TanjilG_19877) و در جمعیت 22660 (22660) (Tanjil133014G_0) 7:476.
ژن هایی با بیان تغییر قابل توجهی در پاسخ به تلقیح با C. lupini (سویه Col-08) تحت آنالیز غنی سازی ژن هستی شناسی (GO) قرار گرفتند (جدول تکمیلی S8). غالباً اصطلاح فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد ارائه می‌شود، «GO: 0006952 پاسخ دفاعی» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × خط) با اهمیت بالا (مقدار P <0.001) ظاهر شد (شکل 2). غالباً اصطلاح فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد ارائه می‌شود، «GO: 0006952 پاسخ دفاعی» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × خط) با اهمیت بالا (مقدار P <0.001) ظاهر شد (شکل 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ»، который появлялся در 6 از 16 (време × لینیя) ترکیبی با высокой0 (0.10) (0006952). غالباً اصطلاح فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد ارائه می‌شد «واکنش دفاعی GO: 0006952» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × دودمان) با اهمیت بالا (001/0 P<) ظاهر شد (شکل 2).最常被过度代表的生物过程术语是"GO:0006952 防御反应"，它出现在16 个（×旻个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. معرف ترین اصطلاح فرآیند بیولوژیکی "GO:0006952 پاسخ دفاعی" است که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (时间×线) با اهمیت بالا (مقدار P <0.001) (图2) ظاهر می شود. "GO: 0006952 Defense Response"، که در 6 از 16 ترکیب (در 6 از 16 ترکیبی) (ورم × لینیя) با высокой значимостью (2.00) <0.2 (معنی 1)) است. غالباً اصطلاح فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد ارائه می شود "GO: 0006952 Defense Response" بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × خط) با اهمیت بالا (مقدار P <0.001) ظاهر شد (شکل 2).این عبارت در دو نقطه زمانی در 83A بیش از حد ارائه شد: 476 و بورجین (6 و 24 اسب بخار) و در یک نقطه زمانی در Mandelup و جمعیت 22660 (به ترتیب 12 و 6 اسب بخار).این یک نتیجه مورد انتظار است که پاسخ ضد قارچی خطوط مقاوم را برجسته می کند.علاوه بر این، 83A:476 با القای سریع ژن‌های مربوط به انفجار اکسیداتیو که با عبارت «GO:0055114 فرآیند ردوکس» نشان داده می‌شود، به C. lupini پاسخ داد، در حالی که Boregine پاسخ‌های دفاعی خاصی را نشان داد، مربوط به اصطلاح «GO».:0006950 پاسخ به استرس”.جمعیت 22660 پاسخ مقاومت افقی شامل متابولیت های ثانویه را فعال کرد، و تعداد بیش از حد عبارات "GO:0016104 فرآیند بیوسنتز تری ترپن" و "GO: 0006722 فرآیند متابولیسم تری ترپن" را برجسته کرد (هر دو عبارت متعلق به یک مجموعه از ژن ها هستند، با در نظر گرفتن عبارت Enregability st. 22660. علاوه بر این، واکنش اولیه 83A:476 (6 hpi) و واکنش تاخیری ماندلوپ و جمعیت 22660 شامل عبارت GO:0015979 "فتوسنتز" و سایر فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط است.
اصطلاحات هستی‌شناسی ژنی فرآیند زیستی انتخاب شده در حاشیه‌نویسی ژن‌های بیان شده متفاوت در طول پاسخ‌های رونویسی لوپین با برگ‌های باریک (NLL) تلقیح شده با لوپین سیاه‌زخم (سویه Col-08 به‌دست‌آمده از مزارع لوپین در Wierzhenice، لهستان، در سال 1999) بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرند.خطوط NLL مورد تجزیه و تحلیل عبارت بودند از: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan هموزیگوت) و جمعیت 22660 (مستعد).
از آنجایی که هدف این مطالعه شناسایی ژن‌هایی بود که به مقاومت آنتراکنوز کمک می‌کنند، ژن‌های اختصاص داده شده به اصطلاحات GO "GO: 0006952 پاسخ‌های دفاعی" و "GO: 0055114 فرآیندهای ردوکس" با برش‌آف‌ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند زیرا میانگین خط پایه ≥ 30 با حداقل یک خط است.× نقطه در زمان ترکیب مقادیر معنی دار آماری log2 (تغییر برابری).تعداد ژن هایی که این معیارها را برآورده می کنند برای GO:0006952 65 و برای GO:0055114 524 ژن بود.
83A:476 دو قله DEG مشروح با عبارت GO:0006952 را نشان داد، اولی با 6 ژن در اینچ (64 ژن، تنظیم بالا و پایین) و دومی با 24 ژن در اینچ (15 ژن، فقط تنظیم بالا).Boregine همچنین نشان داد که GO:0006952 در همان نقطه زمانی به اوج خود رسید، اما با DEG کمتر (11 و 8) و فعال سازی ترجیحی.ماندلوپ دو پیک GO:0006952 را در 12 و 48 HPI نشان داد که هر دو حامل 12 ژن بودند (اولین ژن با ژن‌های فعال‌کننده و دومی تنها با ژن‌های سرکوب‌کننده)، در حالی که جمعیت 22660 نفری با 6 HPI (13 ژن) غلبه بیشتری بر اوج افزایش داشتند.مقررات.لازم به ذکر است که 96.4 درصد از GO:0006952 DEG در این پیک ها، نوع پاسخ یکسانی (بالا یا پایین) داشتند که نشان دهنده همپوشانی قابل توجهی در پاسخ های دفاعی با وجود تفاوت در تعداد ژن های درگیر است.بزرگترین گروه از توالی های مربوط به اصطلاح GO:0006952، پروتئین پیام مرتبط با استرس گرسنگی 22 (شبیه SAM22) را کد می کند که به کلاس 10 پروتئین مرتبط با بیماری زایی (PR-10) و لاتکس پروتئین اصلی تعلق دارد.پروتئین مشابه (MLP مانند)) پروتئین (شکل 3).دو گروه در ماهیت بیان و جهت پاسخ متفاوت بودند.ژن‌های کدکننده پروتئین‌های شبه SAM22 القای ثابت و قابل‌توجهی را در زمان‌های اولیه (6 یا 12 hpi) نشان دادند و به طور کلی در پایان آزمایش (48 hpi) پاسخ ندادند، در حالی که پروتئین‌های شبیه MLP هماهنگی را در 6 hpi نشان دادند.hpi83A:476 و Mandelup با 48 اسب بخار در اینچ، تقریباً تمام نقاط داده دیگر پاسخگو نبودند.علاوه بر این، تفاوت در پروفایل‌های بیان ژن‌های پروتئینی شبه SAM22 به دنبال تنوع مشاهده‌شده در مقاومت آنتراکنوز بود، زیرا خطوط مقاوم‌تر دارای نقاط زمانی بیشتری بودند که به طور قابل‌توجهی این ژن‌ها را نسبت به ژن‌های حساس‌تر القا می‌کردند.یک ژن PR-10 مشابه LlR18A/B، الگوی بیانی بسیار مشابهی با ژن پروتئینی شبیه SAM22 نشان داد.
اجزای اصلی عبارت فرآیند بیولوژیکی "GO: 0006952 Defense Response" و الگوهای بیان ژن‌های کاندید آلل‌های Lanr1 و AnMan شناسایی شدند.مقیاس Log2 مقادیر log2 (تغییر برابری) را بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین، Wizhenica، لهستان، 1999) و شاهد (تلقیح شده با شم) در یک نقطه زمانی نشان می دهد.خطوط لوپین با برگ باریک زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan هموزیگوت)، و جمعیت 22660 (مستعد).
علاوه بر این، پروفایل بیان ژن‌های کاندید RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) و AnMan (TanjilG_12861) مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 3).ژن TanjilG_05042 پاسخ قابل توجهی (فعال سازی) را در 83A:476 تنها در اولین نقطه زمانی (6 hpi) نشان داد، در حالی که TanjilG_12861 در Mandeloop تنها در دو نقطه زمانی معنی دار بود: 6 hpi (تنظیم پایین) و 24 hpi (6 hpi).با.).قابل تنظیم)).
ژن‌هایی که بیش از حد بیان می‌شوند در اصطلاح GO:0055114 «فرایند ردوکس» ژن‌هایی بودند که پروتئین‌های سیتوکروم P450 و پراکسیداز را کد می‌کنند (شکل 4).برای نمونه های جدا شده از 83A:476 در 6 HPI، حداکثر یا حداقل مقادیر log2 (تغییر برابری) (برای 86.6٪ از ژن ها) به طور کلی بین گیاهان تلقیح شده و شاهد مشاهده شد، که پاسخ بالای این ژنوتیپ به جنسیت تلقیح شده را برجسته می کند.83A:476 مهمترین GO را نشان داد: 0055114 درجه در 6 hpi (503 ژن)، در حالی که بقیه خطوط در 48 hpi (Boregine، 31 ژن؛ Mandelup، 85 ژن؛ و جمعیت 22660، 78 ژن)).در اکثر ژن های خانواده GO:0055114، دو نوع پاسخ به واکسیناسیون (فعال سازی و مهار) مشاهده شد.جالب توجه است، تا 97.6٪ از DEG های شناسایی شده برای اصطلاح GO: 0055114 در ماندلوپ با قدرت 48 اسب بخار، این مشاهدات نشان می دهد که، علیرغم مقیاس بسیار کوچکتر (یعنی تعداد ژن های ردوکس جهش یافته، 85 در مقابل 503)، الگوی پاسخ تأخیرآمیز پاسخ رونوشت 4 به رونوشت 4 است. 76.در Boregine و جمعیت 22660، این همگرایی کمتر به ترتیب 51.6٪ و 75.6٪ است.
الگوهای بیان اجزای اصلی اصطلاح فرآیند بیولوژیکی "GO:0055114 فرآیند ردوکس" آشکار شد.مقیاس Log2 مقادیر log2 (تغییر برابری) را بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین، Wizhenica، لهستان، 1999) و شاهد (تلقیح شده با شم) در یک نقطه زمانی نشان می دهد.خطوط لوپین با برگ باریک زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan هموزیگوت)، و جمعیت 22660 (مستعد).
83A:476 پاسخ‌های رونویسی به تلقیح با C. lupini (سویه Col-08) همچنین شامل خاموش کردن هماهنگ ژن‌های منسوب به اصطلاح GO:0015979 "فتوسنتز" و سایر فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط بود (شکل 5).این مجموعه GO:0015979 DEG حاوی 105 ژن بود که به طور قابل توجهی در 6 اسب بخار در 83A:476 سرکوب شدند.در این زیرمجموعه، 37 ژن نیز در Mandelup در 48 HPI و 35 ژن در همان نقطه زمانی در جمعیت 22660، از جمله 19 DEG مشترک در هر دو ژنوتیپ، کاهش یافتند.هیچ DEG مربوط به اصطلاح GO: 0015979 به طور قابل توجهی در هیچ ترکیبی (خط x زمان) فعال نشد.
الگوهای بیان اجزای اصلی اصطلاح فرآیند بیولوژیکی "GO:0015979 Photosynthesis" آشکار شد.مقیاس Log2 مقادیر log2 (تغییر برابری) را بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین، Wizhenica، لهستان، 1999) و شاهد (تلقیح شده با شم) در یک نقطه زمانی نشان می دهد.خطوط لوپین با برگ باریک زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan هموزیگوت)، و جمعیت 22660 (مستعد).
بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل بیان افتراقی و احتمالاً در پاسخ‌های دفاعی در برابر قارچ‌های بیماری‌زا، این مجموعه از هفت ژن برای تعیین کمیت پروفایل‌های بیان با استفاده از PCR بلادرنگ انتخاب شد (جدول تکمیلی S9).
ژن پروتئین فرضی TanjilG_10657 به طور قابل توجهی در تمام خطوط و نقاط زمانی مورد مطالعه در مقایسه با گیاهان شاهد (مقلید) القا شد (جدول تکمیلی S10, S11).علاوه بر این، نمایه بیان TanjilG_10657 روند افزایشی را در طول آزمایش برای همه خطوط نشان داد.جمعیت 22660 بیشترین حساسیت TanjilG_10657 را به تلقیح با فعال سازی 114 برابری و بالاترین سطح بیان نسبی (4.4 ± 0.4) در 24 HPI نشان داد (شکل 6a).ژن پروتئین PR10 LlR18A TanjilG_27015 نیز فعال شدن را در تمام خطوط و نقاط زمانی با اهمیت آماری در اکثر نقاط داده نشان داد (شکل 6b).مشابه TanjilG_10657، بالاترین سطح بیان نسبی TanjilG_27015 در 22660 جمعیت تلقیح شده در 24 HPI (2.4 ± 19.5) مشاهده شد.ژن اسید اندوکیتیناز TanjilG_04706 به طور قابل توجهی در تمام خطوط و در تمام نقاط زمانی به جز Boregine 6 hpi تنظیم مثبت شد (شکل 6c).در اولین نقطه زمانی (6 HPI) در 83A:476 (به میزان 10.5 برابر) به شدت القا شد و در خطوط دیگر به طور متوسط ​​افزایش یافت (6.6-7.5 برابر).در طول آزمایش، بیان TanjilG_04706 در 83A:476 و Boregine در سطوح مشابه باقی ماند، در حالی که در Mandelup و جمعیت 22660 به طور قابل توجهی افزایش یافت و به مقادیر نسبتاً بالایی رسید (به ترتیب 1.5 ± 5.9 و 1.5 ± 6.2).ژن شبه اندوگلوکان-1،3-β-گلوکوزیداز TanjilG_23384 در دو نقطه زمانی اول (6 و 12 اسب بخار) در همه خطوط به جز جمعیت 22660 فعال سازی بالایی را نشان داد (شکل 6d).بالاترین سطح بیان نسبی TanjilG_23384 در نقطه زمانی دوم (12 اسب بخار) در Mandelup (2.7 ± 0.3) و 83A: 476 (1.5 ± 0.1) مشاهده شد.در 24 HPI، بیان TanjilG_23384 در تمام لاین های مورد مطالعه نسبتاً کم بود (از 0.009 ± 0.04 تا 0.12 ± 0.44).
نمایه های بیان ژن های انتخاب شده (ag) توسط PCR کمی نشان داده شد.اعداد 6، 12 و 24 نشان دهنده ساعات پس از واکسیناسیون هستند.ژن های LanDExH7 و LanTUB6 برای نرمال سازی و LanTUB6 برای کالیبراسیون بین سری استفاده شد.نوارهای خطا نشان دهنده انحراف استاندارد بر اساس سه تکرار بیولوژیکی است که هر یک از آنها میانگین سه تکرار فنی است. اهمیت آماری تفاوت در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده در سال 1999 از مزرعه لوپین در Wierzenica، لهستان) و شاهد (تلقیح ساختگی) در بالای نقاط داده مشخص شده است (*P value < 0.05, **P 0.0.0). اهمیت آماری تفاوت در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده در سال 1999 از مزرعه لوپین در Wierzenica، لهستان) و شاهد (تلقیح ساختگی) در بالای نقاط داده مشخص شده است (*P value < 0.05, **P 0.0.0). Статистическая значитемость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchen در 1999 در سال 1999 г. х (*معنای P <0.05، **معنای P ≤ 0.01، ***معنای P ≤ 0.001). تفاوت آماری معنی‌داری در سطح بیان بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به‌دست‌آمده در سال 1999 از مزرعه لوپین در Wierzhenice، لهستان) و شاهد (تلقیح شده با شم) در بالای نقاط داده مشاهده شد (*P value < 0.05، **P-value 0.0 ≤ 0.0 ≤).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模構水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值<0.05، **P 值≤ 0.01، ***P 倂0≤接种 （colletotrichum lupini， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煎平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05، **P ≤ 0.01، ***P ≤ 0.001) Статистически расте значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchennый со полей люпина во ورژنیце, لهستان, در 1999, در سال 1999) нных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). تفاوت‌های آماری معنی‌داری در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به‌دست‌آمده از مزارع لوپین در Verzhenice، لهستان، در سال 1999) و شاهد (تلقیح شده با شم) در بالای نقاط داده مشاهده شد (*P value < 0.05 , **P-0-value ≥0.خطوط NLL مورد تجزیه و تحلیل عبارت بودند از: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan هموزیگوت)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته) و جمعیت 22660 (مستعد).
ژن کاندید TanjilG_05042 در جایگاه Lanr1 الگوی بیان متفاوتی را از پروفایل های به دست آمده از مطالعات RNA-seq نشان داد (شکل 6e).فعال سازی قابل توجهی از این ژن در Mandelup و جمعیت 22660 مشاهده شد (به ترتیب تا 39.7 و 11.7 بار)، که منجر به سطوح بیان نسبتاً بالایی شد (به ترتیب تا 1.4 ± 0.14 و 7.2 ± 1.3).83A:476 همچنین مقداری دگرگونی ژن TanjilG_05042 را نشان داد (تا 3.8 برابر)، با این حال، سطوح بیان نسبی به دست آمده (0.002 ± 0.044) بیش از 30 برابر کمتر از موارد مشاهده شده در Mandelup و جمعیت 22660 بود.تجزیه و تحلیل با qPCR تفاوت معنی‌داری را در سطوح بیان بین ژنوتیپ‌ها در واریته‌های واکسینه ساختگی (شاهد) نشان داد که به اختلاف 58 برابری بین جمعیت‌های 22660 و 83A:476 و همچنین بین جمعیت‌های 22660 و 22660 رسید. تفاوت دو برابری بین Boregine و Mandalup به دست آمد.
ژن کاندید در جایگاه AnMan، TanjilG_12861، در پاسخ به واکسیناسیون در 83A:476 و Mandelup فعال شد، در جمعیت 22660 خنثی بود، و در Boregine کاهش یافت (شکل 6f).بیان نسبی ژن TanjilG_12861 در 83A: 476 (0.14±0.01) بیشترین میزان را داشت.ژن پروتئین شوک حرارتی 17.4 کیلو دالتون کلاس I TanjilG_05080 HSP17.4 سطوح بیان نسبی کمتری را در تمام سویه ها و نقاط زمانی مورد مطالعه نشان داد (شکل 6g).بالاترین مقدار در 24 HPI در جمعیت 22660 مشاهده شد (0.02 ± 0.14، افزایش هشت برابری در پاسخ به واکسیناسیون).
مقایسه پروفایل های بیان ژن (شکل 7) نشان داد که همبستگی بالایی بین TanjilG_10657 و چهار ژن دیگر وجود دارد: TanjilG_27015 (r = 0.89)، TanjilG_05080 (r = 0.85)، TanjilG_05042 (r = 0.60 (r = 0.80)چنین نتایجی ممکن است نشان‌دهنده هم‌تنظیمی این ژن‌ها در طول پاسخ‌های دفاعی باشد.ژن‌های TanjilG_12861 و TanjilG_23384 پروفایل‌های بیان متفاوتی با مقادیر ضریب همبستگی پیرسون پایین‌تر (به ترتیب از 0.08 تا 0.43 و 0.19- تا 0.28) نسبت به سایر ژن‌ها نشان دادند.
همبستگی بین پروفایل های بیان ژن با استفاده از PCR کمی شناسایی شد.خطوط لوپین با برگ باریک زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، ماندلوپ (مقاوم نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan هموزیگوت)، بورجین (مقاوم، پس زمینه ژنتیکی ناشناخته)، و جمعیت 22660 (مستعد).سه نقطه زمانی (6، 12 و 24 ساعت پس از تلقیح)، شامل گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین در Wierzhenice، لهستان، در سال 1999) و شاهد (تلقیح شده با شم) محاسبه شد.این مقیاس مقدار ضریب همبستگی پیرسون را نشان می دهد.
بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده در 6 اسب بخار در هر اینچ، WGCNA روی 9981 DEG شناسایی شده با مقایسه گیاهان تلقیح شده و شاهد برای تمرکز بر پاسخ‌های دفاعی اولیه انجام شد (جدول تکمیلی S12).بیست و دو ماژول ژن (خوشه) با پروفایل های بیان همبسته (مثبت یا منفی) بین ژنوتیپ ها و انواع تجربی پیدا شد. به طور متوسط، سطوح بیان ژن به ترتیب 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 نزولی بود (اما در هر دو گونه، این روند در گیاهان شاهد قوی‌تر بود). به طور متوسط، سطوح بیان ژن به ترتیب 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 نزولی بود (اما در هر دو گونه، این روند در گیاهان شاهد قوی‌تر بود). در среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 (در обоих варијантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). به طور متوسط، سطوح بیان ژن به ترتیب 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 کاهش یافت (اما در هر دو نوع، این روند در گیاهان شاهد قوی‌تر بود).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 的顺序下降（然而，在两在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> جمعیت 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 在在 植物 中 更）.............. در среднем уровни экспрессии генов снижались во رяду 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 به طور متوسط، سطح بیان ژن در سری 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 کاهش یافت (اما، در هر دو نوع، این روند در گیاهان شاهد قوی‌تر بود).واکسیناسیون منجر به تنظیم مثبت بیان ژن، به ویژه در ماژول های 18، 19، 14، 6 و 1 (به ترتیب اثر نزولی)، تنظیم منفی (مانند ماژول های 9 و 20) یا با اثرات خنثی (مثلاً ماژول های 11، 22، 8 و 13) شد.تجزیه و تحلیل غنی‌سازی اصطلاح GO (جدول تکمیلی S13) "GO: 0006952 پاسخ‌های حفاظتی" را برای ماژول تلقیح شده (18) با حداکثر فعال‌سازی نشان داد، از جمله ژن‌های تجزیه‌وتحلیل شده توسط qPCR (TanjilG_04706، TanjilG_23384، TanjilG_23384، TanjilG_23384، TanjilG_1065، TanjilG_23384، TanjilG_1065، TanjilG_1065). ماژول های فتوسنتز فشرده (9).تغلیظ ماژول 18 (شکل 8) به عنوان ژن TanjilG_26536 شناسایی شد که پروتئین LlR18B شبیه PR-10 را کد می کند، و متمرکز کننده ماژول 9 به عنوان ژن TanjilG_28955 شناسایی شد که پروتئین PsbQ فتوسیستم II را کد می کند.یک ژن کاندید مقاومت به آنتراکنوز Lanr1، TanjilG_05042، در ماژول 22 (شکل 9) یافت شد و با عبارات "GO:0044260 فرآیندهای متابولیک ماکرومولکولی سلولی" و "GO:0006355 تنظیم رونویسی، الگوی DNA" مرتبط است که حاوی hub است.ژن فاکتور رونویسی استرس گرمایی A-4a (HSFA4a) را کد می کند.
تجزیه و تحلیل شبکه وزنی بیان ژنی ماژول ها با اصطلاحات فرآیند بیولوژیکی بیش از حد ارائه شده "GO: 0006952 پاسخ های دفاعی".بستن برای برجسته کردن چهار ژن مورد تجزیه و تحلیل با qPCR (TanjilG_04706، TanjilG_23384، TanjilG_10657 و TanjilG_27015) ساده شد.
تجزیه و تحلیل شبکه وزنی بیان مشترک ژن یک ماژول با اصطلاح فرآیند بیولوژیکی بیش از حد ارائه شده "GO: 0006355: تنظیم رونویسی، الگوی DNA" و حامل یک ژن مقاومت به آنتراکنوز نامزد Lanr1 TanjilG_05042.بستن برای جداسازی ژن TanjilG_05042 و ژن مرکزی TanjilG_01212 ساده شد.
غربالگری مقاومت آنتراکنوز جمع آوری شده در استرالیا نشان داد که اکثر ارقام زودرس منتشر شده حساس بودند.Kalya، Coromup و Mandelup به عنوان نسبتاً مقاوم توصیف شده اند، در حالی که Wonga، Tanjil و 83A:476 به عنوان بسیار مقاوم توصیف شده اند26،27،31.آلل مقاومت یکسانی داشتند که Lanr1 تعیین می‌شد و Coromup و Mandelup یک آلل متفاوت داشتند که AnMan10، 26، 39 تعیین می‌شد، در حالی که Kalya آلل متفاوتی را منتقل می‌کرد.، Lanr2.غربالگری مقاومت آنتراکنوز در آلمان منجر به شناسایی یک خط مقاوم Bo7212 با یک آلل دیگر غیر از Lanr1، به نام LanrBo36 شد.
مطالعه ما فرکانس بسیار کم (حدود 6٪) از آلل Lanr1 را در ژرم پلاسم آزمایش شده نشان داد.این مشاهدات با نتایج غربالگری ژرم پلاسم اروپای شرقی با استفاده از نشانگرهای Anseq3 و Anseq4 مطابقت دارد که نشان داد آلل Lanr1 تنها در دو لاین بلاروسی وجود دارد.این نشان می دهد که آلل Lanr1 هنوز به طور گسترده توسط برنامه های اصلاح نژاد محلی استفاده نمی شود، برخلاف استرالیا، جایی که یکی از آلل های کلیدی برای اصلاح به کمک نشانگر است.این ممکن است به دلیل سطح کمتر مقاومت ارائه شده توسط آلل Lanr1 در شرایط میدانی اروپا در مقایسه با گزارش استرالیا باشد.علاوه بر این، مطالعات آنتراکنوز در مناطق پر بارندگی در استرالیا نشان داده است که پاسخ های مقاومتی با واسطه آلل Lanr1 ممکن است در شرایط آب و هوایی که به نفع رشد و توسعه سریع پاتوژن است، مؤثر نباشد.در واقع، در مطالعه حاضر، برخی از علائم آنتراکنوز در ژنوتیپ‌های حامل آلل Lanr1 نیز مشاهده شد که نشان می‌دهد مقاومت ممکن است در شرایط بهینه برای ایجاد C. lupini ناپدید شود.علاوه بر این، تفسیرهای مثبت کاذب از حضور نشانگرهای Anseq3 و Anseq4، که تقریباً 1 سانتی متر از مکان Lanr1 فاصله دارند، ممکن است 28،30،43.
مطالعه ما نشان داد که 83A:476، حامل آلل Lanr1، به تلقیح C. lupini با بازبرنامه‌ریزی رونویسی در مقیاس بزرگ در اولین نقطه زمانی تحلیل شده (6 hpi) پاسخ داد، در حالی که در Mandelup، حامل آلل AnMan، پاسخ‌های رونویسی بسیار دیرتر مشاهده شد.(از 24 تا 48 اسب بخار).این تغییرات زمانی در پاسخ‌های دفاعی با تفاوت‌هایی در علائم بیماری مرتبط است و اهمیت تشخیص زودهنگام پاتوژن برای پاسخ موفقیت‌آمیز به مقاومت را برجسته می‌کند.برای آلوده کردن بافت گیاهی، هاگ سیاه زخم باید چندین مرحله رشد را در سطح میزبان طی کند، از جمله جوانه زنی، تقسیم سلولی و تشکیل یک آپرسوریوم.زائده یک ساختار عفونی است که به سطح میزبان می چسبد و نفوذ به بافت میزبان را تسهیل می کند.بنابراین، اسپور C. gloeosporioides در عصاره نخود اولین تقسیم هسته را پس از 75-90 دقیقه انکوباسیون، تشکیل لوله جوانه پس از 90-120 دقیقه و سرکوب پس از 4 ساعت نشان داد.انبه C. gloeosporioides پس از 3 ساعت انکوباسیون بیش از 40 درصد جوانه زنی کندیال و پس از 4 ساعت حدود 20 درصد تشکیل فشاردهنده نشان داد.ژن CAP20 مرتبط با حدت C. gloeosporioides پس از 3.5 ساعت انکوباسیون در موم سطح آووکادو با غلظت‌های بالای پروتئین CAP20 پس از 4 ساعت و 46 دقیقه، فعالیت رونویسی را در کنیدی‌های اپی‌فیت‌ساز نشان داد.به طور مشابه، فعالیت ژن های بیوسنتز ملانین در C. trifolii در طی یک انکوباسیون 2 ساعته و پس از تشکیل یک آپپرسوریوم پس از 1 ساعت القا شد.مطالعات بر روی بافت برگ نشان داده است که توت فرنگی تلقیح شده با C. acutatum ابتدا با قدرت 8 اسب بخار مهار می شود، در حالی که گوجه فرنگی تلقیح شده با کوکد C. ابتدا در 4 hpi48،49 سرکوب می شود.تا حد زیادی با مقیاس زمانی Colletotrichum spp سازگار است.فرآیند عفونیپاسخ‌های دفاعی سریع به 83A:476 نشان‌دهنده دخالت ژن‌های مقاومت گیاهی و ایمنی تحریک‌شده توسط عامل (ETI) در این خط است، در حالی که پاسخ‌های تاخیری ماندلوپ از فرضیه 50 ایمنی تحریک‌شده با الگوی مولکولی مرتبط (MTI) پشتیبانی می‌کند. پاسخ‌های اولیه به 83A: 476 و Mandelup.همپوشانی جزئی بین ژن‌های تنظیم‌شده بالا یا پایین در پاسخ تاخیری نیز از این مفهوم پشتیبانی می‌کند، زیرا ETI اغلب به عنوان یک پاسخ MTI شتاب‌دار و تقویت‌شده در نظر گرفته می‌شود که به مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی در محل عفونت، معروف به شوک آنافیلاکتیک، منجر می‌شود.
بیشتر ژن‌هایی که به عبارت بیش از حد ارائه‌شده Gene Ontology GO:0006952 «واکنش دفاعی» نسبت داده می‌شوند، 11 همولوگ پروتئین پیام ناشتا 22 ناشی از استرس (مشابه SAM22) و هفت شبه پروتئین لاتکس اصلی (MLPs) هستند.پروتئین های مشابه 31، 34، 43 و 423 شباهت توالی را نشان دادند.ژن‌های شبه SAM22 فعال‌سازی قابل‌توجهی را نشان دادند که طولانی‌تر ماند و سطوح مقاومت آنتراکنوز را افزایش داد (83A:476 و Boregine).با این حال، ژن‌های شبه MLP فقط در خطوط حامل آلل مقاومت نامزد (83A:476/Lanr1 در 6 hpi و Mandelup/AnMan در 24 اسب بخار) تنظیم شدند.لازم به ذکر است که همه همولوگ های SAM22-مانند شناسایی شده از یک خوشه ژنی با حجم تقریبی 105 کیلوبایت منشأ می گیرند، در حالی که ژن های شبه MLP از مناطق جداگانه ژنوم منشاء می گیرند.فعال‌سازی هماهنگ چنین ژن‌های مشابه SAM22 نیز در مطالعه قبلی ما در مورد مقاومت NLL در برابر تلقیح Diaporthetoxica یافت شد، که نشان می‌دهد آنها در اجزای افقی پاسخ دفاعی نقش دارند.این نتیجه گیری همچنین توسط گزارش های پاسخ مثبت ژن های مشابه SAM22 به آسیب یا درمان با اسید سالیسیلیک، القاء کننده های قارچی یا پراکسید هیدروژن پشتیبانی می شود.
نشان داده شده است که ژن‌های شبه MLP به تنش‌های غیرزیستی و زیستی مختلف، از جمله عفونت‌های قارچی باکتریایی، ویروسی و بیماری‌زا در بسیاری از گونه‌های گیاهی پاسخ می‌دهند.جهت پاسخ به فعل و انفعالات خاص بین گیاهان و پاتوژن ها از افزایش شدید (یعنی در هنگام آلودگی پنبه با Verticillium dahliae) تا کاهش قابل توجه (یعنی پس از آلودگی درخت سیب با گونه های Alternaria) متغیر بود.کاهش قابل توجهی از ژن MLP مانند 423 در طول دفاع آووکادو در برابر عفونت F. niger و در طول عفونت درخت سیب Botryosphaeria berengeriana f مشاهده شده است.cn.piricola و Alternaria alternata پاتوتیپ های سیب هستند58،59.علاوه بر این، کالوس‌های سیبی که ژن MLP مانند 423 را بیان می‌کنند، بیان کمتری از ژن‌های مرتبط با مقاومت داشتند و بیشتر مستعد ابتلا به عفونت قارچی بودند.به دنبال Fusarium oxysporum f، ژن MLP مانند 423 نیز در ژرم پلاسم لوبیا معمولی مقاوم سرکوب شد.cn.عفونت لوبیا 60.
سایر اعضای خانواده PR-10 که در مطالعه RNA-seq ما شناسایی شدند، ژن‌های LlR18A و LlR18B در پاسخ به افزایش تنظیم، و همچنین ژن تنظیم‌شده (1 ژن) یا تنظیم‌شده (3 ژن) برای پروتئین انتقال چربی DIR1 بودند..علاوه بر این، WGCNA ژن LlR18B را به عنوان یک مرکز در این ماژول برجسته می کند، که بسیار مستعد واکسیناسیون است و چندین ژن پاسخ محافظ را حمل می کند.ژن‌های LlR18A و LlR18B در برگ‌های لوپین زرد در پاسخ به باکتری‌های بیماری‌زا و همچنین در ساقه‌های NLL پس از تلقیح D. toxica القا شدند، در حالی که همولوگ برنج این ژن‌ها، RSOsPR10، به سرعت توسط یک عفونت قارچی القا شد. پروتئین های انتقال چربی غیر اختصاصی که برای شروع مقاومت اکتسابی سیستمیک (SAR) مورد نیاز است.با توسعه واکنش های محافظتی، پروتئین DIR1 از کانون عفونت از طریق آبکش منتقل می شود تا SAR را در اندام های دور ایجاد کند.جالب توجه است که ژن TanjilG_02313 DIR1 به طور قابل توجهی در اولین نقطه زمانی در خطوط 84A:476 و جمعیت 22660 القا شد، اما مقاومت آنتراکنوز تنها در خط 84A:476 با موفقیت توسعه یافت.این ممکن است نشان‌دهنده برخی زیرعملکردهای ژن DIR1 در NLL باشد، زیرا سه همولوگ باقی‌مانده تنها در خط 83A:476 در 6 اسب بخار به تلقیح پاسخ دادند و این پاسخ به سمت پایین هدایت شد.
در مطالعه ما، رایج ترین اجزای مربوط به فرآیند بیولوژیکی به نام "فرایند ردوکس GO:0055114" پروتئین سیتوکروم P450، پراکسیداز، اسید لینولئیک 9S-/13S-لیپوکسیژناز و 1-آمینو سیکلوپروپان-1- اکسیداز اسید کربوکسیلیک بود.علاوه بر این، WGCNA ما همولوگ HSFA4a را به عنوان یک هاب حامل ماژول‌هایی مانند نامزد ژن مقاومت Lanr1 TanjilG_05042 تعریف می‌کند.HSFA4a جزء تنظیم وابسته به ردوکس رونویسی هسته ای در گیاهان است.
پروتئین‌های سیتوکروم P450 اکسیدوردوکتازهایی هستند که واکنش‌های هیدروکسیلاسیون وابسته به NADPH و/یا O2 را در متابولیسم اولیه و ثانویه، از جمله متابولیسم بیگانه‌بیوتیک‌ها، و همچنین هورمون‌ها، اسیدهای چرب، استرول‌ها، اجزای دیواره سلولی، پلیمرهای زیستی و بیوسنتز گیاهی را کاتالیز می‌کنند. عملکرد از -10.6 log2 (تغییر برابری) به 5.7 به دلیل تعداد زیادی همولوگ تغییر یافته (37) و تفاوت در الگوهای پاسخ بین ژن های خاص کاهش یافت که بازتاب یک تجدید نظر رو به بالا است..استفاده از داده‌های RNA-seq برای روشن کردن عملکرد بیولوژیکی احتمالی ژن‌های NLL در چنین ابرخانواده پروتئینی بزرگ، بسیار گمانه‌زنی خواهد بود.با این حال، شایان ذکر است که برخی از ژن‌های سیتوکروم P450 با افزایش مقاومت در برابر قارچ‌ها یا باکتری‌های بیماری‌زا همراه هستند، از جمله سهمی در واکنش‌های آلرژیک69،70،71.
پراکسیدازهای کلاس III آنزیم‌های گیاهی چند عملکردی هستند که در طیف وسیعی از فرآیندهای متابولیکی در طول رشد و نمو گیاه و همچنین در پاسخ به تنش‌های محیطی مانند شوری، خشکی، شدت نور بالا و حمله بیماری‌زا نقش دارند.پراکسیدازها در تعامل چندین گونه گیاهی با آنتراسیس از جمله Stylosanthes humilis و C. gloeosporioides، Lens culinaris و C. truncatum، Phaseolus vulgaris و C. Lindemuthianum، Cucumis sativus و C. lagenarium نقش دارند.پاسخ بسیار سریع است، گاهی اوقات حتی در 4 HPI، قبل از نفوذ قارچ به بافت گیاه73.ژن پراکسیداز نیز به تلقیح D. toxica NLL پاسخ داد.علاوه بر عملکرد معمول آنها برای تنظیم انفجار اکسیداتیو یا از بین بردن استرس اکسیداتیو، پراکسیدازها می توانند با ایجاد موانع فیزیکی بر اساس تقویت دیواره سلولی در طول lignification، زیر واحد یا اتصال متقابل ترکیبات خاص، با رشد پاتوژن تداخل کنند.این عملکرد را می توان در سیلیکون به ژن TanjilG_03329 نسبت داد که یک آنیون پراکسیداز احتمالی تشکیل لیگنین را کد می کند که در مطالعه ما در خط مقاوم 83A:476 در 6 HPI به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شد، اما نه در سایر سویه ها و نقاط زمانی که پاسخ ندادند.
9S-/13S-لیپوکسیژناز اسید لینولئیک اولین گام در مسیر اکسیداتیو بیوسنتز لیپیدی است.محصولات این مسیر دارای عملکردهای متعددی در دفاع گیاه هستند، از جمله تقویت دیواره سلولی از طریق تشکیل رسوبات کالوز و پکتین و تنظیم استرس اکسیداتیو از طریق تولید گونه‌های فعال اکسیژن 79،80،81،82،83.در مطالعه حاضر، بیان لینولئیک اسید 9S-/13S-لیپوکسیژناز در همه سویه‌ها تغییر کرد، اما در جمعیت حساس 22660، تنظیم دگرگونی در مقاطع زمانی مختلف حاکم بود، در حالی که در سویه‌های حامل Lanr1 مقاوم و آلل AnMan، بر تنوع این لایه‌های محافظ ژن‌لیپینوکس تأکید می‌کند.
همولوگ 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) هنگام تلقیح با لوپین به طور قابل توجهی تنظیم مثبت (9 ژن) یا کاهش (2 ژن) شد.به جز دو استثنا، همه این پاسخ ها در 6 اسب بخار رخ داده است.در 83A:476.واکنش آنزیمی با واسطه پروتئین های ACO مرحله محدود کننده سرعت در تولید اتیلن است و بنابراین بسیار تنظیم شده است.اتیلن یک هورمون گیاهی است که نقش های مختلفی در تنظیم رشد گیاه و پاسخ به شرایط تنش غیرزیستی و زیستی ایفا می کند.القای رونویسی ACO و فعال شدن مسیر سیگنال دهی اتیلن در افزایش مقاومت برنج به قارچ همی بیوتروفیک oryzae oryzae با تنظیم تولید گونه های اکسیژن فعال و فیتوالکسین ها نقش دارد.یک فرآیند بسیار مشابه عفونت برگ که بین M. oryzae و C. lupini88,89 یافت شده است، در برابر پس‌زمینه افزایش قابل توجه همولوگ‌های ACO در خط 83A:476 گزارش شده در این مطالعه، امکان ایجاد مقاومت به NLL آنتراکنوز اتیلن را به عنوان یک مرحله مرکزی سیگنال‌دهنده در مسیرهای مولکولی تغییر می‌دهد.
در مطالعه حاضر، سرکوب در مقیاس بزرگ بسیاری از ژن‌های مرتبط با فتوسنتز با 6 اسب بخار در 83A:476 و در 48 اسب بخار در ماندلوپ و جمعیت 22660 مشاهده شد.میزان و پیشرفت این تغییرات متناسب با سطح است.مقاومت آنتراکنوز در این آزمایش مشاهده شد.اخیراً سرکوب قوی و اولیه رونوشت‌های مرتبط با فتوسنتز در چندین مدل از فعل و انفعالات گیاه و بیماری‌زا، از جمله باکتری‌ها و قارچ‌های بیماری‌زا گزارش شده است.عجله (از 2 HPI در برخی از فعل و انفعالات) و سرکوب جهانی ژن‌های مرتبط با فتوسنتز در پاسخ به عفونت می‌تواند باعث ایجاد مصونیت گیاهی بر اساس استقرار گونه‌های فعال اکسیژن و تعامل آنها با مسیر اسید سالیسیلیک برای واسطه‌گری واکنش‌های آلرژیک شود.
در نتیجه، مکانیسم‌های پاسخ دفاعی پیشنهاد شده برای مقاوم‌ترین دودمان (83A:476) شامل شناسایی سریع پاتوژن توسط ژن R (احتمالاً TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) و سیگنال‌دهی اسید سالیسیلیک و اتیلن با واسطه پاسخ آلرژیک و به دنبال آن ایجاد SAR دوربرد است.عمل توسط پروتئین DIR-1 پشتیبانی می شود.لازم به ذکر است که دوره بیوتروفیک عفونت C. lupini بسیار کوتاه است (تقریباً 2 روز) و به دنبال آن رشد نکروز95 می باشد.انتقال بین این مراحل ممکن است با نکروز و بیان پروتئین های القایی با اتیلن همراه باشد که به عنوان محرک واکنش های حساسیت بیش از حد در گیاهان میزبان عمل می کنند.بنابراین، پنجره زمانی برای گرفتن موفقیت آمیز C. lupini در مرحله بیوتروفیک بسیار باریک است.برنامه‌ریزی مجدد ژن‌های مرتبط با ردوکس و فتوسنتز مشاهده شده در 83A:476 در 6 hpi با پیشرفت هیف‌های قارچی سازگار است و توسعه یک پاسخ محافظتی موفقیت‌آمیز در مرحله بیوتروفیک را نشان می‌دهد.پاسخ‌های رونویسی مندلوپ و جمعیت 22660 ممکن است برای گرفتن قارچ قبل از تغییر به رشد نکروزه خیلی تاخیر داشته باشد، با این حال، ماندلوپ ممکن است موثرتر از جمعیت 22660 باشد زیرا تنظیم نسبتاً سریع پروتئین PR-10 باعث افزایش مقاومت افقی می‌شود.
ETI، که توسط ژن متعارف R هدایت می شود، به نظر می رسد یک مکانیسم رایج برای مقاومت لوبیا در برابر آنتراکنوز باشد.بنابراین، در مدل حبوبات Medicago truncatula، مقاومت به آنتراکنوز توسط ژن RCT1، عضوی از کلاس ژن گیاهی TIR-NBS-LRR97 ایجاد می‌شود.این ژن همچنین در هنگام انتقال به گیاهان حساس، مقاومت آنتراکنوز طیف وسیعی را در یونجه ایجاد می کند.در لوبیا معمولی (P. vulgaris)، بیش از دوجین ژن مقاومت آنتراکنوز تا به امروز شناسایی شده است.برخی از این ژن ها در مناطقی یافت می شوند که فاقد هر گونه ژن R متعارف هستند، با این حال بسیاری دیگر در لبه های کروموزوم های حامل خوشه ژن NBS-LRR، از جمله TIR-NBS-LRRs99 قرار دارند.مطالعه ژنوم SSR همچنین ارتباط ژن NBS-LRR با مقاومت آنتراکنوز در لوبیا را تایید کرد.ژن متعارف R همچنین در ناحیه ژنومی حامل منبع اصلی مقاومت آنتراکنوز در لوپین سفید 101 یافت شد.
کار ما نشان می‌دهد که یک واکنش مقاومتی فوری، که در مراحل اولیه عفونت گیاه (ترجیحاً حداکثر 12 اسب بخار) فعال می‌شود، به طور موثری از لوپین باریک برگ در برابر آنتراکنوز ناشی از قارچ بیماری‌زا Collelotrichum lupini محافظت می‌کند.با استفاده از توالی یابی با توان بالا، ما پروفایل های بیان متفاوت ژن های مقاومت آنتراکنوز را در گیاهان NLL با واسطه ژن های مقاومت Lanr1 و AnMan نشان دادیم.دفاع موفقیت آمیز شامل طراحی دقیق ژن های پروتئین های دخیل در ردوکس، فتوسنتز و پاتوژنز در چند ساعت پس از اولین تماس گیاه با یک عامل بیماری زا است.واکنش‌های محافظتی مشابه، اما با تأخیر در زمان، در محافظت از گیاهان در برابر بیماری‌ها بسیار کمتر مؤثر است.مقاومت به سیاه زخم با واسطه ژن Lanr1 شبیه پاسخ سریع معمولی ژن R (ایمنی تحریک شده توسط فاکتور) است، در حالی که ژن AnMan به احتمال زیاد یک پاسخ افقی (ایمنی ایجاد شده توسط یک الگوی مولکولی مرتبط با میکروب) ایجاد می کند، که سطح متوسطی از پایداری را ارائه می دهد.
215 لاین NLL مورد استفاده برای غربال نشانگرهای آنتراکنوز شامل 74 رقم، 60 لاین حاصل از تلاقی یا پرورش، 5 جهش و 76 ژرم پلاسم وحشی یا اصلی بود.خطوط از 17 کشور، عمدتا از لهستان (58)، اسپانیا (47)، آلمان (27)، استرالیا (26)، روسیه (19)، بلاروس (7)، ایتالیا (5) و خطوط دیگر آمده است.از 10 کشوراین مجموعه همچنین شامل خطوط مقاوم در برابر مرجع است: 83A:476، Tanjil، Wonga حامل آلل Lanr1، و Mandelup حامل آلل AnMan.خطوط از پایگاه داده منابع ژنتیکی لوپین اروپایی که توسط Poznań Plant Breeding Ltd.، Wiatrowo، لهستان نگهداری می شود (جدول تکمیلی S1) به دست آمد.
گیاهان در شرایط کنترل شده (دوره نوری 16 ساعت، دمای 25 درجه سانتی گراد در روز و 18 درجه سانتی گراد در شب) رشد کردند.دو تکرار بیولوژیکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.DNA از برگ های سه هفته ای با استفاده از کیت کوچک گیاهی DNeasy (Qiagen، Hilden، آلمان) طبق پروتکل جدا شد.کیفیت و غلظت DNA جدا شده با روش های اسپکتروفتومتری (NanoDrop 2000؛ Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ارزیابی شد.نشانگر AnManM1 که ژن مقاومت آنتراکنوز AnMan را نشان می‌دهد (مشتق‌شده از cv. Mandelup) و نشانگرهای Anseq3 و Anseq4 در کنار ژن Lanr1 (مشتق‌شده از cv. Tanjil) 11،26،28 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.هموزیگوت ها برای آلل مقاوم به عنوان "1"، حساس - به عنوان "0"، و هتروزیگوت ها - به عنوان 0.5 امتیاز گرفتند.
بر اساس نتایج غربالگری نشانگرهای AnManM1، AnSeq3 و AnSeq4 و در دسترس بودن دانه‌ها برای آزمایش‌های بعدی، 50 لاین NLL برای فنوتیپ‌سازی مقاومت آنتراکنوز انتخاب شد.آنالیز در یک گلخانه تحت کنترل کامپیوتری با دوره نوری 14 ساعته با محدوده دمایی 22 درجه سانتی گراد در روز و 19 درجه سانتی گراد در شب انجام شد.بذرها قبل از کاشت خراشیده می شوند (روی بذر در طرف مقابل جنین با تیغه تیز بریده می شود) تا از خواب بذر به دلیل سفت بودن بیش از حد لایه بذر جلوگیری شود و از جوانه زنی یکنواخت اطمینان حاصل شود.گیاهان در گلدان های (11×11×21 سانتی متر) با خاک استریل (TS-1 REC 085 Medium Basic، Klasmann-Deilmann Polska، ورشو، لهستان) رشد کردند.تلقیح با سویه Colletotrichum lupini Col-08 انجام شد که در سال 1999 از ساقه‌های گیاه لوپین با برگ‌های باریک رشد کرده در مزرعه‌ای در Verzhenitsa، لهستان بزرگ (52° 27' 42″ N 17° 04' 05″ E ) انجام شد.یک منطقه بگیرید.جدایه ها در محیط SNA در دمای 20 درجه سانتی گراد زیر نور سیاه به مدت 21 روز برای القای اسپورزایی کشت داده شدند.چهار هفته پس از کاشت، زمانی که گیاهان به مرحله 6-4 برگی رسیدند، تلقیح با محلول پاشی کنیدی با غلظت 0.5×106 کنیدی در میلی لیتر انجام شد.پس از تلقیح، گیاهان به مدت 24 ساعت در تاریکی با رطوبت حدود 98 درصد و دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شدند تا جوانه زنی کنیدی ها و فرآیند آلودگی تسهیل شود.سپس گیاهان تحت یک دوره نوری 14 ساعته در دمای 22 درجه سانتیگراد روز / 19 درجه سانتیگراد شب و رطوبت 70 درصد رشد کردند.امتیاز بیماری 22 روز پس از تلقیح ایجاد شد و بسته به وجود یا عدم وجود ضایعات نکروز در ساقه و برگ از 0 (ایمنی) تا 9 (بسیار حساس) بود.همچنین پس از امتیاز دهی، وزن بوته ها اندازه گیری شد.روابط بین ژنوتیپ‌های نشانگر و فنوتیپ‌های بیماری به‌عنوان همبستگی‌های دو دنباله‌ای (عدم وجود نشانگرهای هتروزیگوت در مجموعه خطوط برای تجزیه و تحلیل فنوتیپ مقاومت آنتراکنوز) محاسبه شد.